DE3527649C2

DE3527649C2 -

Info

Publication number: DE3527649C2
Application number: DE3527649A
Authority: DE
Inventors: Manji Toyonaka Osaka Jp Wakunaga; Yasufumi Hiroshima Jp Nishimura
Original assignee: Wakunaga Kono KK
Current assignee: Wakunaga Kono KK
Priority date: 1984-08-02
Filing date: 1985-08-01
Publication date: 1988-02-18
Also published as: DE3527649A1; US4686185A

Description

Die Erfindung betrifft den Mikroorganismus Streptomyces sp. FERM BP-826 und die Verwendung dieses Stammes zur Herstellung von Chitinase durch Züchten desselben und Gewinnen der Chitinase aus der Kulturbrühe.

Im allgemeinen bezieht sich die Bezeichnung "chitinolytisches Enzym" auf ein zusammengesetztes Enzymsystem, das eine Vielzahl von Enzymkomponenten, zum Beispiel Chitinase und Chitobiase, enthält. Ihre Funktion ist es, Chitin gleichmäßig zu N-Acetylglucosamin oder Oligosacchariden zu zersetzen.

Chitin ist eines der Polysaccharide, die zu Aminozuckern gehören. Es ist in umfangreichem Maß in niedrigen Tieren, insbesondere Arthropoden, enthalten. Die jährlich biosynthetisch hergestellte Menge an Chitin ist so umfangreich, daß sie als mehrere Billionen Tonnen zu schätzen ist. Chitin stellt daher einen der natürlichen, nichtverwerteten Rohstoffe dar, der im Rampenlicht der letzten Jahre gestanden ist.

Chitin ist wenig reaktiv und stabiler als Cellulose, so daß die Zersetzung von Chitin mit einem Enzym, zum Beispiel Chitinase, zu einer niedermolekularen Substanz vorgeschlagen werden kann.

Chitinase ist beispielsweise in den Verdauungsflüssigkeiten von Schnecken enthalten. Weiterhin ist bekannt, daß es von fadenförmigen Pilzen oder Bakterien hergestellt wird (zum Beispiel "Encyclopaedia Chimica", Band 2, Seite 745, Kyoritsu Shuppan K. K., Tokyo).

Gemäß einem Katalog von Handelsprodukten wird Chitinase von Mikroorganismenquellen aus Streptomyces griseus und Serratia marcescens erhalten. Neuerdings wurde auch über Chitinase berichtet, die von Mikroorganismen der Gattung Aeromonas abgeleitet ist.

Es wurden nun Untersuchungen nach Mikroorganismen angestellt, die Chitinase mit hoher Fähigkeit zur Zersetzung von pulverförmigem Chitin und Verzuckerung zu N-Acetylglucosamin erzeugen könnten. Es wurde eine weite Vielzahl von Bodenproben untersucht. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß der Stamm Streptomyces sp. WAK-83 in einem Kulturmedium Chitinase erzeugt, welche eine hohe chitinzersetzende Aktivität, gekuppelt mit der Fähigkeit zur Erzeugung von N-Acetylglucosamin, besitzt.

Somit gehört der erfindungsgemäße, chitinaseerzeugende neue Stamm der Gattung Streptomyces an.

Bei der erfindungsgemäßen Verwendung dieses Stammes zur Herstellung von Chitinase geht man so vor, daß man diesen Mikroorganismus der Gattung Streptomyces kultiviert bzw. züchtet und die Chitinase aus der Kulturbrühe gewinnt.

Die erfindungsgemäß erhaltene Chitinase hat eine hohe chitinzersetzende Aktivität und eine hohe Fähigkeit zur Erzeugung von N-Acetylglucosamin.

Aus diesem Grund ist es möglich, mit dieser Chitinase in vorteilhafter Weise Chitin zu zersetzen.

