DE3029348C2

DE3029348C2 -

Info

Publication number: DE3029348C2
Application number: DE3029348A
Authority: DE
Inventors: Hideaki Yukawa; Terukazu Nara; Yoshihiro Ibaraki Jp Takayama
Original assignee: Mitsubishi Petrochemical Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1979-08-10
Filing date: 1980-08-01
Publication date: 1990-08-16
Also published as: JPS6129718B2; DE3029348A1; US4326029A; JPS5626196A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginsäure durch Umsetzung von Fumarsäure oder einem Salz derselben und Ammoniak oder einem Ammoniumsalz in Gegenwart eines Enzyms.

L-Asparaginsäure stellt eine der wichtigsten Aminosäuren in Proteinen dar. Man verwendet L-Asparaginsäure für medizinische Zwecke wie auch als Nahrungsmittelzusatz.

Es ist bekannt, daß Aspartase, die man aus den Zellen von Escherichia coli gewinnt, ein Enzym darstellt, das die Umsetzung von L-Asparaginsäure aus Fumarsäure und Ammoniak katalysiert. Kürzlich sind Verfahren gefunden worden zur Herstellung von L-Asparaginsäure aus Fumarsäure und Ammoniak unter Anwendung eines Fermentationsverfahrens mit verschiedenen Mikroorganismen.

Bei einer üblichen Fermentierungskulturmethode wird L-Asparaginsäure aus Fumarsäure und Ammoniak unter Verwendung von Aspartase in Mikroorganismen hergestellt, und deshalb ist es wirtschaftlich von großer Bedeutung, daß der Mikroorganismus eine starke Aspartaseaktivität hat. Die Abtrennung eines Mikroorganismus, der für diese Zwecke geeignet ist, macht aber große Schwierigkeiten und dadurch hat sich die technische Anwendung dieser Methoden bisher verzögert.

DE-AS 12 68 569 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginsäure durch Fermentation. Dabei werden dem Reaktions- und Kulturmedium die für das Wachstum der Bakterien notwendigen Nährsubstanzen zugegeben. Bei diesem Verfahren kommt es zur Bildung von Nebenprodukten, die bei der Gewinnung von L-Asparaginsäure erst abgetrennt werden müssen und zu einer Verunreinigung des Endproduktes führen können.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen Stamm vom Genus Brevibacterium zur Verfügung zu stellen, der aufgrund seiner Beständigkeit gegenüber alpha-Amino-n-buttersäure das Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginsäure aus Fumarsäure oder einem Salz davon und Ammoniak oder einem Ammoniumsalz besonders stark katalysiert.

Die vorstehende Aufgabe wird gemäß der Erfindung durch das eingangs genannte Verfahren gelöst, wobei das Enzym in den aus einer Kulturbrühe abgetrennten Zellen von Brevibacterium flavam MJ-233-AB-41 vorhanden ist.

Gemäß der Erfindung erfolgt somit die Katalyse der Reaktion unter Einsatz eines Kulturproduktes, das durch aerobe Kultivierung eines Mikroorganismenstammes von Genus Brevibacterium erhalten wurde. Aufgrund intensiver Untersuchungen konnte festgestellt werden, daß die Aspartaseaktivität erheblich erhöht ist, wenn der ausgewählte Mikroorganismus gegenüber alpha-Amino-n-buttersäure beständig ist.

Der erfindungsgemäß verwendete Stamm, Brevibacterium flavam MJ-233-AB-41 (FERM-P Nr. 3812) kann, ausgehend von Brevibacterium flavam MJ-233 (FERM-P Nr. 3068) als ein gegenüber alpha-Amino-n-buttersäure beständiger Stamm z. B. nach dem folgenden Verfahren erhalten werden:

Man mutiert Brevibacterium flavam MJ-233 durch eine Behandlung mit chemischen Mitteln, wie N-Methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidin in einer Konzentration von etwa 500 µg/ml während eines Zeitintervalls von ca. 1 bis 60 Minuten, und kultiviert die so erhaltene organische Suspension dann auf einer Plattenkultur (Harnstoff 0,2%, Ammoniumsulfat 0,7%, KH₂PO₄ 0,05%, K₂HPO₄ 0,05%, MgSO₄ · 7 H₂O 0,05%, NaCl 2 mg/l, CaCl₂ · 2 H₂O 2 mg/l, FeSO₄ · 7 H₂O 2 mg/l, MnSO₄ · 4-6 H₂O, ZnSO₄ ·7 H₂O 2 mg/l, Biotin 200 µg/l, Thiaminhydrochlorid 100 µg/l, alpha-Amino-n-buttersäure 1,0%, Agar 2,0% und Ethanol 3 Vol.-% (nach dem Sterilisieren zugegeben) mehrere Tage bei 30°C, worauf die dann erhaltene große Kolonie abgetrennt wird, und man den resistenten mutierten Stamm erhält.

