JPS63313590A - キチナーゼ産生と分必べクター - Google Patents
キチナーゼ産生と分必べクターInfo
- Publication number
- JPS63313590A JPS63313590A JP63057331A JP5733188A JPS63313590A JP S63313590 A JPS63313590 A JP S63313590A JP 63057331 A JP63057331 A JP 63057331A JP 5733188 A JP5733188 A JP 5733188A JP S63313590 A JPS63313590 A JP S63313590A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- chitinase
- dna
- dna sequence
- sequence
- streptomyces
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 title claims description 107
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 title claims description 77
- 239000013598 vector Substances 0.000 title description 23
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 title 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 55
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 36
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 36
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 claims description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 27
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 26
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 23
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 23
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 22
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 claims description 16
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 11
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 claims description 10
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 7
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 5
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 4
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 claims description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 4
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 2
- 241000589180 Rhizobium Species 0.000 claims description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims 2
- 101710116747 Chitinase A Proteins 0.000 claims 1
- 101710202612 Endochitinase A Proteins 0.000 claims 1
- 241000752065 Rhyzobius Species 0.000 claims 1
- 241000187438 Streptomyces fradiae Species 0.000 claims 1
- 241000187412 Streptomyces plicatus Species 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 28
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 12
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 9
- HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 4-methylumbelliferone Chemical compound C1=C(O)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- 241000187398 Streptomyces lividans Species 0.000 description 6
- 239000013606 secretion vector Substances 0.000 description 6
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- -1 chitin Chemical class 0.000 description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- 150000004043 trisaccharides Chemical class 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238424 Crustacea Species 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 2
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- WURBVZBTWMNKQT-UHFFFAOYSA-N 1-(4-chlorophenoxy)-3,3-dimethyl-1-(1,2,4-triazol-1-yl)butan-2-one Chemical compound C1=NC=NN1C(C(=O)C(C)(C)C)OC1=CC=C(Cl)C=C1 WURBVZBTWMNKQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PSGQCCSGKGJLRL-UHFFFAOYSA-N 4-methyl-2h-chromen-2-one Chemical group C1=CC=CC2=C1OC(=O)C=C2C PSGQCCSGKGJLRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150039504 6 gene Proteins 0.000 description 1
- BUQICHWNXBIBOG-LMVFSUKVSA-N Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N BUQICHWNXBIBOG-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710151411 Chitinase 5 Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 1
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- KWLWZYMNUZJKMZ-IHRRRGAJSA-N Leu-Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KWLWZYMNUZJKMZ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- AAKRWBIIGKPOKQ-ONGXEEELSA-N Leu-Val-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O AAKRWBIIGKPOKQ-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- 208000000291 Nematode infections Diseases 0.000 description 1
- FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 101100084022 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) lapA gene Proteins 0.000 description 1
- XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- UQTNIFUCMBFWEJ-IWGUZYHVSA-N Thr-Asn Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O UQTNIFUCMBFWEJ-IWGUZYHVSA-N 0.000 description 1
- GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N Thr-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000282485 Vulpes vulpes Species 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- XDFCIPNJCBUZJN-UHFFFAOYSA-N barium(2+) Chemical compound [Ba+2] XDFCIPNJCBUZJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 231100000481 chemical toxicant Toxicity 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000003271 compound fluorescence assay Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000007421 fluorometric assay Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002440 industrial waste Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 101150009573 phoA gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 1
- 150000004044 tetrasaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2442—Chitinase (3.2.1.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01014—Chitinase (3.2.1.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Virology (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、一般的には、生物体、特に細菌が望みの成熟
タンパク質、特にキチナーゼを産生し、加工し、分泌す
ることを可能にする操作を加えたＤＮＡに関するもので
ある。本発明はまた、キチナーゼに感受性である有害生
物を抑制するための該微生物の使用に関するものである
。“操作した”あるいは“操作を加えたＤＮＡ”という
語は、例えば遺伝子工学技術によって、人間の介在によ
り修飾されたＤＮＡを意味する。
タンパク質、特にキチナーゼを産生し、加工し、分泌す
ることを可能にする操作を加えたＤＮＡに関するもので
ある。本発明はまた、キチナーゼに感受性である有害生
物を抑制するための該微生物の使用に関するものである
。“操作した”あるいは“操作を加えたＤＮＡ”という
語は、例えば遺伝子工学技術によって、人間の介在によ
り修飾されたＤＮＡを意味する。
［従来の技術］
様々な生物が、Ｎ−アセチルグルコサミン モノマ一単
位の重合体からなり、昆虫のクチクラおよび甲殻類の殻
に見られる複合炭水化物であるキチンを消化する酵素を
活発に分泌している。キチナーゼは、菌類、線虫類、お
よび昆虫などの有害生物に対抗する殺虫剤としてなどの
多用な応用面での使用が提案されてきた。ファックス（
Ｆｕｃｈｓ）’。
位の重合体からなり、昆虫のクチクラおよび甲殻類の殻
に見られる複合炭水化物であるキチンを消化する酵素を
活発に分泌している。キチナーゼは、菌類、線虫類、お
よび昆虫などの有害生物に対抗する殺虫剤としてなどの
多用な応用面での使用が提案されてきた。ファックス（
Ｆｕｃｈｓ）’。
Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎ、 Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ、 ５１ （３） ：５０４−５０９ （１
９８Ｂ）は、昆虫類、菌類および線虫類の有害生物を抑
制するために、その構成成分であるキチンの酵素的消化
あるいは変性を提案している。
ｏｂｉｏｌ、 ５１ （３） ：５０４−５０９ （１
９８Ｂ）は、昆虫類、菌類および線虫類の有害生物を抑
制するために、その構成成分であるキチンの酵素的消化
あるいは変性を提案している。
蛍光シュートモナト（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ）など
の適当な根面あるいは葉面に集落形成する細菌の感染部
位にキチナーゼを産生させ、放出させることを彼らは提
出している。キチナーゼはまた、甲殻類の殻などの産業
不用物の加工に用いることができる。
の適当な根面あるいは葉面に集落形成する細菌の感染部
位にキチナーゼを産生させ、放出させることを彼らは提
出している。キチナーゼはまた、甲殻類の殻などの産業
不用物の加工に用いることができる。
セラチア−７ルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃ
ｅｓｃｅｎｓ）のキチナーゼ遺伝子はクローニングされ
ている。
ｅｓｃｅｎｓ）のキチナーゼ遺伝子はクローニングされ
ている。
例えば、前出のファックスらは、Ｓ、マルセセンスが分
子量２１．３６．４８．５２．および５７キロダルトン
のサブユニットを有する、五つのキチン分解タンパク質
を産生ずることを報告している。これらのタンパク質の
一つ（５７キロダルトンタンパク質）を産生ずる遺伝子
は、クローニングされ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｔ）およびシュードモナス争フルオレセンス
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）
内で発現された。サスロウ（Ｓｕｓｌｏｖ）とジョーン
ズ（Ｊｏｎｅｓ）のＥＰ ０１５７３５１は、Ｓ、マル
セセンスからのふたつの独立なキチナーゼ遺伝子のクロ
ーニングを開示している。ジャウォスキ−（Ｊａｗｏｒ
ｓｋｌ）らは、ＥＰ ０１７１３８１で、Ｓ、マルセセ
ンス由来のキチナーゼ遺伝子のクローニングおよび、大
豆への線虫感染を防ぐためにＰ、フルオレセンス中で強
い構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）プロモーターか
ら同遺伝子を発現させることを示している。
子量２１．３６．４８．５２．および５７キロダルトン
のサブユニットを有する、五つのキチン分解タンパク質
を産生ずることを報告している。これらのタンパク質の
一つ（５７キロダルトンタンパク質）を産生ずる遺伝子
は、クローニングされ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｔ）およびシュードモナス争フルオレセンス
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）
内で発現された。サスロウ（Ｓｕｓｌｏｖ）とジョーン
ズ（Ｊｏｎｅｓ）のＥＰ ０１５７３５１は、Ｓ、マル
セセンスからのふたつの独立なキチナーゼ遺伝子のクロ
ーニングを開示している。ジャウォスキ−（Ｊａｗｏｒ
ｓｋｌ）らは、ＥＰ ０１７１３８１で、Ｓ、マルセセ
ンス由来のキチナーゼ遺伝子のクローニングおよび、大
豆への線虫感染を防ぐためにＰ、フルオレセンス中で強
い構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）プロモーターか
ら同遺伝子を発現させることを示している。
［発明の構成］
一般に、本発明はストレプトマイセス キチナーゼのシ
グナル配列および望みの成熟タンパク質からなるプレプ
ロティンをコードする、操作を加えたＤＮＡに関するも
のである；操作を加えたＤＮＡはまた、キチナーゼのシ
グナル配列をコードするＤＮＡの上流にその発現を制御
するための情報を含むことが望ましい。本明細書で用い
るように、“ストレプトマイセス細菌”あるいは“スト
レプトマイセス”という語は、ブキャナン（Ｂｕｃｈａ
ｎａｎ）他、Ｔｈｅ ５ｈｏｒｔｅｒ Ｂｅｒｇｅｙ’
ｓ ＭａｎｕａｌＦｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ （ウィリアムスφアンド
・ウィリアムス、 １９８２）で分類された、ストレプ
トマイセス属のあらゆる細菌株を含む。
グナル配列および望みの成熟タンパク質からなるプレプ
ロティンをコードする、操作を加えたＤＮＡに関するも
のである；操作を加えたＤＮＡはまた、キチナーゼのシ
グナル配列をコードするＤＮＡの上流にその発現を制御
するための情報を含むことが望ましい。本明細書で用い
るように、“ストレプトマイセス細菌”あるいは“スト
レプトマイセス”という語は、ブキャナン（Ｂｕｃｈａ
ｎａｎ）他、Ｔｈｅ ５ｈｏｒｔｅｒ Ｂｅｒｇｅｙ’
ｓ ＭａｎｕａｌＦｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ （ウィリアムスφアンド
・ウィリアムス、 １９８２）で分類された、ストレプ
トマイセス属のあらゆる細菌株を含む。
０シグナル配列”とは、細胞膜を介した輸送に影響する
、プレプロティン中のアミノ酸配列を意味する。シグナ
ル配列の切断により、プレプロティンから成熟タンパク
質が生じる。推奨されるシグナル配列は、ストレプトマ
イセスΦブリカッス キチナーゼのシグナル、例えば、
以下の９０ｂｐのＤＮＡ配列にコードされた配列である
（推測されるアミノ酸配列も示す）： ＡＴＧ ＣＧＴ ＡＴＣＡＧＡ ＣＡＣＭｅｔ
Ａｒｇ １１ｅ、Ａｒｇ ＨｉｓＡＡＡ ＧＣ
ＣＧＣＧ ＧＣＡ ＣＴＣＬｙｓ Ａｌａ Ａ
ｌａ Ａｌａ ＬｅｕＧＣＡ ＧＣＧ ＡＣＣ
ＣＴＧ ＧＣＧＡｌａ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｅ
ｕ ＡｌａＣＴＴ ＣＣＣＣＴＣＧＣＣＧＧＣ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｌａ ＧｌｙＣＴ
Ｇ ＧＴＣＧＧＣＣＴＣＧｅＧ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｅｕ ＡｌａＡＧ
ＣＣＣＧ ＧＣＣＣＡＧ ＧＣＧＳｅｒ Ｐｒｏ
Ａｌａ Ｇｉｎ Ａｌａ。
、プレプロティン中のアミノ酸配列を意味する。シグナ
ル配列の切断により、プレプロティンから成熟タンパク
質が生じる。推奨されるシグナル配列は、ストレプトマ
イセスΦブリカッス キチナーゼのシグナル、例えば、
