DE3029348A1 - Verfahren zur herstellung von l-asparaginsaeure - Google Patents

Description

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DR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976) . Ol PL-I N G. W. EITLE · BR.RER. N AT.-K. HOFFMANN · DJ PL.-I NG. W. LEH N

DIPL.-ING. K. FOCHSLE ■ DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSE <t · D-8000 MÜNCHEN Cl · TELEFON (039) 9110 87 · TELEX 03-29019 (PATH E)

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MITSUBISHI PETROCHEMICAL Co«,Ltd. Tokyo J Japan

Verfahren zur Herstellung von L-Asparag~insäure

Die Erfindung betrifft ein Verfahren -zur Herstellung von L-Asparginsäure aus .Fumarsäure oder einem Salz davon und Ammoniak., oder einem Ammoniumsalz als Ausgangsmaterialien, indem man von der Reaktion eines Enzyms , das in einer •aeroben Kultur eines Mikroorganismus vom Stamme Genus Brevibacterium vorliegt, das gegenüber ijC-Amino-n-butter säure beständig ist, Gebrauch macht.

L-Asparginsäure ist in Proteinen der wichtigsten Aminosäuren enthalten und man macht davon medizinisch und als Nahrungsmitteladditiv Gebrauch.

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Es ist bekannt, daß Aspartase, die man aus den Zellen von Escherichia coli erhält, ein Enzym ist, das die Umsetzung von L-Asparginsäure aus Fumarsäure und Ammoniak antreibt. Kürzlich sind Verfahren gefunden worden zur Herstellung von L-Asparginsäure aus Fumarsäure und Ammoniak unter Anwendung eines Fermentierungskulturverfahrens mit verschiedenen Mikroorganismen.

Bei einer üblichen Fermentierungskulturmethode wird L-Asparginsäure aus Fumarsäure und Ammoniak unter Verwendung von Aspartase in Mikroorganismen hergestellt und deshalb ist es wirtschaftlich von großer Bedeutung, daß der Mikroorganismus eine starke Aspartaseaktivität hat. Die Abtrennung eines Mikroorganismus, der für diese Zwecke geeignet ist, macht aber große Schwierigkeiten und dadurch hat sich die technische Anwendung dieser Methoden bisher verzögert.

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung von L-Asparginsäure aus Fumarsäure oder ein Salz davon und Ammoniak oder einem Ammoniumsalz unter Verwendung eines Kulturproduktes , das durch aerobe Kultivierung eines Mikroorganismus vom Stamme Genus Brevibacterium, das beständig gegenüber (X/-Amino-n-buttersäure ist, gezeigt.

Aufgrund intensiver Untersuchungen wurde festgestellt, daß man durch Erzielen einer Beständigkeit von Mikroorganismen vom GenusBrevibacterium gegenüber CC-Amino-n-buttersäure deren Aspartaseaktivität erheblich erhöhen kann, d.h. deren Fähigkeit L-Asparginsäure aus Fumarsäure und Ammoniak biologisch zu synthetisieren.

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Die Erfindung beruht auf dem Erfolg, daß ein Verfahren entwickelt wurde, mittels dessen man Stämme züchten kann, die für die technische Herstellung von L-Asparginsäure geeignet sind, und nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man L-Asparginsäure ökonomisch und wirtschaftlich gewinnen.

Erfindungsgemäß werden als Mikroorganismen solche vom Genus Brevibacterium mit einer Beständigkeit gegen öC-Amino-nbuttersäure verwendet und diese sind nicht begrenzt hinsichtlich solcher Mikroorganismen, denen künstlich eine Beständigkeit verliehen wurde, sondern eingeschlossen sind auch solche, die eine diese Beständigkeit durch zufällige Veränderung in der Natur erworben haben.

