DE2026092B2

DE2026092B2 - Verfahren zur Herstellung einer alkalischen Protease

Info

Publication number: DE2026092B2
Application number: DE2026092A
Authority: DE
Inventors: Koki Saitama Horikoshi; Yonosuke Tokio Ikeda
Original assignee: RIKAGAKU KENKYUSHO SAITAMA (JAPAN)
Current assignee: RIKAGAKU KENKYUSHO SAITAMA (JAPAN)
Priority date: 1969-05-31
Filing date: 1970-05-27
Publication date: 1978-08-03
Also published as: US4052262A; DE2026092A1; DK135545B; GB1308238A; DE2026092C3; NL7007854A; DK135545C; SE368961B; NL176870B; NL176870C; FR2052484A5; CA923833A

Description

Es ist eine sehr große Anzahl von Verfahren zur Herstellung von Proteasen, u. a. von alkalischen Proteasen, bekannt, wobei bestimmte Mikroorganismen in üblichen Nährmedien gezüchtet werden. Die bekannten Proteasen genügen jedoch noch nicht allen Ansprüchen an Aktivität und Temperaturstabilität in alkalischen Medien.

Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung einer neuen alkalischen Protease besonders hoher Aktivität und hoher Stabilität bei Temperaturen von 60°C und darüber.

Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt durch die Erfindung, die in den Ansprüchen definiert ist

Die erfindungsgemäß erhaltenen alkalischen Proteasen haben den besonderen Vorteil einer sehr hohen Aktivität bei pH-Werten zwischen 11 und 12 mit einem Maximum bei etwa 11,5 und hoher Stabilität bei Temperaturen von etwa 6O⁰C und in Gegenwart von CaI-ciumionen bei fast 70⁰C, wobei die Anwesenheit von Ca-Ionen eine Aktivitätserhöhung der Proteasen bewirkt Die Proteasen sind vom Serin-Typ.

Die erfindungsgemäß zu verwendenden Mikroorganismen zeigen gutes Wachstum unter nachstehend näher beschriebenen Züchtungsbedingungen. Die Mikroorganismen sind neue Stämme. Die genannten

Bacillus sp. No. 221

(a) Wachstum im Medium

Bacillus sp. No. 221, Bacillus sp. No. 0-4 und Bacillus sp. No. Y-76 sind von den Erfindern entdeckt und bei der American Type Collection (ATCC) mit den ATCC-Nummern 21522, 21536 und 21 537 hinterlegt worden und befinden sich bei ATCC in unbeschränkter Hinterlegung, welche der Öffentlichkeit vollen Zugang zu der Kultur gestattet. Die genannten Stämme sind zur Verteilung an die Öffentlichkeit am 22. April 1970, 5. Mai 1970 bzw. 5. Mai 1970 freigegeben worden.

Es ist gefunden worden, daß die genannten Mikroorganismen Bacillus sp. No. 221, Bacillus sp. No. 0-4 und Bacillus sp. No. Y-76 eine hohe Menge der neuen alkalischen Protease unter den nachstehend beschriebenen Züchtungsbedingungen erzeugen und anhäufen. Die erhaltene alkalische Protease ist sehr brauchbar als Zusatz zu Reinigungsmitteln.

Die genannten Bacillus sp. No. 221, Bacillus sp. No. 0-4 und Bacillus sp. No. Y-76 haben die folgenden Eigenschaften: Die mikrobiologischen Eigenschaften wurden nach den Methoden geprüft, die in »Aerobic Spore-forming Bacteria« von Nathan R. Smith, R. E. G ο r d ο η und F. E. C1 a r k (United States Department of Agriculture, November 1952) und »Bergeys Manual of Determinative Bacteriology« (1957) beschrieben sind.

Medium	pH-Wert in dem Medium	pH-Wert 10,2*)
	pH-Wert 7	Wachstum
(1) Bouillon	Wachstum	gutes Wachstum
(2) Bouillon-Agar	Wachstum	Wachstum reichlich
(3) Glucose-Bouillon	schlechtes Wachstum	Wachstum reichlich
(4) Glucose-Bouillon-Agar	Wachstum gering	gutes Wachstum
(5) Gelatinemedium	-	Wachstum nicht gut
(6) Peptone-Wasser	Wachstum	gutes Wachstum
(7) Kartoffelmedium	Wachstum

*) ! % Na₁CO-. wurde. 7uge.<sel7t.

Die Größe des Mikroorganismus ist 0,6-0,8 μ x 2,0-3,0 μ; das Sporangium ist etwas gequollen, und die Spore ist oval, 0,8-1,0 μ x 1,3 μ.

Der Mikroorganismus hat pertrichinöpe Flagella (pertrichous flagella), wie dies in der Elektronenmikrographie zu sehen ist (Fig.l). Der genannte Bacillus wächst sehr gut auf dem Medium (Glucose, Hefeextrakt, Peptone, K₂HPO₄, MgSO₄ · 7 H₂O und Na₂CO₃, pH-Wert 10,2), wie dies nachstehend beschrieben ist, in Form einer weißen Kolonie. Das Charakteristische dieses Bacillus ist, daß er gut auf alkalischem Medium anstelle von neutralem Medium, in dem kein Zucker enthalten ist, wächst

(b) Physiologische Eigenschaften

(1) Optimale Wachstumsbedingungen:

pH-Wert 8-10.
Temperatur: 37-40⁰C aerob.

(2) Bedingungen, unter welchen die Bakterien wachsen können:

pH-Wert 7-11.

Temperatur: bis zu 55⁰C aerob.
Die folgenden Versuche wurden unter Verwendung des 1% Na₂CO₃ enthaltenden Mediums ausgeführt.

(3) Gram-Färbbarkeit:

positiv (änderbar).

Bacillus sp. No. 0-4

(a) Wachstum im Medium

(4) Voges-Proskauer-Reaktion:

negativ.

(5) Nitrat wird reduziert.

(6) Catalase:

positiv.

(7) Hydrolyse von Gelatine und Casein:

positiv.

(8) Hydrolyse von Stärke.

schwach.

(9) Verwertung von Citrat:

verwertet.

(10) Verwertung von Ammoniumsalzen:

verwertet.

(11) Wachstum, bestimmt in 5% Natriumchloridlösung.

(12) Wachstum, bestimmt auf Glucose-Nitratmedium.

(13) Kein Wachstum unter anaeroben Bedingungen.

(14) Keine Erzeugung von Gas in Nitratmedium unter anaeroben Bedingungen.

(15) Wachstum, bestimmt auf Glucose-Asparagin-Medium.

(c) Verwertung der Kohlenstoffquelle

Verwertet: Glucose, Mannose, Salicin, Cellobiose, Lactose, Saccharose, Arabinose, Mannit und Xylose in einem Medium, das 1 % Carbonat enthält. Die Erzeugung von Säure ist jedoch infolge der Gegenwart einer großen Menge von Carbonat nicht ersichtlich.

Medium	pH-Wort in dem Medium	pH-Wert 10,2*)
	pH-Wert 7	Wachstum
(1) Bouillon	schlechtes Wachstum	gutes Wachstum
(2) Bouillon-Agar	schlechtes Wachstum	gutes Wachstum
(3) Glucose-Bouillon	schlechtes Wachstum	gutes Wachstum
(4) Glucose-Bouillon-Agar	Wachstum	gutes Wachstum
(5) Gelatinemedium	-	Wachstum nicht gut
(6) Peptone-Wasser	-	gutes Wachstum
(7) Kartoffelmedium	Wachstum

*) 1 % Na₂Co₃ wurde zugesetzt.

Die Größe des Mikroorganismus ist 0,5-0,7 μ Χ 2,0-3,0 μ; das Sporangium ist etwas gequollen, und die Spore ist oval, 0,7-1,0 μ Χ 1,2-1,3 μ.