以下の９０ｂｐのＤＮＡ配列にコードされた配列である
（推測されるアミノ酸配列も示す）： ＡＴＧ ＣＧＴ ＡＴＣＡＧＡ ＣＡＣＭｅｔ
Ａｒｇ １１ｅ、Ａｒｇ ＨｉｓＡＡＡ ＧＣ
ＣＧＣＧ ＧＣＡ ＣＴＣＬｙｓ Ａｌａ Ａ
ｌａ Ａｌａ ＬｅｕＧＣＡ ＧＣＧ ＡＣＣ
ＣＴＧ ＧＣＧＡｌａ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｅ
ｕ ＡｌａＣＴＴ ＣＣＣＣＴＣＧＣＣＧＧＣ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｌａ ＧｌｙＣＴ
Ｇ ＧＴＣＧＧＣＣＴＣＧｅＧ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｅｕ ＡｌａＡＧ
ＣＣＣＧ ＧＣＣＣＡＧ ＧＣＧＳｅｒ Ｐｒｏ
Ａｌａ Ｇｉｎ Ａｌａ。
このシグナルは、リポソーム結合部位、シグナルをコー
ドするＤＮＡの転写に効果的な向きおよび位置であるプ
ロモーター、および、キチンの存在に反応して転写を誘
導するための、配列中に含まれる適当な調節ＤＮＡの下
流に位置する（第１ｂ図参照）。適切なプロモーターは
（例えば、ストレプトマイセス・フラジエ ａｐｈプロ
モーターあるいは天然に存在するキチナーゼプロモータ
ー）は、操作されたＤＮＡ中で、プレプロティンをコー
ドするＤＮＡの転写を開始するような位置および向きに
置かれている。
ドするＤＮＡの転写に効果的な向きおよび位置であるプ
ロモーター、および、キチンの存在に反応して転写を誘
導するための、配列中に含まれる適当な調節ＤＮＡの下
流に位置する（第１ｂ図参照）。適切なプロモーターは
（例えば、ストレプトマイセス・フラジエ ａｐｈプロ
モーターあるいは天然に存在するキチナーゼプロモータ
ー）は、操作されたＤＮＡ中で、プレプロティンをコー
ドするＤＮＡの転写を開始するような位置および向きに
置かれている。
適当な成熟タンパク質は一般にその産生が、細胞外培地
への分泌により単純化あるいは改善されている。多数の
このようなタンパク質をコードする遺伝子がクローニン
グされており（例えば、成長ホルモン、リンホカイン、
ワクチンのための抗［、ｔＰＡ）、ストレプトマイセス
キチナーゼシグナルは、成熟タンパク質の性質に関わり
なく、一般的に分泌および切断に効果を及ぼすと予想さ
れる。成熟タンパク質を産生ずるためには、ＤＮＡ （
プロモーター、キチナーゼ調節ＤＮＡ。
への分泌により単純化あるいは改善されている。多数の
このようなタンパク質をコードする遺伝子がクローニン
グされており（例えば、成長ホルモン、リンホカイン、
ワクチンのための抗［、ｔＰＡ）、ストレプトマイセス
キチナーゼシグナルは、成熟タンパク質の性質に関わり
なく、一般的に分泌および切断に効果を及ぼすと予想さ
れる。成熟タンパク質を産生ずるためには、ＤＮＡ （
プロモーター、キチナーゼ調節ＤＮＡ。
およびシグナル配列−成熟タンパク質をコードするＤＮ
Ａを含む）を宿主細菌（例えば、ストレプトマイセス属
の細菌）中に導入し、該細菌を培地中で培養し、成熟タ
ンパク質を該培地中から回収する。キチンなどのある種
の複合炭水化物は、操作を加えたＤＮＡ配列の発現の誘
導に使用され得る。
Ａを含む）を宿主細菌（例えば、ストレプトマイセス属
の細菌）中に導入し、該細菌を培地中で培養し、成熟タ
ンパク質を該培地中から回収する。キチンなどのある種
の複合炭水化物は、操作を加えたＤＮＡ配列の発現の誘
導に使用され得る。
別の局面では、望みの成熟タンパク質は、ストレプトマ
イセスキチナーゼ、例えば、ｓ、ブリカラス エンドキ
チナーゼであり、この場合には、本発明は成熟ストレプ
トマイセスキチナーゼに関するものである（キチナーゼ
シグナルをコードするＤＮＡは含んでいてもいなくても
よい）。本発明のこの局面は、操作を加えたＤＮＡを宿
主生物（例えば、バチルス、シュードモナス、ストレプ
トマイセス、あるいはりゾビウム属の細菌）に導入し、
該宿主を害虫成分（例えば、保護されるべき穀物植物の
根城）に投与する事により、キチナーゼ感受性の害虫の
繁殖を抑える方法として使用することができる。あるい
は、植物の害虫のために、操作を加えたＤＮＡを直接植
物細胞に形質転換することも可能である。
イセスキチナーゼ、例えば、ｓ、ブリカラス エンドキ
チナーゼであり、この場合には、本発明は成熟ストレプ
トマイセスキチナーゼに関するものである（キチナーゼ
シグナルをコードするＤＮＡは含んでいてもいなくても
よい）。本発明のこの局面は、操作を加えたＤＮＡを宿
主生物（例えば、バチルス、シュードモナス、ストレプ
トマイセス、あるいはりゾビウム属の細菌）に導入し、
該宿主を害虫成分（例えば、保護されるべき穀物植物の
根城）に投与する事により、キチナーゼ感受性の害虫の
繁殖を抑える方法として使用することができる。あるい
は、植物の害虫のために、操作を加えたＤＮＡを直接植
物細胞に形質転換することも可能である。
本発明の他の特徴および利点は、特許請求の範囲あるい
は、以下の本発明の推奨される態様の説明から明らかに
なるであろう。
は、以下の本発明の推奨される態様の説明から明らかに
なるであろう。
［推奨される態様の説明コ
上で概説した本発明の特徴は、以下で詳述する特異的な
実例によって具体化される：Ａ）Ｓ、ブリカラス エン
ドキチナーゼ遺伝子の大腸菌に於けるクローニングおよ
び発現；Ｂ）該遺伝子のＳ、リビダンスでの発現；Ｃ）
キチナーゼの産生；Ｄ）クローニングしたキチナーゼの
性質；Ｅ）キチナーゼ遺伝子の操作；Ｆ）他のストレプ
トマイセス キチナーゼの単離；Ｇ）異種の成熟タンパ
ク質の分泌のためのベクター作成；および、ＩＩ）害虫
の抑制。
実例によって具体化される：Ａ）Ｓ、ブリカラス エン
ドキチナーゼ遺伝子の大腸菌に於けるクローニングおよ
び発現；Ｂ）該遺伝子のＳ、リビダンスでの発現；Ｃ）
キチナーゼの産生；Ｄ）クローニングしたキチナーゼの
性質；Ｅ）キチナーゼ遺伝子の操作；Ｆ）他のストレプ
トマイセス キチナーゼの単離；Ｇ）異種の成熟タンパ
ク質の分泌のためのベクター作成；および、ＩＩ）害虫
の抑制。
Ａ、キチナーゼ遺伝子の大腸菌に於けるクローニングお
よび発現 バクテリオファージ ラムダクローニングベクターＥＭ
ＢＬ４ （プロメガΦバイオチク社から購入）をＳ、ブ
リカラス由来ＤＮＡライブラリーの作成に用いた。ベク
ターの制限酵素による切断およびＤＮＡのファージのア
ームとの連結反応には、推奨されるプロメガの方法を用
いた。Ｓ、ブリカラスＤＮＡを５ａｕ３Ａで切断し、蔗
糖密度勾配でサイズを選択し、ｌＯ〜２０ｋｂ画分を仔
牛腸アルカリホスファターゼで処理し、続いてＢａ■Ｈ
ＩおよびＥｃｏＲＩで切断したファージと連結させた。
よび発現 バクテリオファージ ラムダクローニングベクターＥＭ
ＢＬ４ （プロメガΦバイオチク社から購入）をＳ、ブ
リカラス由来ＤＮＡライブラリーの作成に用いた。ベク
ターの制限酵素による切断およびＤＮＡのファージのア
ームとの連結反応には、推奨されるプロメガの方法を用
いた。Ｓ、ブリカラスＤＮＡを５ａｕ３Ａで切断し、蔗
糖密度勾配でサイズを選択し、ｌＯ〜２０ｋｂ画分を仔
牛腸アルカリホスファターゼで処理し、続いてＢａ■Ｈ
ＩおよびＥｃｏＲＩで切断したファージと連結させた。
１ｐｇのファージアームとＯ，Ｂ、ｕｇのＳ、ブリカラ
スＤＮＡとの連結反応により、それに続くパッケージン
グおよび大腸菌Ｎ Ｍ ５３８への感染で全収量およそ
６ Ｘ １０６の組換えプラークが得られた。プラーク
は精製し、ファージＤＮＡを標準的方法により単離した
。
スＤＮＡとの連結反応により、それに続くパッケージン
グおよび大腸菌Ｎ Ｍ ５３８への感染で全収量およそ
６ Ｘ １０６の組換えプラークが得られた。プラーク
は精製し、ファージＤＮＡを標準的方法により単離した
。
Ｎ−アセチルグルコサミンオリゴサツカライドの４−メ
チルウムベリフエリルグリコシド（シグマ社、セントル
イスから入手）を大腸菌に於けるストレプトマイセスキ
チナーゼの発現の検出の基質として用いた（以下の、ク
ローニングしたキチナーゼの性質、参照）。キチナーゼ
活性のスクリーニングのために、−次ＥＭＢＬ４ライブ
ラリーを、ソフトアガー上層（１２，５μｇ／ｍｌのト
リサツカライド、あるいは、２５ｍ／ｍｌのジサッカラ
イド）中の４−メチルウムベリフエリル基質とともに、
１５０龍ＬＢプレート上に撒き、プラークが形成され始
めたら直ちに長波長紫外光のもとで観察した。シグナル
は非常に弱いものであったが、キチナーゼを示す微かな
蛍光ハローが５×１０５から１０８のプラークのうち、
６個の周りに見られた。
チルウムベリフエリルグリコシド（シグマ社、セントル
イスから入手）を大腸菌に於けるストレプトマイセスキ
チナーゼの発現の検出の基質として用いた（以下の、ク
ローニングしたキチナーゼの性質、参照）。キチナーゼ
活性のスクリーニングのために、−次ＥＭＢＬ４ライブ
ラリーを、ソフトアガー上層（１２，５μｇ／ｍｌのト
リサツカライド、あるいは、２５ｍ／ｍｌのジサッカラ
イド）中の４−メチルウムベリフエリル基質とともに、
１５０龍ＬＢプレート上に撒き、プラークが形成され始
めたら直ちに長波長紫外光のもとで観察した。シグナル
は非常に弱いものであったが、キチナーゼを示す微かな
蛍光ハローが５×１０５から１０８のプラークのうち、
６個の周りに見られた。
最も強く陽性を示したプラークは、３０℃で一晩インキ
ユベートした後に観察された。
ユベートした後に観察された。
いくつかの陽性クローンは、ジサッカライド基質で、別
のものは、トリサツカライド誘導体で検出された。挿入
ＤＮＡの制限酵素地図により、同一の酵素が全ての場合
に発現されていることが示唆された。６個全ての挿入部
分は、一方の末端で完全に記録された。サブクローニン
グにより、問題の遺伝子の５′末端はベクターＤＮＡの
通常の接合部位（Ｓａｕ３Ａ部位）の近傍に位置するこ
とが確認された。ラムダ挿入物の一方の末端の、ｐＢＲ
３２２のＥｃｏＲＩ部位への連結反応は、低いながらも
検出可能な酵素水準を与えた（第２図）。
のものは、トリサツカライド誘導体で検出された。挿入
ＤＮＡの制限酵素地図により、同一の酵素が全ての場合
に発現されていることが示唆された。６個全ての挿入部
分は、一方の末端で完全に記録された。サブクローニン
グにより、問題の遺伝子の５′末端はベクターＤＮＡの
通常の接合部位（Ｓａｕ３Ａ部位）の近傍に位置するこ
とが確認された。ラムダ挿入物の一方の末端の、ｐＢＲ