Ein typischer erfindungsgemäß verv/endeter Stamm ist Brevibacterium flavam MJ-233-AB-41 (FERM-P Nr. 3812). Dieser Stamm kann von Brevibacterium flavam MJ-233 (FERM-P Nr.3068) als ein oC-Z-unino-n-buttersäure-beständiger Stamm, z.B. nach den folgenden Verfahren erhalten werden:

Man hat Brevibacterium flavam MJ-233 durch eine Behandlung mit chemischen Mitteln, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin in einer Konzentration von beispielsweise etwa 500 ug/ml während beispielsweise 1 bis 60 Minuten, mutiert und die so erhaltene organische Suspension wurde dann auf einer Plattenkultur (Harnstoff 0,2 %, Amminiumsulfat 0,7 %, KH₃PO₄ 0,05 %, K₂HPO₄ 0,05 %, MgSO₄'7H₂O 0,05 %, NaCl 2 mg/1, CaCl₂'2H₂O 2 mg/1, FeSO₄^H₂O 2 mg/1, MnSO₄M - 6 H₃O, ZnSO₄·7Η₂Ο 2 mg/1, Biotin 200 ug/1, Thiaminhydrochlorid 100 ug/1, cC-Amino-n-buttersäure 1,0 %, Agar 2,0 % und Äthanol 3 Volumenprozent (nach dem Sterilisieren zugegeben) mehrere Tage bei 30 C kultiviert, worauf die dann erhaltene große Kolonie, abgetrennt wurde und man den resistenten variierten Stamm erhielt.

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Die mykologischen Eigenschaften und die Gründe für die taxonomische Identifizierung des Brevibacterium flavam MJ-233-AB-41 sind die folgenden:

Mykologische Eigenschaften

I. Mit dem Mikroskop festgestellte Eigenschaften:

Brevibacillus von ovaler oder Stäbchenform mit den ungefähren Dimensionen 0,6 bis 0,8 χ 1,0 χ 2,4 um, im allgemeinen in Form von V-förmigen Paaren vorliegend, obwohl auch zaunartige Formen beobachtet werden. Diese Bazillen sind Gram-positiv, zeigen keine Sporenbildung, keine Motilität, keine Kapselbildung und sind nicht säurebeständig.

II. Kultureigenschaften

1. Eine Bouillon-Agarkolonie:

Kreisförmige, flache Oberfläche, Kolonie fast flach oder leicht erhaben,die Peripherie etwas wellig, gelb, opak und etwas hell.

2. Bouillon-Agar-Schrägkultur: Mittleres Wachstum, fadenförmig und gelb.

3. Bouillon-Flüssigkultur:

Mi t-Ki er ρ κ Wachstum, schleimig, nicht trübe.

4. Bouillon-Gelatine-Stabkultur:

Wächst gut auf der Oberfläche, im Inneren mäßiges Wachstum, fadenförmig.

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III. Wachstumsbedingungen

1. Wachstumstemperatur: Geeigneter Temperaturbereich 15 bis 4O°C, Optimaltemperatur 30 bis 37°C.

2. pH: Geeigneter Bereich 1 bis 10, optimaler pH f 7 bis 8.

3. Verhalten gegenüber Sauerstoff: Aerob

4. Verwendung von Amminiumsalz: Ja

5. Verwendung von Harnstoff: Ja

6. Verwendung von Nitrat: Ja

IV. Physiologische Eigenschaften und dergleichen

1. Verflüssigt nicht Gelatine.

2. Verändert Lakmusmilch nicht.

3. Reduktion von Nitrat: Positiv

4. Bildung von Indol: Negativ

5. Bildung von Schwefelwasserstoff: Negativ

6. Hydrolyse von Stärke: Negativ

7. Ammoniakbildung aus Pepton: Positiv

8. Vorges-Proskauer-Reaktion: Negativ

9. Methyl-Rot-Test: Positiv (schwach)

10. Katalase: Positiv

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11. Urease: Positiv

12. Bildung von Säure aus Kohlenwasserstoff: Säuren werden ohne Gasbildung gebildet aus Glukose, Saccharose, Trehalose, Maltose und Salizin. Keine Säure und kein Gas wurden gebildet aus Arabinose, Xylose, Laktose, Rhamnose, Raffinose, Mannit, DuI-zit, Inosit und Adonit.

