DE69911061T2

DE69911061T2 - N-3, 3-dimethylbutyl-l-asparaginsäure und ihre ester, verfahren zur herstellung dieser und das verfahren um daraus n-[n-(3,3-dimethylbutyl)-l-alpha-aspartyl)-l-phenylalanin-1-methylester herzustellen

Info

Publication number: DE69911061T2
Application number: DE69911061T
Authority: DE
Inventors: Indra Prakash; Marie-Christine D. Chapeau
Original assignee: Nutrasweet Co
Current assignee: NUTRASWEET PROPERTY HOLDINGS,INC., CHICAGO, II, US
Priority date: 1998-12-24
Filing date: 1999-12-08
Publication date: 2004-06-03
Anticipated expiration: 2019-12-09
Also published as: ES2201812T3; EP1140795B1; ATE248806T1; EP1140795A1; AU1751700A; US6077962A; DE69911061D1; WO2000039075A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft N-3,3-Dimethylbutyl-L-asparaginsäure und Derivate davon. Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zum Herstellen von N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-α-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester (Neotame) über Peptid-Kupplung eines Derivats der neuartigen N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-asparaginsäure mit L-Phenylalanin oder einem L-Phenylalaninester.
Einschlägiger Stand der Technik
N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-α-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester (Neotame) ist ein nährstofffreies Süßungsmittel hoher Intensität, das verwendbar ist, um eine große Vielzahl von Lebensmittelprodukten Süße zu vermitteln. Dieses Süßungsmittel wurde in der US-P-S 480 668 offenbart und ist auf Gewichtsbasis näherungsweise 8.000 Mal so süß wie Saccharose. Damit lassen sich sehr geringe Mengen dieses Süßungsmittels verwenden, um Lebensmittel und Lebensmittelprodukte zu erzeugen, die genauso süß schmecken wie gegenwärtig verfügbare kalorienreiche Lebensmittelprodukte.
Die US-P-5 510 508 beschreibt ein Verfahren zum Herstellen von N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-α-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester der Formel
welches Verfahren die Behandlung einer wässrigen Essigsäure/alkoholischen Lösung von Aspartame und 3,3-Dimethylbutyraldehyd bei Raumtemperatur mit Wasserstoff bei einem Druck von weniger als oder gleich 0,1 MPa (1 bar) in Gegenwart eines Katalysators auf der Basis von Platin oder Palladium umfasst. Das Produkt wird durch Ausfällung und unter Filtration gereinigt, nachdem der Alkohol aus der Lösung unter Vakuum abgetrieben wurde.
Die US-P-5 728 862 beschreibt ein Verfahren, das das Behandeln einer Lösung von Aspartame und 3,3-Dimethylbutyraldehyd in einem organischen Lösemittel mit dem reduzierenden Mittel, Wasserstoff in Gegenwart eines Katalysators, umfasst. Nach Entfernung des Katalysators wird Wasser zugegeben, um eine wässrige/organische Lösungsmittel-Lösung zu erzeugen, die etwa 17% bis etwa 30 Gew.-% des organischen Lösemittels enthält, von dem das Neotame durch Ausfällung und Filtration erhalten wird.
Es wäre jedoch wünschenswert, wirksamere und kostengünstigere Verfahren zum Herstellen von Neotame hoher Reinheit aus leicht verfügbaren oder leicht erhältlichen Materialien zu entwickeln.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-asparaginsäure und Derivate davon, z. B. Ester und Anhydride. Diese neuartigen Asparaginsäure-Verbindungen können hergestellt werden durch reduzierende Alkylierung von 3,3-Dimethylbutyraldehyd mit L-Asparaginsäure oder Derivaten davon. N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-asparaginsäure kann auch hergestellt werden durch reduzierende Alkylierung von 3,3-Dimethylbutyraldehyd mit L-Asparaginsäure-dialkylester, gefolgt von einer Hydrolyse der Dialkylester-Teile.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren für die Herstellung von N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-α-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester unter Anwendung der Methode der Peptid-Kopplung. In diesem Verfahren kann die Peptid-Amid-Bindungvon N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-α-aspartylj-L-phenylalanin-1-methylester über Peptid-Kopplung eines aktivierten Derivats von N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-asparaginsäure mit L-Phenylalanin oder L-Phenylalaninester erzeugt werden. N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-α-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester hoher Reinheit kann erhalten werden durch direkte Kristallisation des kondensierten Produkts oder durch zusätzliche funktionelle Gruppenumwandlung des Produkts, gefolgt von Kristallisation oder Säulenchromatographie.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf neuartige N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-asparaginsäure und Derivate davon gerichtet, die dargestellt werden durch die Formel:
worin R¹ und R² unabhängig Hydroxy oder niederes Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen sind oder zusammengenommen Sauerstoff sind und ein Anhydrid davon bilden; und Q Wasserstoff ist oder (CH₃)₃C(CH₂)₂-. Bevorzugt ist Q Wasserstoff. Bevorzugt sind R¹ und R² Hydroxy oder Methoxy.