３２２のＥｃｏＲＩ部位への連結反応は、低いながらも
検出可能な酵素水準を与えた（第２図）。
Ｂａ１−３１切除およびそれに続（ｐＵｃ１８への第二
のサブクローニングは以下の結果を与えた。ラムダＤＮ
Ａが完全には除かれていないプラスミドは、通常の水準
の酵素発現を示した。挿入部分に１５０〜２００ｂｐの
切除があるプラスミドは、ある場合には、より高い水準
の発現を与えた。挿入部分に２００ｂｐ以上の切除があ
るプラスミドでは、完全な不活化が見られた。
のサブクローニングは以下の結果を与えた。ラムダＤＮ
Ａが完全には除かれていないプラスミドは、通常の水準
の酵素発現を示した。挿入部分に１５０〜２００ｂｐの
切除があるプラスミドは、ある場合には、より高い水準
の発現を与えた。挿入部分に２００ｂｐ以上の切除があ
るプラスミドでは、完全な不活化が見られた。
これらの結果は、通常は大腸菌内での発現はあまり効果
的ではないが、高水準の発現はキチナーゼ遺伝子とｐＵ
Ｃベクターの短いβ−ガラクトシダーゼ配列との融合の
結果であることを示唆している。これらの発現プラスミ
ドのひとつであるｐｃＴＦｌを詳しい解析のために選択
した。
的ではないが、高水準の発現はキチナーゼ遺伝子とｐＵ
Ｃベクターの短いβ−ガラクトシダーゼ配列との融合の
結果であることを示唆している。これらの発現プラスミ
ドのひとつであるｐｃＴＦｌを詳しい解析のために選択
した。
第１ａ図はｐｃＴＦｌにおける、ｐＵｃｌｇと切除した
キチナーゼ遺伝子の接合領域のＤＮＡ配列を示している
。該配列は明らかに、ＤＮＡ残基７〜９が、この場合は
ｐＵＣβ−ガラクトシダーゼ配列と同じ読み枠で融合し
ているキチナーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドンをコードし
ていることを示している。キチナーゼ遺伝子のはじめの
３０アミノ酸はダラム陽性菌の分泌性タンパク質に見ら
れる典型的なシグナル配列である。プラスミドｐｃＴＦ
１を有する大腸菌の細胞周辺腔抽出物から精製したキチ
ナーゼタンパク質のアミノ末端アミノ酸分析により、タ
ンパク質残基３１から開始されると推測されたものと正
確に対応する１５アミノ酸の配列が示された。この結果
はアミノ酸３０と３１のふたつのアラニン残基の間で該
タンパク質を正確に切断することを示している。
キチナーゼ遺伝子の接合領域のＤＮＡ配列を示している
。該配列は明らかに、ＤＮＡ残基７〜９が、この場合は
ｐＵＣβ−ガラクトシダーゼ配列と同じ読み枠で融合し
ているキチナーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドンをコードし
ていることを示している。キチナーゼ遺伝子のはじめの
３０アミノ酸はダラム陽性菌の分泌性タンパク質に見ら
れる典型的なシグナル配列である。プラスミドｐｃＴＦ
１を有する大腸菌の細胞周辺腔抽出物から精製したキチ
ナーゼタンパク質のアミノ末端アミノ酸分析により、タ
ンパク質残基３１から開始されると推測されたものと正
確に対応する１５アミノ酸の配列が示された。この結果
はアミノ酸３０と３１のふたつのアラニン残基の間で該
タンパク質を正確に切断することを示している。
Ｂ、キチナーゼ遺伝子のＳ、リビダンスにおける発現
ｐｃＴＦｌ中のキチナーゼ遺伝子はＡＴＧ開始コドンか
ら上流に６ｂｐＬか含まないため、我々はストレプトマ
イセスでの発現のために、別の上述のＢ ａ１３１切除
発現プラスミド、ｐＣＴ４を選択した。この構造は、リ
ポソーム結合部位および少なくともいくつかの上流調節
配列をコードするのに十分な１５０ｂｐの上流ＤＮＡを
含んでいる。低コピー数ベクター（ｐｌＪ６１、〜ｌＯ
ｌピコピー胞）および、高コピー数ベクター（ｐｓＥＨ
，ｐｌＪ７０２の誘導体、〜１００−３００コピー／細
胞）をＳ、リビダンスでのキチナーゼ遺伝子発現のため
に選択した。ｐｌＪ６１およびｐ Ｉ Ｊ ７０２は、
ストレプトマイセスベクターとして広く知られている。
ら上流に６ｂｐＬか含まないため、我々はストレプトマ
イセスでの発現のために、別の上述のＢ ａ１３１切除
発現プラスミド、ｐＣＴ４を選択した。この構造は、リ
ポソーム結合部位および少なくともいくつかの上流調節
配列をコードするのに十分な１５０ｂｐの上流ＤＮＡを
含んでいる。低コピー数ベクター（ｐｌＪ６１、〜ｌＯ
ｌピコピー胞）および、高コピー数ベクター（ｐｓＥＨ
，ｐｌＪ７０２の誘導体、〜１００−３００コピー／細
胞）をＳ、リビダンスでのキチナーゼ遺伝子発現のため
に選択した。ｐｌＪ６１およびｐ Ｉ Ｊ ７０２は、
ストレプトマイセスベクターとして広く知られている。
（トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）他、 Ｇｅｎｅ ２
０ ： ５ｌ−６２（１９８２）およびホブウッド（Ｉ
ｌｏｐｖｏｏｄ）、 Ｊ、 Ｇｅｎ。
０ ： ５ｌ−６２（１９８２）およびホブウッド（Ｉ
ｌｏｐｖｏｏｄ）、 Ｊ、 Ｇｅｎ。
Ｍｉｃｒｏ、 １２９ ： ２７０３−２７１４ （１
９８３） 、 ）低コピー数の構造として、ｐｃＴＦ１
由来直下にクローニングした。このプラスミドをｐＯＷ
３と呼ぶ（第３図）。
９８３） 、 ）低コピー数の構造として、ｐｃＴＦ１
由来直下にクローニングした。このプラスミドをｐＯＷ
３と呼ぶ（第３図）。
高コピーベクターｐＳＥＨへのクローニングには、二種
類の方法を選んだ。この二つのクローニング法は、キチ
ナーゼ遺伝子のｐＳＥＨへの二つの異なる方向での挿入
を可能にした。第一の方法では、キチナーゼ遺伝子を含
むｐＣＴ４山来Ｂ由来ＨＩからＳ ａｃ Ｉ断片を、Ｂ
ｇｌＩＩ／５ａｃＩで切断したｐＳＥＨの骨組みに連結
させ、ｐｏｌｌを作成した。第二の方法では、キチナー
ゼ遺伝子を含むｐＣＴ４由来のＢａｍＨＩからＡｓｐ７
１８断片を骨組みｐｓＥＨのＢａ１ｌＩおよびＡｓｐ７
１８部位に連結させ、ｐＯＷ２を作成した（第３図）。
類の方法を選んだ。この二つのクローニング法は、キチ
ナーゼ遺伝子のｐＳＥＨへの二つの異なる方向での挿入
を可能にした。第一の方法では、キチナーゼ遺伝子を含
むｐＣＴ４山来Ｂ由来ＨＩからＳ ａｃ Ｉ断片を、Ｂ
ｇｌＩＩ／５ａｃＩで切断したｐＳＥＨの骨組みに連結
させ、ｐｏｌｌを作成した。第二の方法では、キチナー
ゼ遺伝子を含むｐＣＴ４由来のＢａｍＨＩからＡｓｐ７
１８断片を骨組みｐｓＥＨのＢａ１ｌＩおよびＡｓｐ７
１８部位に連結させ、ｐＯＷ２を作成した（第３図）。
ネス拳ファウンデーション（１９８５）で述べられてい
るように、高コピー（ｐＯＷｌ、ｐＯＷ２）および低コ
ピー（ｐＯＷ３）ベクター上の３個の異なるープラスミ
ド構造をＳ、リビダンスのプロトプラストに形質転換し
たところ、三種全てのプラスミド構造がキチナーゼ発現
誘導能を有することが、形質転換体の一次スクリーニン
グで示された。低コピーベクター、ｐＯＷ３上のキチナ
ーゼ遺伝子の発現により、高コピーベクターｐＯＷ１お
よびｐＯＷ２上のキチナーゼ遺伝子を有するクローンの
周辺が明らかに小さな透明化であるのに対し、これらの
クローンのまわりの寒天からキチンが大きく透明化して
いることに裏付けられるように、はとんどの酵素が産生
されていることが明らかになった。
るように、高コピー（ｐＯＷｌ、ｐＯＷ２）および低コ
ピー（ｐＯＷ３）ベクター上の３個の異なるープラスミ
ド構造をＳ、リビダンスのプロトプラストに形質転換し
たところ、三種全てのプラスミド構造がキチナーゼ発現
誘導能を有することが、形質転換体の一次スクリーニン
グで示された。低コピーベクター、ｐＯＷ３上のキチナ
ーゼ遺伝子の発現により、高コピーベクターｐＯＷ１お
よびｐＯＷ２上のキチナーゼ遺伝子を有するクローンの
周辺が明らかに小さな透明化であるのに対し、これらの
クローンのまわりの寒天からキチンが大きく透明化して
いることに裏付けられるように、はとんどの酵素が産生
されていることが明らかになった。
この結果を定量するために、これらの株による液体培地
中へのキチナーゼ産生を実験した。振とうフラスコ発酵
を最小培地（炭素源および窒素源としてグルコースおよ
び〔ＮＨ４〕２５０４）、最小誘導培地（炭素および窒
素源としてキチン）、および栄養培地（グルコース、マ
ルトース、ペプトン、および酵母抽出物を含む）中で行
なった。
中へのキチナーゼ産生を実験した。振とうフラスコ発酵
を最小培地（炭素源および窒素源としてグルコースおよ
び〔ＮＨ４〕２５０４）、最小誘導培地（炭素および窒
素源としてキチン）、および栄養培地（グルコース、マ
ルトース、ペプトン、および酵母抽出物を含む）中で行
なった。
液体培地中発酵は、２，４．６日目に液体培地から回収
し、培養液上清を、蛍光アッセイによるキチナーゼの存
在を調べた。
し、培養液上清を、蛍光アッセイによるキチナーゼの存
在を調べた。
ｐＯＷ３を含むストレプトマイセスの液体発酵が最もキ
チナーゼを産生した。二種類の異なる向きで高コピーベ
クター上にクローニングしたキチナーゼ遺伝子（ｐＯＷ
ｌおよびｐＯＷ２）は、ｐＯＷ３よりも少ないキチナー
ゼしか産生じなかった。低コピーベクターおよび高コピ
ーベクターの双方のキチナーゼ遺伝子のために、キチン
を最小培地に加えることによるキチナーゼ産生の強力な
誘導を行なった。これらの結果はクローニングされた断
片内にキチナーゼ誘導に必要な調節領域が存在すること
を示している。第１ｂ図に示すように、調節領域はｐＣ
Ｔ４にクローニングされたキチナーゼ遺伝子のシグナル
配列の開始コドンの上流および１５０ｂｐのヌクレオチ
ド配列内に存在する。発酵により、誘導によってクロー
ニングされたキチナーゼ酵素の高産生を行なう誘導性キ
チナーゼ遺伝子の存在が示された。５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル分析およびタンパク質決定は、キチナーゼ
酵素がｐＯＷ３でのストレプトマイセス発酵において培
地中の全蛋白の８０〜９０％を構成していることを示唆
した。
チナーゼを産生した。二種類の異なる向きで高コピーベ
クター上にクローニングしたキチナーゼ遺伝子（ｐＯＷ
ｌおよびｐＯＷ２）は、ｐＯＷ３よりも少ないキチナー
ゼしか産生じなかった。低コピーベクターおよび高コピ
ーベクターの双方のキチナーゼ遺伝子のために、キチン
を最小培地に加えることによるキチナーゼ産生の強力な
誘導を行なった。これらの結果はクローニングされた断
片内にキチナーゼ誘導に必要な調節領域が存在すること
を示している。第１ｂ図に示すように、調節領域はｐＣ
Ｔ４にクローニングされたキチナーゼ遺伝子のシグナル