Der Mikroorganismus hat pertrichinöse Flagella (pertrichous flagella), wie dies in der Elektronenmikrographie zu sehen ist (Fig. 2). Der genannte Bacillus wächst sehr gut auf dem Medium (lösliche Stärke, Hefeextrakt, Peptone, K₂HPO₄, MgSO₄ · 7 H₂O und Na₂CO₃, eingestellt auf pH-Wert von 10,2), wie dies nachstehend beschrieben wird, in Form einer weißen Kolonie. Das Charakteristische dieses Bacillus besteht darin, daß er gut auf alkalischem Medium anstatt auf neutralem Medium wächst.

(b) Physiologische Eigenschaften

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(1) Optimale Wachstumsbedingungen:

pH-Wert 8-10.
Temperatur: 37-40⁰C aerob.

(2) Bedingungen, unter welchen die Bakterien wachsen können:

pH-Wert 6,0-11.
Temperatur: bis zu 56 C aerob.
Die folgenden Versuche wurden unter Verwendung des 1 % Na₂CO₃ enthaltenden Mediums ausgeführt.

(3) Gram-Färbbarkeit:

positiv (änderbar).

(4) Voges-Proskauer-Reaktion: ±

(5) Nitrat wird reduziert.

(6) Catalese:

positiv.

(7) Hydrolyse von Gelatine und Casein:

positiv.

(8) Hydrolyse von Stärke:

schwach.

(9) Verwertung von Citrat:

verwertet.

(10) Verwertung von Ammoniumsalzen:

verwertet.

(11) Schwaches Wachstum, bestimmt in 7% Natriumchloridlösung.

(12) V.'achstum, gering auf Glucose-Nitratmedium.

(13) Kein Wachstum unter anaeroben Bedingungen.

(14) Keine Erzeugung von Gas in Nitratmedium unter anaeroben Bedingungen.

(15) Wachstum, bestimmt auf Glucose-Asparaginmedium.

(c) Verwertung der Kohlenstoffquelle

Verwertet: Glucose, Mannose, Salicin, Cellobiose, Lactose, Saccharose, Arabinose, Mannit und Xylose in

Bacillus sp. No. Y-76

(a) Wachstum im Medium

einem Medium, das 1 % Carbonat enthält. Die Erzeugung von Säure ist jedoch infolge der Gegenwart einer großen Menge von Carbonat nicht ersichtlich.

Medium

pH-Wert in dem Medium

pH-Wert 7 pH-Wert 10,2*)

(D	Bouillon	Wachstum	Wachstum
(2)	Bouillon-Agar	Wachstum	Wachstum
(3)	Glucose-Bouillon	Wachstum	gleichförmige Trübung,
			gutes Wachstum
(4)	Glucose-Bouillon-Agar	Wachstum	gutes Wachstum
(5)	Gelatinemedium	-	gutes Wachstum verflüssigt
(6)	Peptone-Wasser	-	Wachstum nicht gut
(7)	Kartoffelmedium	Wachstum	gutes Wachstum

Die Größe des Mikroorganismus ist 0,5-0,7 μ Χ 2,0-3,0 μ; das Sporangium ist etwas gequollen, und die Spore ist oval, 0,7-1,0 μ x 1,2-1,3 μ.

Der Mikroorganismus hat pertrichinöse Flagella (pertrichous flagella), wie dies in der Elektronenmikrographie zu sehen ist (Fig. 3). Der genannte Bacillus wächst sehr gut auf dem Medium (lösliche Stärke, Hefeextrakt, Peptone, K₂HPO₄, MgSO₄ · 7 H₂O und Na₂CO₃, eingestellt auf pH-Wert von 10,2), wie dies nachstehend beschrieben wird, in Form einer weißen Kolonie. Das Charakteristische dieses Bacillus besteht darin, daß er gut auf alkalischem Medium anstatt auf neutralem Medium wächst.

(b) Physiologische Eigenschaften

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(1) Optimale Wachstumsbedingungen:

ph-Wert8-10.
Temperatur: 37-40°C aerob.

(2) Bedingungen, unter welchen die Bakterien wachsen können:

pH-Wert 6,0-11.
Temperatur: bis zu 56⁰C aerob. Die folgenden Versuche wurden unter Verwendung des 1 % Na₂COi enthaltenden Mediums ausgeführt.

(3) Gram-Färbbarkeit:

positiv (änderbar).

(4) Voges-Proskauer-Reaktion: ±

(5) Nitrat wird reduziert.

(6) Catalase:

positiv.

(7) Hydrolyse vou Gelatine und Casein:

positiv.

(8) Hydrolyse von Stärke:

positiv.

(9) Verwertung von Citrat:

verwertet.

(10) Verwertung von Ammoniumsalzen:

verwertet.

(11) Wachstum, bestimmt in 7% Natriumchloridlösung.

(12) Wachstum, bestimmt auf Glucose-Nitratmedium.

(13) Kein Wachstum unter anaeroben Bedingungen.

(14) Keine Erzeugung von Gas in Nitratmedium unter anaeroben Bedingungen.

(15) Wachstum, bestimmt auf Glucose-Asparagin-Medium.

(c) Verwertung der Kohlenstoffquelle

Verwertet: Glucose, Mannose, Salicin, Cellobiose, Lactose, Saccharose, Arabinose, Mannit und Xylose in einem Medium, das 1 % Carbonat enthält Die Erzeugung von Säure ist jedoch infolge der Gegenwart einer großen Menge von Carbonat nicht ersichtlich.

Die genannten Mikroorganismen, Bacillus sp. No. 221, Bacillus sp. No. 0-4 und Bacillus sp. No. Y-76 sind voneinander verschieden, und ihre charakteristischen unterschiedlichen Punkte sind in der folgenden Tabelle gezeigt:

Eigenschaften

Mikroorganismen	Bacillus
Bacillus	sp. No. 0-4
sp. No. 221

Bacillus
sp. No. Y-76

Wachstum auf neutralem Medium sehr schwaches Wachstum Wachstum in NaCI 7% langsames Wachstum

Wachstum in Glucose-Asparaginmedium

Voges-Proskauerreaktion
Wachstum bei 56 C

Membranbildung

sehr langsames Wachstum

negativ Wachstum

keine Bildung

schwaches Wachstum
schwaches Wachstum

Wachstum

sehr schwaches
Wachstum

keine Bildung

Wachstum gutes

Wachstum Wachstum

schwaches Wachstum

Bildung

Aus der obengenannten Tabelle ist ersichtlich, daß die genannten Mikroorganismen nicht identisch miteinander in ihren Eigenschaften sind.

Vergleichsuntersuchungen der genannten Bacillus sp. No. 221, Bacillus sp. No. 0-4 und Bacillus sp. No. Y-76 gemäß dem Klassifikationsverfahren, das in »Aerobic Sporeforming Bacteria« und in »Bergeys Manual of Determinative Bacteriology« (1957), Seiten 613 ff. beschrieben ist, zeigten, daß die genannten Mikroorganismen hinsichtlich einiger Punkte ähnlich den bekannten Mikroorganismen waren, welche zu der Gruppe Bacillus sp. gehören, daß sie jedoch in charakteristischen Eigenschaften vollständig verschieden waren und daß keine Species unter der bekannten Gattung waren, die mit den genannten Eigenschaften übereinstimmten. Es wurde daraus geschlossen, daß sie neue Stämme des Bacillus sp. darstellen. Da die genannten Mikroorganismen jeweils aerobe, sporenbildende Bakterien sind, ist ersichtlich, daß sie zu der Bacillusgattung gehören. Der besonders charakteristische Punkt der genannten Mikroorganismen besteht darin, daß das Wachstum in alkäischem Medium besonders gut ist, wobei der optimale pH-Wert 8-10 beträgt.