13. Vitaminerfordernisse: Biotin wird benötigt.

Veränderung in der Gram-Färbung: Eine morphologische Veränderung oder Verzweigung der Zellen unter Proliferation wurde nicht festgestellt.

Der relative Wachstumsgrad von Brevibacterxum flavain MJ-233-AB-41 und dessen Elternstamm, Brevibacterxum flavam MJ-233, gegenüber CV-Amino-η-buttersäure wird in Tabelle 1 gezeigt, in welcher alle Prozentsätze auf das Gewicht bezogen sind.

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	TABELLE 1	oC-Amino-n-buttersäure beständiger Stamm MJ-233-AB-41
Menge an zugegebener c£ -Amino-n-buttersäure	Elternstaitm MJ-233	100 60 50 40
0 1,0 1,5 2,0	100 50 30 5

Anmerkungen:

1. Die Zahlen in den Spalten 2 und 3 der Tabelle 1 bedeuten den Wachstuinsgrad gemessen als O.D._g1 relativ zu dem Wachstumsgrad, den man erhält, wenn keine <7\,-Amino-n-buttersäure zugegeben wird (100) (die Messung der Absorption wurde gemäß Agricultural and Horticultural Chemistry, Tokyo University, Agricultural Department, Band 1, Seite 212, veröffentlicht von Asakura Shoten (1969) vorgenommen).

2. Zusammensetzung der verwendeten Kultur und Kulturmethode: 10 ml eines Mediums aus 0,2 % Harnstoff, 0,7 % Ammoniumsulfat, 0,05 % KH₂PO₄, 0,05 % K₃HPO₄, 0,05 % MgSO₄-7H₂O, 0,01 % Hefeextrakt, 0,01 % Casaminosäure, 2 mg/1 FeSO₄'7H₂O, 2 mg/1 MnSO₄' 4 bis 6 H₂O, 2 mg/1 NaCl, 2 mg/1 CaCl₂'2H₂O, 2 mg/1 ZnSO₄' 7H₂O, 200 lig/1 Biotin und 100 ug/1 Thiaminhydrochlorid, mit dem in Tabelle 1 gezeigten Gehalt an tfC-Amino-n-buttersäure wurden in ein großes Reagenzglas mit einem Durchmesser von 24 mm gefüllt, 10 Minuten bei 120°C sterilisiert und dann mit Brevibacterium flavam MJ-233-AB-41 inokuliert.

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Anschließend wurden 0,3 ml (3 Volumenprozent) Äthanol unter aseptischen Bedingungen zugegeben und die Kultur wurde 3 Tage bei 30°C geschüttelt.

Der Unterschied im Grad der Beständigkeit zwischen dem Elternstanm und dem cC-Amino-n-buttersäure-beständigen Stamm ist nicht wesentlich, und jeder Stamm, der eine verbesserte Beständigkeit gegenüber (/(-Amino-n-buttersäure hat im Vergleich zu den Elternstämmen wird hier als beständiger Stamm angesehen.

Der c(-Amino-n-buttersäure-beständige Stamm gemäß der vorlie-

genden Erfindung hat vorzugsv/eise einen relativen Wachstumsgrad gemäß der obigen Definition von wenigstens 15 bei Zugabe von 2 %-iger o(-Amino-n-buttersäure zu einem Kulturmedium und 3 tägigem Kultivieren unter Schütteln bei 30⁰C.

Relativer Wachstumsgrad

Wachstumsgrad nach Zugabe von 2 % <?C-Aminon-Buttersäure

Wachstumsgrad ohne Zugabe von 2 % C^-Aminon-Buttersäure

X 100

Anstatt einer chemischen Behandlung kann man Brevibacterium flavam MJ-233 auch durch Bestrahlen mit ultraviolettem Licht mutieren.