配列の開始コドンの上流および１５０ｂｐのヌクレオチ
ド配列内に存在する。発酵により、誘導によってクロー
ニングされたキチナーゼ酵素の高産生を行なう誘導性キ
チナーゼ遺伝子の存在が示された。５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル分析およびタンパク質決定は、キチナーゼ
酵素がｐＯＷ３でのストレプトマイセス発酵において培
地中の全蛋白の８０〜９０％を構成していることを示唆
した。
Ｃ，キチナーゼ産生
キチナーゼを産生ずるために、適当なプラスミドを有す
る適当な宿主、例えば、Ｓ、リビダンス株を適当な培地
で３０℃で通気しながら培養した。
る適当な宿主、例えば、Ｓ、リビダンス株を適当な培地
で３０℃で通気しながら培養した。
上述のプラスミドが適切である。他のプラスミド、例え
ば、キチナーゼ産生を促進するためにベクター内の適当
な向きおよび位置に強力なプロモーター（例えば、ａｐ
ｈ）を持つものも使用可能である。例えば、１リツトル
あたり以下の成分を含む最小誘導培地を使用できる：
０．５ｇＫ Ｃ，Ｑ 。
ば、キチナーゼ産生を促進するためにベクター内の適当
な向きおよび位置に強力なプロモーター（例えば、ａｐ
ｈ）を持つものも使用可能である。例えば、１リツトル
あたり以下の成分を含む最小誘導培地を使用できる：
０．５ｇＫ Ｃ，Ｑ 。
０．２５ｇＫ ＨＰＯ４，０，５ｇＭｇＳＯ４： ７
Ｈ２０゜０．０１ｇ Ｆ ｅ Ｓ Ｏ４，１０ｇキチン
、およびトリス緩衝液５０ａ＋Ｍ、 ｐＨ７，６゜ 適当な栄養ブロス培地は１リツトルあたり以下の成分を
含むＹＥＭＥブロスである＝３ｇディフコ酵母抽出物、
５ｇディフコ ペプトン、３ｇオキソイド・マルト抽出
物、１０ｇグルコース、 ３４０ｇスクロース、および
５■Ｍ Ｍ ｇ Ｃ（１２゜望みのタンパク質は翻訳
され相当量分泌され、細胞外増殖培地から効果的な回収
および精製を可能にする。培地試料は様々な時点で採り
、遠心し、上清画分を産物のアッセイに用いた。例えば
、キチナーゼは以下のＤの部分で述べるように蛍光測定
アッセイによって定量化される。アルカリホスファター
ゼはブリックマン（Ｂｒｉｃｋ■ａｎ）およびベックウ
ィズ（Ｂｅｃｈｗｉｔｈ）、 （１９７５） Ｊ、 Ｍ
ｏｌ。
Ｈ２０゜０．０１ｇ Ｆ ｅ Ｓ Ｏ４，１０ｇキチン
、およびトリス緩衝液５０ａ＋Ｍ、 ｐＨ７，６゜ 適当な栄養ブロス培地は１リツトルあたり以下の成分を
含むＹＥＭＥブロスである＝３ｇディフコ酵母抽出物、
５ｇディフコ ペプトン、３ｇオキソイド・マルト抽出
物、１０ｇグルコース、 ３４０ｇスクロース、および
５■Ｍ Ｍ ｇ Ｃ（１２゜望みのタンパク質は翻訳
され相当量分泌され、細胞外増殖培地から効果的な回収
および精製を可能にする。培地試料は様々な時点で採り
、遠心し、上清画分を産物のアッセイに用いた。例えば
、キチナーゼは以下のＤの部分で述べるように蛍光測定
アッセイによって定量化される。アルカリホスファター
ゼはブリックマン（Ｂｒｉｃｋ■ａｎ）およびベックウ
ィズ（Ｂｅｃｈｗｉｔｈ）、 （１９７５） Ｊ、 Ｍ
ｏｌ。
Ｂｉｏｌ、 ９８ ： １−１０に述べられているよう
に黄色産生によってアッセイ可能である。
に黄色産生によってアッセイ可能である。
キチナーゼを８０〜９０％含む粗調製液は、濃縮、ろ過
、凍結乾燥によって調製される。例えば、ヒドロキシア
パタイト、ゲルろ過などの標準的なカラムクロマトグラ
フィー技術が、酵素の精製に用いられる。
、凍結乾燥によって調製される。例えば、ヒドロキシア
パタイト、ゲルろ過などの標準的なカラムクロマトグラ
フィー技術が、酵素の精製に用いられる。
Ｄ、クローニングされたキチナーゼの性質本明細書で述
べるキチナーゼ、キチナーゼ−５６は、Ｓ、ブリカラス
キチナーゼ複合体の酵素の一つである。キチナーゼ−
５６は、４−ウムベリフエリルオリゴサッカライドを切
断することによりエンドキチナーゼに分類される。
べるキチナーゼ、キチナーゼ−５６は、Ｓ、ブリカラス
キチナーゼ複合体の酵素の一つである。キチナーゼ−
５６は、４−ウムベリフエリルオリゴサッカライドを切
断することによりエンドキチナーゼに分類される。
より詳細には、酵素は通常、必要ならば溶液Ａで希釈し
た、２〜２５ＪＪｇの酵素試料を２ｍｌの溶液Ａ中の４
−メチルウンベリフェリルトリサツカライドあるいはジ
サッカライド（１０７Ｍ）に加えることによりアッセイ
した。蛍光発生の程度をベルキン−エルマー モデル６
５０−１５スペクトロフルオロメーターで直接測定した
（３５０ｎｍ励起、４４０ｎｍ放射）。この条件は酵素
反応速度あるいは蛍光の検出に最適ではないが、直接的
な速度測定に固有な正確さのために便宜上用いられた。
た、２〜２５ＪＪｇの酵素試料を２ｍｌの溶液Ａ中の４
−メチルウンベリフェリルトリサツカライドあるいはジ
サッカライド（１０７Ｍ）に加えることによりアッセイ
した。蛍光発生の程度をベルキン−エルマー モデル６
５０−１５スペクトロフルオロメーターで直接測定した
（３５０ｎｍ励起、４４０ｎｍ放射）。この条件は酵素
反応速度あるいは蛍光の検出に最適ではないが、直接的
な速度測定に固有な正確さのために便宜上用いられた。
最適ｐｔ＋測定あるいは他の目的のために、最終体積１
００）Ａｌでインキュベーションを行い、蛍光測定の前
に０．１ＭグリシンｐＨ１０，４で最終体積２ｍｌに希
釈することにより冷却した。溶液Ａの４−メチルウムベ
リフェロンの蛍光は、Ｏ，１Ｍグリシンｐ１１１０．４
の３８％である。キチナーゼ５６産物はジサッカライド
誘導体よりも、トリサツカライドからより迅速に４−メ
チルウムベリフェロンを産生ずる。この酵素は、４−メ
チルウムベリフエロントリサッカライドおよびテトラサ
ツカライドの双方から、４−メチルウムベリフエロンモ
ノサツカライド（非蛍光産物）よりも４−メチルウムベ
リフエロンを多く形成し、従ってエンドキチナーゼとし
て分類される。
００）Ａｌでインキュベーションを行い、蛍光測定の前
に０．１ＭグリシンｐＨ１０，４で最終体積２ｍｌに希
釈することにより冷却した。溶液Ａの４−メチルウムベ
リフェロンの蛍光は、Ｏ，１Ｍグリシンｐ１１１０．４
の３８％である。キチナーゼ５６産物はジサッカライド
誘導体よりも、トリサツカライドからより迅速に４−メ
チルウムベリフェロンを産生ずる。この酵素は、４−メ
チルウムベリフエロントリサッカライドおよびテトラサ
ツカライドの双方から、４−メチルウムベリフエロンモ
ノサツカライド（非蛍光産物）よりも４−メチルウムベ
リフエロンを多く形成し、従ってエンドキチナーゼとし
て分類される。
予備的な実験から、キチナーゼは放射性活性キチンをｐ
Ｈ６で最も速く加水分解し、ｐＨ４，５および７．５で
この反応の最大速度のおよそ２分の１であることが示さ
れている。
Ｈ６で最も速く加水分解し、ｐＨ４，５および７．５で
この反応の最大速度のおよそ２分の１であることが示さ
れている。
予備的な実験からまた、キチナーゼは非常に安定な酵素
であることが示されている。以下の処置で酵素活性が失
われないことが見いだされた：凍結および融解、４℃で
６日間保存、６５℃で加熱、凍結乾燥および再構成。
であることが示されている。以下の処置で酵素活性が失
われないことが見いだされた：凍結および融解、４℃で
６日間保存、６５℃で加熱、凍結乾燥および再構成。
Ｅ、キチナーゼ遺伝子の操作
シグナル配列とキチナーゼ構造遺伝子の間に唯一の制限
酵素部位（ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩ）を含むようにす
るため、プラスミドをオリゴ−ブイレフテッド ミュー
タジエネシスによって作成した（第６図参照）。これら
の部位は異種のプロモーターおよびシグナル配列のスト
レプトマイセスキチナーゼ構造遺伝子との融合に有用で
ある。このような構造により、既知の技術を用いて適当
なプロモーターおよびシグナル配列の挿入により、他の
細菌系（例えば、バチルス、大腸菌、シュードモナスな
ど）における発現、翻訳および分泌が可能になるであろ
う。
酵素部位（ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩ）を含むようにす
るため、プラスミドをオリゴ−ブイレフテッド ミュー
タジエネシスによって作成した（第６図参照）。これら
の部位は異種のプロモーターおよびシグナル配列のスト
レプトマイセスキチナーゼ構造遺伝子との融合に有用で
ある。このような構造により、既知の技術を用いて適当
なプロモーターおよびシグナル配列の挿入により、他の
細菌系（例えば、バチルス、大腸菌、シュードモナスな
ど）における発現、翻訳および分泌が可能になるであろ
う。
Ｆ、他のストレプトマイセスキチナーゼの単離 １クロ
ーニングされたキチナーゼ−５６遺伝子は、ストレプト
マイセスキチナーゼ複合体を構成する他の酵素の単離の
道具として用いられる。標準的なりＮＡハイブリダイゼ
ーション技術により、クローニングしたキチナーゼ−５
６遺伝子由来のＤＮＡを上述のＳ、ブリカフスのライブ
ラリーのように、ストレプトマイセスＤＮＡライブラリ
ーから他の構造的に関連したキチナーゼ遺伝子を同定に
使用することができる。
ーニングされたキチナーゼ−５６遺伝子は、ストレプト
マイセスキチナーゼ複合体を構成する他の酵素の単離の
道具として用いられる。標準的なりＮＡハイブリダイゼ
ーション技術により、クローニングしたキチナーゼ−５
６遺伝子由来のＤＮＡを上述のＳ、ブリカフスのライブ
ラリーのように、ストレプトマイセスＤＮＡライブラリ
ーから他の構造的に関連したキチナーゼ遺伝子を同定に
使用することができる。
Ｇ、異種成熟タンパク質のための分泌ベクターの構成
キチナーゼは上述のベクターによって、非常に高水準で
発現し、分泌されるので、分泌ベクター内の調節シグナ
ル、第一の誘導シグナル、リポソーム結合部位、および
シグナル配列をストレプトマイセスでの一般的なタンパ
ク質分泌に使用することが可能である。第１図に示され
たように、遺伝子の最初の９０ｂｐにコードされる、タ
ンパク質配列の最初の３０アミノ酸は、典型的なグラム
陽性シグナルペプチドに相当する。ある宿主では異なる
部位で切断が起こることも可能だが、望ましい切断部位
は、ＡＩａ３０とＡｌａ３１の間であると考えられてい
る。
発現し、分泌されるので、分泌ベクター内の調節シグナ
ル、第一の誘導シグナル、リポソーム結合部位、および
シグナル配列をストレプトマイセスでの一般的なタンパ
ク質分泌に使用することが可能である。第１図に示され
