AT404839B

AT404839B - Verfahren zur herstellung von z-l-asparaginsäure-dinatriumsalz aus fumarsäure

Info

Publication number: AT404839B
Application number: AT167296A
Authority: AT
Original assignee: Chemie Linz Gmbh; Holland Sweetener Co
Priority date: 1996-09-20
Filing date: 1996-09-20
Publication date: 1999-03-25
Also published as: ATA167296A

Description


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   L-Asparaginsäure ist ein essentieller Ausgangsstoff für die Synthese des Dipeptides Aspartam, ein künstlicher Süssstoff mit einer   +/- 200-fachen   Süsskraft von Saccharose. 



   Für die Synthese von Aspartam wurden bereits eine Vielzahl von chemischen und enzymatischen Verfahren beschrieben, bel welchen vor allem L-Asparaginsäure und Phenylalaninmethylester auf unterschiedlichste Weisen, etwa mit oder ohne enzymatischer Katalyse, miteinander gekoppelt werden. Dabei wird beispielsweise von fester Asparaginsäure ausgegangen, die nach Umwandlung in das Dinatnumsalz mit   Benzytoxycarbony ! ch) orid (Z-Ci)   in wässriger Lösung zu   Z-L-Asparaginsäure-Dinatriumsalz   umgesetzt wird. Asparaginsäure wird dabei, wie beispielsweise in EP-A-0   127 940   beschrieben, aus Maleinsäure, die zur Fumarsäure isomerisiert wird, auf enzymatischem Wege über das Ammonium-L-Aspartat und anschlie- ssender Kristallisation in Gegenwart einer Säure hergestellt.

   Dabei fallen in der Mutterlauge äquimolare Mengen an Ammoniumsalzen an, die entsprechend entsorgt werden müssen. Weiters ist eine Vielzahl von Schntten erforderlich, um   Z-L-Asparaginsäure-Dinatriumsalz   zu erhalten. 



   Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein Verfahren zu finden, bei welchem die Ammoniumionen-hältigen Abwasser vermieden und die Anzahl der Schritte zum   Z-L-Asparaginsäure-Dinatriumsalz   reduziert wird. 



   Unerwarteterweise konnte diese Aufgabe durch ein Verfahren gelöst werden, bei welchem, ausgehend von Fumarsäure, Ammonium-L-Aspartat direkt In das Dinatriumsalz der L-Asparaginsäure bei gleichzeitiger quantitativer Rückführung des Ammoniaks überführt wird. 



   Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Herstellung von Z-L-Asparaginsäure-Dinatriumsalz aus Fumarsäure, das dadurch gekennzeichnet ist, dass a) Fumarsäure in einem inerten Verdünnungsmittel in Gegenwart von Aspartase oder Aspartase- produzierenden Mikroorganismen mit Ammoniak zu Ammonium-L-Aspartat umgesetzt,   anschliessend   b) die Ammonium-L-Aspartat hältige Lösung mit Natriumhydroxid bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 10 bis 14 versetzt wird, wobei c) der sich abspaltende Ammoniak in eine   Fumarsäuresuspension,   die als Ausgangslösung für weitere enzymatische Umsetzungen verwendet wird, rückgeführt wird, worauf d)

   die verbleibende Dinatrium-L-Aspartat   hältige   Lösung mit   Benzyloxycarbonylchlond   bei einem pH-
Wert zwischen 9 und 14 reagieren gelassen wird, und sich   Z-L-Asparaginsäure-Dinatriumsalz   bildet. 



   Im ersten Schritt a) des erfindungsgemässen Verfahrens wird Fumarsäure in einer enzymatischen Reaktion zu Ammonium-L-Aspartat umgesetzt. 



  Das Ausgangsprodukt für das erfindungsgemässe Verfahren, die Fumarsäure, kann beispielsweise durch Isomerisierung von Maleinsäure hergestellt werden. 



   Für die enzymatische Reaktion wird Fumarsäure bis zur Löslichkeitsgrenze In ein inertes Verdünnungsmittel eingerührt, sodass eine Suspension erhalten wird. Als inerte Verdünnungsmittel eignen sich Wasser,   Wasser/Ethanol- oder   Wasser/Aceton-Gemische und dergleichen. 



