DE3650564T2 - Dipeptide-Analoge von Aspertam und Verfahren zur deren Herstellung, sowie eine neue Herstellung von Aspertam - Google Patents

Description

• Im allgemeinen betrifft die vorliegende Erfindung die Herstellung von Dipeptiden. Die Dipeptid-Synthese erfolgt mit einem wirksamen Enzym und unter Verwendung einer neuen Gruppe von Verbindungen als einer der Reaktanten, die zu Phenylserin analog sind. Die Synthesewege für die letztgenannte Gruppe werden angegeben.
• Nach einer bevorzugten Ausführungsform beinhaltet die Erfindung die Herstellung von (2S, 3S)-β-Phenylserinester und die Kondensation des Esters mit blockierter (S)-Asparaginsäure, um Hydroxyaspartam (eine neue Verbindung, die als Süßstoff geeignet ist) und bestimmte Aspartamhomologe und -analoga herzustellen. Es sind mehrere Hauptstufen beteiligt, wobei jede von ihnen mehr als einen Schritt aufweist. Während des Verlaufs sämtlicher Verfahrensschritte werden zahlreiche Zusammensetzungen hergestellt.
• Seit vielen Jahren ist Aspartam kommerziell durch Kopplung von Z-Asparaginsäure mit Phenylalaninester hergestellt worden. Phenylalanin wird jedoch mittels Fermentation oder durch komplexe chemische/enzymatische Verfahren hergestellt und ist teuer. Seit längerem sind Anstrengungen erfolgt, um ein kostengünstigeres Verfahren für Aspartam zu finden, wobei diese Versuche jedoch bis zur vorliegenden Erfindung erfolglos gewesen sind. Es wird davon ausgegangen, daß die vorliegend beschriebenen neuen Verfahren einen kostengünstigeren weg darstellen.
Abkürzungen und Definitionen
• Die folgenden Abkürzungen sind auf dem betreffenden Gebiet üblich und werden vorliegend vereinzelt verwendet:
• Q bezeichnet eine Schutzgruppe wie z.B. Z (bedeutet Carbobenzoxy), wie sie zum Blockieren der Aminogruppe von L-Asparaginsäure verwendet wird. Q wird in einem späteren Abschnitt eingehender definiert.
• Me bedeutet Methyl.
• Ph bedeutet Phenyl.
• Phe bedeutet Phenylalanin.
• Z bedeutet Carbobenzoxy.
• Asp bedeutet Asparaginsäure.
• Ser bedeutet Serin.
• APM bedeutet Aspartam.
• BOC (oder Boc) bedeutet t-Butoxycarbonyl.
• Niederes Alkyl bedeutet ein Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen einschließlich, sofern nicht anders angegeben.
• Ts bedeutet Tosyl, d.h. Toluolsulfonyl.
• DMSO bedeutet Dimethylsulfoxid.
• Metallo-Proteinase bezeichnet ein proteolytisches Enzym mit einem Metallion am aktiven Zentrum. Beispiele hierfür stammen von Mikroorganismen wie eine von Actinomyceten stammende neutrale Protease, und schließen Prolysin, Thermolysin, Kollagenase, Crotulus atrox-Protease, sowie solche ein, die von Mikroorganismen wie Bacillus subtilis. Bacillus thermoproteoliticus Streptomyces coespitosus, Bacillus megaterium. Bacillus polymyxa, Streptomyces griseus, Streptomyces naraensis, Streptomyces fradiae. Pseudomonas aeruginosa, Aspergillus oryzae, Clostridium histolyticum. Proteus aeruginosa, Aeromonas proteolytica und dergleichen gebildet werden. Unbehandelte Formen sind eingeschlossen. Beispielsweise schließt der Begriff Thermolysin unbehandeltes Thermolysin ein. Andere geeignete Enzyme sind Trypsin, Papain und Pronase.
Die O-Gruppe
• Bei der Synthese bestimmter Peptide und Polypeptide müssen Messungen vorgenommen werden, um die Aminogruppe einer gegebenen Aminosäure daran zu hindern, mit der Carboxylgruppe eines anderen Moleküls derselben Verbindung (oder tatsächlich mit dem identischen Molekül) zu reagieren. Um dies zu verhindern, muß mindestens eines der reaktiven Radikale geschützt werden. Im allgemeinen wird die Aminogruppe eines Reaktanten ausgewählt, wodurch eine freie Carboxylgruppe verbleibt, um mit einer freien Aminogruppe eines anderen Reaktanten zu reagieren. Im vorliegenden Fall wird die Aminogruppe von Asparaginsäure blockiert, wodurch eine benachbarte Carboxylgruppe frei bleibt, um mit der Aminogruppe von Phenylserinester zu reagieren.
• Derartige Blockierungs- (oder Maskierungs- oder Schutz-) Gruppen werden vorliegend als "Q"-Gruppen bezeichnet.
• Das Hilfsmittel der Schutzgruppe wurde von Emil Fischer im Verlauf seiner Arbeiten über Polypeptide zu Beginn dieses Jahrhunderts entwickelt. Fischer untersuchte die Verwendung einer großen Anzahl von Aminoschutzgruppen, und seitdem ist eine große Anzahl zusätzlicher Gruppen vorgeschlagen worden. Viele dieser N-Substituenten führen zu einer Gruppe des Urethan-Typs, gebunden an N, wie z.B. -NH-C(:O)OR, wobei R ein Alkyl oder tatsächlich im wesentlichen alles sein kann, was eine Urethangruppe vervollständigt. Diese Materialien sind den Fachleute auf dem Gebiet der Peptidchemie gut bekannt. Typische Q-Radikale sind Carbobenzoxy (bekannt als Benzyloxycarbonyl), p-Methoxybenzoxycarbonyl, t-Butoxycarbonyl, etc. Am Ende der Synthese entfernte Fischer die Q-Gruppe auf einfache Weise, und seitdem sind Pep tidsynthesen in analoger Weise durchgeführt worden. Die Entfernung von Q mittels spezifischer Hydrierung oder dergleichen stellt einen Zwischenschritt im Rahmen der vorliegenden Erfindung dar und führt in der Tat zur Bildung einer neuen Verbindung.
• Auf dem Gebiet der Dipeptide wird Carbobenzoxy, C&sub6;H&sub5;CH&sub2;OCO-, so häufig als Blockierungsgruppe verwendet, daß es der Einfachheit halber mit "Z" bezeichnet wird. Es ist insbesondere deshalb praktisch verwendbar, da die Gruppe als Säurechlorid (Carbobenzoxychlorid) leicht mit der Aminogruppe in einer Schotten-/Baumann-Synthese reagiert und dann leicht von dem Peptid durch katalytische Hydrierung in Form von Toluol und Kohlendioxid eliminiert wird. Andere schützende Q-Gruppen sind durch Mittel, die den auf diesem Gebiet kundigen Fachleuten gut bekannt sind, leicht zu entfernen. Beispielsweise wird BOC durch Behandlung mit Säure leicht entfernt. (Vgl. Beispiel 10.)
• Im allgemeinen schließt Q tertiäre Alkoxycarbonylgruppen wie t-Butoxycarbonyl (bereits erwähnt), Phenylacetyl, Acetoacetyl, N-Benzyliden, Benzoyl, Benzyl, t-Amyloxycarbonyl; Benzyloxycarbonylgruppen (einschließlich Z, bereits erwähnt), p-Methoxybenzyloxycarbonyl; 3,5-Dimethoxybenzyloxycarbonyl; 2,4,6- Trimethylbenzyloxycarbonyl; p-Phenylazobenzyloxycarbonyl; p- Toluolsulfonyl; o-Nitrophenylsulfonyl; Trifluoracetyl; Chloracetyl; Carbamyl; und dergleichen ein.
• Demgemäß bezieht sich Q auf eine konventionelle Gruppe, die leicht mit der Aminogruppe der relevanten Aminosäure umgesetzt wird und eine weitere Reaktion dieser Aminogruppe mit Carboxyl bei der Peptidsynthese blockiert und nach Ablauf der Peptidsynthese leicht entfernt werden kann. Demgemiß wird die Q-Terminologie in diesem klassischen Sinne verwendet und sollte nicht so ausgelegt werden, daß die relevanten Reaktanten auf spezifische, chemisch definierte Substituenten eingeschränkt werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
• Nach einem Hauptaspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Dipeptids der Formel (Formel 1)
• in der B Wasserstoff oder Q ist; Q eine Aminosäureschutzgruppe ist; V Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1, 2, 3 oder 4 Kohlenstoffatomen ist; und C¹ und C² die übliche natürliche Konfiguration von natürlich vorkommenden Aminosäuren aufweisen, X Hydroxyl oder Chlor ist und Y Wasserstoff ist;
• bei dem: B-substituierte Asparaginsäure der Formel (Formel II)
• oder ein Salz (z.B. ein Salz der Säure oder des Amins) derselben mit einer zweiten Aminosäure der Formel (Formel III)
• enzymatisch umgesetzt (d.h.gekoppelt) wird, um dadurch eine Verbindung der Formel
• zu bilden, und die letztgenannte Verbindung zum Ersetzen von X durch H, und, fakultativ, wenn B Q ist, zum Ersetzen von Q durch H behandelt wird.
• Durch die Erfindung wird ferner ein Verfahren bereitgestellt, bei dem eine Verbindung der Formel
• in der B Wasserstoff oder Q ist; Q eine Aminosäureschutzgruppe ist; V Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1, 2, 3 oder 4 Kohlenstoffatomen ist; C¹ und C² die übliche natürliche Konfiguration von natürlich vorkommenden Aminosäuren aufweisen, X Hydroxyl oder Chlor ist und Y Wasserstoff ist, behandelt wird zur Bildung einer Verbindung der Formel
• in der B' B ist, das fakultativ als Ergebnis der Behandlung durch Wasserstoff ersetzt ist.
• Durch die Erfindung wird ferner ein Verfahren bereitgestellt zur Herstellung eines Dipeptids der Formel
• bei dem ein Aminosäureester der Formel
• zum Austausch von X durch H behandelt wird, um einen Phenylalaninester der Formel
• zu erhalten, und der Phenylalaninester mit B-substituierter Asparaginsäure der Formel
• oder einem Salz derselben umgesetzt wird; wobei die Umsetzung in einem mit Wasser nicht-mischbaren Lösungsmittel in Gegenwart einer Metallo-Proteinase oder einer Nicht-Metallo-Proteinase durchgeführt wird,
• wobei B Wasserstoff oder Q ist;
• B' B ist, das fakultativ als Ergebnis der Behandlung durch Wasserstoff ersetzt ist;
• Q eine Aminosäureschutzgruppe ist,
• V Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1, 2, 3 oder 4 Kohlenstoffatomen ist; x Chlor ist und Y Wasserstoff ist.
• Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung von Lösungsmittelsystemen durchgeführt werden, die Zweiphasen- oder Mehrphasen-Systeme (z.B. eine feste gebundene Enzymphase und mit Wasser nicht-mischbare organische sowie wäßrige Phasen) einschließen, bei denen das Enzym und die Substrate in der wäßrigen Lösung gelöst werden und das Dipeptidprodukt in die organische Phase diffundiert.
• Nach einem Aspekt werden die Zusammensetzungen der Formel III vor der Kopplung reduktiv behandelt (z.B. durch katalytische Hydrierung). Derartig reduzierte Produkte schließen Phenylalanin und Phenylserin ein, insbesondere, wenn der Vorläufer Benzoylglycin ist.