Die vorliegende Erfindung ist ebenfalls auf nützliche Verfahren für die Herstellung von N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-α-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester mit hoher Ausbeute und hoher Reinheit über Peptid-Kopplung von aktivierten DerivatenderneuartigenN-(3,3-Dimethylbutyl)-L-asparaginsäure mit L-Phenylalanin oder dem Methylester davon gerichtet.
Reaktionsschema I veranschaulicht ein Verfahren zur Herstellung von N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-asparaginsäure über reduzierende Alkylierung von L-Asparaginsäure unter Verwendung von 3,3-Dimethylbutyraldehyd.
Reaktionsschema I
Die reduzierende Alkylierungsreaktion wird im typischen Fall in Wasser, in dem Lösemittel eines niederen Alkylalkohols oder in Mischungen davon ausgeführt. Niedere Alkylalkohol-Lösemittel, z. B. Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol und Butanol, sind bevorzugt. Die Reduktion wird im typischen Fall unter Verwendung von Palladium-auf-Kohlenstoff in einer Wasserstoffatmosphäre ausgeführt. Andere Hydrierungskatalysatoren, die zur Anwendung gelangen können, schließen Platin-auf-Kohlenstoff, Platinschwarz, Palladiumschwarz, Nickel-auf-Siliciumdioxid und Aluminiumoxid als homogene Hydrierungskatalysatoren ein, Raney-Nickel, Rutheniumschwarz, Ruthenium-auf-Kohlenstoff, Palladiumoxid, Palladiumhydroxid-auf-Kohlenstoff, Rhodiumschwarz, Rhodium-auf-Kohlenstoff oder Aluminiumoxid ein. Andere verwendbare reduzierende Mittel schließen Natriumcyanoborhydrid, Lithium- oder Natriumborhydrid ein. Um die Asparaginsäure zu solubilisieren wird wahlweise der Zusatz einer Base angewendet, z. B. Natriumhydrogencarbonat, Natriumcarbonat, Kaliumhydrogencarbonat, Kaliumcarbonat, Lithiumcarbonat, oder eine organische Base. Wenn die Reaktion in Abwesenheit einer Base ausgeführt wird, erfolgt eine Dialkylierung und es kann ein N,N-Di-(3,3-dimethylbutyl)-L-asparaginsäure erhalten werden.
Alternativ kann, wie im Reaktionsschema II veranschaulicht ist, N-(3,3-Di-methylbutyl)-L-asparaginsäure über den zweistufigen Prozess der reduzierenden Alkylierung einer zweifach geschützten L-Asparaginsäure mit 3,3-Dimethylbutyraldehyd, gefolgt von der Entfernung der Carboxyl-Schutzgruppe erhalten werden. Jede der Carboxyl-Gruppen der L-Asparaginsäure ist mit einer geeigneten Schutzgruppe geschützt. Carboxyl-Schutzgruppen, die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind solche, die beide gegenüber Bedingungen der reduzierenden Alkylierungsreaktion stabil sind und die aus dem Endprodukt ohne Racemisierung oder Abbau dieses Produkts entfernt werden können. Wahlweise werden die Carboxyl-Gruppen durch Umwandlung in Ester-Teile geschützt. Beispielhafte Ester-Gruppen schließen C₁-C₄-Alkylester ein, substituierte C₁-C₄-Alkylester oder Silylester. Verfahren zum Schützen und zur Schutzgruppenabspaltung von Carboxyl-enthaltenden Verbindungen sind dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt und wurden beschrieben in T. W. Greene, et al., "Protective Groups in Organic Synthesis", 2. Ausg., John Wiley & Sons, New York, New York (1991). In dieser Reaktionsfolge kann die reduzierende Alkylierung in der gleichen Weise ohne den Zusatz einer Base und unter Verwendung der gleichen Hydrierungskatalysatoren oder reduzierenden Mittel ausgeführt werden, wie sie vorstehend beschrieben wurden. Die Reaktion kann auch in organischen Lösemitteln ausgeführt werden, wie beispielsweise Ethylacetat, Propylacetat, Isopropylacetat, Butylacetat, Tetrahydrofuran (THF), Diethylether, terf-Butylmethylether und Toluol.