Die morphologischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen Stammes sowie die Gründe für dessen taxonomische Identifizierung als Brevibacterium flavam MJ-233-AB-41 sind nachfolgend beschrieben:

Morphologische Eigenschaften I. Mit dem Mikroskop festgestellte Eigenschaften

Brevibacillus von ovaler oder Stäbchenform mit den ungefähren Dimensionen 0,6 bis 0,8×1,0×2,4 µm, im allgemeinen in Form von V-förmigen Paaren vorliegend, obwohl auch zaunartige Formen beobachtet werden. Diese Bazillen sind Gram-positiv, zeigen keine Sporenbildung, keine Motilität, keine Kapselbildung und sind nicht säurebeständig.

II. Kultureigenschaften

1. Eine Bouillon-Agarkolonie:
Kreisförmige, flache Oberfläche, Kolonie fast flach oder leicht erhaben, die Peripherie etwas wellig, gelb, opak und etwas hell.
2. Bouillon-Agar-Schrägkultur:
Mittleres Wachstum, fadenförmig und gelb.
3. Bouillon-Flüssigkultur:
Mittleres Wachstum, schleimig, nicht trübe.
4. Bouillon-Gelatine-Stabkultur:
Wächst gut auf der Oberfläche, im Inneren mäßiges Wachstum, fadenförmig.

III. Wachstumsbedingungen

1. Wachstumstemperatur: Geeigneter Temperaturbereich 15 bis 40°C, Optimaltemperatur 30 bis 37°C.
2. pH: Geeigneter Bereich 1 bis 10, optimaler pH 7 bis 8.
3. Verhalten gegenüber Sauerstoff: aerob.
4. Verwendung von Ammoniumsalz: Ja.
5. Verwendung von Harnstoff: Ja.
6. Verwendung von Nitrat: Ja.

IV. Physiologische Eigenschaften und dergleichen

1. Verflüssigt nicht Gelatine.
2. Verändert Lakmusmilch nicht.
3. Reduktion von Nitrat: Positiv.
4. Bildung von Indol: Negativ.
5. Bildung von Schwefelwasserstoff: Negativ.
6. Hydrolyse von Stärke: Negativ.
7. Ammoniakbildung aus Pepton: Positiv.
8. Vorges-Proskauer-Reaktion: Negativ.
9. Methyl-Rot-Test: Positiv (schwach).
10. Katalase: Positiv.
11. Urease: Positiv.
12. Bildung von Säure aus Kohlenwasserstoff: Säuren werden ohne Gasbildung gebildet aus Glukose, Saccharose, Trehalose, Maltose und Salizin. Keine Säure und kein Gas wurden gebildet aus Arabinose, Xylose, Laktose, Rhamnose, Raffinose, Mannit, Dulzit, Inosit und Adonit.
13. Vitaminerfordernisse: Biotin wird benötigt.

Veränderung in der Gram-Färbung: Eine morphologische Veränderung oder Verzweigung der Zellen unter Profileration wurde nicht festgestellt.

Der relative Wachstumsgrad von Brevibacterium flavam MJ-233- AB-41 und dessen Elternstamm, Brevibacterium flavam MJ-233, gegenüber α-Amino-n-buttersäure wird in Tabelle 1 gezeigt, in welcher alle Prozentzahlen auf das Gewicht bezogen sind.

Tabelle 1

Anmerkungen:

1. Die Zahlen in den Spalten 2 und 3 der Tabelle 1 bedeuten den Wachstumsgrad gemessen als O.D.₆₁₀ relativ zu dem Wachstumsgrad, den man erhält, wenn keine α-Amino-n-buttersäure zugegeben wird (100) (die Messung der Absorption wurde gemäß Agricultural and Horticultural Chemistry, Tokyo University, Agricultural Department, Band 1, Seite 212, veröffentlicht von Asakura Shoten [1969], vorgenommen).