• Die X:Y-Gruppen oder -Atome sind von C³ durch eines oder durch mehrere der bekannten Verfahren zur Spaltung freisetzbar, entweder vor oder nach der Peptidkopplung. Hiermit ist gemeint, daß die X:Y-Verbindung derart behandelt werden kann, daß die Atome oder Gruppen durch Wasserstoff ersetzbar sind, wodurch C³ als eine Methylengruppe, -CH&sub2;-, verbleibt. Dem Fachmann auf dem betreffenden Gebiet sind zahlreiche Verfahren der reduktiven Spaltung von Benzyl-Substituenten bekannt. Die katalytische Hydrierung ist eine der bekanntesten Typen der reduktiven Spaltung von Gruppen mit Benzylfunktionen. Erfindungsgemäß sind tatsächlich sämtliche X:Y-Gruppen oder -Atome mittels katalytischer Verfahren ersetzbar. Beispielsweise kann die Umsetzung mit Wasserstoff über Pd, Pt oder Raney-Ni durchgeführt werden, und die Gruppe X wird durch Wasserstoff ersetzt. (Einer der Hauptartikel auf diesem Gebiet ist veröffentlicht von A.M. Khan et al., Tet.Let. Nr. 24, 5. 2649-55 (1966).)
• Zusätzlich zur katalytischen Hydrierung können bestimmte Vertreter der X:Y-Gruppen durch chemische Reduktionsmittel zu Methylenen reduziert werden. Beispielsweise werden Halogensubstituenten zu Methylenen reduziert durch Umsetzung mit NaBH&sub4; NaBH&sub3;CN Zn in Essigsäure, MgH&sub2;, oder n-Bu&sub3;SnH, sowie mit anderen, dem Fachmann auf dem Gebiet bekannten chemischen Reduktionsmitteln. Bei der Auswahl eines Reduktionsmittels muß lediglich auf dessen Kompatibilität mit anderen funktionellen Gruppen in der zu reduzierenden Verbindung geachtet werden.
• Zahlreiche Beispiele für diese reduktiven Verfahren sind enthalten in der fünfbändigen Reihe The Compendium of Organic Synthetic Methods, Ed. Vol 1 und 2, Harrison und Harrison; Vol 3, Hegedus und Wade; Vol 4 und 5, Wade; Wiley-Interscience, New York, New York.
• Die vorliegend vereinzelt verwendete Ausdrucksweise "Behandlung von Q-, X- und/oder Y-Gruppen zum Ersetzen derselben durch Wasserstoff" (oder eine äquivalente Formulierung) wird im weiten Sinne verwendet, um Verfahren zur Entfernung einer oder mehrerer derartiger Gruppen und zum Ersetzen derselben durch Wasserstoff einzuschließen. Wie in diesem Abschnitt ausgeführt wird, stehen eine Reihe von Behandlungen hierfür zur Verfügung, z.B. Säurehydrolyse und verschiedene Typen der reduktiven Spaltung, einschließlich katalytischer Hydrierung; enzymatische Spaltung, chemische Reduktion, usw. In einigen Fällen sind für jede der drei Gruppen unterschiedliche Behandlungen vorgesehen. Bestimmte Gruppen sprechen bevorzugt auf bestimmte Behandlungen an, und es werden Richtlinien typischer Vorzüge bereitgestellt.
• In Formel IV (q.v.), in der R¹ = R³, und in dem Fall, bei dem die Verbindung zum Ersetzen von Q durch H durch Säurehydrolyse behandelt wird, ist das Verfahren zum Ersetzen nicht streng genommen eine reduktive Spaltung, es ist jedoch von der allgemeinen Formulierung "Behandlung zum Ersetzen durch Wasserstoff" eingeschlossen.
• Die Säurehydrolyse wird zur Entfernung der folgenden Q- Gruppen empfohlen: t-Butoxycarbonyl, Phenylacetyl, Trifluoracetyl, Acetoacetyl, Benzoyl, und t-Amyloxycarbonyl. Eine derartige Behandlung führt zum Ersetzen der Gruppe durch Wasserstoff.
• Bestimmte Q-Gruppen können enzymatisch entfernt werden, z.B. Phenylacetyl, Chloracetyl und Carbamyl. Bei einer derartigen Behandlung (durch die die Gruppe durch Wasserstoff ersetzt wird) können im Stand der Technik bekannte Verfahren angewendet werden.
• Bei der Entfernung von X-, Y- und Q-Gruppen (und deren entsprechender Ersetzung durch Wasserstoff) ist die Zugabe von Säure (z.B. einer starker Mineralsäure) wünschenswert, um die Bildung von Diketopiperazin zu unterdrücken und die Geschwindigkeit der Entfernung zu beschleunigen. Die Bildung von Salzen erleichtert die Behandlung zum Ersetzen durch Wasserstoff.
• Bei dem grundlegenden Kopplungsverfahren wird eine Asparaginsäureverbindung (eine Aminosäure) mit einer Phenylserinverbindung (einer zweiten Aminosäure) umgesetzt. Beide Verbindungen weisen asymmetrische Kohlenstoffatome auf (C¹ bzw. C² in den obigen Formeln) und können als solche natürlich vorkommen oder Derivate, Homologe oder Analoga sein, oder in anderer Weise strukturelle Ähnlichkeiten mit natürlich vorkommenden Verbindun gen aufweisen, bei denen die natürliche Konfiguration der Aminosäuren von der Fischer-Projektion wiedergegeben wird,
• in der R jede Gruppe ist, durch die die Aminosäure vervollständigt wird.
• Dem Fachmann auf dem betreffenden Gebiet sind allgemeine Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzungen der Formel III bekannt. Typisch sind die Umsetzung von Chloriden mit N-geschützten Phenylserinestern, z.B.
• und dergleichen.
• Um das erfindungsgemäße Verfahren abzuschließen, wird das Dipeptid der Formel I behandelt, um ein reduziertes Derivat zu bilden (welches Aspartam sein kann), das bedeutet (Formel 1, verkürzt)
• in der R³ = R¹ oder R², und R¹=
• und R² =
• wird reduktiv behandelt (z.B. durch Hydrierung oder dergleichen), um eine Verbindung der Formel (Formel IV)
• zu bilden, in der R³ R² ist, V Methyl ist, die Verbindung Aspartam, L-α-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester ist,
Hintergrund der Erfindung unter Berücksichtigung bestimmten Standes der Technik
• Die Herstellung von Aspartam durch enzymatische Kopplung geschützter Asparaginsäure mit Phenylalaninmethylester ist bekannt. Obgleich der Mechanismus zweifellos komplex ist, ist das Ergebnis eine einfache Dehydratation:
• Die Aminogruppe der Asparaginsäure wird mit Carbobenzoxy (d.h. einer "Q"-Gruppe) geschützt, um unerwünschte Nebenreaktionen zu verhindern.
• Aspartam ist als Süßstofflediglich in der L,L-Form geeignet, d.h., wenn seine zwei chiralen Kohlenstoffe (in diesem Fall eins im Phenylalaninrest und eins im Asparaginsäurerest) in der L-Form vorliegen. Die drei anderen optisch aktiven Isomere (L,D; D,L; und D,D) sind bitter oder geschmacklos. Es sind Verfahren unter Verwendung von Phenylalanin bekannt, die die L,L-Form ergeben, im wesentlichen frei von unerwünschten Isomeren.
• Das US-Patent 4 284 721 von Oyama et al. beschreibt die vorhergehende Reaktion zum Erhalt der L,L-Form unter Verwendung zahlreicher immobilisierter Enzyme einschließlich Thermolysin. Die Poren der immobilisierten Enzymmatrix sind mit Wasser gefüllt, und daher wird die Umsetzung von Asparaginsäure und Phenylalanin in Wasser durchgeführt. Die 2 Reaktanten sind jedoch in einem mit Wasser nicht-mischbaren organischen Lösungsmittel (z.B. Ethylacetat) gelöst, und diese Lösung kontaktiert das wasserhaltige, immobilisierte Enzym. Die Ausbeuten an L,L-ZAPM werden unterschiedlich mit 25,5-88 % angegeben, Die Erfinder der 4 284 721 veröffentlichten einen entsprechenden Artikel, in dem es um dieselbe Reaktion, Reaktanten und Enzyme geht, Oyama et al., J. Org. Chem., 1981, 46, 5241-5242. Dort heißt es: "... Substrate wandern von der organischen Schicht zu der wäßrigen Schicht des Trägers, wo die Umsetzung stattfindet, und anschließend diffundiert das Produkt in wirksamer Weise zurück in die organische Schicht ... ". In diesem Artikel wird ebenfalls erwähnt, daß im Falle organischer Lösungsmittel "die Umsetzungsrate im Vergleich zu derjenigen in wäßriger Lösung ziemlich langsam ist." Siehe auch Oyama et al., Enzymatic Production of Aspartame, Enzvme Engineering, 7, 5. 96-98, in der die Umsetzung von L-Asparaginsäure mit D,L-Phenylalanin unter Verwendung von Thermolysin zum Erhalt von L,L-Aspartam beschrieben wird. Die Reaktion wird in Wasser durchgeführt. Das Reaktionsprodukt liegt in Form einer "unlöslichen Additionsverbindung" vor, ZAPM PeOMe. (S. Isowa, unten.) Die Z-Gruppe wird mittels katalytischer Hydrierung entfernt.
• Isowa et al., Tetrahedron Letters, Nr. 28, 5. 2611-2612 (1979), beschreiben, daß die durch Thermolysin induzierte Umsetzung von Z-L-Asparaginsäure mit L-Phenylalanin-OMe in Wasser Z- L-Asp-L-Phe-Ome L-Phe-Ome ergibt. Das bedeutet, daß das L,L- Reaktionsprodukt mit dem PheOMe-Reaktant ein Additionsprodukt bildet. Das Enzym war nicht immobilisiert. Im Falle der Verwendung von racemischen Mischungen an Reaktanten wurde lediglich das L,L-Aspartamprodukt als Additionsverbindung gefällt. Der Phenylalaninanteil wurde durch Verwendung von wäßriger Salzsäure abgetrennt, und die Z-Gruppe wurde durch katalytische Hydrogenolyse entfernt, um freies L,L-Aspartam zu ergeben. Die Ausbeuten sind hoch und liegen typischerweise über 90 %. Die Bildung der artiger Additionsverbindungen durch enzymatische Kopplung in wäßrigem Medium wird auch in den US-Patenten 4 116 768, 4 119 493, 4 165 311, 4 256 836 und 4 436 925 beschrieben.
• Die Umsetzung von Z-Asp mit PheOMe in Wasser unter Verwendung von Thermolysin wird beschrieben von Petkov et al., Enzyme Peptide Synthesis, Tetrahedron Letters, 25, Nr. 34, 5. 3751-3754 (1984). Mit einem Überschuß an PheOMe wird eine Additionsverbindung gebildet (S. Isowa et al., oben). Reaktionszeiten von 3- 4 Stunden ergeben ausgezeichnete Ausbeuten (typischerweise höher als 90 %).
• Eine Zusammenfassung des Standes der Technik zur Umsetzung von Z-Asparaginsäure mit Phenylalaninmethylester unter Verwendung von immobilisiertem Thermolysin zeigt:
• a) daß die Umsetzung in Wasser schnell verläuft und hohe Ausbeuten einer Additionsverbindung Z-L,L-Asp PheOMe, 10 ergibt;
• b) daß die Umsetzung in organischer Lösung langsamer verläuft, sich aber keine Additionsverbindung abtrennt;