Es wurden einige Prüfungen an bekannten bakteriellen Species mit Bezug auf Bacillus sp. No. 221 und Bacillus subtilis gemacht, und Bacillus subtilis kann als Vergleichsorganismus genannt werden. Bacillus subtilis ist positiv gegenüber der Vogel-Proskauerreaktion und hat einen optimalen pH-Wert von 5—8 in einem Glucose enthaltenden Medium. Demgegenüber ist Bacillus sp. No. 22J negativ gegenüber der Vogel-Proskauerreaktion und zeigt ein schlechtes Wachstum in einem Medium, das Glucose bei einem pH-Wert von 7 enthält, während der optimale Wert bei etwa pH 10 liegt. In dieser Hinsicht ist Bacillus sp. No. 221 deutlich vom Bacillus subtillis unterschieden.

Bacillus brevis kann auch als Vergleichsorganismus Tür Bacillus sp. No. 221, Bacillus sp. No. 0-4 und Bacillus sp. No. Y-76 genannt werden. Bacillus brevis hat jedoch keine Fähigkeit zum Hydrolysieren von Stärke, erzeugt Gas in einem Nitratmedium unter aeroben Bedingungen, und seine Gram-Färbbarkeit ist verschieden, gewöhnlich ist sie negativ. Demgegenüber haben Bacillus sp. No. 221, Bacillus sp. No. 0-4 und Bacillus sp. No. Y-76 jeweils etwas Fähigkeit zum Hydrolysieren von Stärke; sie erzeugen kein Gas in einem Nitratmedium unter aeroben Bedingungen und sind unveränderlich positiv hinsichtlich der Gram-Färbung. Der charakteristische Unterschied in ihren Eigenschaften besteht in folgendem: Während Bacillus brevis als Wachstumsbedingung einen pH-Wert von 8,0-8,6 erfordert, wächst er überhaupt nicht bei einem pH-Wert von 10; Bacillus sp. No. 221, Bacillus sp. No. 0-4 und Bacillus sp. No. Y-76 wachsen demgegenüber bei pH-Werten von 7-11. Das Wachstum von jedem der Mikroorganismen Bacillus sp. No. 221, Bacillus sp. No. 0-4 und Bacillus sp. No. Y-76 ist sehr langsam bei einem pH-Wert von 7 in Gegenwart von Glucose, und der pH-Wert von etwa 10 ist optimal. In dieser Hinsicht unterscheiden sich jeweils Bacillus sp. No. 221, Bacillus sp. No. 0-4 und Bacillus sp. No. Y-76 deutlich vom Bacillus brevis.

Da das Wachstum von Bacillus sp. No. 221 durch Glucose gehemmt wurde, kann er mit Bacillus firm us ver- e5 glichen werden. Das Wachstum dieser beiden Mikroorganismen auf Citratmedium und die optimale Temperatur ihres Wachstums sind jedoch verschieden.

Außerdem zeigt Bacillus 221 Glucosehemmung bei einem pH-Wert von 7. Es wird jedoch bei einem pH-Wert von 10 keine Wachstumshemmung durch Glucose festgestellt; während Bacillus firmus kein Wachstum bei einem pH-Wert von 10, unabhängig von der Gegenwart oder Abwesenheit von Glucose, hat. In dieser Hinsicht sind die beiden Mikroorganismen deutlich unterschieden.

Demtentsprechend ist es zweckmäßig, eine neue Species für jeden der Mikroorganismen Bacillus sp. No. 221, Bacillus sp. No. 0-4 und Bacillus sp. No. Y-76 zu errichten.

Bei der praktischen Ausführung der Erfindung kann die Gärung (Fermentation) gemäß den folgenden Verfahren ausgeführt werden.

Es gibt zwei Methoden für die Herstellung des bei der Erfindung verwendeten Züchtungsmediums.

Die erste Methode ist durch den Zusatz von Carbonat zu der Zusammensetzung des Züchtungsmediums gekennzeichnet. In diesem Medium werden Glucose, Stärke, Dextrin, Maltose, Fructose oder dergleichen als Kohlenstoffquelle benutzt. Hefeextrakt, Pepton, Maiseinweichflüssigkeit und dergleichen werden als Stickstoffquelle angewendet. Verschiedene Carbonate, wie Kaliumcarbonat, Natriumcarbonat und Natriumbicarbonat werden als anorganische Salze benutzt und zu der Lösung zugegeben, um das Züchtungsmedium herzustellen, das auf einen pH-Wert von etwa 10,5 eingestellt wird.

Die zweite Methode ist durch die Ausschaltung von Glucose und Stärke von der Zusammensetzung des Züchtungsmediums gekennzeichnet. In diesem Fall kann ein Carbonat zu dem Züchtungsmedium als anorganisches Salz zugegeben werden. Hefeextrakt, Pepton, Maiseinweichflüssigkeit od. dgl. werden als Stickstoffquelle angewendet, und es finden verschiedene Carbonate, wie Kaliumcarbonat, Natriumcarbonat und Natriumbicarbonat, als anorganische Salze Anwendung und können zu der Lösung der erstgenannten zugegeben werden, um das Züchtungsmedium herzustellen, das auf einen pH-Wert von etwa 7 eingestellt wird.

Das so hergestellte Medium wird mit dem Stamm eines Mikroorganismus geimpft, der aus der Gruppe Bacillus sp. No. 221, Bacillus sp. No. 0-4 und Bacillus sp. No. Y-76 ausgewählt wurde, und unter Schütteln bei einer Temperatur von etwa 24-45^;C gezüchtet Im allgemeinen erreicht die Aktivität des erzeugten Enzyms ein Maximum nach etwa 24-75 Stdn. Züchtung, z.B. 30-50 Stdn.

Da die Zeitdauer, welche zu der Erreichung der maximalen Enzymaktivität erforderlich ist, gemäß den Belüftungs- und Rührbedingungen variieren kann, selbst wenn die gleiche Temperatur und ein Kulturmedium aus denselben Komponenten verwendet werden, ist es zweckmäßig, über die Züchtungsdauer durch Messung der Enzymaktivität in jedem Fall zu entscheiden.

Die zweite wichtige Bedingung ist der pH-Wert des Mediums. Es ist notwendig, den Anfangs-pH-Wert innerhalb des Bereichs von 6-11 mit Carbonat- oder Bicarbonatsalzen einzustellen. Der optimale pH-Wert beträgt, wenn ein Zucker enthaltendes Kulturmedium angewendet wird, 8-11, während der pH-Wert von 6-10 der optimale ist, wenn Glucose von dem Kulturmedium ausgeschaltet worden ist.

Die Üblicherweise verwendeten physikalisch-chemischen Methoden können zur Isolierung des Enzyms

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ίο

aus der Züchtungsbrühe Anwendung finden. Beispielsweise wird nach Abkühlung der Züchtungsbrühe Essigsäure zugegeben oder nicht zu der Züchtungsbrühe zugegeben, um sie zu neutralisieren, und es wird dann Äthanol zugegeben, um das Enzym, alkalische Protease, quantitativ zu fällen. Der Durchschlag wird dann gesammelt, gründlich mit Äthanol gewaschen und getrocknet. Das Enzym, alkalische Protease, das so aus der Züchtung der genannten Mikroorganismen erhalten ist, stellt eine alkalische Protease dar, welche den optimalen pH-Wert von etwa 11,5 hat, und die Aktivität, wenn sie auf 50 C erhitzt wird, eine Stunde behält.

Als Kulturbedingung ist es notwendig, ein alkalisches Medium mit einer hohen Konzentration an Carbonat zu haben. Verschiedene Carbonate werden zu dem Medium zugegeben, das eine Zusammensetzung hinsichtlich der Kohlenstoffquelle und der Stickstoff quelle aufweist, welche notwendig für das Wachstum des Mikroorganismus ist. Es ist beispielsweise notwendig, ein Medium, das Glucose, K₂HPO₄, Hefeextrakt, Pepton und MgSO₄ · 7 H2O enthält, unter Zusatz von Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat oder Natriumbicarbonat herzustellen. Es ist erwünscht, eine Konzentration des zugesetzten Carbonats von 0,5-5% vorzusehen.