2. Zusammensetzung der verwendeten Kultur und Kulturmethode: 10 ml eines Mediums aus 0,2% Harnstoff, 0,7% Ammoniumsulfat, 0,05% KH₂PO₄, 0,05% K₂HPO₄, 0,05% MgSO₄ · 7 H₂O, 0,01% Hefeextrakt, 0,01% Casaminosäure, 2 mg/l FeSO₄ · 7 H₂O, 2 mg/l MnSO₄ · 4 bis 6 H₂O, 2 mg/l NaCl, 2 mg/l CaCl₂ · 2 H₂O, 2 mg/l ZnSO₄ · 7 H₂O, 200 µg/l Biotin und 100 µg/l Thiaminhydrochlorid, mit dem in Tabelle 1 gezeigten Gehalt an α-Amino-n-buttersäure wurden in ein großes Reagenzglas mit einem Durchmesser von 24 mm gefüllt, 10 Minuten bei 120°C sterilisiert und dann mit Brevibacterium flavam MJ-233-AB-41 inokuliert.

Anschließend wurden 0,3 ml (3 Volumenprozent) Ethanol unter aseptischen Bedingungen zugegeben, und die Kultur wurde 3 Tage bei 30°C geschüttelt.

Der α-Amino-n-buttersäure-beständige Stamm gemäß der vorliegenden Erfindung hat vorzugsweise einen relativen Wachstumsgrad gemäß der obigen Definition von wenigstens 15 bei Zugabe von 2%iger α-Amino-n-buttersäure zu einem Kulturmedium und 3tägigem Kultivieren unter Schütteln bei 30°C.

Anstatt einer chemischen Behandlung kann man Brevibacterium flavam MJ-233 auch durch Bestrahlen mit ultraviolettem Licht mutieren.

Die Zusammensetzung des Kulturmediums, d. h. die Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganischen Salze, wie sie für die erfindungsgemäße Kultur verwendet wird, ist bekannt und in keiner Weise beschränkt.

Kohlenstoffquellen, wie Ethanol, Methanol, n-Paraffine und Melasse können allein oder als Gemisch verwendet werden. Als Stickstoffquellen können Ammoniak, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat und Harnstoff allein oder als Gemisch verwendet werden.

Anorganische Salze, wie Kaliummonohydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Magnesiumsulfat können zugegeben werden. Falls für das Wachstum der Zellen erforderlich, können weitere Nährstoffe zu dem Medium gegeben werden, z. B. Pepton, Bouillonextrakt, Hefeextrakt, Maismaische, Casaminosäure, verschiedene Vitamine.

Die Kultivierung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, z. B. durch Rühren unter Belüftung, Schütteln, wobei die Temperatur der Kultur zwischen 20 und 40°C und vorzugsweise zwischen 25 und 35°C gehalten wird. Der pH der Kultur liegt zwischen 5 und 10 und vorzugsweise bei 7 bis 8, wobei man die Einstellung des pH der Kulturflüssigkeit durch Zugabe von Säure oder Alkali bewirkt.

Die Konzentration an zugegebener α-Amino-n-buttersäure liegt zwischen 0,1 und 5 Gew.-% und vorzugsweise bei 1 bis 30 Gew.-%.

Die Konzentration an Ethanol zu Beginn der Kultur liegt bei 1 bis 50 Volumenprozent und vorzugsweise 2 bis 30 Volumenprozent. Die Kulturzeit liegt im allgemeinen bei 2 bis 8 Tagen mit einer optimalen Zeit zwischen 4 und 5 Tagen.

Da das so erhaltene Kultivierungsprodukt hochaktive Aspartase enthält, kann man damit wirksam L-Asparaginsäure aus Fumarsäure oder einem Salz davon, z. B. dem Natriumsalz oder Kaliumsalz, und Ammoniak oder einem Ammoniumsalz, z. B. Ammoniumchlorid oder Ammoniumkarbonat, biosynthetisieren. Das vorerwähnte Kulturprodukt bezieht sich auf alle durch die Kultivierung erhaltenen Produkte, d. h. nicht nur auf die Kulturflüssigkeit selbst, sondern auch auf die darin enthaltenen Zellen, die zerstörten, zermahlenen und die selbstverdauten Produkte solcher Zellen.