• c) daß, ob in Wasser oder organischer Lösung, von racemischen Reaktanten, d.h. L,D-Phe + L,D-Asp, durch Thermolysin L,L-Aspartam gebildet wird.
• Nach einem Schritt der vorliegenden Erfindung wird Methyl-2-oximinobenzoylacetat hydriert, um erythro-β-Phenylserinmethylester zu ergeben. Siehe Beispiel 4. In diesem Zusammenhang ist der folgende Artikel von Interesse.
• Elphimoff-Felkin et al., Memoires Presentes a La Société Chimique (1952), S. 252-264, beschreiben auf S. 259 die Hydrierung von Ethyl-1-oximinbenzoylacetat, gelöst in Essigsäure, in Gegenwart von PtO&sub2; unter Verwendung von Wasserstoff. Sie berichten über eine Mischung von threo- und erythro-Isomeren von Phenylserin und stellten fest, daß das erythro-Isomer vorherrschte. Eine Wiederholung ihrer Arbeit bestätigt ihr Ergebnis, denn die analysierte Mischung ergab 75 % an erythro-Isomer und 25 % an threo-Isomer. Die entsprechende Umsetzung nach der vorliegenden Erfindung weicht hinsichtlich der Verwendung eines Katalysators (Pd-Metall, nicht das französische PtO&sub2;) und hinsichtlich der Verwendung eines Lösungsmittels (Methanol, nicht die französische-Essigsäure) ab. Diese Abweichungen führen zu einer Ausbeute an im wesentlichen reinem erythro-Isomer, und ein derartiges Ergebnis war nicht vorhersehbar. Unter Anwendung des genannten französischen Verfahrens ergibt 1 g Oxim 600 mg erythro-Isomer und 200 mg threo-Isomer, eine Gesamtausbeute von 92 % (auf Oxim bezogen) und eine Ausbeute an erythro-Isomer von 54,3 %, bezogen auf Oxim. Im Vergleich dazu liegen die Ausbeuten an bei erfindungsgemäßen Vorgehen erhaltenem reinen erythro-Isomer auf gleicher Basis bei 95 + %. Siehe Beispiel 4, unter Verwendung von Methylester, und Beispiel 5, unter Verwendung von Ethylester.
Unterschiede zum Stand der Technik
• Obgleich sich Phenylserin von Phenylalanin lediglich durch den Besitz einer Hydroxylgruppe anstelle eines Wasserstoffatoms unterscheidet, verläuft dessen enzymatische Umsetzung mit Asparaginsäure erstaunlicherweise abweichend. Wie erwähnt, ergibt D,L-Phe + L-Asp in Wasser mit Enzym eine Additionsverbindung; die Reaktion verläuft rasch, die Ausbeute ist gut. Die Substitution von D,L-Phe durch D,L-erythro-β-Phenylserinmethylester ergibt demgegenüber eine Mischung von Produkten, wobei sich keine Additionsverbindung abtrennen läßt. Siehe Beispiel 9. Der Stand der Technik lehrt, daß die Umsetzung in organischem Medium langsamer abläuft als in Wasser, und man könnte erwarten, daß die Substitution von Phenylserin durch Phenylalanin zu noch schlechteren Ergebnissen führen würde als Phenylserin + Asparaginsäure in Wasser. Es ist daher überraschend, daß Phenylserin + Asparaginsäure in organischem Medium nicht nur eine ausgezeichnete Ausbeute an Dipeptid 1 ergibt, sondern etwa 2,5 mal schneller abläuft als die entsprechende Umsetzung unter Verwendung von PheOMe + L-Asp.
• Die Internationale Patentanmeldung Nr. PCT/HU84/00060 (WO- A-85/02609), angemeldet am 7. Dezember 1984, beschreibt die Hydrierung eines Phenylserinderivats der Formel
• zum Erhalt von
• in der R Wasserstoff oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl ist, Wasserstoff oder -C(:O)R&sup4; ist, und R&sup4; C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl, Aralkyl oder Aryl ist, und R&sup5; H oder -CO-R&sup4; ist. In mehreren Beispielen wird D,L-threo-Phenylserin zu Phenylalanin hydriert, und es wird die Hydrierung des erythro-Isomers erwähnt.
• Tou und Vineyard, J. Org. Chem. 1984, 49, 1135-1136, lehren die Umwandlung von threo-β-Phenyl-L-serin zum Hydrochloridsalz von thero-O-Acetyl-β-phenylserin, das durch Hydrogenolyse zu N- Acetyl-L-phenylalanin umgewandelt wird, wonach sich die Hydrogenolyse des letztgenannten zu L-Phenylalanin anschließt.
• Das Japanische Patent 7332830, WPI Zugr. Nr. 75-31430W/19, vom 28. Februar 1979, beschreibt die Kondensation von Glycin und Benzaldehyd mit Threoninaldolase.
Überblick über die Herstellung von (2S, 3S)-β-Phenylserinester
• Beachte die Formel von β-Phenylserin:
• Vier Stereoisomere sind möglich und tatsächlich bekannt: Zwei in der erythro-Form, umfassend die (2S,3S)-Konfiguration und ihr Spiegelbild, (2R,3R)-; und zwei in der threo-Form, (2R,3S)- und ihr Spiegelbild (2S,3R)-. Die racemischen Mischungen dieser vier sind ebenfalls bekannt, d.h. die erythro-Form (2RS.3RS)-, und die threo-Form (2RS,3SR)-. S. Dictionary of Organic Compounds, 5. 238-239. Diese Verwendung der absoluten Konfiguration bestätigt die Konvention von Cahn, Ingold, Prelog.
• Von den vier β-Phenylserinisomeren wird für die in Beispiel 8 beschriebene Kopplungsreaktion lediglich die (2S,3S)- Form verwendet. Dieses Isomer kann entweder in seiner reinen Form oder in der Form der erythro-racemischen Mischung (2SR,3SR)-, oder einfach (SR,SR)-, verwendet werden, wobei dieses Racemat aus (2S,3S)-β-Phenylserin und seinem Spiegelbild (2R,3R)-β-Phenylserin besteht. Von diesem Racemat (in der Ester form) tritt lediglich das (2S,3S)-Isomer in die Kopplungsreaktion des Beispiels 8 ein. Der Grund hierfür liegt darin, daß das Enzym selektiv ist und lediglich unter den Bedingungen des Beispiels 8 das (S,S)-Isomer kondensiert. Das gleiche trifft zu bei dem blockierten Asparaginsäurereaktant Q-Asp. (Für Abkürzungen und Definitionen, s.u.) Ausgehend von der Entdeckung, daß das S,S-Isomer von Phenylserin arbeitet, würde man erwarten, daß das 2S,3R-Isomer ebenfalls arbeiten würde. Wie bereits erwähnt, ist dies jedoch nicht der Fall. Es ist daher überraschend, daß das S,S-Isomer arbeitet, und zwar als einziges der vier optischen Isomere. Seine Verwendung ist tatsächlich entscheidend. Der Phenylserinreaktant kann das threo-Isomer einschließen, vorausgesetzt, daß das erythro-Isomer ebenfalls anwesend ist.
• Im Beispiel 8 ist der β-Phenylserinreaktant das erythro-Racemat, (25R.35R)-, Methylester, und dieses bevorzugte Produkt wird erhalten anhand zweier neuer Verfahren, nämlich:
• A) Kondensieren von Benzaldehyd mit Glycinmethyl-, -ethyl- oder -propylester zum Erhalt von Phenylserinester unter Verwendung von Serinhydroxymethyltrans ferase -- vorliegend als SHMT-Verfahren bezeichnet; und
• B) Kondensieren von Methylbenzoat mit einem Alkylacetat, Umwandeln des Kondensats in das β-Keto-Oxim, und Reduzieren des Oxims zu erythro-Phenylserinester -- vorliegend mit Methyl-Benzoat-Verfahren bezeichnet.
Das SHMT-Verfahren Hintergrund
• Es ist bekannt, Glycin mit Formaldehyd unter Verwendung von Serinhydroxymethyltransferase (SHMT) (ebenfalls bekannt als Serintranshydroxymethylase) zu kondensieren, um L-Serin zu erhalten. Siehe Hamilton et al., Manufacture of L-Amino Acids with Bioreactors, Trends in Biotechnology, 3, Nr. 3, 5. 64-68; und GB-A-2 130 216A vom 18. November 1983. Nakazawa et al. beschreiben im US-Patent 3 871 958, 18. März 1975, die enzymatische Kondensation von Benzaldehyd mit Glycin zum Erhalt von β-Phenylserin. SHMT ist nicht angegeben, und ob sie tatsächlich verwendet wurde, ist ungewiß. US 3 871 958 lehrt ferner die Kondensation von Benzaldehyd mit Ethanolamin. Soweit festgestellt werden kann, ist die Umsetzung von Benzaldehyd mit einem Glycinester unter Verwendung von SHMT neu. Tatsächlich wird in der Literatur offenbar lediglich in der Veröffentlichung von Ulevitch et al., Biochemistry, 16, Nr. 24, S. 5342-5363 (1977), auf Glycinester und SHMT Bezug genommen, in der die Spaltung von β-Phenylserin zu Benzaldehyd und Glycinester beschrieben wird. Diese Reaktion ist natürlich das Gegenteil des erfindungsgemßen Verfahrens.
• SHMT ist leicht verfügbar. Siehe Schirch et al., J. Bact., 163, Nr. 1, S. 1-7 (Juli 1985); und Ulevitch et al., op. cit.
• In der Literatur und in Patentschriften herrscht Unklarheit über die Identität von Enzymen, die die oben beschriebenen Umsetzungen katalysieren. Es ist über Enzyme mit den Bezeichnungen wie Threoninaldolase und Allothreoninaldolase berichtet worden. Ferner sind entsprechende D-spezifische Enzyme genannt worden. Es ist gezeigt worden, daß diese Aktivitäten dasselbe Enzym betreffen, obgleich auch gezeigt worden ist, daß unterschiedliche Enzyme diese Reaktionen katalysieren. Zur Verwirrung kommt hinzu, daß Säugerzellen mitochondriale und cytosolische SHMT- Aktivitäten aufweisen. Diese Enzyme sind deutlich verschieden, und überdies variiert die Aktivität von SHMT gegenüber verschiedenen Substraten von einer Säuger-Zelltype zur anderen.
• SHMT und ihre verwandten Enzyme sind in Eukaryonten - Pilz-, Pflanzen- und tierischen Zellen - und in Prokaryonten (Bakterien) gefunden worden. Der überwiegende Teil der über SHMT zur Verfügung stehenden Informationen basiert auf dem Enzym der Säugerzelle. Da größere Enzymmengen leichter aus bakteriellen Quellen erhältlich sind, ist im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens SHMT von Escherichia coli (E. coli) ausgewählt worden. Die erfindungsgemäß als Enzymquelle eingesetzten E. coli Stämme waren gentechnisch verändert, um erhöhte Mengen an SHMT zu bilden. SHMT ist das Produkt des E. coli-Gens g1yA. Dieses Gen wurde in das Gen für Tetracyclinresistenz von PBR322 eingeführt, wodurch transformierte Bakterien die Resistenz gegenüber diesem Antibiotikum verlieren. Das Gen liegt auf einem 3,3-Kilobasen großen SalI-EcoRI-Fragment, und das Plasmid ist mit pGS29 bezeichnet. Das Plasmid kodiert die Resistenz gegenüber Ampicillin und erlaubt somit die Auswahl von Bakterien, die mit diesem Plasmid transformiert sind. pGS29 wurde in zwei E. coli-Wirts stämme - DH2 und HB101 - eingeführt.
Beispiel 1 Herstellung von β-Phenylserinmethylester aus Benzaldehyd und Glycinmethylester unter Verwendung von SHMT aus E. coli als Katalysator