Für die vorteilhafte Herstellung der in Betracht kommenden alkalischen Protease ist ein Zusatz eines Carbonats zu dem obengenannten Medium eine äußerst wichtige Bedingung, und die folgende Tatsache wird durch experimentelle Ergebnisse bewiesen.

Das Wachstum des angewendeten Mikroorganismus Bacillus sp. No. 221 und die Herstellung von Protease wurden unter Verwendung des vorstehenden Mediums, dem 1% Natriumcarbonat oder jeweils 1% von verschiedenen Carbonaten zugesetzt war, und durch die Verwendung des gleichen Mediums, von dem das Carbonat fortgelassen und an seiner Stelle 1 % Natriumchlorid oder Kaliumchlorid zugesetzt war, wobei der pH-Wert auf 10,0 mit Natriumhydroxyd eingestellt war, untersucht. Das Wachstum des Mikroorganismus (Bacillus sp. No. 221) wurde dadurch geprüft, daß man die Züchtungsbrühe nach 18 Stdn. in eine Cuvette von 1 cm Lichtweg einbrachte und ihre Absorption bei 660 ηιμ maß; die Proteaseaktivität wurde unter später beschriebenen Bedingungen gemessen. Diese Ergebnisse sind in der Tabelle I wiedergegeben, welche zeigt, daß die Gegenwart eines Carbonats in dem Medium eine wichtige Bedingung für die Erzeugung der alkalischen Protease gemäß der Erfindung ist.

Tabelle I	Salzzusatz	Anfangs-pH	End-pH	Wachstum	Protease
Glucose-					aktivität
Konzen-					(U/ml)
tration	keiner	7,2	6,5	0,1	< 100
1	(nur Glucose, K₂HPO₄,
	Hefeextrakt, Pepton
	und MgSO₄-7H₂O)
	KCl, 1%	10,5	-	0,5	<100
1		(eingest. mit NaOH)
	NaCl, 1 %	10,5	-	0,45	< 100
1		(eingest. mit NaOH)
	Na₂HPO₄-NaOH, 0,05 M	10,5	-	0,8	750
1	NaHCO₃, 1,0%	10,0	8,5	1,2	1400
1	Na₂CO₃, 0,5%	10,2	8,8	1,2	1800
1	Na₂CO₃, 1,0%	10,5	9,3	1,2	2800
1	K₂CO₃, 1,0%	10,5	9,2	1,15	1500
1

Es wurden ferner das Wachstum des Mikroorganismus Bacillus sp. Np. 0-4 und die Erzeugung von Protease durch Anwendung des vorstehenden Mediums, dem 1 % Natriumcarbonat oder jeweils 1 % von verschiedenen Carbonaten zugesetzt worden war, und unter Anwendung des gleichen Mediums, von dem das 55 Salzzusatz Carbonat fortgelassen und an seiner Stelle 1 % Natriumchlorid oder Kaliumchlorid zugesetzt war, wobei ein pH-Wert von 10 mit Natriumhydroxyd eingestellt war,

untersucht. Das Wachstum des Mikroorganismus

wurde dadurch geprüft, daß man die Züchtungsbrühe &o nach 18 Stunden in eine Cuvette von 1 cm Lichtweg einbrachte und ihre Absorption bei 660 ηψ maß; die Proteaseaktivität wurde unter den nachstehend beschriebenen Bedingungen gemessen. Diese Ergebnisse sind in der Tabellen aufgeführt, die zeigt, daß die Gegenwart eines Carbonats in dem Medium eine wichtige Bedingung Tür die Erzeugung der alkalischen Protease gemäß der Erfindung ist.

Wenn der Bacillus sp. No. Y-76 als Testorganismus verwendet wurde, wurden ähnliche Ergebnisse, wie diejenigen der Tabelle II, erzielt.

Tabelle II

pH

Wachs- Proteaseturn aktivität

(U/ml)

Keiner	10,0	0,8	750
(nur lösliche Stärke,
K₂HPO₄, Hefeextrakt,
Pepton und MgSO₄ · 7 H₂O)
KCl	10,0	0,9	750
NaCl	10,0	0,9	750
Na₂CO₃	10,5	1,2	7100
NaHCO₃	9,0	1,2	5100
K₂CO₃	10,5	1,1	5200

Das andere gemäß der Erfindung verwendete Medium ist ein Medium, das keinen Zucker enthält. Es ist ein Medium, das Komponenten enthält, die fur das Wachstum des Mikroorganismus notwendig sind, wie eine Kohlenstoffquelle und eine Stickstoffquelle, z. B. K₂HPO₄, Hefeextrakt, Pepton und MgSO₄ · 7H₂O. Es ist erwünscht, daß der pH-Wert auf 6-10 eingestellt wird.

Für die vorteilhafte Erzeugung der in Betracht kommenden alkalischen Protease ist die Abwesenheit von Zuckern in dem vorgenannten Medium eine wichtige Bedingung, und diese Tatsache wird durch die folgenden Versuche belegt.

Das Wachstum des verwendeten Organismus Bacillus sp. No. 221 und die Erzeugung der alkalischen Protease wurden durch die Anwendung dieses Mediums unter-

12

sucht, und das Medium wurde mit Natriumcarbonat oderNatriumbicarbonat versetzt. Das gleiche Medium, das mit Glucose versetzt war, wurde mit oder ohne Natriumcarbonat oder Natriumbicarbonat geprüft. Das Wachstum des Organismus (Bacillus sp. No. 221) wurde dadurch untersucht, daß man die Züchtungsbrühe nach 18 Stdn. in eine Cuvette von 1 cm Lichtweg einbrachte und ihre Absorption bei 660 πιμ maß; die Proteaseaktivität wurde unter später angegebenen Bedingungen gemessen. Diese Ergebnisse sind in der Tabelle III wiedergegeben, welche zeigt, daß die Abwesenheit oder niedrige Konzentration von Glucose in dem Medium eine wichtige Bedingung bei einem neutralen pH-Wert für die Erzeugung der alkalischen Protease gemäß der Erfindung ist.

Tabelle III

Glucose-

Konzentra-

Salz (Carbonat)
Konzentration

Anfangs-pH End-pH

Wachstum

Proteaseaktivität

(U/ml)

0 keines (nur K₂HPO₄, Hefe- 6,8

extrakt, Pepton, MgSO₄-7 H₂O)

NaHCO₃,0,1 8,2

NaHCO₃,0,2 8,7

NaHCO₃,0,3 9,1

Na₂CO₃,0,2 9,5

Na₂CO₃, 1,0 10,6

0,1 keines (nur Glucose, 7,2

K₂HPO₄, Hefeextrakt, Pepton, MgSO₄ · 7 H₂O)

0,1 NaHCO₃,0,2 8,7

0,1 NaHCO₂,0,5 9,6

0,1 NaHCO₃, 1,0 10,0

0,1 Na₂CO₃,0,2 9,3

0,1 Na₂CO₃,0,4 10,0

0,1 Na₂CO₃, 1,0 10,5

0,5 O 7,2

0,5 NaHCO₃,0,2 8,6

0,5 NaHCO₃,0,5 9,6

0,5 NaHCO₃, 1,0 10,0

0,5 Na₂CO₃,0,2 9,2

0,5 Na₂CO₃,0,4 10,0

0,5 Na₂CO₃, 1,0 10,5

1,0 Na₂CO₃, 1,0 7

1,0 Na₂CO₃, 1,0 8

1,0 Na₂CO₃, 1,0 9

1,0 Na₂CO₃, 1,0 10

1,0 Na₂CO₃J₁O 11

1,1

9,4	1,0
9,5	0,9
9,6	1,0
9,6	0,9
9,8	0,8
9,0	1,1
9,3	1,0
9,4	1,0
9,5	0,98
9,3	0,98
9,5	1,1
9,5	1,05
6,0	0,14
6,4	0,40
9,3	1,2
9,3	1,15
9,1	1,1
9,3	1,1
9,6	1,15
(eingestellt mit HCl oder NaOH)	0,4
(eingestellt mit HCl oder NaOH)	0,9
(eingestellt mit HCl oder NaOH)	1,2
(eingestellt mit HCl oder NaOH)	1,2
(eingestellt mit HCl oder NaOH)	0,7