Die Erfindung wird anhand der Zeichnungen näher erläutert. Es zeigt:

Fig. 1 eine Fotografie der Spore des erfindungsgemäßen Stammes Streptomyces sp. WAK-83, aufgenommen durch ein Elektronenmikroskop vom Transmissionstyp;

Fig. 2 eine optische Mikrofotografie des durch den erfindungsgemäßen Stamm erzeugten Pycnidiums;

Fig. 3 eine optische Mikrofotografie der Sporenkette des erfindungsgemäßen Stamms; und die

Fig. 4, 5 und 6 Diagramme, die jeweils den optimalen pH, die optimale Temperatur und den die Stabilität beibehaltenden Temperaturbereich des Enzyms, das aus dem Mikroorganismus gemäß der Erfindung hergestellt worden ist, zeigen.

Der erfindungsgemäße Stamm wurde von der Erde in Sukumoji, Kda-cho, Takata-gun, Hiroshima-ken, Japan im Dezember 1983 isoliert und am 13. Juli 1984 bei dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry of Japan, 1-3, Higashi 1 chome, Yatabe-machi, Tsukuba-gun, Ibaraki-ken 305, Japan unter der Aufnahmenummer FERM P-7714 hinterlegt. Der Stamm trägt nun die Aufnahmenummer bzw. Hinterlegungsnummer FERM BP-826 unter dem Budapester Vertrag. Die Hinterlegungsstelle erfüllt alle Voraussetzungen der Regeln des Budapester Vertrags. Sie erfüllt insbesondere die Erfordernisse der Regel 11.3 des Budapester Vertrags, der zufolge der Organismus der Öffentlichkeit bei Patenterteilung verfügbar ist und die Erfordernisse der Regel 9 des Budapester Vertrags, welche die Aufrechterhaltung des Organismus über einen Zeitraum von mindestens 30 Jahren nach dem Hinterlegungstag vorschreibt.

Die mikrobiologischen Eigenschaften des Stamms WAK-83 sind wie folgt. Die Farbnamen wurden entsprechend der Farbnamenliste (Shinju-d), herausgegeben von Japan Color Research Institute, zugeordnet.

I. Morphologische Eigenschaften

Der Stamm WAK-83 dehnt Lufthyphen auf verschiedenen Medien aus. Die Hyphen sind verzweigt. Es wird kein Sporangium gebildet. Die Sporen sind nicht beweglich. Die reifen Sporen auf dem Luftmycelium sind gelb, und die Sporenkette ist geradlinig oder leicht gekrümmt (Rectus Flexibilis). Die Sporen haben eine zylindrische Gestalt (2-3 µm×0,8-1,2 µm), und 20 oder mehrere Sporen bilden eine Kette. Die Oberfläche der Sporen ist glatt. Ein auffallendes Charakteristikum dieses Stammes ist die Bildung von Pycnidium nach Inkubierung bei 28°C über 14 Tage auf dem Bennett-Medium.

II. Kultureigenschaften auf verschiedenen Medien

1. Saccharosenitrat-Agar
Gutes Wachstum mit erheblichen Sporen. Die Oberfläche der Kolonien ist gelb und die Rückseite rostrot.
2. Glucose-Asparagin-Agar
Üppiges Wachstum mit üppigen Sporen. Die Oberfläche der Kolonien ist fleischfarben und die Rückseite lachsrosa.
3. Glycerin-Asparagin-Agar
Mäßiges Wachstum mit mäßiger Anzahl von Sporen. Die Kolonien breiten sich nicht sehr weit aus. Die Oberfläche der Kolonien ist hellgelb, und die Rückseite ist lachsrosa.
4. Stärke-/anorganische Salze-Agar
Gutes Wachstum mit erheblichen Sporen. Die Oberfläche der Kolonien ist hellgelb, und die Rückseite ist grau-rosa.
5. Tyrosin-Agar
Dürftiges Wachstum mit dürftigen Sporen und mäßiges Luftmycelium. Die Kolonien sind nicht faltig. Die Oberfläche der Kolonien ist weiß bis hellgelb, und die Rückseite ist mattrötlich/ gelblich orange. Kein lösliches Pigment.
6. Nährmittel-Agar
Weißes Luftmycelium breitet sich auf dem gelben Substratmycelium mit dürftigen Sporen aus. Die Rückseite ist gelblich orange.
7. Hefe-/Malzextrakt-Agar
Der Stamm wächst im faltigen Zustand und wird umgekehrt gekrümmt. Die Oberfläche der Kolonien ist hautfarben bis hellgelb und die Rückseite mattrötlich/gelblich orange.
8. Hafermehl-Agar
Der Stamm wächst nicht im gefalteten Zustand. Die Oberfläche der Kolonien ist weiß bis hellgelb und die Rückseite hellgelb.
9. Pepton-Hefeextrakt-Eisenagar
Der Stamm wächst im gefalteten Zustand mit einem dürftigen Luftmycelium und keinen Sporen. Sowohl die Oberfläche als auch die Rückseite der Kolonien ist hellorange-braun.