• Zellen von DH2/pGS29, die in komplexem Kulturmedium kultiviert worden waren, wurden in Phosphatpuffer + Pyridoxal-5- phosphat (P-5-P) aufgebrochen, und dieser Rohextrakt wurde als SHMT-Enzymquelle verwendet. Der Extrakt wurde einer Reaktionsmischung zugegeben, die anfänglich eine Konzentration von 150 millimolar (mM) Glycinmethylester, 100 mM Benzalydehyd und 50 mikromolar (µM) P-5-P in Phosphatpuffer bei pH-Wert 8,0 enthielten. Die Proben wurde aus den Reaktionsmischungen in Abständen von 0, 2 und 4 Stunden Reaktionszeit entnommen, Die Proben wurden durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) auf βPhenylserinmethylester analysiert. Die Mengen an erythro- und threo-Isomeren wurden anhand dieses Verfahrens ebenfalls bestimmt.
• Nach einer Reaktionsdauer von 2 Stunden waren 1,48 g/l β- Phenylserinmethylester gebildet, wovon 83 % auf das erythro-Isomer entfielen. Nach 4 Stunden hatte sich die Konzentration an β- Phenylserinmethylester auf 2,14 g/l erhöht. Zu diesem Zeitpunkt machte das erythro-Isomer 83 % der Gesamtmenge aus.
• Im Sinne der vorliegenden Erfindung erfordert SHMT Pyridoxal-5-phosphat (P-5-P), z.B. bei µM - 5 mM P-5-P pro 100 mM Benzaldehyd.
Einige Variationen des SHMT-Verfahrens
• Die Konzentration der Substrate kann variieren. Ein praktikabler Konzentrationsbereich für Benzaldehyd liegt bei etwa 10 bis 100 mM, wobei eine Konzentration von etwa 100 mM bevorzugt ist. Die Konzentration an Glycinester kann innerhalb des Bereichs von etwa 10 bis 150 mM liegen. Die Obergrenze ist lediglich durch die Löslichkeit des Esters festgesetzt, welche bei etwa 150 mM liegt. Es ist bevorzugt, daß die Reaktionsmischung mit Glycinester gesättigt ist.
• Die SHMT kann immobilisiert sein, wobei jedes Trägermaterial und Verfahren zur Immobilisierung angewendet werden können, die im Stand der Technik bekannt sind. In dem Beispiel wurden vollständige Zellen verwendet, dies ist jedoch nicht erforderlich.
• In dem Beispiel wurden 0,6 Einheiten SHMT pro ml verwendet. Die Konzentration kann bis auf 0,05 Einheiten/ml herabgesenkt werden. (Eine Einheit von SHMT entspricht derjenigen Enzymmenge, die die Bildung von 1 Mikromol Benzaldehyd pro Minute aus Phenylserin katalysiert.)
• Die Kopplungsreaktion kann bei etwa 10 bis 65 ºC durchgeführt werden, wobei der bevorzugte Bereich 30 bis 40 ºC ist. Die Reaktionsmischung sollte auf einem pH-Wert von etwa 6,5-9, vor zugsweise bei 7,5-8, gehalten werden. Die Synthese kann chargenweise oder kontinuierlich erfolgen. Nach einer Ausführungsform kann die Reaktion in einem mit Wasser mischbaren (z.B. Methanol) oder in einem mit Wasser nicht-mischbaren organischen Lösungsmittel (z.B. Ethylacetat) durchgeführt werden.
B) Das Methylbenzoat-Verfahren
• Das Methylbenzoat-Verfahren zur Herstellung von β-Phenylserin läßt sich damit zusammenfassen, daß i) Methylbenzoat mit niederem Alkylacetat (z.B. wie vorliegend mit Methylacetat) in Gegenwart von Natrium kondensiert wird, um Methylbenzoylacetat und das Nebenprodukt Methylalkohol zu bilden. ii) Dieses wird mit Natriumnitrit behandelt, um das Oxim zu ergeben, welches anschließend iii) hydriert wird, um eine racemische Mischung (1:1 S,S/R,R) von β-Phenylserinstereoisomeren zu bilden, d.h. β- Phenylserinmethylester als erythro-Racemat.
• Die Schritte i) und ii) sind seit langem bekannt, und iii) wird erfindungsgemäß auf neuem Wege ausgeführt. Die integrierte Reihenfolge der Schritte i), ii) und iii), wie sie zuvor grob dargelegt wurden, wird als neu angesehen, was auch für die Gesamtheit der Schritte ii) und ii) gilt. Demgemäß schließt die Erfindung i) + ii) + iii) sowie ii) + iii) ein.
• Auf das folgende Schema wird Bezug genommen. (Formel VIII) H&sub2;, Katalysator
• Das Produkt der Formel VIII ist eine racemische Mischung, d.h. (SR,SR)-Phenylserinmethylester, oder erythro-β-Phenylserinmethylester. Dieses Racemat bildet den Ausgangsreaktant für die nächste Stufe der Erfindung, die Kopplung von (S,S)-Phenylserinester mit Q-Asparaginsäure gemäß Beispiel 8. Es folgen expenmentelle Einzelheiten der Herstellung von erythro-β-Phenylserinmethylester-Hydrochlorid und dessen Vorläufer.
Beispiel 2 Herstellung von Methylbenzoylacetat
• PhCOOCH&sub3; + CH&sub3;COOCH&sub3; + Na T PhCOCH&sub2;COOCH&sub3; + CH&sub3;OH
• Ein 1-Liter fassender Kolben, der mit einem mechanischen Rührer, einem Rückflußkühler und einem Stickstoffeinlaß (um das Na zu schützen) ausgestattet war, wurde zur Kontrolle der Temperatur in ein Wasserbad getaucht (d.h. um gegebenenfalls Wärme und Kälte zuzuführen). In den Kolben wurden 272,3 g (2 Mol) Methylbenzoat, 74,1 g (1 Mol) Methylacetat, 1 Grammatom - 23 g Na, sowie 32 g (1 Mol) Methanol (um mit dem Na zu reagieren und die Reaktion auszulösen) gegeben. Der Kolben wurde mit Stickstoff gespült und während der gesamten Reaktion unter einem Stickstoffüberdruck gehalten. Die Lösung wurde über Nacht auf 80-85 ºC erhitzt, währenddessen sämtliches Na-Metall verbraucht wurde. Die resultierende, gelbe heterogene Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und in einen Trenntrichter gegeben, der 130 ml an konzentrierter Salzsäure und 200 g gebrochenes Eis enthielt. Es wurde geschüttelt, und die untere wäßrige Phase wurde entfernt. (Bei diesem Schritt reagiert das Na in dem Na- Methylbenzoylacetat mit HCl und wird als NaCl entfernt.) Das verbleibende Material wurde anschließend gewaschen mit Wasser, 2 x 100 ml, gesättigter NaHCO&sub3;-Lösung, 2 x 100 ml, und schließlich mit 2 x 100 ml gesättigter Kochsalzlösung (NaCl). (Das Nebenprodukt Methanol verbleibt mit dem Wasser in den Wasserwaschungen.) Die verbleibende gelbe organische Phase wurde anschließend in einen Destillierkolben überführt und durch eine Vigreux-Säule von 12 Zoll bei einem Druck von 0,5 mm Hg fraktioniert. Ein Vorlauf, der Methylbenzoat und Methylacetoacetat enthielt, wurde bei 37-42 ºC und 0,5 mm Hg gesammelt. Anschließend folgte eine Fraktion von 82,5 g Methylbenzoylacetat, das bei 81-84 ºC und 0,5 mm Hg siedete. Die Ausbeute des reinen Produkts Methylbenzoylacetat in Form einer wasserweißen Flüssigkeit betrug, bezogen auf Na, 46,3 %.
Beispiel 3 Herstellung von Methyl-2-oximinobenzoylacetat
• PhCOCH&sub2;COOCH&sub3; + NaNO&sub2;/HOAc T PhCOC(:NOH)COOCH&sub3;
• Die Vorrichtung war ein 500 ml Kolben, ausgestattet mit einem magnetischen Rührer und einem Zugabetrichter. In den Kolben wurden 44,55 g (250 mM) reines Methylbenzoylacetat und 100 ml Eisessig gegeben. Diese Lösung wurde auf 10-12 ºC abgekühlt (Eisbad) und während der Zugabe von 20 g (290 mmol) in 35 ml Wasser gelöstem NaNO&sub2; auf dieser Temperatur gehalten. Nachdem die Zugabe erfolgt war (30-45 Minuten), ließ man die Lösung auf Raumtemperatur erwärmen und rührte für weitere 2 Stunden, währenddessen sich aus der Lösung weiße Kristalle absetzten. Die Lösung wurde anschließend in 500 ml Wasser gegeben, und dieser Ansatz wurde filtriert. Der weiße Filterkuchen wurde anschließend zweimal mit 100 ml Wasser gewaschen und getrocknet, um 48,9 g des Oximprodukts mit einem Schmelzpunkt von 134-136 ºC zu ergeben. Eine aus Toluol rekristallisierte Probe ergab weiße Nadeln, Schm.p. 135-136,5 ºC.
Beispiel 4 Herstellung von erythro-β-Phenylserin methylester-Hydrochlorid
• PhCOC(:NOH)COOCH&sub3; +H&sub2;/Katalysator) T PhCH(OH)CH(NH&sub2;)COOCH&sub3;
• Eine mit einem Schüttler ausgestattete Parr-Flasche von 500 ml wurde für die Reduktion verwendet. In die Flasche wurden 20,7 g (100 mmol) des Oxims, 200 ml methanolisches Lösungsmittel, 15 ml konzentrierte HCl und, als Hydrierungskatalysator, 500 mg von 5 % Pd (Metall) auf Aktivkohle gegeben. Die Flasche wurde verschlossen und unter Vakuum entgast. Danach wurde der Schüttler angestellt, und die Flasche wurde bei einem Wasserstoffüberdruck von 15-18 psi mittels eines Hochdruckwasserstofftanks gehalten, der zu einem Niederdrucktank führte, welcher mit der Parr-Flasche verbunden war, bis die Wasserstoffadsorption abnahm (angezeigt durch einen kalibrierten Meßpunkt auf dem Hochdruckwasserstofftank). Es wurden etwa 1,75-2,5 Stunden benötigt. Die Flasche wurde anschließend entlüftet und unter Vakuum entgast. Während der Hydrierung traten einige Feststoffe des Reaktionsprodukts aus der Lösung aus, und die Flasche wurde auf 60 ºC erhitzt, um diese Feststoffe wieder zu lösen. Anschließend wurde die heiße Lösung durch einen Kuchen aus Diatomeenerde (Celite ) filtriert, um den Katalysator zu entfernen. Das Filtrat wurde anschließend auf 0 ºC abgekühlt, und glitzernde, silberweiße Plättchen wurden abgesetzt. Dieses Material wurde durch Filtration gesammelt, um 13,6 g des Produkts erythro-β- Phenylserinmethylester-Hydrochlorid zu ergeben. Die Konzentration der Mutterlauge ergab weitere 8,2 g des Produkts. Die Gesamtausbeute an Material betrug 21,8 g, oder 95,2 %; Schm.p. 168-169 ºC.
• ¹H NMR (400 MHz) (freie Base, CDCl&sub3;) δ 1,65 (breites Singulett 2H); 3.66 (Singulett, 3H), 3.78 (Dublett, J = 5.78, 1 H); 4.92 (Dublett, J = 5.78, 1 H); 7.28 (komplexes Multiplett, 5 H). Bei diesem Lauf ist ein geeigneter H&sub2;-Überdruck 15-60 psi.
Beispiel 5 Herstellung von erythro-β-Phenylserin ethylester-Hydrochlorid