2500

2700 2000 1800 1600 1150

600

2600 2100 2100 1800 1600 600

100

600

1600

2000

1600

1100

900

200

900

1500

2100

700

Der nächste wichtige Punkt bei den Züchtungsbedingungen ist der pH-Wert während der Züchtung. Gemäß den Ergebnissen der folgenden Versuche ist es iiotwendig, den pH-Wart für die Erzeugung der alkalischen Protease auf den gewählten Wert in dem Bereich von 6-11 einzustellen. Eine Untersuchung der Wirkung des pH-Werts auf die Erzeugung von alkalischer Protease durch Abänderung des pH-Werts des obengenannten Züchtungsmediums mit 1 % Natriumcarbonat mit HCl oder NaOH, wie dies aus Tabelle IV ersichtlich ist, zeigte, daß das beste Ergebnis bei einem pH-Wert von 7-11 bzw. bei einem pH-Wert von 8-11 in Gegenwart von Glucose erhalten wurde. In diesem Fall war der verwendete Mikroorganismus der genannte Bacillus sp. No. 221.

Tabelle	IV	Proteaseaktivität (U/ml) pH 7 8 9	880 100	1,520 100	10	11	20
Medium		220 100		1,640 100	700 100	25
Mit 1 % Ohne 1	Na₂CO₃ % Na^CO₁

Wenn der genannte Bacillus sp. No. 0-4 benutzt wurde, wurden die aus der Tabelle V ersichtlichen Ergebnisse erhalten.

Tabelle V

Medium

Proteaseaktivität (U/ml)

pH

6,8 8 9 10

11

Mit 1 % Na₂CO₃ 800 3,000 5,550 6,300 2,530

Aus der Tabelle V ist ersichtlich, daß die besten Ergebnisse bei einem pH-Wert von 6-11, besonders bei einem pH-Wert von 8-11, in der Gegenwart von Carbonat erhalten werden.

Die Wirkung des pH-Werts auf die Erzeugung von alkalischer Protease wurde dann durch Variierung des pH-Werts des Züchtungsmediums mit NaHCO₃ oder Na₂CO₃ und ohne einen Gehalt von Zuckern untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI wiedergegeben. Wenn Glucose nicht zugegeben war, wurden die besten Ergebnisse in einem pH-Wert-Bereich von 6-11, insbesondere bei pH-Werten von 6-10, erhalten. Der verwendete Mikroorganismus war der Bacillus sp. No. 221.

Tabelle VI	An- fangs- PH	End- PH	Wachs tum	Protease aktivität (U/ml)
Salzzusatz	7,0 6,8*)	9,3 9,2	1,2 1,1	2100 2000
Keiner (nur K₂HPO₄, Hefeextrakt, Pepton, MgSO₄ ■ 7H₂O) Na₂CO₁, 0,5%

Salzzusatz	An	End-	Wachs	Protease
	fangs-	pH	tum	aktivität
	pH			(U/ml)
NaHCO₃, 0,1 %	8,2	9,4	1,0	1800
NaHCO₃, 0,2%	8,7	9,5	0,9	1580
NaHCO₃, 0,3	9,1	9,6	1,0	1300
Na₂CO₁, 0,2%	9,5	9,6	0,9	1020
Na₁CO₁, 1,0%	10,3	9,8	0,8	420

*) Eingesteüt mit HCl.

So wird unter den vorstehenden Züchtungsbedingungen mit jedem der genannten Mikroorganismen Bacillus sp. No. 221, Bacillus sp. No. 0-4 und Bacillus sp. No. Y-76, vorbebrütet in dem gleichen Medium, das Medium geimpft und einer Züchtung unter Schütteln unter geeigneten Bedingungen, 1. B. bei 24-75 Stdn. bei 37°C unterworfen. Nach Vollendung der Züchtung werden die Zellen entfernt, die Brühe wird mit Essigsäure oder ähnlicher Säure neutralisiert oder auch nicht ne tralisiert, und es wird dann ein organisches Lösungsmittel, wie Äthanol oder Aceton, zugegeben, um die erzeugte alkalische Protease zu fällen. Der Niederschlag wird dann dehydratisiert und getrocknet, um die in Betracht kommende Substanz zu erhalten. Die Aktivität der so erhaltenen alkalischen Protease beträgt etwa 3000 U/ml, die alkalische Protease hat einen optimalen pH-Wert auf der alkalischen Seite von ungefähr 11,5. Diese alkalische Protease verliert ihre Aktivität nicht, selbst wenn sie auf 50°C während einer Stunde erhitzt wird, was durch die Versuchsergebnisse belegt ist.

Physikalisch-chemische Eigenschaften der erfindungsgemäß isolierten alkalischen Protease sind folgende:

(1) Analytische Werte:

Gefunden: C 48,04; H 6,62; N 16,07; S*) 0,31 %.

*) Wert berechnet aus der Aminosäureanalyse, die zeigte, daß nur Methionin als schwefelhaltige Aminosäure anwesend ist und weder Cystein noch Cystin festzustellen sind.

(2) Molekulargewicht:

Das nach der Archibald-Methode kalkulierte Molekulargewicht beträgt etwa 33 000.

(3) Optimaler pH-Wert- und stabiler pH-Wert-Bereich:

Aus Fig. 4 ist ersichtlich, daß der optimale pH-Wert zwischen 11 und 12 liegt.

Das kristalline Enzym, versetzt mit Pufferlösung bei verschiedenen pH-Werten, wurde auf 6O⁰C 10min erhitzt, und die Restaktivität wurde bestimmt.

Die Ergebnisse sind in Fig. 5 gezeigt.

Verwendete Pufferlösung

pH

Acetatpuffer	4- 6
Phosphatpuffer,	6- 8
Sämtlich 0,05 M,
NaHCO₃-Na₂CO₃-Puffer	9-10,7
Na₂HPO₄-NaOH-Puffer	11-12

(4) Prüfung der Enzymaktivität

1 ml der in geeigneter Weise verdünnten Enzymlösung mit 10 M CaCl₂ wurde mit 5 ml von 0,6%iger Caseinlösung (pH-Wert 11,5, 2 ■ 10"²M Na₂HPO₄-NaOH-Puffer) bei 30°C gemischt. Nach 10 min Bebrütung wurden 5 ml Trichloressigsäurelösung (0,11 M Trichloressigsäure, 0,22 M Natriumacetat und 0,33 M Essigsäure) zu der Reaktionsmischung zugegeben, und die Mischung wurde weiter bei 30°C 30 min bebrütet. Die Mischung wurde filtriert, und die Absorption des Filtrats wurde bei 275 μπι gemessen. Die Ablesungen wurden durch Subtraktion des Werts der Kontrollprobe korrigiert, in welcher die Enzymlösung mit Trichloressigsäurelösung gemischt war, bevor die Caseinlösung zugegeben wurde.

Definition der Enzymaktivität

Eine Einheit von Proteaseaktivität wird als die Menge von Enzym definiert, welche die Verdauung erzeugt, die nicht durch Trichloressigsäure gefällt wird und die einen Absorptionswert äquivalent 1 Gamma Tyrosin je Minute bei 30°C gibt.