たように、遺伝子の最初の９０ｂｐにコードされる、タ
ンパク質配列の最初の３０アミノ酸は、典型的なグラム
陽性シグナルペプチドに相当する。ある宿主では異なる
部位で切断が起こることも可能だが、望ましい切断部位
は、ＡＩａ３０とＡｌａ３１の間であると考えられてい
る。
新しい分泌ベクターの作成のための、クローニングされ
たキチナーゼ遺伝子、シグナル配列、および／または調
節領域の使用のために三つの異なる手法が採られ得る。
たキチナーゼ遺伝子、シグナル配列、および／または調
節領域の使用のために三つの異なる手法が採られ得る。
第一の手法では、細菌のアルカリホスファターゼ遺伝子
がキチナーゼ調節配列の制御下にあるように位置してい
るベクターが作成された。ベクターｐＰＲ５は、第４図
に示すように二段階の構成過程で作成した。最初の構成
過程では、ｐＣＴ４プラスミドをＢａｍＨＩおよびＳ
ａｃ Ｉで切断した。キチナーゼ遺伝子を含む断片をｐ
ＵＣｌ３のＢａ■ＩＩ ５ａｃＩ切断物に連結し、
プラスミドｐＣＢ５を生成した。ｐｈｏＡ断片はプラス
ミドｐＣＨ３９のＰｓｔＩ切断物に由来している（ホフ
マン（Ｈｏｆｆｍａｎ）およびライト（Ｗｒｉｇｈｔ）
、 ＰＮＡＳ５１０７−５１１１ （１９８５）参照
） ｏ ｐ ｈ ｏ Ａ Ｐ ｓｔ Ｉ断片をＰｓｔ
Ｉで切断したｐＵＣ８に連結させ、ｐＮＨ２１４を作成
した。構成の第二段階では、ｐＣＢ５をＥ ａｏ Ｉで
部分分解し、該断片をクレノーで平滑末端とし、該平滑
末端をＳｍａＩで切断したｐＮＨ２１４に連結させた。
がキチナーゼ調節配列の制御下にあるように位置してい
るベクターが作成された。ベクターｐＰＲ５は、第４図
に示すように二段階の構成過程で作成した。最初の構成
過程では、ｐＣＴ４プラスミドをＢａｍＨＩおよびＳ
ａｃ Ｉで切断した。キチナーゼ遺伝子を含む断片をｐ
ＵＣｌ３のＢａ■ＩＩ ５ａｃＩ切断物に連結し、
プラスミドｐＣＢ５を生成した。ｐｈｏＡ断片はプラス
ミドｐＣＨ３９のＰｓｔＩ切断物に由来している（ホフ
マン（Ｈｏｆｆｍａｎ）およびライト（Ｗｒｉｇｈｔ）
、 ＰＮＡＳ５１０７−５１１１ （１９８５）参照
） ｏ ｐ ｈ ｏ Ａ Ｐ ｓｔ Ｉ断片をＰｓｔ
Ｉで切断したｐＵＣ８に連結させ、ｐＮＨ２１４を作成
した。構成の第二段階では、ｐＣＢ５をＥ ａｏ Ｉで
部分分解し、該断片をクレノーで平滑末端とし、該平滑
末端をＳｍａＩで切断したｐＮＨ２１４に連結させた。
プラスミドｐＰＲ５は、ストレプトマイセスＤＮＡを２
５０ｂｐ含んでいる。
５０ｂｐ含んでいる。
ｐＰＲ５ベクターは、大腸菌内でのアルカリホスファタ
ーゼの発現および分泌を可能にする。
ーゼの発現および分泌を可能にする。
大腸菌アルカリホスファターゼのストレプトマイセス内
での発現および分泌のために、キチナーゼ−ｐｈｏＡ融
合物を有するｐＰＲ５の３．２ｋｂＨ１ｎｄＩ［［断片
をｐＳＥＨのＨｉｎｄ■部位に連結させた。融合物が第
５図に示される向きに挿入され部位に連結させることが
可能である。
での発現および分泌のために、キチナーゼ−ｐｈｏＡ融
合物を有するｐＰＲ５の３．２ｋｂＨ１ｎｄＩ［［断片
をｐＳＥＨのＨｉｎｄ■部位に連結させた。融合物が第
５図に示される向きに挿入され部位に連結させることが
可能である。
他の商業的に有用なタンパク質（例えば、成長ホルモン
、リンホカイン、ワクチン、ｔＰＡなど）のための他の
構造遺伝子を上述の大腸菌アルカリホスファターゼ遺伝
子の代わりに挿入することができる。
、リンホカイン、ワクチン、ｔＰＡなど）のための他の
構造遺伝子を上述の大腸菌アルカリホスファターゼ遺伝
子の代わりに挿入することができる。
分泌ベクターをデザインするための別の手法では、シグ
ナル配列とキチナーゼ構造遺伝子の間のクローニング部
位（ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩ）の挿入のためのオリゴ
−ブイレフテッド ミュータジエネシスを利用する（第
６図参照）。これらのクローニング部位は既知の技術に
より、キチナーゼ構造遺伝子の代わりに他の構造遺伝子
の挿入を可能にする。得られたベクターは、次に、適当
な宿主に形質転換する。続いて宿主を既知の適当な技術
によって培養し、産物を回収する。目的の新しいタンパ
ク質はキチナーゼシグナル配列を用いてストレプトマイ
セスによって翻訳され、分泌されるであろう。該タンパ
ク質の発現および分泌はまた、上流のキチナーゼＤＮＡ
１節配列によって制御されるであろう。
ナル配列とキチナーゼ構造遺伝子の間のクローニング部
位（ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩ）の挿入のためのオリゴ
−ブイレフテッド ミュータジエネシスを利用する（第
６図参照）。これらのクローニング部位は既知の技術に
より、キチナーゼ構造遺伝子の代わりに他の構造遺伝子
の挿入を可能にする。得られたベクターは、次に、適当
な宿主に形質転換する。続いて宿主を既知の適当な技術
によって培養し、産物を回収する。目的の新しいタンパ
ク質はキチナーゼシグナル配列を用いてストレプトマイ
セスによって翻訳され、分泌されるであろう。該タンパ
ク質の発現および分泌はまた、上流のキチナーゼＤＮＡ
１節配列によって制御されるであろう。
第三の手法では、望みの構造遺伝子をキチナーゼ遺伝子
内あるいは、その３′末端に適当な制限酵素切断部位を
用いて、望みの遺伝子がキチナーゼ遺伝子と同じ読み枠
になるように挿入する。得られたベクターを適当な宿主
に形質転換した場合、該宿主を既知の適当な技術によっ
て培養し、キチナーゼタンパク質のすべであるいは一部
と望みの構造遺伝子にコードされるタンパク質あるいは
ペプチドからなる融合タンパク質はストレプトマイセス
によって翻訳され、分泌されるであろう。次に望みのタ
ンパク質あるいはペプチドを標準的方法によってキチナ
ーゼタンパク質から切断することができる。分泌のため
のこの方法は、キチナーゼタンパク質と融合することに
よってタンパク質分解反応から保護されるような小さな
ペプチドの発現および分泌に特に有用であろう。
内あるいは、その３′末端に適当な制限酵素切断部位を
用いて、望みの遺伝子がキチナーゼ遺伝子と同じ読み枠
になるように挿入する。得られたベクターを適当な宿主
に形質転換した場合、該宿主を既知の適当な技術によっ
て培養し、キチナーゼタンパク質のすべであるいは一部
と望みの構造遺伝子にコードされるタンパク質あるいは
ペプチドからなる融合タンパク質はストレプトマイセス
によって翻訳され、分泌されるであろう。次に望みのタ
ンパク質あるいはペプチドを標準的方法によってキチナ
ーゼタンパク質から切断することができる。分泌のため
のこの方法は、キチナーゼタンパク質と融合することに
よってタンパク質分解反応から保護されるような小さな
ペプチドの発現および分泌に特に有用であろう。
Ｈ０害虫の抑制
上述のように産生されたキチナーゼは、害虫、例えば、
菌類、線虫、あるいは昆虫繁殖などの部位に直接（例え
ば、溶液で、あるいは、不活性な物質と混合した細かく
砕かれた固体など）投与することができる。得られた害
虫防御法は、有毒化学物質を回避する。
菌類、線虫、あるいは昆虫繁殖などの部位に直接（例え
ば、溶液で、あるいは、不活性な物質と混合した細かく
砕かれた固体など）投与することができる。得られた害
虫防御法は、有毒化学物質を回避する。
あるいは、キチナーゼ遺伝子は前出の欧州特許出願で述
べられているように宿主に形質転換し、該宿主を、例え
ば植物などの、害虫部位に投与する。また、害虫が植物
の害虫である場合、キチナーゼ遺伝子は植物細胞を直接
形質転換することが可能であり、通常認められている１
９８６年３月２８日に提出された米国特許出願ＳＮ ８
４５．４５７号、あるいは１９８５年１２月１１日に提
出されたＳＮ ８０７．７９８号で述べられているよう
に、該植物細胞は完全な植物に再生する。
べられているように宿主に形質転換し、該宿主を、例え
ば植物などの、害虫部位に投与する。また、害虫が植物
の害虫である場合、キチナーゼ遺伝子は植物細胞を直接
形質転換することが可能であり、通常認められている１
９８６年３月２８日に提出された米国特許出願ＳＮ ８
４５．４５７号、あるいは１９８５年１２月１１日に提
出されたＳＮ ８０７．７９８号で述べられているよう
に、該植物細胞は完全な植物に再生する。
（保 管）
上述のプラスミドの以下に示すものの保管は、アメリカ
ン・タイプ令カルチャー・コレクション、ロックビル、
ＭＤによって行なわれている：保 管
ＡＴＣＣ番号Ｓ、リビダンス１３２６内の
ｐＯＷ３ ６７３３３大腸菌ＪＭ１０７内のｐ Ｐ
Ｒ５６７３３２出願人の譲受人、バイオテクニカ・イン
ターナショナル社は、ＡＴＣＣが永久に保管可能な保管
人であり、特許が認められた場合に公衆が容易に入手し
得るものであることを保証する。上記のように保管され
た物質の、公衆に対する入手可能性についての全ての制
限は、特許の認可により最終的には除去されるであろう
。特許出願の係属中は、３７ ＣＦＲ１，１４および３
５ ＵＳＣ１２２に基づき、局長に資格があると認めら
れた者に対しては入手可能となるであろう。保管されて
いる物質は、その生存性および混入のないことを維持す
るために必要なあらゆる注意をはらって、保管されてい
る微生物試料の供給の最新の要請から少なくとも５年間
、また、いかなる場合にも、寄託当日から少なくとも３
０年間、あるいは特許の実施可能な期間、いずれの場合
にもより長い期間、維持されるであろう。
ン・タイプ令カルチャー・コレクション、ロックビル、
ＭＤによって行なわれている：保 管
ＡＴＣＣ番号Ｓ、リビダンス１３２６内の
ｐＯＷ３ ６７３３３大腸菌ＪＭ１０７内のｐ Ｐ
Ｒ５６７３３２出願人の譲受人、バイオテクニカ・イン
ターナショナル社は、ＡＴＣＣが永久に保管可能な保管
人であり、特許が認められた場合に公衆が容易に入手し
得るものであることを保証する。上記のように保管され
た物質の、公衆に対する入手可能性についての全ての制
限は、特許の認可により最終的には除去されるであろう
。特許出願の係属中は、３７ ＣＦＲ１，１４および３
５ ＵＳＣ１２２に基づき、局長に資格があると認めら
れた者に対しては入手可能となるであろう。保管されて
いる物質は、その生存性および混入のないことを維持す
るために必要なあらゆる注意をはらって、保管されてい
る微生物試料の供給の最新の要請から少なくとも５年間
、また、いかなる場合にも、寄託当日から少なくとも３