• Der Vorgehensweise des Beispiels 3 wurde gefolgt mit der Abweichung, daß der Lauf mit Ethylbenzoylacetat gestartet wurde, das im Handel erhältlich ist. Das entsprechende Oxim, Ethylester, wurde wie in Beispiel 3 mit einer Ausbeute von 97 % in Form feiner weißer Nadeln mit einem Schm.p. von 122,5-123 ºC hergestellt. Dieses Oxim wurde wie in Beispiel 4 hydriert, um eine Ausbeute an Phenylserinethylester-Hydrochlorid von 94,9 % zu ergeben, Schm.p. 173-174 ºC. Dies war das reine erythro-Isomer, wie durch NMR festgestellt wurde. Es wurde kein threo-Isomer nachgewiesen. ¹H NMR (400 MHz) (freie Base, CDCl&sub3;) δ = 1.19 (Triplett, J = 7.16, 3H), 2.0 (breites Singulett; 3.77 (Dublett, J = 5.70, 1 H); 4.10 (Dublett von Quartetts, J = 7.16, Jgem = 4.29, 2H); 4.93 (Dublett, J = 3.70, 1 H); 7.29 (komplexes Multiplett, 5 H).
• Diese Methanol/HCl-Lösungen von im wesentlichen reinen niederen erythro-β-Phenylserinalkylestern werden als neu angesehen. Sie sind insbesondere geeignet als Quellen an niederen (2S,3S)-β-Phenylserinalkylestern zur Umsetzung mit Q-Asparaginsäure durch das erfindungsgemäße Verfahren, wie nachfolgend beschrieben wird.
Dipeptidbildung Ein Überblick
• In der nächsten Stufe der Erfindung wird (S,S)-β-Phenylserin oder ein Ester oder Analogon wie oben beschrieben mit Q- Asparaginsäure zur Bildung eines Dipeptids gekoppelt, welches anschließend in zwei Schritten (oder fakultativ in einem Schritt) hydriert wird, um Aspartam oder ein Analogon als Endprodukt zu bilden.
• Asparaginsäure verfügt über ein chirales Kohlenstoffatom, wodurch zwei optisch aktive Isomere bereitgestellt werden. Zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird das L-Isomer (S-Konfiguration) benötigt. Eine Mischung von L- und D- (S und R)-Formen kann eingesetzt werden, aber die L- (d.h. S-)Form ist der wirksame Reaktant. Z-L-Asparaginsäure ist im Handel erhältlich und wird bevorzugt verwendet. Sofern nicht anders angegeben, bezeichnet "Q-Asparaginsäure" die L- (d.h. S-)Form.
• Das Kopplungsverfahren (eigentlich eine Dehydratation) läuft wie folgt ab:
• Schritt 1. Ein niederer erythro-β-Phenylserinalkylester (Methylester wird vorliegend beispielhaft verwendet) wird mit geschützter Asparaginsäure (mit Z als beispielhafter Schutzgruppe) in organischem Medium in Anwesenheit einer Metallo-Proteinase als Kopplungsenzym (beispielhaft wird immobilisiertes Thermolysin verwendet) wie folgt umgesetzt: (Formel VIII) (Formel IX) β-Phenylserinmethylester N-Carbobenzoxyasparaginsäure (Formel X, "Dipeptid I")
• welche einen N-Carbobenzoxy-L-α-aspartyl-L-erythro-β-phenylserinmethylester bezeichnet. Unter Verwendung der absoluten Konfiguration ist es N-Carbobenzyloxyy-(S)-α-aspartyl-(2S,3S)-β- phenylserinmethylester. Der Einfachheit halber wird hierauf nachfolgend gelegentlich als "Dipeptid I" hingewiesen. Das Dipeptid I wird als neu angesehen, was auch für die Klasse der Dipeptide gilt, die dieses umfassen, wo Me im allgemeinen ein niederes Alkyl und -COOCH&sub2;Ph im allgemeinen Q ist. (Siehe Formel XII, unten).
• Im nächsten Schritt wird das Dipeptid I unter Verwendung von Pd auf Aktivkohle unter relativ milden Bedingungen katalytisch hydriert, um dadurch die schützende Gruppe Z zu entfernen. Die resultierende Verbindung ist (Formel XI, Hydroxyaspartam)
• und bezeichnet L-α-Aspartyl-L-erythro-β-phenylserinmethylester, oder Hydroxyaspartam. Unter Anwendung der absoluten Konfiguration ist Hydroxyaspartam (S) -α-Aspartyl-(2S,3S)-β-phenylserinmethylester. Dieser ist als Süßstoff geeignet. Hydroxyaspartam wird gleichermaßen als neu angesehen. Es ist im nachfolgend beschriebenen nächsten Schritt unmittelbar geeignet:
• Die Hydrierung wird bei höheren Temperaturen und Drücken fortgeführt, wodurch die -OH-Gruppe des Phenylserinrests reduziert wird, um Aspartam zu ergeben. (Formel V, Aspartam)
• Aspartam ist L-α-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester.
• Nach einer Ausführungsform erfolgt die Hydrierung des Dipeptids I direkt zu Aspartam. Hydroxyaspartam ist ein Zwischenprodukt. Siehe Beispiel 13.
• Nachfolgend werden experimentelle Einzelheiten zur Herstellung des Dipeptids I erläutert. Diese Herstellung beinhaltet die Bildung von Vorläufern, nämlich immobilisiertes Thermolysin und dessen Aktivierung, sowie die Herstellung des freien Phenylserinesters. Die Daten zur Herstellung immobilisierten Thermolysins und zu dessen Aktivierung folgen der Literatur und werden vorliegend der Vollständigkeit halber dargelegt.
Beispiel 6 Herstellung von immobilisiertem Thermolysin
• Ein Polyacrylatharz (3 g), im Handel unter Amberlite XAD-7 erhältlich, wurde auf einer Glasfritte mit Ethanol und mit einem 25 mM Tris-HCl-Puffer, pH-Wert 7,5, der 16 Irim Calciumchlorid enthielt, gewaschen. "Tris" ist eine Abkürzung für Tris(hydroxymethylaminomethan). 750 mg Thermolysin wurden in 15 ml eiskaltem 25 mM Tris-HCl-Puffer gelöst, enthaltend 126 mM Calciumchlorid und 5 mM Natriumbromid, pH-Wert 7,50 Das gewaschene Harz wurde der Enzymlösung zugegeben, und die Mischung wurde im Kälteraum bei 4 ºC 17 Stunden lang geschüttelt. Ein Teil der Lösung (7,5 ml) wurde abgezogen, und 7,5 ml 25%iges Glutaraldehyd (Vernetzungsmittel) wurden zugegeben, um 15 ml Gesamtsuspension zu ergeben, welche 3 Stunden lang bei 4 ºC geschüttelt wurde. Das auf diese Weise immobilisierte Enzym wurde über eine Glasfritte filtriert und mit 0,1 M Tris HCl, pH-Wert 7,5, enthaltend 5 mM Calciumchlorid und 1 M Natriumchlorid, gewaschen, und erneut gewaschen mit demselben Puffer, der jedoch kein Natriumchlorid enthielt. Die Konzentration des immobilisierten Enzyms betrug 50-80 mg/g von feuchtem Harz.
• In einem Trenntrichter wurde eine zweiphasige Flüssigkeit hergestellt, die 50 ml Ethylacetat und 50 ml 0,1 M 2(N-Morpholino)ethansulfonsäure bei pH-Wert 6,0 umfaßte. Diese Mischung wurde unter gelegentlichem Schütteln 20 Minuten lang inkubiert. Die Phasen wurde getrennt und das immobilisierte Thermolysin (6 g) wurde der gesättigten wäßrigen Phase zugegeben, und die Mischung wurde behutsam 20 Minuten lang bei 40 ºC geschüttelt, filtriert und stand der Verwendung gemäß Beispielen 8 und 10 zur Verfügung. Die gesättigte organische Schicht wurde in den Beispielen 8 und 10 als Reaktionsmedium eingesetzt.
Beispiel 7 Herstellung von Phenylserinester als freie Base
• Die Kopplungsreaktion gemäß Beispielen 8 und 10 erfordert die freie Basenform des niederen Phenylserinalkylesters. Daher wird das Esterhydrochlorid aus Beispiel 4 mit einer Base wie folgt neutralisiert, um den freien Ester zu ergeben. D,L-erythro-β-Phenylserinmethylester-Hydrochlorid, 7 g, und Natriumcarbonat, 3,2 g in 125 ml Wasser, sowie 200 ml Chloroform wurden in einem 500 ml fassenden Trennkolben geschüttelt. Die beiden Phasen wurden getrennt, und die wäßrige Phase wurde zweimal mit 100 ml Chloroform extrahiert. Die organische Phase wurde mit gesättigtem Natriumchlorid gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, und bis zur Trockene eingedampft, um einen farblosen Feststoff des Phenylserinesters als freie Base zu ergeben. Schm.p. 100-101 ºC.
Beispiel 8 Kopplung des erythro-β-Phenylserinmethylesters mit Z-Asparaginsäure zur Herstellung des Dipedtids I
• Das in Beispiel 6 hergestellte immobilisierte Thermolysin (6 g) wurde einem 125 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben zugegeben, welcher 1,12 g (4,2 mM) Z-Asparaginsäure und 2,5 g D,L-erythro- Phenylserinmethylester (12,8 mmol) in 30 ml gesättigtem Ethylacetat aus Beispiel 6 enthielt. Die Reaktionsmischung wurde 8 Stunden lang bei 40 ºC in einem mechanischen Schüttler geschüttelt. Der Reaktionsverlauf wurde mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) überwacht. Nach 8 Stunden waren gemäß HPLC-Analyse 93 % der Z-Asparaginsäure verbraucht. Das immobilisierte Enzym wurde abfiltriert und mit Ethylacetat gewaschen. Die organische Phase wurde zweimal mit 20 ml 1 M HCl und mit 20 ml Wasser gewaschen und anschließend über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Filtration und das Einengen ergab ein Öl in Form des Dipeptids 1, nämlich N-Carbobenzoxy-L-α-aspartyl-L-erythro- β-phenylserinmethylester. (Nicht-umgesetzter Phenylserinester wurde als Hydrochlorid im HCl-Waschvolumen entfernt.) Das Dipeptid-Öl I wurde in einer minimalen Menge an Chloroform gelöst, und es wurde Hexan zugegeben, bis sich die Lösung trübte. Das Dipeptid I-Produkt kristallisierte aus dieser Lösung in Form leicht gefärbter (gelber) Kristalle aus. (Die Farbe kann gewünschtenfalls durch Behandlung mit entfärbender Aktivkohle beseitigt werden.) Ausbeute an Dipeptid 1, 1,2 g; Schm.p. 127-128 ºC; [α]D²&sup0; = -7,0º (C = 1, Methanol).
• ¹H NMR (400 MHz) (δ): 2.61 (Dublett von Dublett, Jgem = 17.2 Hz, Jvic = 5.5 Hz, 1-H), 2.95 (Dublett von Dublett, Jgem = 17.2 Hz, Jvic = 4.4 Hz, 1-H), 3.49 (Singulett, 3-H), 4.51 (Multiplett, 1-H), 4.83 (Dublett von Dublett, JCH-NH - 8.0 Hz, Jvic 3.6 Hz, 1-H), 5.02 (Singulett, 2-H), 5.07 (Dublett, Jvic 3.6 Hz, 1-H), 6.23 (Dublett, J = 8 Hz, 1-H), 7.1-7.3 (komplex, aromatische CH, 10-H).
• ¹³C NMR (100.6 MHz) (δ); 36.16 (CH&sub2;), 51.01 (CH), 51.74 (CH&sub3;), 58.90 (CH), 66.86 (CH&sub2;), 73.64 (CH), 125.60, 127.40, 127.82, 128.23, 135.77, 139.36 (aromatische C-H), 155.81, 169.20, 170.86 und 173.22 (C=O).
• Massenspektrum: 445 [(M + H)&spplus;], 427 [(M + H - H&sub2;O)&spplus;].
Beispiel 9 Versuchte Koddlung von erythro-β-Phenylserinmethylester und Z-Asparaginsäure in Wasser zur Herstellung des Dipeptids I
• In 12 ml Wasser wurden 534 mg (2 mmol) Z-Asparaginsäure und 926 mg (4 mmol) erythro-β-Phenylserinmethylester-Hydrochlorid gelöst, und der pH-Wert wurde mit 4 N NaOH auf 6,2 eingestellt. Es wurden 10 mg Thermolysin zugegeben, und die Lösung wurde bei 40 ºC geschüttelt. Nach 3 Stunden waren einige Feststoffe gefällt, und nach 15 Stunden wurden zwei Phasen erhalten. Die untere Phase wurde mit Ethylacetat extrahiert. Eine HPLC-Analyse zeigte, daß sie hauptsächlich Benzaldehyd enthielt. Die Reaktion wurde aufgrund des Abbaus von Phenylserin zu Benzaldehyd und Glycin-Me-Ester abgebrochen. Bei 20 ºC schreitet die Umsetzung jedoch unter Bildung eines Produktes fort, wenn der Ethylester eingesetzt wird.