(5) Arbeitstemperaturbereich

Die Enzymaktivität wurde durch die übliche Methode unter Variierung der Temperatur gemessen. Die Messung wurde unter Verwendung von Lösungen mit und ohne Zusatz von 5 raM CaCl₂ als Stabilisierungsmittel ausgeführt. Wie in Fig. 6 gezeigt, in der die Aktivität bei 30°C als 100% angenommen wurde, betrug die Aktivität bei 60-70°C in Gegenwart von CaCl₂ 700% und diejenige bei 60⁰C ohne Zusatz von CaCl₂ 500 %. Sämtliche Versuche wurden bei einem pH-Wert von 11,5 ausgeführt.

(6) Bedingungen zur Inaktivierung durch Temperatur

Das kristalline Enzym gemäß der Erfindung wurde in M/20 Tris-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0 gelöst, die Lösung wurde während 15 min bei verschiedenen Temperaturen erhitzt, und die Restaktivität wurde gemessen. Die Messungen wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von 5mM CaCl₂ ausgeführt. Wie aus Fig. 7 ersichtlich ist, betrug die Restaktivität etwa 100%, wenn eine Erhitzung bei etwa 30-62⁰C in Gegenwart von CaCl₂ vorgenommen wurde und 50%, wenn auf etwa 65°C erhitzt wurde. Wenn kein CaCl₂ zugesetzt wurde, betrug die Restaktivität 100%, wenn auf etwa 30-52°C erhitzt wurde und 80%, wenn auf etwa 57°C erhitzt wurde.

(7) Inhibierung, Aktivierung und Stabilisierung

Inhibierung und Aktivierung des kristallinen Enzyms gemäß der Erfindung wurden untersucht, und die Ergebnisse sind in der Tabelle VII wiedergegeben.

Tabelle VII

Zusatz

Konzentration

(M)

Restaktivität

EDTA (Äthylendiamintetraessigsäure)

PCMB (p-Chlormercuribenzoat)
Harnstoff

10"²

ίο-³

100

100
0

Hinsichtlich der Stabilisierung gegen Wärme bewirkte ein Zusatz von 5 mM CaCl₂ eine Stabilisierung von etwa 10°C (vgl. Bedingung zur Inaktivierung durch Temperatur im Abschnitt (6) und in Fig. 7).

(8) Reinigungsverfahren

Zu 11 (3000 U/ml) des Züchtungsfiltrats, das durch die Züchtung der Mikroorganismen gemäß der Erfindung jeweils von Bacillus sp. No. 221, Bacillus sp.

ίο No. 0-4 und Bacillus sp. No. Y-76 erhalten war, wurden 51 Aceton zugegeben, der gebildete Niederschlag wurde gesammelt und mehrmals mit Aceton gewaschen. Es wurden etwa 42 g acetongetrocknetes Pulver erhalten. Dieses wurde gründlich mit 100% gesättigter (NH₄)₂SO₄-Lösung gewaschen, in 0,01 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,5 gelöst und über Nacht gegen den gleichen Puffer dialysiert.

Dieses Dialysat wurde durch eine Säule von Diäthylaminoäthylcellulose (DEAE-Cellulose), mit 0,01 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7,5) ins Gleichgewicht gebracht, geführt. Die alkalische Protease wurde nicht adsorbiert und ging durch die Säule. Das ausfließende Material wurde dann durch eine Säule von Carboxymethylcellulose (CM-Cellulose), mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gebracht, geführt, wodurch das Enzym vollständig (100%) adsorbiert wurde. Die adsorbierte alkalische Protease wurde mit 0,01 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7,5) mit einem Gehalt von 0,3 M NaCl eluiert.

Das so gereinigte Enzym bildet säulenförmige Kristalle in 30%iger, mit Ammoniumsulfat gesättigter Lösung. Die Ausbeute des Enzyms aus der obengenannten Reinigungsarbeitsweise beträgt etwa 50%, und die spezifische Aktivität des Enzyms beträgt etwa 13 000 U/ml.

(9) Kristallstruktur

Eine feine Struktur des Enzyms ist nicht ersichtlich, aber die unter Anwendung von Ammoniumsulfat gebildeten Kristalle erscheinen in einer Anordnung von säulenförmigen Kristallen, wie dies in der Mikrophotographie gemäß Fig. 8 gezeigt ist.

(10) Elektrophorese

Der isoelektrische Punkt des Enzyms wurde mit dem Tiseliusapparat gemessen und liegt, wie gefunden wurde, bei etwa pH 10.

Zusammenfassend ist festzustellen, daß ein Vergleich der physikalisch-chemischen Eigenschaften der alkalischen Protease mit demjenigen der bekannten alkalischen Proteasen deutlich zeigt, daß es sich um eine neue alkalische Protease handelt, die von irgendwelchen der bekannten alkalischen Proteasen verschieden ist.

Figurenbeschreibung

Fig. 1 ist eine Elektronenmikrophotographie des gemäß der Erfindung verwendeten Mikroorganismus Bacillus sp. No. 221;

Fig. 2 ist eine Elektronenmikrophotographie des gemäß der Erfindung verwendeten Mikroorganismus Bacillus sp. No. 0-4;

Fig. 3 ist eine Elektronenmikrophotographie des b5 gemäß der Erfindung verwendeten Mikroorganismus Bacillus sp. No. Y-76;

Fig. 4 ist eine graphische Darstellung, welche den optimalen pH-Wert der alkalischen Protease zeiet:

Fig. 5 ist eine graphische Darstellung, welche die Restaktivität der alkalischen Protease unter Wirkung des pH-Wertes zeigt;

Fig. 6 ist eine graphische Darstellung, welche den Bereich der Arbeitstemperatur der alkalischen Protease zeigt;

Fig. 7 ist eine graphische Darstellung, welche die Bedingungen für eine Inaktivierung der alkalischen Protease durch Temperatureinwirkung zeigt, und

Fig. 8 ist eine Mikrophotographie der Kristalle der alkalischen Protease.

Wirksamkeit im praktischen Gebrauch

Die alkalische Protease ist ein Protein abbauendes Enzym, das einen optimalen pH-Wert auf der alkalisehen Seite (pH-Wert etwa 11,5) hat, ausgezeichnete Enzymaktivität zeigt, wenn es mit Reinigungsmitteln verwendet wird, und die Waschkraft der Reinigungsmittel festigt oder verstärkt.

Die enzymatische Aktivität dieser alkalischen Protease in Reinigungsmitteln wird nachstehend aufgrund experimenteller Ergebnisse, erläutert.

1) Gebrauch

Wenn das Enzym als Zusatzstoff für Reinigungsmittel verwendet werden soll, wird das kristalline Enzym unmittelbar zu den Reinigungsmitteln, wie Natriumdodecylbenzolsulfonat (DBS) und Natriumlaurylsulfat, oder gemischt mit anderen Zusatzstoffen, wie Polyäthylenglykol, zugesetzt. Es gibt keine Begrenzung bei dieser Zubereitung, wie z. B. der pH-Wert des Reinigungsmittels oder das Mischungsverhältnis von Reinigungsmittelkomponenten und Zusatzstoffen. Beispielsweise gibt die Anwendung von 0,01-1,0 Gew.-% der Enzymzubereitung gernäß Beispiel 1 gute Wirksamkeit, d.h., es tritt eine gute proteolytische Kraft ein.

2) Wirksamkeit (enzymatische Aktivität
in Reinigungsmitteln)

Das Enzym wurde während einer bestimmten Zeitdauer bei verschiedenen Temperaturen in Gegenwart eines Reinigungsmittels bebrütet, und die restliche Aktivität des Enzyms wurde gemessen.

Experimentelles Verfahren

Die Konzentration des Reinigungsmittels zu der Zeit der Berührung mit dem Enzym betrug 0,1%. Natriumdodecylbenzolsulfonat (DBS) und Natriumlaurylsulfat wurden als Reinigungsmittel verwendet. Der pH-Wert wurde auf 10,5 zu der Zeit der Reaktion durch die Verwendung eines Boratpuffers eingestellt.