０年間、あるいは特許の実施可能な期間、いずれの場合
にもより長い期間、維持されるであろう。
出願人の譲受人は、保管人が保管状態によって要求され
た時に試料を供給できなくなった場合には、その保管物
を交換するのはその義務であると認める。
た時に試料を供給できなくなった場合には、その保管物
を交換するのはその義務であると認める。
（他の態様）
この他の態様は、前述の特許請求の範囲に示されている
。例えば、他の望みの成熟タンパク質をコードする他の
構造遺伝子を上記ベクター、あるいはキチナーゼシグナ
ルをコードするＤＮＡを含むベクターに挿入することが
可能である。
。例えば、他の望みの成熟タンパク質をコードする他の
構造遺伝子を上記ベクター、あるいはキチナーゼシグナ
ルをコードするＤＮＡを含むベクターに挿入することが
可能である。
第１ａ図はｐ Ｕ Ｃ１８とｐｃＴＦｌの切除されたキ
チナーゼ遺伝子との間の接合領域のヌクレオチド配列を
示したものである。推測されるアミノ酸配列も示してい
る。キチナーゼシグナルは細線で、成熟キチナーゼタン
パク質をコードするＤＮＡの５′末端を太線で示してい
る。 第１ｂ図は、プラスミドｐＣＴ４のクローニングされた
キチナーゼ調節領域のほとんどのヌクレオチド配列を示
している。５′ヌクレオチド配列、シグナル配列の推測
されるアミノ酸配列、および遺伝子の５′領域も示した
。 第２図は、大腸菌内でキチナーゼを発現させるためのプ
ラスミドｐｃＴＦ１およびｐＣＴ４の構成を示す流れ図
である・ 第３図は、Ｓ、リビダンスでキチナーゼを発現させるた
めのプラスミドｐ ＯＷ ｌ 、 ｐ ＯＷ ２ 、
およびｐＯＷ３の構成を示す流れ図である。 第４図は、ｐＰＲ５の構成を示す流れ図である。 第５Ａ図および第５Ｂ図は、ｐＯＷ５の構成を示す流れ
図と、ｐ ＯＷ ３と同様な分泌ベクターの構成のため
の手法である。 第６図は、シグナル配列とキチナーゼ構造遺伝子の間に
制限酵素切断部位を作成するためにプラスミドに導入の
ための変異を１口えた領域のヌクレオチド配列を示す。 （外４名） ａ、 Ｔｈｒ ＩＩｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ
Ｓｉｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ ＧａｇｆｌＴ６
ＲＣＣＲＴＧ ＲＴｒ ＲＣＧ ＲＲＴ ＴＣＧ Ｒ（
ｉＣｉＣ６ＧＴＲＣＣＣＧＧＧ＠、、ｓｓｂ＋ｘｘｓ＠
＋ｓｃａ Ｋ Ｉ ＳＸ Ｋ １８λ
−３６２ １上−にニュエニー トーｖ横−一】２２ １、 −８１切餅 ２１） 迂ｍ１３１ ４、ＤＮＡｍ違％＋せりなめ１；丸曝業１１形貰私東５
、 月１＠にし衣ＤＮＡめフ（す１し東く； 塾煤二）
ＩＩ ｔ Ｘ袷エビ切ま１６、 ｐｔＪｃＩ８
ｌｌ！ｌｆｏ”＆ＸＤ ５ｊｌＪ’セ）ＡＩＬＳクロー
ニソ７１７・ 叉隅面中て゛スクリーニノク゛よ・ｉ゛
プラスミ’ｈ’ ＰＣＴＦＩ ｆ １１０尺承２ｚ ”＆ｘｃ”−訃Ｗ）Ｙイｔス ベアＷ−ｐｓＩ！Ｉ−Ｉ
Ｑ！！！−１ｒ（ｐＤ’７０２ｅｔ％＊ｇ）懲】ヒ一
又Ｙレプ％ｘイｔＪ ＜７７− ｐ０６７ ％ｌｉ
ｘ臣ΣΣ鋒】 票＼テナーｔ＝”４仏与 匹ｎ 匹最−↓ 大月１蕾中ｆｎｔｍｓｒへの発炙りφのスクリー・＝・
ンデ↓ プラス１Ｋｇ１ＰＲ５０隼鶴阪 ↓ 阜５ａ凹 ◆２９ ◆ｉｓ 令３１
◆５２ ◆３３ ◆３４Ｇｌｎ
Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌ！Ｊ Ｓｕｒ Ａｌａ Ａ
ｌａ Ａｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ ＡｌａＣＲＧ ＧＣ［
； ＧＣＣ（ｉＧＲＴＣＣＧＣＴ ＧＣＲＧＣＣＲＣＣ
ＲＧＣＧＣＧシクリル組ｆｆ１１
４馳す量ゼ１シ下
鶴し噴水＋ｚ １５逸暮吋の坤＼陶１含ｔ・纂６ 図 手続補正書（ハ） 昭和６３年特許願第５７３３１号 ２１）発明の名称 キチナーゼ産生と分泌ベクター ３、補正をする者 事件との関係 出 願 人 住所 名 称 バイオテクニカ・インターナショナノいインコ
ーホレーテッド ４、代理人 住所 東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町
ビル ２０６区 ６、補正の対象
チナーゼ遺伝子との間の接合領域のヌクレオチド配列を
示したものである。推測されるアミノ酸配列も示してい
る。キチナーゼシグナルは細線で、成熟キチナーゼタン
パク質をコードするＤＮＡの５′末端を太線で示してい
る。 第１ｂ図は、プラスミドｐＣＴ４のクローニングされた
キチナーゼ調節領域のほとんどのヌクレオチド配列を示
している。５′ヌクレオチド配列、シグナル配列の推測
されるアミノ酸配列、および遺伝子の５′領域も示した
。 第２図は、大腸菌内でキチナーゼを発現させるためのプ
ラスミドｐｃＴＦ１およびｐＣＴ４の構成を示す流れ図
である・ 第３図は、Ｓ、リビダンスでキチナーゼを発現させるた
めのプラスミドｐ ＯＷ ｌ 、 ｐ ＯＷ ２ 、
およびｐＯＷ３の構成を示す流れ図である。 第４図は、ｐＰＲ５の構成を示す流れ図である。 第５Ａ図および第５Ｂ図は、ｐＯＷ５の構成を示す流れ
図と、ｐ ＯＷ ３と同様な分泌ベクターの構成のため
の手法である。 第６図は、シグナル配列とキチナーゼ構造遺伝子の間に
制限酵素切断部位を作成するためにプラスミドに導入の
ための変異を１口えた領域のヌクレオチド配列を示す。 （外４名） ａ、 Ｔｈｒ ＩＩｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ
Ｓｉｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ ＧａｇｆｌＴ６
ＲＣＣＲＴＧ ＲＴｒ ＲＣＧ ＲＲＴ ＴＣＧ Ｒ（
ｉＣｉＣ６ＧＴＲＣＣＣＧＧＧ＠、、ｓｓｂ＋ｘｘｓ＠
＋ｓｃａ Ｋ Ｉ ＳＸ Ｋ １８λ
−３６２ １上−にニュエニー トーｖ横−一】２２ １、 −８１切餅 ２１） 迂ｍ１３１ ４、ＤＮＡｍ違％＋せりなめ１；丸曝業１１形貰私東５
、 月１＠にし衣ＤＮＡめフ（す１し東く； 塾煤二）
ＩＩ ｔ Ｘ袷エビ切ま１６、 ｐｔＪｃＩ８
ｌｌ！ｌｆｏ”＆ＸＤ ５ｊｌＪ’セ）ＡＩＬＳクロー
ニソ７１７・ 叉隅面中て゛スクリーニノク゛よ・ｉ゛
プラスミ’ｈ’ ＰＣＴＦＩ ｆ １１０尺承２ｚ ”＆ｘｃ”−訃Ｗ）Ｙイｔス ベアＷ−ｐｓＩ！Ｉ−Ｉ
Ｑ！！！−１ｒ（ｐＤ’７０２ｅｔ％＊ｇ）懲】ヒ一
又Ｙレプ％ｘイｔＪ ＜７７− ｐ０６７ ％ｌｉ
ｘ臣ΣΣ鋒】 票＼テナーｔ＝”４仏与 匹ｎ 匹最−↓ 大月１蕾中ｆｎｔｍｓｒへの発炙りφのスクリー・＝・
ンデ↓ プラス１Ｋｇ１ＰＲ５０隼鶴阪 ↓ 阜５ａ凹 ◆２９ ◆ｉｓ 令３１
◆５２ ◆３３ ◆３４Ｇｌｎ
Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌ！Ｊ Ｓｕｒ Ａｌａ Ａ
ｌａ Ａｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ ＡｌａＣＲＧ ＧＣ［
； ＧＣＣ（ｉＧＲＴＣＣＧＣＴ ＧＣＲＧＣＣＲＣＣ
ＲＧＣＧＣＧシクリル組ｆｆ１１
４馳す量ゼ１シ下
鶴し噴水＋ｚ １５逸暮吋の坤＼陶１含ｔ・纂６ 図 手続補正書（ハ） 昭和６３年特許願第５７３３１号 ２１）発明の名称 キチナーゼ産生と分泌ベクター ３、補正をする者 事件との関係 出 願 人 住所 名 称 バイオテクニカ・インターナショナノいインコ
ーホレーテッド ４、代理人 住所 東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町
ビル ２０６区 ６、補正の対象
Claims (25)
- （１）望みのタンパク質と融合したストレプトマイセス
（￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥）キチナーゼシグナル
配列を含有するプレプロテインをコードするＤＮＡを含
む、操作を加えたＤＮＡ配列。 - （２）該配列がさらに該キチナーゼシグナル配列をコー
ドするＤＮＡから上流の調節ＤＮＡを含む、特許請求の
範囲第１項記載のＤＮＡ配列。 - （３）該調節ＤＮＡがキチンの存在に反応して該プレプ
ロテインをコードするＤＮＡの転写を誘導するＤＮＡを
含む、特許請求の範囲第２項記載のＤＮＡ配列。 - （４）該キチナーゼシグナル配列がＳ．プリカツス（￥
Ｓ．Ｐｌｉｃａｔｕｓ￥）のキチナーゼシグナル配列で
ある、特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列。 - （５）該キチナーゼシグナル配列がエンドキチナーゼシ
グナル配列である、特許請求の範囲第１項または第４項
記載のＤＮＡ配列。 - （６）該ＤＮＡ配列が、 【ＤＮＡ配列があります】 からなるシグナル配列をコードする、特許請求の範囲第
１項記載のＤＮＡ配列。 - （７）塩基配列 【ＤＮＡ配列があります】 を含む特許請求の範囲第６項記載のＤＮＡ配列。
- （８）該望みのタンパク質がキチナーゼである、特許請
求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列。 - （９）該ＤＮＡ配列ｐＣＴＦ１、ｐＣＴ４、ｐＯＷ１、
ｐＯＷ２、ｐＯＷ３、およびｐＯＷ５、あるいはそれら
の誘導体から選択されたプラスミド中に含まれる、特許
請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列。 - （１０）該配列がさらに該プレプロテインをコードする
ＤＮＡの転写を開始するような位置に正しい向きで存在
するプロモーターを含む、特許請求の範囲第１項または
第４項記載のＤＮＡ配列。 - （１１）該プロモーターがＳ．フラジエ （￥Ｓ．ｆｒａｄｉａｅ￥）￥ａｐｈ￥プロモーターで
ある、特許請求の範囲第１０項記載のＤＮＡ配列。 - （１２）特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列を含有
する細菌。 - （１３）該細菌がストレプトマイセス （￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥）属のものである、特
許請求の範囲第１２項記載の細菌。 - （１４）特許請求の範囲第１２項記載の細菌を培地中で
培養し、培地から成熟タンパク質を回収することからな
る、望みの成熟タンパク質を産生する方法。 - （１５）操作を加えたＤＮＡ配列の発現を誘導するため