• Die ausbleibende Bildung eines unlöslichen Additionsprodukts in Wasser sollte mit den Ergebnissen unter Verwendung von Phenylalanin verglichen und unterschieden werden.
Beispiel 10 Synthese von N-tert.-Butoxycarbonyl-β-aspartyl-L-erythrophenylserinmethylester
• Das immobilisierte Thermolysin aus Beispiel 6 (6 g) wurde einem 125 ml Erlenmeyer-Kolben zugegeben, welcher 0,5 g (2,1 mmol) N-BOC-L-Asparaginsäure und 1,22 g (6,3 mmol) D,L- erythro-Phenylserinmethylester in 20 ml Puffer-gesättigtem Ethylacetat enthielt. Die Reaktionsmischung wurde 10 Stunden lang bei 40 ºC geschüttelt. Das Produkt wurde gemäß Darlegung in Beispiel 8 isoliert. Nach dem Eindampfen des Lösungsmittels wurde das Produkt als gelblicher Schaum erhalten.
• ¹H NMR δ 2.7 (Dublett von Dublett, Jgem = 15 Hz, Jvic = 5 Hz, 1-H), 2.8 (Dublett von Dublett, Jgem = 15 Hz, Jvic = 4 Hz, 1-H), 3.5 (Singulett, 3-H), 3.55 (Singulett, 9-H), 4.55 (Multiplett, 1-H), 4.85 (Multiplett, 1-H), 5.25 (breites Singulett, 1- H) und 7.15-7.4 (komplex, aromatische CH).
• Massenspektrum: 411 [(M+H)&spplus;], 355 [(M+H-C&sub4;H&sub8;)&spplus;], und 337 [(M+H-C&sub4;H&sub1;&sub0;0)&spplus;].
Beispiel 11 Hydrierung des Dipeptids 1 zur Bildung von Hydroxyaspartam. L-α-Aspartyl-L-erythro-β-phenylserinmethylester
• Bei diesem Schritt wird die Z-Gruppe des Aspartylrests des Dipeptids 1 durch H ersetzt. In ein Teströhrchen von 15 x 150 mm wurden 200 mg (0,5 mmol) des Dipeptids I (N-Carbobenzoxy-L-α-aspartyl-L-erythro-β-phenylserinmethylester) gegeben. In das Teströhrchen werden 2 ml Eisessig, 0,1 ml (1,2 mx) konzentrierte HCl und 80 mg 20 % Pd(OH)&sub2; auf Aktivkohle eingebracht. Dieses Röhrchen wurde in eine 500 ml Parr-Flaschen überführt. Die Flasche wurde verschlossen und unter Vakuum entgast sowie nachfolgend mit einem Wasserstoffüberdruck von 3 x 25 psi gespült. Die gespülte Lösung wurde anschließend geschüttelt und mit Wasserstoff bei Umgebungstemperatur auf einem Überdruck von 45 psi gebracht. Ein Aliquot dieser Lösung wurde nach 2,5 Stunden analysiert und zeigte, daß weniger als 2 % des Ausgangsmaterials verblieben. Die Lösung wurde anschließend filtriert, und der Katalysatorkuchen wurde zweimal mit 1 ml Methanol gewaschen. Das resultierende Filtrat wurde anschließend bei Raumtemperatur unter hohem Vakuum konzentriert, um einen blaßgelben Schaum zu ergeben. Dieses Material wurde in 1,5 ml Wasser aufgenommen, um eine trübe Lösung zu ergeben, welche filtriert wurde. Das Filtrat, eine klare blaßgelbe Flüssigkeit, pH-Wert 2,05, wurde anschließend mit NNAOH auf einen pH-Wert von 5,1 eingestellt. Dies erfolgte, um das HCl-Salz des erwünschten Produkts zu "neutralisieren", indem es auf seinen isoelektrischen Punkt gebracht wurde. An diesem Punkt ist das Produkt Hydroxyaspartam ein Öl. Mittels HPLC wurde reines Material erhalten; oder in Form sehr feiner Nadeln aus Wasser/Ethanol bei pH-Wert 5.
• Das Hydroxyaspartam bildet leicht Salze, z.B. das Trifluoracetat, Hydrochlorid, Hydrobromid, Bisulfat, Dihydrogenphosphat und dergleichen.
Hydroxyaspartam-Süßstoff
• Hydroxyaspartam kann in Verbrauchsgüter in einer Vielzahl von physikalischen Formen eingearbeitet werden, z.B. in Pulver, Tabletten, Körnchen, Dragees, Lösungen, Suspensionen, Sirups, Emulsionen und dergleichen. Sie können verwendet werden in Kombination mit geeigneten nicht-toxischen Süßstoffträgern wie Wasser, Ethanol, Sorbit, Glycerol, Zitronensäure, Maisöl, Erdnußöl, Sojabohnenöl, Sesamöl, Propylenglykol, Maissirup, Ahornsirup, flüssigem Paraffin, Lactose, Cellulose, Stärke, Dextrin, und anderen modifizierten Stärken; und Mono-, Di- und Tricalciumphosphat.
• Kombinationen von Hydroxyaspartam mit Zucker oder synthetischen Säßstoffen wie Saccharin können in gleicher Weise in Verbrauchsmaterialien eingearbeitet werden.
• Spezifische Beispiele von Konsum- bzw. Verbrauchsgütern, die Hydroxyaspartam enthalten, sind Früchte, Gemüse, Säfte, Fleischprodukte wie Hack, Schinken und Wurst; Eierprodukte; Fruchtkonzentrate; pulverisierte Getränkekonzentrate; Gelatinen; Marmeladen; Gallerten; Konservierungsmittel; Milchprodukte wie Eiscreme, Sorbet und Sauerrahm; Sirups wie Molassen; Mais-, Weizen-, Sojabohnen- und Reisprodukte wie Brot, Getreide, Pasta und Kuchenmischungen; Fisch; Käse und Käseprodukte; Nußkerne und Nußprodukte; Getränke wie Kaffee, Tee; kohlensäurefreie und kohlensäurehaltige alkoholfreie Getränke; Biere, Weine, und andere Spirituosen; Konfekte wie Süßigkeiten und Bonbons mit Fruchtgeschmack; Würzmittel wie Kräuter, Gewürze und Würzen; Geschmacksverstärker wie Mononatriumglutamat; Kaugummi; Fertigmischungen; Puddinge; und Kaffeeweißer. Konsumierbare Toilettenartikel wie Mundwässer und Zahnpasta sowie geschützte und nicht-geschützte pharmazeutische Präparate können mit Hilfe von Hydroxyaspartam ebenfalls gesüßt werden.
• Die Menge an Hydroxyaspartam, die dem Konsumartikel zugegeben wird, ist die Menge, welche das erwünschte Ausmaß an Süße liefert. Dies kann leicht durch Geschmackstests ermittelt werden.
• Hydroxyaspartam kann Verbrauchsgütern innerhalb eines großen Anteilsbereiches zugegeben werden, typischerweise innerhalb des Bereichs von 0,05-3 Gew.-%. Die folgende Liste von Dosierungen dient der Veranschaulichung, nicht aber der Beschränkung.
• Während der Verdauung im menschlichen Verdauungstrakt hydrolysieren Hydroxyaspartam und seine Ester-Homologe zurück zu den einzelnen Aminosäuren, einschließlich Phenylserin oder sein niederes Alkylester-Homolog, je nachdem. Demgemäß fällt bei dem Metabolismus kein Phenylalanin-Zwischenprodukt an.
• Die niederen Alkylester-Homolog von Hydroxyaspartam sind ebenfalls als Süßstoffe geeignet und können in derselben Weise wie Hydroxyaspartam eingesetzt werden.
• Wenn freies Hydroxyaspartam erhitzt wird, neigt es zum Ringschluß unter Bildung von Diketopiperazin. Wenn man Hydroxyaspartam verschiedenen Reaktionen unterwirft, bei denen Q-Gruppen durch Wasserstoff ersetzt werden oder eine Hydrierung oder dergleichen geschieht, ist es im allgemeinen wünschenswert, die Reaktion in Gegenwart einer Säure durchzuführen. Die Säure stabilisiert das Hydroxyaspartam unter Bildung des entsprechenden Salzes und unterdrückt die Bildung von Diketopiperazin. Diese Technik (unter Verwendung von HCl) wurde in Beispiel 11 angewendet. In Beispiel 12 wird die BOC-Gruppe durch Säurehydrolyse unter Verwendung von Trifluoressigsäure entfernt, und Hydroxyaspartam wird als Trifluoracetatsalz stabilisiert. Dieses Salz wird in Beispiel 13 in Methanol-HCl hydriert.
Beispiel 12 Herstelllung von Hydroxyasdartam-trifluoracetat Entfernung der t-Butoxy-Gruppe von t-Butoxyaspartyl phenylserinmethylester
• In einen 500 ml Kolben wurden 504 mg (1,2 mmol) t-Butoxyaspartyl-phenylserinmethylester und 5 ml Trifluoressigsäure gegeben. Diese Lösung ließ man 1 Stunde lang bei Raumtemperatur stehen. Eine HPLC-Analyse ergab zu diesem Zeitpunkt eine Umwandlung von 100 %, und das Produkt wurde durch Zugabe von 50 ml Ether zu der Lösung isoliert, und man ließ das Produkt kristallisieren. Dieses Material wurde mittels Filtration gesammelt und mit 10 ml wasserfreiem Ether gewaschen und unter Vakuum bei 56 ºC über Nacht getrocknet, um 329,6 mg (64,7 % Ausbeute) an reinem Hydroxyaspartam-trifluoracetat zu ergeben. Schm.p. 155- 156,5 ºC, mit Zersetzung. [α]²² D = 20.94. (C = 1.06 H&sub2;O). Beobachtete Drehung = +0,222º ± 0,001.
• ¹³C - NMR (100.6 MHz) (D&sub2;O) δ = 35.62; 50.13; 53.79; 59.40; 73.52; 117.20 (Quartett, J19F-13C = 291 Hz); 127.34; 129.62; 139.64; 163.76 (Quartett, J19f-13C = 34.9 Hz); 169.21; 171.98; 173.45.
• ¹N - NMR (400 MHz) (DMSO d&sub6;) δ = 8.82 (Dublett, J = 8.0 Hz, 1H); 7.30 (komplexes Multiplett, 5H); 5.97 (breites Singulett, 1H); 4.83 (Dublett, J = 4.3 Hz, 1H); 4.53 (Triplett, J = 7.5 Hz, 1H); 4.02 (Dublett von Dubletts, J = 4.3 Hz, J 400 8.0 Hz, 1 H); 3.56 (Singulett, 3 H); 3.35 (breites Singulett, 3 H); 2.71 (zwei Dubletts von Dubletts, J = 7.5 Hz, J = 17.3 Hz, 3 H).
Beispiel 13 Reduktion von Hydroxyaspartamtrifluoracetat zu Aspartam
• In eine 500 ml Parr-Flasche wurden 10 ml Methanol, 100 mg Pd(OH)&sub2; auf Aktivkohle und 212,2 mg (0,5 mmol) α-L-Asp-L-ery thro-PhSerOMe CF&sub3;COOH gegeben. Es erfolgte die Zugabe von 1 ml N HCl, und die resultierende Lösung wurde entgast und gespült mit 3 x 25 psi H&sub2;-Überdruck. Die Flasche wurde anschließend entlüftet und der Katalysator wurde von der Lösung abfiltriert.
• Die Lösung wurde anschließend unter Vakuum auf 1 ml konzentriert, und der pH-Wert wurde mit 6 N NaOH auf 5,1 eingestellt. Die resultierende Lösung wurde über Nacht auf 0-5 ºC abgekühlt, und die Aspartamkristalle wurden auf einem Büchner-Trichter gesammelt und mit 0,75 ml absolutem Ethanol gewaschen. Nach dem Trocknen unter Vakuum für eine Dauer von 5 Stunden bei 56 ºC wiesen die reinen weißen Aspartamkristalle ein Gewicht von 139,8 mg auf.
Einstufige Hydrierung
• Wie zuvor erwähnt, kann das Dipeptid I (oder Verbindungen der Dipeptid I-Klasse) direkt in einem Schritt zum Endprodukt hydriert werden, wodurch in einem Arbeitsgang die Q-Gruppe am Asparaginsäurerest sowie die Hydroxylgruppe am Phenylserinrest entfernt werden. Das Ergebnis ist das endgültige Esterprodukt (Aspartam, wenn Alkyl Methyl ist): (Formel XII Dipeptid I-klasse) Niederes Alkyl Katalysator (Aspartam oder Ester-Homolog) Niederes Alkyl