III. Physiologische Eigenschaften

1. Temperaturerfordernisse
Wachstum wird zwischen 20 und 37°C erhalten, wobei die optimale Temperatur 28°C beträgt. Das Wachstum bei 37°C ist schlecht.
2. Gelatineverflüssigung: positiv
3. Stärkehydrolyse: positiv
4. Wachstum in Milch: kein Wachstum
5. Produktion von Melanoidpigment: negativ

IV. Verwertung von Kohlenstoffquellen

Die beim Inkubieren in Pridham-Gottlieb-Agar-Medium erhaltenen Ergebnisse sind wie folgt.

KohlenstoffquelleWachstum*)

L-Arabinose+ D-Xylose+ D-Glucose+ D-Fructose+ Saccharose+ i-Inosit+ L-Rhamnose- Raffinose- D-Mannit+ ohne Zusatz-

*)+ = Wachstum
- = kein Wachstum

V. Identifizierung

Angesichts der oben angegebenen Charakteristiken nimmt man an, daß der Stamm WAK-83 zu Streptomyces gehört. Die Sporenkette ist gerade bis leicht gekrümmt. Das Luftmycelium ist weiß oder gelb. Die Oberfläche der Sporen ist glatt, und es wird kein lösliches Pigment erzeugt. Nach Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe (1975) kann dieser Stamm als Stamm der gelben Reihe (46 Arten) identifiziert werden.

Jedoch bildet keiner der Stämme der 46 Arten Pycnidium, dessen Bildung eines der herausragenden Merkmale des Stamms WAK-83 ist. Daher unterscheidet sich der Stamm WAK-83 von den Stämmen der 46 Arten. Wenn man unter bekannten Stämmen, wie sie in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe (1975), ISP-Stämme von Shirling, E. B. und Gottlieb beschrieben werden, und Stämmen, die in Waksman's The Actinomycetes beschrieben werden, Stämme sucht, die Pycnidium bilden, dann ist der Stamm Streptomyces sindenensis (ISP 5255) der einzige Stamm, der Pycnidium bildet. Jedoch bildet Streptomyces sindenensis ein rosa Pycnidium, während der Stamm WAK-83 ein gelbes Pycnidium bildet. Diese Stämme sind daher vollständig verschiedene Stämme.

Es kann somit festgestellt werden, daß kein bekannter Stamm gefunden wurde, der mit dem Stamm WAK-83 identisch ist. Der Stamm ist daher als ein Stamm einer neuen Mikroorganismenart anzusehen, und er wurde als Streptomyces sp. WAK-83 bezeichnet.

Der erfindungsgemäße Stamm kann durch herkömmliche Methoden zur Züchtung von Actinomyceten gezüchtet werden. Eine Vielzahl von Kohlenstoffquellen, wie Glucose, Stärke, Fructose, Glycerin und Mannit können entweder einzeln oder in Kombination in ein Kulturmedium eingebracht werden. Beispiele für Stickstoffquellen sind Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Natriumnitrat, Sojabohnenmehl, Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt und Kasaminosäure, entweder einzeln oder in Kombination.