  Bevorzugt wird Wasser eingesetzt. In die Fumarsäure-Suspension wird sodann bei Raumtemperatur Ammoniak verflüssigt oder in Form einer 10 bis 35 Gew. % igen Lösung eingeleitet, wodurch sich die Temperatur bis zu   600   C erhöht und ein pH-Wert zwischen 8 und 9 einstellt. 



  Bevorzugt wird eine wässrige 20 bis 30 Gew. % ige Ammoniaklösung verwendet. 



  In das so erhaltene System, vorzugsweise eine Lösung, wird sodann bei 20 bis 60'C, bevorzugt bei 30 bis   500 C,   das Enzym Aspartase oder ein Aspartaseproduzierender Mikroorganismus, eingerührt. Bei dieser Zugabe an Enzym- bzw. Aspartase-produzierenden Mikroorganismus ist es von Vorteil, wenn durch die Ammoniakzugabe eine Lösung erhalten wird, da im Falle einer Suspension durch Adsorption des Enzyms und dadurch bedingten Aktivitätsverlust mehr Enzym erforderlich ist. Für einen fast quantitativen Umsatz nach bis zu 24 bis 30 Stunden sind dabei 30 bis 50 IU (Enzymaktivität) pro Mol Fumarsäure erforderlich. 



   Aspartase-produzierende Mikroorganismen sind beispielsweise Pseudomonas   fluorescens,   Protens vulgans, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Bacterium succinium, Bacillus subtilis, Aerobacter aerogenes, Micrococcus sp. Escherichia coli u. a. 



  Weitere geeignete Aspartase-produzierende Mikroorganismen sind beispielsweise In US 3, 791, 926 und US 3, 198, 712 beschrieben. 



  Bei dem erfindungsgemässen Verfahren kann welters gereinigte oder synthetische Aspartase eingesetzt werden. Das Enzym bzw. der Aspartaseproduzierende Mikroorganismus kann in flüssiger oder in immobilisierter Form wie beispielsweise in EP 0   127 940   beschrieben, zugesetzt werden. 



  Nach vollendeter Reaktion, das Reaktionsende kann beispielsweise photometrisch ermittelt werden, wird die das Ammonium-L-Aspartat enthaltende Lösung bevorzugt auf 20 bis   30'C abgekühlt   und im 2. Schritt (b) mit Natriumhydroxid versetzt. Dabei erwärmt sich die Reaktionslösung auf etwa 40 bis 60'C, und es wird ein pH-Wert zwischen 10 und 14 eingestellt. Bevorzugt wird soviel Natriumhydroxid zugesetzt, dass ein pHWert zwischen 11 und 12 erhalten wird. Natriumhydroxid kann dabei in fester Form oder als Natronlauge 

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 eingesetzt werden. Bevorzugt wird Natronlauge eingesetzt.

   Der sich abspaltende und entweichende Ammoniak wird beispielsweise in einem weiteren Reaktionsgefäss mittels Tauchrohr in eine Fumarsäuresuspension, die nach weiterer Zugabe von Ammoniak wieder als Ausgangslösung für die nächste enzymatische Umsetzung verwendet werden kann, eingeleitet. (Schritt c) Um den Ammoniak aus der Reaktionslösung zu entfernen, wird die Temperatur auf etwa 50 bis   70. C   eingestellt und durch Anlegen eines Vakuums von 80 bis 120 mbar die Hauptmenge des Ammoniaks ausgetrieben. 



  Nach etwa 0, 5 bis 10 Stunden wird bei einem Vakuum von 200 bis 300 mbar Stickstoff durch die Reaktionslösung geblasen und eine Temperatur von 55 bis 65 C gehalten, sodass auch die Restmenge an Ammoniak entfernt wird. 



  Die so erhaltene Dinatrium-L-Aspartat-Lösung wird sodann im nächsten Schritt d) bei einer Temperatur von 30 bis   60. C   mit Benzyloxycarbonylchlorid (Z-CI) versetzt, wobei durch gleichzeitiges Zutropfen von Natronlauge ein pH-Wert zwischen 9 und 14 gehalten wird. Z-CI kann dabei in einer äquimolaren Menge, aber auch in leichtem Überschuss zugesetzt werden. Nach der Z-CI Zugabe wird das Reaktionsgemisch noch 0, 5 bis 4 Stunden bei der Reaktionstemperatur stehen gelassen und anschliessend auf Raumtemperatur   abgekühlt,   worauf es zu einer Phasentrennung kommt. 