Beispiel 14 Direkte Hydrierung des Dipeptids I zu Asdartam
• Die Vorgehensweise des Beispiels 11 wurde wiederholt mit der Abweichung, daß das zur Hydrierung ausgewählte Lösungsmittel 8,5 ml Methanol war. 390,9 mg (0,88 mmol) vom Dipeptid 1 wurden verwendet, mit 1,5 ml N HCl (1,5 mmol). Die Parr-Flasche wurde auf einen Wasserstoffüberdruck von 60 psi gebracht, und die Lösung wurde auf 45 ºC erhitzt. Die Reaktionszeit betrug 6 Stunden. Am Ende der Reaktionsdauer wurde die Suspension filtriert, und das Methanol wurde bei Raumtemperatur unter hohem Vakuum entfernt. Das verbleibende Material wurde in 8 ml Wasser gelöst, und der pH-Wert wurde mit 6 N NaOH von 1,5 auf 5,1 angehoben. Die resultierende Lösung wurde auf 0º -5ºC abgekühlt, und das Aspartam kristallisierte. Die Kristalle wurden mittels Filtration gesammelt und mit 2 ml absolutem Ethanol gewaschen. Dieses Material wurde in eine Abderhalden-Trocknungsvorrichtung überführt und unter hohem Vakuum (0,01 mm Hg) 24 Stunden lang bei 56 ºC getrocknet. Ausbeute, 220 mg, 85 %. Schm.p. 246-248 ºC.
Beispiel 15 Herstellung von β-Chlor-Phenylalaninethylester-Hydrochlorid
• In einen mit einem magnetischen Rührer und einem Rückflußkühler sowie einem Trocknungsröhrchen ausgestatteten 50 ml Rundkolben wurden 2,46 g (10 mmol) β-Phenylserinethylester-Hydrochlorid gegeben. Die resultierende Suspension wurde gerührt und unter Rückfluß erhitzt, bis sämtliche Feststoffe in die Lösung eingetreten waren (etwa 2,5-3 Stunden). Die Lösung wurde abgekühlt und der Rückflußkühler wurde durch einen Destillieraufsatz ersetzt, und der Überschuß an Thionylchlorid wurde durch Destillation entfernt. Das gelb-orangene verbleibende Öl wurde sodann unter Vakuum bei 50 ºC von verbleibenden flüchtigen Stoffen befreit. Das Öl wurde anschließend in 25 ml wasserfreiem Ether gelöst und man ließ es bei 0-5 ºC kristallisieren. Das Produkt wurde mittels Filtration gesammelt und mit 10 ml wasserfreiem Ether gewaschen. Der reine weiße Feststoff erreichte ein Gewicht von 1,78 g (67,4 % Ausbeute) in Form einer 1,9 : 1-Mischung an erythro- und threo-Isomeren (mittels NMR).
• Die vorstehenden Beispiele 1-14 und 15 basieren auf tatsächlicher Laborarbeit.
• Auflösung von (SS)- und (RR)-Isomeren von erythro-β-Phenylserinmethylester
• Nach einer Ausführungsform läßt sich die Erfindung anwenden, um die zwei Spiegelbild-Isomere des erythro-β-Phenylserinmethylesters zu trennen und zurückzugewinnen. Das Verfahrensschema ist wie folgt: Thermolysin Ethylacetat Q-Asp + D,L-PhSerOMe Q-Asp-L-PhSerOMe(Dipeptid I) + D-PhSerOMe Ethylacetat Thermolysin Q-Asp + L-PhSerOMe Recyceln
• Blockierte Asparaginsäure wird mit erythro-Phenylserinmethylester wie in Beispiel 7 gekoppelt. Lediglich das (S,S)(d.h. L-)Isomer der erythro-Verbindung reagiert. Die Reaktionsproduktmischung enthält demgemäß das Dipeptid 1 und freies, nicht-umgesetztes (RR)-(oder D-)erythro-Isomer. Die Reaktionsmischung wird mit Ethylacetat extrahiert, wovon Q-Asp-L-PhSerO- Me, Dipeptid 1, als Hydrochlorid rückgewonnen werden kann. Das freie (SS)- oder L-Isomer wird durch Behandlung mit Thermolysin in Wasser erhalten. Diesmal wirkt das Enzym jedoch als Hydrolysierungsmittel, wodurch die blockierte Asparaginsäure sowie freies L- (S,S)-PhSerOMe wieder erhalten wird. Um die beiden zu trennen, wird HCl zugegeben, und die angesäuerte Lösung wird mit Ethylacetat extrahiert, um Q-Asp zu erhalten. L-PhSerOMe verbleibt in der angesäuerten Lösung. Die blockierte Asparaginsäure wird recycelt.
• Die 2 optischen Isomere von erythro-β-Phenylserin können hauptsächlich auf dem pharmazeutischen Gebiet eingesetzt werden.
• In dem obigen Schema können andere Aminosäuren wie Q-Phenylalanin anstelle von Q-Asp eingesetzt werden, was auch für andere Racemate als D,L-Phser wie z.B. Formel II in der D,L-Form gilt.
Einige Veränderungen
• Träger für immobilisierte Enzyme sind im Stand der Technik gut bekannt. Sie schließen Polyacrylatharze, poröse Glaskügelchen, hydrophile Gele, Vermiculit und dergleichen ein.
• Geeignete organische Lösungsmittel für die Umsetzung der beiden Substrate (z.B. PhSerOMe und Q-Asp) schließen ein niederes Alkylhalogenid wie Chloroform oder Ethylendichlorid, einen Ester der Carbonsäure wie Ethylacetat, Isopropylacetat, Butylacetat und Isobutylacetat, ein Keton wie Methylisobutylketon, und einen aromatischen Kohlenwasserstoff wie Benzol, Toluol, oder eine Mischung ein. Andere geeignete Lösungsmittel schließen Butandiol, Glycerol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Triethylenglykol, Acetonitril, Methanol, Ethanol, t-Butanol, Cydohexanol, Dioxan, Isopropylether, Trichlorethylen, Tetrachlorethylen, und dergleichen ein.
• In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Proteasekatalysierte Peptidsynthese in Gegenwart eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels durchgeführt, um die Löslichkeit der Reaktanten zu verbessern und die lonisierung der reagierenden Carboxylgruppe zu unterdrücken, was zu einer Verlagerung des Gleichgewichts in Richtung Synthese führt. Verwendbare, mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel sind Butandiol, Glycerol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Triethylenglykol, Acetonitril, und dergleichen. Beispiele: Trypsin in 50 % Dimethylformamid -- s. J. Amer. Chem. Soc., 101, 751 (1979); 33 % Diemthylformamid -- s. J. Biol. Chem., 255, 8234 (1980); Papain in Ethanol-Pufferlösung -- s. Biochem. Biophys. Res. Commun., 91, 693 (1979); und Prolysin von B. subtilis var. myeloliquefa ciens in 15 % Methanol oder Dioxan-- s. Bull. Chem. Soc. Japan, 51, 271 (1976).
• In einem Zweiphasen-System werden das Enzym und die Substrate in der wäßrigen, gepufferten Lösung gelöst, und das Produkt diffundiert zu der nicht-polaren organischen Phase wie Benzol, Toluol, Dichlorethan, Tetrachlorethylen und dergleichen. Jede der beiden Reaktanten (Formel II und Formel III, z.B. Q-Asp und PhSerOMe) können in einer Konzentration von etwa 0,01 molar bis 1,5 molar, und vorzugsweise etwa 0,1 bis 0,5 molar eingesetzt werden. Das molare Verhältnis von Q-Asp:PhSer liegt geeigneterweise zwischen 10:1 und 1:10, wobei ein Bereich zwischen 1:1 und 1:5 bevorzugt ist.
• Bei der katalytischen Hydrierung eines Dipeptids in der Dipeptid I-Klasse zu einem der Hydroxyaspartam-Klasse (Formel XI) kann der Wasserstoffdruck im Bereich von atmosphärischem Druck bis zu einem Überdruck von 1500 psi reichen, und die Temperatur kann zwischen 0-150 ºC variieren. Dieselben Druck- und Temperaturbereiche gelten für die Hydrierung von Dipeptiden der Formel XI zu Aspartam oder seinen Homologen, und für die Hydrierung von Dipeptiden der Dipeptid I-Klasse (Formel X) direkt zu Aspartam oder einem Ester-Homolog. Bei diesen Hydrierungen ist der Katalysator geeigneterweise Pt oder PtO&sub2;; oder Pd, Pd-Mohr oder Pd(OH)&sub2;. Der Träger kann Kohlenstoff, Bariumsulfat, Aluminiumoxid oder dergleichen sein. Als Katalysatoren sind Raney-Ni und Raney-Co ebenfalls geeignet.
• In der Kopplungsreaktion wird eine katalytische Menge an Enzym eingesetzt, typischerweise 10 mg - 3 g Enzym (auf Trockenbasis) pro Millimol Asparaginsäureverbindung in einem kontinuierlichen Reaktor. Bei Chargenläufen beträgt das Verhältnis geeigneterweise 10-150 mg Enzym (auf Trockenbasis) pro Millimol Asparaginsäure der Formel II, z.B. Q-Asp. Es ist ersichtlich, daß es bei einem kontinuierlichen Reaktor zu jedem beliebigen Zeitpunkt eine gegenüber der Asparaginsäureverbindung beträcht liche Enzymmenge in der Reaktorsäule gibt. Bei einem Chargenverfahren ist dies natürlich nicht der Fall.
• Die Temperatur für die Kopplungsreaktion liegt geeigneterweise im Bereich von 20-70 ºC, und vorzugsweise bei 30-50 ºC. Die Reaktion ist gewöhnlich im wesentlichen innerhalb von 2- 10 Stunden abgeschlossen. Wenn die Umsetzung nach ihrem Abschluß übermäßig fortgeführt wird, kann es zu einem gewissen Abbau unter Bildung von Benzaldehyd kommen.
Einige weitere Überlegungen zur Erfindunashöhe
• Obgleich die Zugabe eines Substituenten an der β-Position von PheOMe als geringfügige chemische Veränderung erscheinen kann, verhalten sich diese Derivate gegenüber der unsubstituierten Verbindung vollkommen unterschiedlich, wenn sie als Substrate für Proteasen analysiert werden. Während L-PheOMe durch Chymotrypsin, Papain und Pronase zu L-PheOH hydrolysiert wird, wurden erythro- und threo-PhSerOMe unter Anwesenheit dieser Proteasen nicht hydrolysiert.
• Die Verwendung von Proteasen als Katalysatoren bei der Synthese von Peptiden ist gut etabliert. Dieses Vorgehen beinhaltet jedoch die Kondensation der üblichen, natürlich vorkommenden Aminosäuren. Soweit bekannt ist, werden Derivate der seltenen Aminosäure Phenylserin erfindungsgemäß zum ersten Mal bei der Protease-katalysierten Peptidsynthese eingesetzt. Es ist bekannt, daß Proteasen stereospezifisch sind, d.h., daß sie die spezifische Kondensation der L-Isomere katalysieren, wobei die D-Isomere intakt bleiben. Man könnte erwarten, daß die Anwesenheit eines anderen asymmetrischen Zentrums wie in PhSer- OMe an einer von der Reaktionsstelle etwas entfernteren Stelle (β-Position) nicht zu irgendeinem Unterschied hinsichtlich der Stereoselektivität führen würde. Die Ergebnisse zeigen jedoch, daß Thermolysin gegenüber der Stereochemie bei C³ in Verbindungen der Formel III sensitiv ist, und daß im Falle von Phenylserinmethylester lediglich das L-erythro-Isomer in der Kondensationsreaktion genutzt wird.