Gewünschtenfalls können anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Nitrate, Kalciumcarbonat, Kaliumchlorid, Kobaltchlorid, Eisensulfat und Spurenmengen von Schwermetallen zugesetzt werden. Einige organische Substanzen, die das Wachstum der Mikroorganismen zur Förderung der Produktion von Chitinase anregen, können gleichfalls zugegeben werden, wenn es gewünscht wird.

Obgleich der erfindungsgemäße Stamm auch in einem festen Kulturmedium gezüchtet werden kann, wird ein flüssiges Medium bevorzugt, wie es bei den üblichen Methoden zur Herstellung von Enzymen der Fall ist. Das Züchten erfolgt unter aeroben Bedingungen, im allgemeinen bei einer Temperatur von 20°C bis 30°C, vorzugsweise um 28°C.

Die Produktion der Chitinase kann beispielsweise durch Tankfermentierung erfolgen. In diesem Falle wird die Chitinase erzeugt und in der Kulturflüssigkeit nach 2- bis 4tägiger Fermentierung angesammelt. Wenn die Produktionsausbeute der Chitinase in der Kulturflüssigkeit ein Maximum erreicht, dann wird die Fermentierung abgebrochen, und die gewünschte Chitinase wird aus der Kultur isoliert und wie folgt gereinigt.

Die resultierende Kultur wird zentrifugiert oder mit einem Filterhilfsmittel filtriert, wodurch eine rohe Enzymlösung erhalten wird. Die Flüssigkeit, die durch Zentrifugieren oder Filtrieren der von der Fermentation herrührenden Kultur erhalten wird, kann als rohe Enzymlösung ohne eine weitere Behandlung angewendet werden, oder sie kann zur Bewirkung einer Sedimentierung mit einem organischen Lösungsmittel wie Aceton und Ethanol konzentriert werden. Sie kann auch zur Bewirkung einer Ausfällung mit einem Aussalzmittel, wie Ammoniumsulfat, behandelt werden, wodurch ein rohes Enzymmittel erhalten wird. Das auf diese Weise erhaltene rohe Enzymmittel kann nach bekannten Methoden gereinigt und kristallisiert werden, wodurch ein gereinigtes Enzym erhalten wird.

Das auf die obige Weise erhaltene rohe Enzymmittel hat die folgenden Eigenschaften.

1) Aktivität und Substratspezifität
Dieses Enzym wirkt auf pulverförmiges Chitin, Chitinflocken, kolloidales Chitin oder Ethylenglycolchitin und zersetzt es unter Bildung von N-Acetylglucosamin (siehe die unten stehende Tabelle I).
2) Optimaler pH und Stabilität
Der optimale pH bei 37°C ist 5,5 bis 6,0. Dieses Enzym ist im pH-Bereich von 3,5 bis 8,0 stabil.
3) Optimale Temperatur und Stabilität
Die optimale Temperatur für die Wirkung dieses Enzyms war 37°C bei einem pH von 5,5 in einer 3stündigen Reaktion. Bei Temperaturen von 30°C oder niedriger war das Enzym über einen Zeitraum von 24 Stunden oder länger stabil.
4) Reinigung
Verunreinigungen in dem rohen Enzymmittel können durch Adsorptionschromatographie auf einer Chitinsäule, durch herkömmliche Ionenaustauscherchromatografie oder durch Gelfiltration mit einem Biogel entfernt werden, wodurch ein hochgereinigtes Enzym erhalten werden kann.

Die erfindungsgemäß hergestellte Chitinase hat das vorteilhafte Merkmal, daß sie auf Chitinpulver wirksamer als herkömmliche Enzyme einwirkt. So erzeugt zum Beispiel erhältliche handelsübliche Chitinase reduzierenden Zucker allmählich in 48 Reaktionsstunden, während das erfindungsgemäß erhaltene Enzym dazu imstande ist, eine gleiche Menge von reduzierendem Zucker in 3 Reaktionsstunden herzustellen.