Reaktionslösung

Reinigungsmittel, 0,5 %
Boratpuffer (0,05M)
kristallines Enzym (1000 U/ml)
Zusatz für Wasser

2 ml

3 ml
ImI

4 ml

Ergebnis:

1. Restliche Aktivität des Enzyms {Reaktionstemperatur: 50⁰C)

Reinigungsmittel	Zusatz	Restliche Aktivität (%)	60 Min.
		0 Min. 30 Min.	10
Natriumdodecyl benzolsulfonat	keiner	100	94
	CaCl₂ 5mM	100 95
	0,02% Polyäthylenglykol (Polymerisationsgrad 2000)		5-15
Natriumlaurylsulfat	keiner	100	100
	CaCl₂ 5mM	100 100
	0,02% Polyäthylenglykol (Polymerisationsgrad 2000)		15 Min)
2. Restliche Aktivität	des Enzyms (Stabilität gegen	Temperatur) (Berührungszeit:
Reinigungsmittel	Zusatz	Restliche Aktivität (%)	65°C
		50⁰C 55°C 6O⁰C

Natriumdodecylbenzolsulfonat

CaCl₂ 5mM

0,02% Polyäthylenglykol (Polymerisationsgrad 2000) 100

100

10

Wie aus den obenstehenden Werten ersichtlich, ist die Restaktivität des Enzyms ausgezeichnet, und es wurde gefunden, daß die Stabilität des Enzyms ausgesprochen durch die vereinigte Anwendung von Zusatzstoffen, wie CaCl₂ und Polyäthylenglykol, erhöht wird.

65 Beispiel 1
Mediumzusammensetzung

Glucose
K₂HPO₄

10g
Ig

Hefeextrakt
Pepton
MgSO₄ · 7H₂O

5g
5g
0,25 g

Die obengenannte Zusammensetzung wJrd in 900 ml Wasser gelöst und bei 115°C 15 Min. sterilisiert. Eine Lösung von 10 g wasserfreiem Natriumcarbonat, gelöst in 100 ml Wasser, wird bei 115°C 15 Min. sterilisiert. Diese beiden Lösungen werden dann gemischt, um ein Züchtungsmedium mit einem pH-Wert von etwa 10,5 herzustellen. 50 ml dieses Züchtungsmediums werden in mit Schultern versehene Schüttelkolben (Sakaguchi-Kolben) von 500 ml Fassungsvermögen eingebracht. Der genannte Bacillus sp. No. 221 (ATCC 21 522), über Nacht vorbebrütet, wird in diese Kolben geimpft, und die Kolben werden unter Schütteln bei 37°C 48 Std. der Züchtung unterworfen. Die Zellen werden aus dem Züchtungsmedium entfernt; 1 ml dieses Züchtungsfiltrats enthält 2700 Einheiten von alkalischer Protease.

Diese Züchtungsbriihe wurde gründlich gekühlt, und es wurden 3 Volumina Äthanol zugegeben, durch welche das Enzym quantitativ gefällt wurde. Dieser Niederschlag wurde gründlich mit Äthanol gewaschen und in Luft getrocknet. Etwa 11g des Pulvers wurden aus einem Liter der Züchtungsbrühe erhalten.

Die dadurch erhaltene Probe hatte einen optimalen pH-Wert von etwa 11,5, und es wurde gefunden, daß sie aus einer alkalischen Protease bestand, welche ihre Aktivität selbst dann nicht verlor, wenn sie bei 50⁰C eine Stunde erhitzt wurde (spezifische Aktivität 240 U/g).

Beispiel 2
Mediumzusammensetzung

Weizenkleie
Hefeextrakt
Maismehl

5g
0,1g
0,5 g

Die obengenannte Zusammensetzung wird in Wasser in einen Erlenmeyer-Kolben von 250 ml Fassungsvermögen eingebracht und bei 115°C 20 Min. sterilisiert. Zu dieser Lösung werden 7 ml von l%iger Natriumcarbonatlösung, sterilisiert bei 115⁰C während 15 Min., zugegeben und gut vermischt. Eine Platinschleife des genannten Bacillus sp. No. 221 (ATCC 21522) wird in dieses Medium geimpft, und der Kolbeninhalt wird statisch bei 37°C 48 Std. unter gelegentlichem Bewegen gezüchtet Die Protease wurde mit 30 ml Wasser extrahiert; ihre Aktivität betrug 2900 U/ml. Die so erhaltene Probe ist, wie sich erweist, eine alkalische Protease mit einem optimalen pH-Wert von etwa 11,5, welche nicht ihre Aktivität verlor, selbst wenn sie auf 50°C eine Stunde erhitzt wurde.

Beispiel 3
Mediumzusammensetzung

Hefeextrakt
Pepton
K₂HPO₄
MgSO₄ -7H₂O

5g
5g
Ig
0,25 g

Die obengenannte Zusammensetzung wird in 1000 ml Wasser gelöst, bei 115°C 15 Min. sterilisiert, um ein Züchtungsmedium mit einem pH-Wert von etwa 7,0 bis 7,2 herzustellen, und 50 ml dieses Züchtungs-

K₂HPO₄	ig
Hefeextrakt	5g
Pepton	5g
MgSO₄-7H₂O	0,25 g

mediums werden in mit Schultern versehene Schüttelkolben (Sakaguchi-Kolben) von 500 ml Fassungsvermögen eingebracht. Der genannte Bacillus sp. No. 221 (ATCC 21 522), über Nacht in dem gleichen Medium vorbebrütet, wird in diese Kolbe«! geimpft und unter Schütteln bei 37⁰C 48 Std. der Züchtung unterworfen. Die Zellen wurden entfernt, und die Aktivität der alkalischen Protease in diesem Züchtungsfiltrat betrug 1950 U/ml.

to Dieses Züchtungsfiltrat wurde gründlich gekühlt, und 3 Volumina Äthanol wurde zugegeben, durch welche das Enzym quantitativ gefallt wurde. Dieser Niederschlag wurde gesammelt, gründlich mit Äthanol gewaschen und in Luft getrocknet.

Die so erhaltene Probe erwies sich als eine alkalische Protease mit einem optimalen pH-Wert von etwa 11,5 und verlor ihre Aktivität nicht, selbst wenn sie bei 5O⁰C eine Stunde erhitzt wurde.

Beispiel 4

Mediumzusammensetzung

25 Die obengenannte Zusammensetzung wird in 900 ml Wasser gelöst, und die Lösung wird bei 115°C 15 Min.

sterilisiert. Eine l%ige Lösung von NaHCO₃ wird bei 115°C 15 Min. sterilisiert, und 100 ml dieser Lösung werden mit der obengenannten Lösung gemischt, um ein Züchtungsmedium herzustellen. 50 ml des Züchtungsmediums werden in mit Schultern versehene Schüttelkolben (Sakaguchi-Kolben) mit einem 500-ml-Fassungsvermögen gegossen. Der genannte Bacillus sp. No. 221 (ATCC 21522), über Nacht in dem gleichen Medium vorbebrütet, wird in diese Kolben geimpft, und es erfolgte eine Züchtung unter Schütteln bei 37°C während 48 Std. Die Zellen wurden entfernt, und die alkalische Protease in diesem Züchtungsfiltrat betrug 2500 U/ml.

Dieses Züchtungsfiltrat wurde gründlich gekühlt, 5 Volumina Aceton wurden zugegeben, und das erzeugte Enzym wurde gefällt. Dieser Niederschlag wurde gesammelt, mit Aceton gewaschen und in Luft getrocknet. Es wurden etwa 1,2 g eines bräunlichen Pulvers aus einem Liter der Züchtungsbriihe erhalten.

Die dadurch erhaltene Probe erwies sich als eine alkalische Protease mit einem optimalen pH-Wert von etwa 11,5, die ihre Aktivität nicht verlor, selbst wenn sie bei 50°C eine Stunde erhitzt wurde (Aktivität 1 900000 U/g).