Claims (8)

1. Verfahren zur Herstellung eines Dipeptids der Formel

in der B Wasserstoff oder Q ist; Q eine Aminosäureschutzgruppe ist; V Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1, 2, 3 oder 4 Kohlenstoffatomen ist; und C¹ und C² die übliche natürliche Konfiguration von natürlich vorkommenden Aminosäuren aufweisen, bei dem

(I) in einer ersten Reaktion B-substituierte Asparaginsäure der Formel

oder ein Salz derselben mit einer zweiten Aminosäure der Formel

enzymatisch umgesetzt wird, um dadurch eine Verbindung der Formel

zu bilden, in der X Hydroxyl oder Chlor und Y Wasserstoff sind; und

(II) die letztgenannte Verbindung zum Ersetzen von X durch H, und, fakultativ, wenn B Q ist, zum Ersetzen von Q durch H behandelt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Lösungsmittel, in welchem die Reaktion durchgeführt wird, Chloroform, Ethylendichlorid, Ethylacetat, Isopropylacetat, Butylacetat, Isobutylacetat, Methylisobutylketon, Benzol, Toluol, Butandiol, Glycerol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Triethylenglykol, Acetonitril, Ethanol, Methanol, Dioxan, Isopropylether, Tetrachlorethylen, Trichlorethylen, t-Butanol oder Cyclohexanol ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Hydrierung bei 0-150 ºC, einem Wasserstoffdruck im Bereich von atmosphärischem Druck bis zu 1500 psi Überdruck, in Anwesenheit eines Katalysators von Pt, PtO&sub2;, Pd, Pd-Mohr oder Pd(OH)&sub2; auf Kohlenstoff, Bariumsulfat oder Aluminiumoxid, oder in Anwesenheit eines Katalysators von Raney-Ni oder Raney-Co durchgeführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die Hydrierung bei einer Temperatur im Bereich von Raumtemperatur bis 45 ºC, einem Wasserstoffüberdruck im Bereich von 45 bis 60 psi, in Anwesenheit von Pd(OH)&sub2;-Katalysator durchgeführt wird.

5. Verfahren umfassend das Behandeln einer Verbindung der Formel

in der B Wasserstoff oder Q ist; Q eine Aminosäureschutzgruppe ist; V Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1, 2, 3 oder 4 Kohlenstoffatomen ist; C¹ und C² die übliche natürliche Konfiguration von natürlich vorkommenden Aminosäuren aufweisen, X Hydroxyl oder Chlor ist und Y Wasserstoff ist, zur Bildung einer Verbindung der Formel

in der B' B ist, das fakultativ als Ergebnis der Behandlung durch Wasserstoff ersetzt ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die Behandlung eine Hydrierung ist, die bei 0-150 ºC, einem Wasserstoffdruck im Bereich von atmosphärischem Druck bis 1500 psi Überdruck, in Anwesenheit eines Katalysators von Pt, PtO&sub2;, Pd, Pd-Mohr oder Pd(OH)&sub2; auf Kohlenstoff, Bariumsulfat oder Aluminiumoxid, oder in Anwesenheit eines Katalysators von Raney-Ni oder Raney-Co durchgeführt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Dipeptids, welches L,L-Aspartam oder dessen niederes Alkylester-Homolog ist, bei dem

A) Q-substituierte Asparaginsäure und ein niederer β- Phenylserinalkylester, wobei der Ester (2S,3S)-Isomer enthält, einer Reaktion in einem organischen Lösungsmittel, welches mit Wasser nicht mischbar ist, in Anwesenheit einer wasserhaltigen immobilisierten Metallo-Proteinase unterzogen wird, um dadurch ein erstes Dipeptid der Formel Niederes Alkyl

zu bilden,

B) das erste Dipeptid behandelt wird zum Austausch von Q durch H unter Bildung eines zweiten Dipeptids der Formel Niederes Alkyl

C) das zweite Dipeptid unter Bildung von Aspartam oder seines niederen Alkylester-Homologs katalytisch hydriert wird.

8. Verfahren zur Herstellung eines Dipeptids der Formel

bei dem ein Aminosäureester der Formel

zum Austausch von X durch H behandelt wird, um einen Phenylalaninester der Formel

zu erhalten, und der Phenylalaninester mit B-substituierter Asparaginsäure der Formel

oder einem Salz derselben umgesetzt wird; wobei die Umsetzung in einem mit Wasser nicht-mischbaren Lösungsmittel in Gegenwart einer Metallo-Proteinase oder einer Nicht-Metallo- Proteinase durchgeführt wird,

wobei B Wasserstoff oder Q ist;

B' B ist, das fakultativ als Ergebnis der Behandlung durch Wasserstoff ersetzt ist;

Q eine Aminosäureschutzgruppe ist,

V Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1, 2, 3 oder 4 Kohlenstoffatomen ist; X Chlor ist und Y Wasserstoff ist.