Die Zusammmensetzung des Kulturmediums, d.h. die Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze, wie sie für die erfindungsgemäße Kultur verwendet wird, ist bekannt und in keiner Weise beschränkt.

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Kohlenstoffquellen, wie Äthanol, Methanol, n-Paraffine, Melasse und dergleichen, können allein oder als Gemisch verwendet werden. Als Stickstoffquellen können Ammoniak, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Harnstoff und dergleichen allein oder als Gemisch verwendet werden.

Anorganische Salze, wie Kaliummonohydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, können zugegeben werden. Falls für das Wachstum der Zellen erforderlich, können weitere Nährstoffe zu dem Medium gegeben werden, z.B. Pepton, Bouillonextrakt, Hefeextrakt, Maismaische, Casaminosäure, verschiedene Vitamine und dergleichen.

Die Kultivierung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, z.B. durch Rühren unter Belüftung, Schütteln usw., wobei die Temperatur der Kultur zwischen 20 und 40°C und vorzugsweise zwischen 25 und 35°C gehalten wird. Der pH der Kultur liegt zwischen 5 und 10 und vorzugsweise bei 7 bis 8, wobei man die Einstellung des pH der Kulturflüssigkeit durch Zugabe von Säure oder Alkali bewirkt.

Die Konzentration an zugegebener (/{-Amino-n-buttersäure liegt zwischen 0,1 und 5 Gew.-% und vorzugsweise bei 1 bis 30 Gew.-%.

Die Konzentration an Äthanol zu Beginn der Kultur liegt bei 1 bis 50 Volumenprozent und vorzugsweise 2 bis 30 Volumenprozent. Die Kulturzeit liegt im allgemeinen bei 2 bis 8 Tagen mit einer optimalen Zeit zwischen 4 und 5 Tagen.

Da das so erhaltene Kultivierungsprodukt hoch aktive Aspartase enthält, kann man damit wirksam L-Asparaginsäure aus Fumarsäure oder einein Salz davon, z.B. dem Natriumsalz oder Kaliumsalz, und Ammoniak oder einem Ammoniumsalz, z.B.

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Ammoniumchlorid oder Ammoniumkarbonat, biosynthetisieren. Das vorerwähnte Kulturprodukt bezieht sich auf alle durch die Kultivierung erhaltenen Produkte, d.h. nicht nur auf die Kulturflüssigkeit selbst sondern auch auf die darin enthaltenen Zellen, die zerstörten, zermahlenen und die selbstverdauten Produkte solcher Zellen.

Die Biosynthese von L-Asparginsäure aus Fumarsäure oder einem Salz davon und Ammoniak oder einem Ammoniumsalz kann in üblicher Weise durchgeführt werden, mit der Ausnahme, daß man das erfindungsgemäße Kulturprodukt anstelle der üblichen Kulturprodukte verwendet.

Nachfolgend wird die Erfindung in einem Beispiel, das aber nicht limitierend ausgelegt werden soll, näher beschrieben.

In dem Beispiel wurde die qualitative Untersuchung der gebildeten L-Asparaginsäure durchgeführt, indem man die Rf-Werte bei der Papierchromatographie mit denen einer Standard-L-Asparaginsäure verglich. Die quantitative Analyse erfolgte mittels einer Analysenmethode für Mikroorganismen unter Verwendung von Leuconostoc mesenterioides (ATCC Nr. 8042). (Siehe JIKKEN NOGEI KAGAKU (Experimental Agricultural Chemistry, 1. Band, Seiten 284 bis 285, Tokyo Universität, Faculty of Agriculture, Department of Agricultural Chemistry, veröffentlicht von Asakura Shobo (1960). Die gebildete L-Asparaginsäure wurde in üblicher Weise gewonnen, z.B. durch isoelektrische Ausfällung, durch Ionenaustauschharz-Chromatographie und dergleichen (s.hierzu beispielsweise AMINOSAN HAKKO (Amino-Säure-Fermentation), 2. Band, Seiten 129 bis 138, veröffentlicht von Kyoritsu Shuppan (Japan).