Beispiel 5
Mediumzusammensetzung

Lösliche Stärke
K₂HPO₄
Hefeextrakt
Pepton
MgSO₄-7 H₂O

20 g
Ig
5g
5g
0,2 g

Die obengenannte Zusammensetzung wird in 900 ml Wasser gelöst und bei 115°C 15 Min. sterilisiert. Eine Lösung von 10 g wasserfreiem Natriumcarbonat, gelöst in 100 ml Wasser, wird bei 115°C 15 Min. sterilisiert. Diese beiden Lösungen werden gemischt, um ein

Züchtungsmedium mit einem pH-Wert von etwa 10,5 herzustellen, von welchem 50 ml in mit Schultern versehene Kolben (Sakaguchi-Kolben) mit einem Fassungsvermögen von 500 ml eingebracht werden. Der genannte Bacillus sp. No. Y-76 (ATCC 21 537), über Nacht in dem gleichen Medium vorbebrütet, wird in diese Kolben geimpft, und die Kolben werden unter Schütteln bei 37°C 72 Std. der Züchtung unterworfen. Die Zellen werden aus dem Züchtungsmedium entfernt, und 1 ml dieses Züchtungsfiltrates enthielt 4500 Einheiten alkalischer Protease.

Diese Züchtungsbrühe wurde gründlich gekühlt und 3 Volumina Äthanol wurden zugegeben, durch welche das Enzym quantitativ gefällt wurde. Dieser Niederschlag wurde gründlich mit Äthanol gewaschen und in Luft getrocknet. Aus einem Liter der Züchtungsbrühe wurden etwa 11 g des Pulvers enthalten.

Die dadurch erhaltene Probe hat einen optimalen pH-Wert von etwa 11,5, und sie war, wie gefunden wurde, eine alkalische Protease, die ihre Aktivität, selbst wenn sie bei 50^cC eine Stunde erhitzt wurde, nicht verlor (spezifische Aktivität: 400 000 U/g).

Beispiel 6
Mediumzusammensetzung

Lösliche Stärke	20 g
K₂HPO₄	ig
Hefeextrakt	5g
Pepton	5g
MgSO₄ · 7 H₂O	0.2 g

Eine Lösung von 10 g Kaliumbicarbonat, gelöst in 100 ml Wasser, wird bei 115°C 15 Min. sterilisiert. Diese beiden Lösungen werden gemischt, um ein Züchtungsmedium mit einem pH-Wert von etwa 10,5 herzustellen, wovon 50 ml in mit Schultern versehene Schüttelkolben (Sakaguchi-Kolben) mit einem Fassungsvermögen von 500 ml eingebracht werden. Der genannte Bacillus sp. No. Y-76 (ATCC 21 537), über Nacht in dem gleichen Medium vorbebrütet, wird in diese Kolben geimpft, und die Kolben werden unter Schütteln bei 37 C 72 Stunden einer Züchtung unterworfen.

Die Zellen werden aus dem Züchtungsmedium entfernt; 1 ml dieses Züchtungsfiltrats enthielt 3100 Einheiten alkalischer Protease.

Diese Züchtungsbrühe wurde gründlich gekühlt und 3 Volumina Äthanol wurden zugegeben, durcl welche das Enzym quantitativ gefallt wurde. Diese Niederschlag wurde gründlich mit Äthanol gewaschei und in Luft getrocknet. Ein Liter der Züchtungsbrühi enthielt etwa 11 g des Pulvers.

Die dadurch erhaltene Probe hat einen optimalei pH-Wert von etwa 12,0 (spezifische Aktivität 300000 U/g).

Beispiel 7
Mediumzusammensetzung

Lösliche Stärke 20 g

is K₂HPO₄ Ig

Hefeextrakt 5 g

Pepton 5 g

MgSO₄-7 H₂O 0,2 g

Die obengenannte Zusammensetzung wird in 900 m Wasser gelöst und die Lösung bei 115°C 15 Min sterilisiert. Eine l%ige Lösung von NaHCO₃ wird be 115°C 15 Min. sterilisiert, und 100 ml dieser Lösunj werden mit der obengenannten Lösung gemischt, urr ein Züchtungsmedium herzustellen. 50 ml des Züch tungsmediums werden in mit Schultern versehen Schüttelkolben (Sakaguchi-Kolben) mit einem Fas sungsvermögen von 500 ml gegossen. Der genannt Bacillus sp. No. 0-4 (ATCC 21536), über Nacht ii dem gleichen Medium vorbebrütet, wird in dies« Kolben geimpft, und diese Kolben werden unte Schütteln bei 37°C 72 Std. einer Züchtung unter worfen. Die Zellen wurden entfernt, und die alkalisch) Protease in diesem Züchtungsfiltrat betrug 7500 U/ml Dieses Züchtungsfiltrat wurde gründlich gekühlt 5 Volumina Acetat wurden zugegeben, und das er zeugte Enzym wurde quantitativ gefällt. Dieser Nieder schlag wurde gesammelt, mit Aceton gewaschen unc in Luft getrocknet. Aus einem Liter der Züchtungs brühe wurden etwa 12 g eines bräunlichen Pulver erhalten.

Die dadurch erhaltene Probe war, wie sich ergibt eine alkalische Protease mit einem optimalen pH-Wer von etwa 12,0, die ihre Aktivität, selbst wenn sie be 50' C eine Stunde erhitzt wurde, nicht verlor (Aktivität 620000 U/g).

Hierzu 6 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung einer alkalischen Protease, die aus einem säulenförmigen kristallinen Pulver besteht, ein Molekulargewicht von etwa 33 000 nach der Archibald-Methode hat, folgende analytische Werte aufweist: 48,04% Kohlenstoff, 6,62% Wasserstoff, 16,07% Stickstoff, 0,31% Schwefel und Rest Sauerstoff, und einen optimalen pH-Wert von 11 bis 12 besitzt, dadurch gekennzeichnet, daß man entweder einen Stamm aus der Gruppe von Bacillus sp. No. 211 (= ATCC 21 522), Bacillus sp. No. 0-4 (= ATCE 21536) und Bacillus sp. No. Y-76 (= ATCC 21537) in ein Züchtungsmedium, das aus einem Carbonat, einer Kohlenstoffquelle, einer Stickstoffquelle und einem anorganischen Material zusammengesetzt ist, impft, das Züchtungsmedium bei einem pH-Wert von 7 bis 11 während einer zur Erzeugung der alkalischen Protease ausreichenden Zeitdauer aerob züchtet und daß man die alkalische Protease mit üblichen physikalisch-chemischen Methoden aus der Fermentationsflüssigkeit isoliert,
oder daß man den Bacillus sp. No. 211 (= ATCC 21 522) in ein Züchtungsmedium, das aus einem Carbonat, einer Kohlenstoffquelle, einer Stickstoffquelle und einem anorganischen Material zusammengesetzt ist und in dem keine Zucker enthalten sind, impft, das Züchtungsmedium bei einem pH-Wert von 6 bis 11 während einer zur Erzeugung der alkalischen Protease ausreichenden Zeitdauer

ίο aerob züchtet und daß man die alkalische Protease mit üblichen physikalisch-chemischen Methoden aus der Fermentationsflüssigkeit isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung unter aeroben submersen Bedingungen unter Rühren ausgeführt wird.

3. Verwendung einer nach dem Anspruch 1 oder 2 hergestellten alkalischen Protease als Zusatz in einer Menge von 0,01 bis l.O'Gew.^/o zu einer Reinigungsmittelzusammensetzung, die Natriumdodecylbenzolsulfat und Natriumlaurylsulfat umfaßt und einen pH-Wert zwischen 9 und 12 in einer wäßrigen Waschlösung liefert, und gegebenenfalls PoIyäthylenglykol und/oder Claciumchlorid enthält.