Die Biosynthese von L-Asparaginsäure aus Fumarsäure oder einem Salz davon und Ammoniak oder einem Ammoniumsalz kann in üblicher Weise durchgeführt werden, mit der Ausnahme, daß man das erfindungsgemäße Kulturprodukt anstelle der üblichen Kulturprodukte verwendet.

Nachfolgend wird die Erfindung in einem Beispiel näher beschrieben.

In dem Beispiel wurde die qualitative Untersuchung der gebildeten L-Asparaginsäure durchgeführt, indem man die Rf-Werte bei der Papierchromatographie mit denen einer Standard-L-Asparaginsäure verglich. Die quantitative Analyse erfolgte mittels einer Analysenmethode für Mikroorganismen unter Verwendung von Leuconostoc mesenterioides (ATCC Nr. 8042), siehe JIKKEN/ NOGEI KAGAKU (Experimental Agricultural Chemistry, 1. Band, Seiten 284 bis 285, Tokyo Universität, Faculty of Agriculture, Department of Agricultural Chemistry, veröffentlicht von Asakura Shobo [1960]). Die gebildete L-Asparaginsäure wurde in üblicher Weise gewonnen, z. B. durch isoelektrische Ausfällung, durch Ionenaustauschharz-Chromatographie, s. hierzu beispielsweise AMINOSAN HAKKO (Amino-Säure-Fermentation), 2. Band, Seiten 129 bis 138, veröffentlicht von Kyoritsu Shuppan (Japan).

Beispiel

In ein großes Reagenzglas mit einem Durchmesser von 24 mm wurden jeweils 10 mm eines Mediums eingefüllt aus 4,0 g Harnstoff, 14,0 g Ammoniumsulfat, 0,5 g KH₂PO₄, 0,5 g K₂HPO₄, 0,5 g MgSO₄ · 7 H₂O, 6 mg FeSO₄ · 7 H₂O, 6 mg MnSO₄ · 4 bis 6 H₂O, 1,0 g Hefeextrakt, 1,0 g Casaminosäure, 200 µg Biotin, 100 µg Thiamin und 1 l Leitungswasser. Das Ganze wurde bei 120°C unter Druck 10 Minuten sterilisiert, und dann wurden zur Herstellung eines Vorkulturmediums 0,3 ml Ethanol zugegeben. Die Medien wurden mit Brevibacterium flavam MJ-233 bzw. Brevibacterium flavam MJ-233-AB-41 inokuliert und 2 Tage unter Schütteln bei 30°C kultiviert. Anschließend wurden 50-l-Mengen eines Mediums der gleichen Zusammensetzung wie das obige Vorkulturmedium in 500-ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben und unter Druck 10 Minuten bei 120°C sterilisiert. Das so erhaltene Kulturmedium wurde dann mit 1,0 ml der vorerwähnten Vorkulturflüssigkeit inokuliert und 3 Tage bei 30°C einer Schüttelkultur unterworfen, worauf man anschließend eine Zentrifugentrennung (3000 Umdrehungen während 15 Minuten) zum Sammeln der Zellen durchführte.

Getrennt davon wurden 10 g Fumarsäure zu 50 ml Wasser gegeben, der pH wurde mit Ammoniakwasser auf 10,0 eingestellt, und dann wurde mit Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 100 ml aufgefüllt. 10 g (Naßgewicht) der oben gewonnenen Zellen wurden zugegeben, und dann wurde unter leichtem Rühren die Umsetzung während 3 Tagen bei 30°C durchgeführt.

Folgendes Ergebnis wurde erzielt:
Wurden die Zellen des Elternstammes, Brevibacterium flavam MJ-233 verwendet, erhielt man 1,1 g L-Asparaginsäure. Bei Verwendung der Zellen des α-Amino-n-buttersäure-beständigen Stammes, Brevibacterium flavam MJ-233-AB-41, erhielt man 3,2 g L-Asparaginsäure.

Claims

Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginsäure durch Umsetzung von Fumarsäure oder einem Salz derselben und Ammoniak oder einem Ammoniumsalz in Gegenwart eines Enzyms, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Enzym in den aus einer Kulturbrühe abgetrennten Zellen von Brevibacterium flavam MJ 233-AB-41 vorhanden ist.