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BEISPIEL

In ein großes Reagenzglas mit einem Durchmesser von 24 mm wurden jeweils 10 mm eines Mediums eingefüllt aus 4,0 g Harnstoff, 14,0 g Ammoniumsulfat, 0,5 g KH₃PO., 0,5 g K₂HPO₄, 0,5 g MgSO₄ "7H₂O, 6 mg FeSO₄'7H₂O, 6 mg MnSO₄M bis 6 H₃O, 1,0g Hefeextrakt, 1,0g Casaminosäure, 200 ug Biotin, 1,00 ug Thiamin und 1 1 Leitungswasser. Das Ganze wurde bei IJ20 C unter Druck 10 Minuten sterilisiert und dann wurden zur Herstellung eines Vorkulturmediums 0,3 ml Äthanol zugegeben. Die Medien wurden mit Brevibacterium flavam MJ-233 bzw. Brevibacterium flavam MJ-233-AB-41 inokuliert und 2 Tage unter Schütteln bei 30 C kultiviert. Anschließend wurden 50 1 Mengen eines Mediums der gleichen Zusammensetzung wie das obige Vorkulturmedium in 500 ml Erlenmeyer-Kolben gegeben und unter Druck 10 Minuten bei 120 C sterilisiert. Das so erhaltene Kulturmedium wurde dann mit 1,0 ml der vorerwähnten Vorkulturflüssigkeit inokuliert und 3 Tage bei 30°C einer Schüttelkultur unterworfen, worauf man anschließend eine Zentrifugentrennung (3 000 Umdrehungen während 15 Minuten) zum Sammeln der Zellen durchführte.

Getrennt davon wurden 10 g Fumarsäure zu 50 ml Wasser gegeben, der pH wurde mit Ammoniakwasser auf 10,0 eingestellt und dann wurde mit Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 100 ml aufgefüllt. 10 g (Naßgewicht) der oben gewonnenen Zellen wurden zugegeben, und dann wurde unter leichtem Rühren die Umsetzung während 3 Tagen bei 30⁰C durchgeführt.

Folgendes Ergebnis wurde erzielt:

Wurden die Zellen des Elternstammes, Brevibacterium flavam MJ-233 verwendet, erhielt man 1,1 g L-Asparaginsäure. Bei Verwendung der Zellen des CX^-Amino-n-buttersäure-beständigen Stammes, Brevibacterium flavam MJ-233-AB-41, erhielt man 3,2 g L-Asparginsäure.

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Claims (2)

1. HOFPMA.NI*] · RiTL·^ & PARTNEJR

   PAT 15 N TAN WÄLT I?

   DR. ING. E. HOFFMANN [1930-1W) . D I PL-I N C. V/. E ITLE · D R. RF R. N AT. K. H O FFMAN N · D I Pl.-1 N G. W. LEHN

   Dl P L.-1 NG. K. FO CH SLE - DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 · D-BOOO M Q N CH E N 81 · TELE FON (06?) 911087 ■ TELE X 05-29619 (PATH E)

   33 800 o/fi

   MITSUBISHI PETROCHEMICAL CO.,Ltd. Tokyo / Japan .

   Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginsäure

   Patentansprüche

   Verfahren zur Herstellung von ii-Asparginsäure aus Fumarsäure oder einem Salz davon und Ammoniak oder einem Airaaoniumsalz_/ dadurch gekennzeichnet, daß man ein Kulturprodukt verwendet, das durch aerobe Kultivierung eines Mikroorganismus vom Genus Brevibacterium mit einer Beständigkeit gegenüber cC-Amino-n-buttersäure pj-ti;i.Vt"en wnrr*]pi-j ist,
2. 2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der Mikroorganismus Brevibacterium flavaia MJ--233-AB-41 ist.

   130009/0806,

   BAD ORIGINAL