に培地中に複合炭水化物を添加する、特許請求の範囲第
１４項記載の方法。 - （１６）該炭水化物がキチンである、特許請求の範囲第
１５項記載の方法。 - （１７）該望みのタンパク質が成熟ストレプトマイセス
キチナーゼの少なくとも一部とほかのタンパク質との融
合体からなる、特許請求の範囲第１４項記載の方法。 - （１８）該望みのタンパク質が実質的にストレプトマイ
セスキチナーゼ以外のタンパク質からなる、特許請求の
範囲第１４項記載の方法。 - （１９）ストレプトマイセスキチナーゼをコードするＤ
ＮＡを含む操作を加えたＤＮＡ配列。 - （２０）Ｓ．プリカツスエンドキチナーゼをコードする
ＤＮＡを含む、特許請求の範囲第１９項記載のＤＮＡ配
列。 - （２１）特許請求の範囲第１９項記載のＤＮＡ配列を含
有する生物体。 - （２２）該生物体がストレプトマイセス属、シュードモ
ナス（￥Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ￥）属、バチルス（￥
Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥）属、エスケリキア（￥Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ￥）属、リゾビウム（￥Ｒｈｉｚｏｂｉｕ
ｍ￥）属の細菌である、特許請求の範囲第２１項記載の
生物体。 - （２３）該生物体が植物である、特許請求の範囲第２１
項記載の生物体。 - （２４）特許請求の範囲第２１項記載の生物体を有害生
物の存在する部位に与えることからなる、キチナーゼ感
受性の有害生物を抑制する方法。 - （２５）該有害生物が、菌類、線虫類、あるいは、昆虫
類からなる、特許請求の範囲第２４項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US2400287A | 1987-03-10 | 1987-03-10 | |
| US24002 | 1987-03-10 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63313590A true JPS63313590A (ja) | 1988-12-21 |
Family
ID=21818331
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63057331A Pending JPS63313590A (ja) | 1987-03-10 | 1988-03-10 | キチナーゼ産生と分必べクター |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0290123A1 (ja) |
| JP (1) | JPS63313590A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5258502A (en) * | 1989-01-30 | 1993-11-02 | Massachusetts Institute Of Technology | Immobilization and purification of fusion proteins using chitin-binding ability |
| EP0474601A3 (en) * | 1990-09-07 | 1992-10-28 | Ciba-Geigy Ag | Expression of genes encoding plant pathogenesis related proteins in plant associated bacteria |
| FR2681076B1 (fr) * | 1991-09-06 | 1994-11-18 | Sanofi Elf | Adn recombinant codant pour une proteine a activite endochitinase. |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4751081A (en) * | 1984-03-26 | 1988-06-14 | Advanced Genetic Sciences, Inc. | Chitinase-producing bacteria |
| AU4569285A (en) * | 1984-08-02 | 1986-02-06 | Monsanto Company | Nematode control by recombinant microorganisms |
| US4686185A (en) * | 1984-08-02 | 1987-08-11 | Wakunaga Kono Kabushiki Kaisha | Microorganism of new species of genus Streptomyces and use thereof for production of chitinase |
-
1988
- 1988-03-10 JP JP63057331A patent/JPS63313590A/ja active Pending
- 1988-03-10 EP EP88302106A patent/EP0290123A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0290123A1 (en) | 1988-11-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5034322A (en) | Chimeric genes suitable for expression in plant cells | |
| JP2521413B2 (ja) | シグナル配列をコ―ドしているｄｎａと直接結合しているヒト成長ホルモンをコ―ドしているｄｎａ | |
| EP0946711B1 (en) | Improved expression vectors | |
| JPS61158782A (ja) | ストレプトミセス属分泌ベクタ− | |
| US6984505B2 (en) | Modified chitin-binding domain and use thereof | |
| JP2963695B2 (ja) | クローン化リゾスタフィン遺伝子の発現 | |
| JP3878207B2 (ja) | ｏｓｍＢ プロモータで制御される発現プラスミド | |
| US4797359A (en) | Heat shock regulated production of selected and fused proteins in yeast | |
| JPH07502647A (ja) | ユビキチン特異的プロテアーゼ | |
| HU193504B (en) | Process for preparing and applying recombinated plasmids containing basic phosphatase gens | |
| WO1999023223A1 (en) | Induction promoter gene and secretory signal gene usable in $i(schizosaccharomyces pombe), expression vectors having the same, and use thereof | |
| CA1301096C (en) | High yield protein production system | |
| US5834233A (en) | Method of limiting the survival of genetically engineered microorganisms in their enivronment | |
| JPS63313590A (ja) | キチナーゼ産生と分必べクター | |
| US5795766A (en) | Protein having α-glucosidase activity, DNA having genetic information thereof, and production of α-glucosidase | |
| EP0196375A1 (en) | Gene coding for signal peptides and utilization thereof | |
| JPS62502025A (ja) | ペプチドおよびタンパク質を酵母から分泌させるのに有用なｄｎａ配列 | |
| NZ274482A (en) | Cells transformed with a truncated and/or mutated staphylococcus aureus nuclease and their use in immunological, pesticidal and environmental pollutant-degrading compositions | |
| US5188961A (en) | DNA encoding a Streptomyces endochitinase 56 signal peptide | |
| HU205388B (en) | Process for genetic transformation of plants | |
| US4977089A (en) | Vector comprising signal peptide-encoding DNA for use in Bacillus and other microorganisms | |
| JPH0773505B2 (ja) | 誘発性プロモーターの制御下にある組換ｄｎａの表現法 | |
| JP3107847B2 (ja) | ポリペプチド | |
| Jung et al. | Expression of the colH gene encoding Clostridium histolyticum collagenase in Bacillus subtilis and its application to enzyme purification | |
| EP0635061B1 (en) | A method of limiting the survival of genetically engineered microorganisms in their environment |