Die Tabelle I zeigt die Aktivität der erfindungsgemäß erhaltenen Chitinase auf verschiedene Substrate. Die Aktivität wurde für Ethylenglycolchitin im wesentlichen auf der Basis der Verfahrensweise von Tsukamoto et al (Agriculture of Biological Chemistry, Band 48, Seite 931 (1984)) gemessen. Für pulverförmiges Chitin und Chitingel wurden die Substrate verwendet, die jeweils 1% pulverförmiges Chitin oder Chitingel enthielten. Die enzymatische Aktivität wurde nach der folgenden Methode gemessen. Es wird die Erhöhung des N-Acetylglucosamins gemessen, die durch eine Enzymreaktion bewirkt wird (zum Beispiel Morgan-Elson-Verfahren).

Zu 1 ml 1%igem pulverförmigem Chitin als Substrat wurden 1 ml einer Enzymlösung geeigneter Konzentration und sodann 3 ml 0,025 M Phosphat acetatpufferlösung (pH 5,5) gegeben, um eine Reaktion bei 37°C über 3 Stunden zu bewirken. Die Enzymmenge, die unter diesen Bedingungen 1 µmol/min N-Acetylglucosamin erzeugt, ist als eine Einheit definiert.
Erfindungsgemäß
erhaltene Chitinase
mE/mg Protein

Ethylenglycolchitin720 Pulverförmiges Chitin 4 Chitingel*) 42

*) Hergestellt nach der Verfahrensweise von Hirano et al. ("Biopolymers" Band 15, Seite 1685 (1976))

Aus der Tabelle wird ersichtlich, daß die erfindungsgemäß erhaltene Chitinase Ethylenglycolchitin und Chitingel wirksam zersetzt. Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert.

Beispiel

Der Stamm Streptomyces sp. WAK-83 wurde bei 28°C 4 Tage auf ein Bennett Schrägmedium inkubiert, zu dem 2,5 ml steriles Wasser gegeben worden war, um eine Sporensuspension herzustellen. 2,5 ml Suspension wurden jeweils in Kulturmedien der folgenden Zusammensetzung inokuliert bzw. in 100 ml und 500 ml Kolben gegeben, und es wurde eine 3tägige Kultivierung bei 28°C unter Schütteln durchgeführt.

BestandteileMenge

Hefeextrakt3,0 g/Liter Polypepton3,0 g/Liter Glucose2,0 g/Liter Kolloidales Chitin4,0 g/Liter

Die resultierende Kultur wurde zentrifugiert, um den Rückstand zu entfernen, wodurch eine rohe Enzymlösung erhalten wurde, die eine enzymatische Aktivität von 1,12 mE/ml auf pulverförmiges Chitin zeigte.

Referenzbeispiel

Kolloidales Chitin wurde wie folgt hergestellt.

100 ml destilliertes Wasser, das 4 g pulverförmiges Chitin enthielt, und 100 ml konzentrierte Schwefelsäure wurden gesondert mit Eis 3 Stunden lang gekühlt. Nach 3 Stunden wurden die zwei Lösungen langsam miteinander vermischt. Das Gemisch wurde durch einen Trichter, der mit Glaswolle filtriert war, gefüllt. Das Filtrat wurde zu 180 ml destilliertem Wasser gegeben und bei 3000 UpM zentrifugiert. Zum Rückstand wurde destilliertes Wasser gegeben, und die Zentrifugierung wurde wieder aufgenommen. Diese Verfahrensweise wurde wiederholt, bis der pH-Wert des Waschwassers 6 betrug.

Claims

1. Streptomyces sp. FERM BP-826.

2. Verwendung des Stammes des Anspruchs 1 zur Herstellung von Chitinase durch Züchten desselben und Gewinnen der Chitinase aus der Kulturbrühe.