   Die wässrige Phase wird sodann gewaschen, beispielsweise mit Methyl-tert-butylether, Diisobutylether, Toluol oder anderen mit Wasser nicht-mischbaren Lösungsmitteln. 



  Die organische Phase wird verworfen und Z-L-Asparaginsäure als Dinatriumsalz in wässriger Lösung erhalten. Zur Entfernung von eventuellen Restmengen an organischen Lösungsmitteln In der wässrigen Phase wird bei Raumtemperatur ein Vakuum angelegt. 



  Durch das erfindungsgemässe Verfahren wird   Z-L-Asparaginsäure-Dinatriumsalz   als klare, leicht gelbliche Lösung erhalten, die bei Bedarf für die Weiterverarbeitung zu Aspartam, mittels Kopplung mit Phenylalanin, verwendet werden kann. 



  Durch das erfindungsgemässe Verfahren werden Ammoniumionen-hältige Abwässer vermieden und Ammoniak quantitativ für weitere enzymatische Umsetzungen von Fumarsäure rückgeführt. 



  Weiters Ist es bei dem erfindungsgemässen Verfahren nicht erforderlich, L-Asparaginsäure oder eines der Zwischenprodukte zu isolieren. 



  Beispiel 1 a) Enzymatische Umsetzung 
In einem 5   I     Doppelmantelgefäss   wurden 2070 ml Trinkwasser vorgelegt und 973 g Fumarsäure (8, 38 Mol) eingerührt. In die Fumarsäuresuspension wurden anschliessend 1450 ml 25 Gew. % ige AmmoniakLösung (1314 g) während 30 Minuten eingebracht. Dabei wurde eine Reaktionstemperatur von   45 - 50. C   und ein pH-Wert von 8, 5 erreicht. Bei   45.   C und unter leichtem Rühren wurden in die klare Lösung 1, 4 ml Aspartase Lösung   (245     U/mt)   eingebracht. Danach wurde die Rührung ausgeschaltet und die Reaktionslösung bei   45. C   gehalten. 



  Der Reaktionsverlauf wurde photometrisch verfolgt. Eine nahezu quantitative Umsetzung ( > 99 %) wurde nach 25, 5 Stunden erreicht. b) und c) Austreiben von Ammoniak 
In die gemäss a) erhaltene Lösung wurde nach Abkühlen auf 25 C 1330 g 50 Gew. % ige Natronlauge innerhalb von 15 Minuten eingebracht. Dabei erwärmte sich die Lösung auf   50. C.   Es wurde ein pH-Wert von 11, 5 gemessen. Der entweichende Ammoniak wurde in eine Fumarsäuresuspension mittels Tauchrohr eingeleitet (Fumarsäure/Ammoniak Waschlösung). Die Wassermenge und Fumarsäuremenge waren dieselben, wie in a) angeführt. Durch Erwärmen auf   57. C   und Anlegen eines Vakuums von 100 mbar wurde die Hauptmenge des Ammoniaks ausgetneben. Nach 6 Stunden wurde Stickstoff durch die Reaktionslösung geblasen (20 I/Std.). Die Temperatur wurde dabei auf   60.

   C   erhöht und ein Vakuum von 240 mbar eingestellt (Dauer 4, 5 Stunden). Die Gesamtmenge an Destillat betrug ungefähr 1100 g. 



   Es wurde eine Dinatrium-L-Aspartat-Lösung mit einem Gehalt von 23, 5 Gew. % an L-Asparaginsäure erhalten. Dabei konnte keine Racemisierung beobachtet werden. 



  Der Gehalt an Fumarsäure   betrug < 0, 1 Gew. %, Äpfelsäure   und Asparagin konnte nicht nachgewiesen werden. 

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 d) Herstellung von Dinatrium   Z- (L)-aspartat  
Es wurden 80   ml   einer analog   Beispiel 1 a - c) hergestellten   Dinatrium   L-Aspartat Lösung mit 18,1   
 EMI3.1 
    %nylchlorid (Z-CI) (Gehalt : 92, 5   nach GC) (0, 11 Mol) während 1 Stunde zugetropft. Gleichzeitig wurde durch Zutropfen von 50   Gew. %ige Natronlauge   der pH-Wert zwischen 10, 9 und   13, 8 gehalten. Insgesamt   wurden dabei 7, 8 g 50 Gew. % ige Natronlauge zugegeben. Nach dem Zutropfen wurde die Reaktionslösung für 2, 5 Stunden bei   45 - 47. C gehalten.   Der pH-Wert betrug konstant 12, 1.

   Nach dem Abkühlen auf   25. C   wurde   die wässrige   Lösung 2 mal mit jeweils 92 ml Methyl-tert- butylether behandelt. Die organische Phase wurde verworfen ; die wässrige Phase wurde 30 Minuten bei   20. C   und 20 mbar im Rotavapor von Lösungsmittelresten befreit. 



  Es wurden 101 g einer leicht gelblichen, klaren Lösung erhalten. Der Gehalt betrug 30, 8 Gew. % Dinatrium-   Z- (L)-Aspartat.    



  Beispiel 2 Herstellung von Dinatrium   Z- (L)-Aspartat mit   einem   Überschuss   von Z-CI 
Es wurden   64, 2 mi einer   Dinatrium-L-Aspartat Lösung mit   18, 1 Gew. %   L-Asparaginsäure (0, 09 Mol), hergestellt analog Beispiel 1   a - c,   auf   45. C   erwärmt. 



  Unter Rühren wurden   17, 7 g Benzyloxycarbonylchlorid (Z-CI, Gehalt : 92, 5   nach GC) (0, 10 Mol) während 1 Stunde zugetropft. Gleichzeitig wurde durch Zutropfen von 50 Gew. % ige Natronlauge der pH Wert zwischen 9, 4 und   11, 8 gehalten. Insgesamt   wurden dabei   8, 8 g   50 Gew. % ige Natronlauge zugegeben. Nach dem Zutropfen wurde die Reaktionslösung für 2, 5 Stunden bei   45 *   C gehalten. 



  Der pH-Wert betrug konstant 11, 3. Nach dem Abkühlen auf 25 C wurde die wässnge Lösung 2 mal mit jeweils 46   ml     Methyl-tert-butylether   behandelt. Die organische Phase wurde verworfen ; die wässrige Phase wurde 30 Minuten   bel 20. C   und 20 mbar Im Rotavapor von Lösungsmittelresten befreit. 



   Es wurden 84, 2 g einer leicht gelblichen, klaren Lösung erhalten. Der Gehalt betrug 31, 4 Gew. % Dinatrium-Z- (L)-Aspartat. 



  Beispiel 3 : Enzymatische Umsetzung der   Fumarsäure/Ammoniak-Waschlösung   
Die gemäss Beispiel 1 a-c erhaltene Fumarsäure/Ammoniak Waschlösung wurde nach abgeschlossenem Versuch mit 514 g 25 Gew. % Ammoniak auf pH 8, 5 gestellt und analog Beispiel 1 a-c zu Dinatrium-LAspartat-Lösung weiterverarbeitet. 



  Die Ergebnisse sind aus Tabelle 1 ersichtlich. 

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  Tabelle 1 
 EMI4.1 
 
<tb> 
<tb> Versuch <SEP> 1.2. <SEP> 3.4. <SEP> 5.
<tb> Wasser <SEP> (mi) <SEP> 2070 <SEP> 2000 <SEP> 2423 <SEP> 2450 <SEP> 2100
<tb> Fumarsäure <SEP> (g) <SEP> 973 <SEP> 973 <SEP> 973 <SEP> 973 <SEP> 973
<tb> Ammoniak <SEP> (g) <SEP> 1314 <SEP> 514 <SEP> 752 <SEP> 570 <SEP> 643
<tb> pH-Wert <SEP> bei <SEP> 45'C <SEP> 8, <SEP> 5 <SEP> 8, <SEP> 18 <SEP> 8, <SEP> 48 <SEP> 8, <SEP> 48 <SEP> 8, <SEP> 4 <SEP> 
<tb> Enzym-Lsg <SEP> (mi) <SEP> 1, <SEP> 4 <SEP> 1, <SEP> 4 <SEP> 2, <SEP> 1 <SEP> 2, <SEP> 1 <SEP> 1, <SEP> 4 <SEP> 
<tb> Dauer <SEP> (h) <SEP> 25, <SEP> 5 <SEP> 24 <SEP> 16 <SEP> 15 <SEP> 28
<tb> Umsatz <SEP> (%) <SEP> > 99 <SEP> > 99 <SEP> > 99 <SEP> 98, <SEP> 6 <SEP> > 99
<tb> 50% <SEP> NaOH <SEP> (g) <SEP> 1330 <SEP> 1229 <SEP> 1316 <SEP> 1333 <SEP> 1312
<tb> pH-Wert <SEP> 11, <SEP> 5 <SEP> 11, <SEP> 9 <SEP> 11, <SEP> 6 <SEP> 11, <SEP> 9 <SEP> 11,

   <SEP> 8 <SEP> 
<tb> T <SEP> max <SEP> ( <SEP> C) <SEP> 57 <SEP> 51 <SEP> 53 <SEP> 66 <SEP> 59
<tb> Vakuum <SEP> (mbar) <SEP> 100 <SEP> 174 <SEP> 120 <SEP> 200 <SEP> 170
<tb> Dauer <SEP> (h) <SEP> 6 <SEP> 1 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> 3, <SEP> 5 <SEP> 2, <SEP> 75 <SEP> 
<tb> N2 <SEP> Purge <SEP> I/h <SEP> 20 <SEP> 35 <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 30
<tb> Temp. <SEP> ('C) <SEP> 61 <SEP> 60 <SEP> 59 <SEP> 70 <SEP> 63
<tb> Vakuum <SEP> (mbar) <SEP> 240 <SEP> 300 <SEP> 250 <SEP> 250 <SEP> 210
<tb> Dauer <SEP> (h) <SEP> 4, <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> Gehalt <SEP> (%l-Asp) <SEP> 23, <SEP> 5 <SEP> 18, <SEP> 2 <SEP> 21, <SEP> 4 <SEP> 22, <SEP> 6 <SEP> 20, <SEP> 7 <SEP> 
<tb> 
 Die so erhaltenen Dinatrium-L-Aspartat-Lösungen wurden analog Beispiel 1 d und Beispiel 2 zu Z-L-   Asparaginsäure-Dlnatriumsalz   umgesetzt.

Claims

Patentansprüche 1. Verfahren zur Herstellung von Z-L-Asparaginsäure-Dinatriumsalz aus Fumarsäure, das dadurch ge- kennzeichnet Ist, dass a) Fumarsäure in einem Inerten Verdünnungsmittel in Gegenwart von Aspartase oder Aspartase- produzierenden Mikroorganismen mit Ammoniak zu Ammonium-L-Aspartat umgesetzt, anschliessend b) die Ammonium-L-Aspartat hältige Lösung mit Natriumhydroxid bis zum Erreichen eines pH- Wertes von 10 bis 14 versetzt wird, wobei c) der sich abspaltende Ammoniak in eine Fumarsäuresuspension, die als Ausgangslösung für weitere enzymatische Umsetzungen verwendet wird, rückgeführt wird, worauf d) die verbleibende Dinatrium-L-Aspartat hältige Lösung mit Benzyloxycarbonylchlorid bei einem pH-Wert zwischen 9 und 14 reagieren gelassen wird und sich Z-L-Asparaginsäure-Dlnatriumsalz bildet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als inertes Verdünnungsmittel Wasser, Wasser/Ethanol oder Wasser/Aceton Gemische verwendet werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Ammoniak verflüssigt oder in Form einer wässrigen 10 bis 35 Gew. % igen Lösung eingesetztwird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Fumarsäure in Gegenwart von 30 bis 50 IU (Enzymaktivität) pro Mol Fumarsäure umgesetzt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Ammonium-L-Aspartat hältige Lösung bis zum Erreichen eines pH-Wertes zwischen 11 und 12 mit Natronlauge versetzt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der sich abspaltende Ammoniak durch Anlegen eines Vakuums von 80 bis 120 mbar bei 50 bis 70. C und anschliessendem Einblasen von Stickstoff bei 200 bis 300 mbar und 55 bis 65. C vollständig aus der Reaktionslösung entfernt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Dinatrium-L-Aspartat hältige Lösung bei 30 bis 60. C mit Benzyloxycarbonylchlorid versetztwird. <Desc/Clms Page number 5>
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass im Anschluss an die Reaktion von Dinatrium-L-Aspartat und Benzyloxycarbonylchlorid, nach erfolgter Phasentrennung, die wässrige Phase mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel gewaschen wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass als mit Wasser nicht mischbares Lösungs- mittel Methyl-tert-butylether, Diisopropylether oder Toluol verwendet wird.
10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die das Z-L-Asparaginsäure-Dinatriumsalz enthaltende wässrige Phase mittels Kopplung mit Phenylalanin zu Aspartam weiterverarbeitet wird.