Reaktionsschema II
Wie bereits ausgeführt, richtet sich noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung auf Verfahren zum Herstellen von N-(N-(3,3-Dimethylbu tyl)-L-α-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester über Peptid-Kopplung eines aktivierten Derivats von N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-asparaginsäure mit L-Phenylalanin oder einem L-Phenylalaninester. Nach der vorliegenden Erfindung schließt ein aktiviertes Derivat von N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-asparaginsäure das Anhydrid oder gemischte Anhydride der Asparaginsäure sowie intermediär aktivierte Derivate ein, die unter Umständen nicht zu isoliert werden brauchen erzeugt durch Behandlung der Asparaginsäure oder einer geschützten Asparaginsäure mit einem Mittel zur Peptid-Kopplung. Die Verfahren der Peptid-Kopplung sind dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt und wurden beschrieben in M. Bodansky, et al., "The Practice of Peptide Synthesis, Reactivity and Structure, Concepts in Organic Chemistry", Bd. 21, 2. überarb. Ausg., Springer-Verlag, New York, New York (1994).
In einer ersten Ausführungsform des Verfahrens der Peptid-Kopplung der vorliegenden Erfindung wird die Peptid-Amid-Bindung von N-[N-(3,3-Dimethyl-butyl)-L-α-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester über Kondensation von L-Phenylalanin oder L-Phenylalanin-Methylester mit dem Anhydrid von N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-asparaginsäure, nachfolgend bezeichnet als N-Neohexyl-L-asparaginsäureanhydrid, erzeugt. Reaktionsschema III veranschaulicht die Herstellung von N-Neohexyl-L-asparaginsäureanhydrid und Reaktionsschema IV veranschaulicht die Herstellung von N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-α-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester in dieser ersten Ausführungsform. In den Strukturen in den folgenden Reaktionsschemen III bis VII wird der Rest N-(3,3-Dimethylbutyl) oder Neohexyl abgekürzt als "Neo".
Reaktionsschema III
N-Neohexyl-L-asparaginsäureanhydrid kann hergestellt werden durch Dehydrierung von N-Neohexyl-L-asparaginsäure unter Verwendung eines Dehydrierungsmittels. Die Reaktionen der Dehydrierung sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und können unter Anwendung bekannter Reaktionsbedingungen ausgeführt werden. Beispielhafte Dehydrierungsmittel schließen ein: Phosphorpentoxid, Phosphortrichlorid, Phosphorsäure, Säureanhydride, wie beispielsweise Essigsäureanhydrid und Ameisensäureanhydrid, Carbodiimide, wie beispielsweise Dicyclohexylcarbodiimid (DCC).
Wahlweise kann vor der Erzeugung des Anhydrids die Amino-Gruppe von N-Neohexyl-L-asparaginsäure unter Erzeugung einer N-geschützten-N-Neohexyl-L-asparaginsäure geschützt werden. Amino-Schutzgruppen, die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, müssen gegenüber den Bedingungen der Dehydrierungsreaktion stabil sein und müssen von dem N-Neohexyl-L-α-aspartyl-L-phenylalanin oder seinem Methylester ohne Racemisierung entfernbar sein. Geeignete Amino-Schutzgruppen sind in der Regel Schutzgruppen vom Carbamat- oder Amid-Typ. Beispielhafte Amino-Schutzgruppen schließen Formyl, Acetyl, Benzyloxycarbonyl, tert-Butoxycarbonyl und p-Methoxybenzyloxycarbonyl ein. Verfahren zum Schützen und zur Schutzgruppenabspaltung von Stickstoff-enthaltenden Verbindungen unter Verwendung dieser Gruppen sind dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt und wurden in T. W. Greene, et al., supra, beschrieben.
Vorzugsweise ist die Stickstoff-Schutzgruppe entweder Benzyloxycarbonyl, Formyl oder Acetyl und mehr bevorzugt Formyl. N-Benzyloxycarbonyl-N-neohexyl-L-asparaginsäure kann durch Reaktion von N-Neohexyl-L-asparaginsäure mit Benzylchlorformiat erzeugt werden. N-Formyl-N-neohexyl-L-asparaginsäure kann durch Reaktion der N-Neohexyl-L-asparaginsäure mit einem Mittel zur Formylierung hergestellt werden, wie beispielsweise Ameisensäureanhydrid oder Ameisensäure und Essigsäureanhydrid. N-Acetyl-N-neohexyl-L-asparaginsäure kann hergestellt werden durch N-Neohexyl-L-asparaginsäure mit einem Acetylierungsmittel, wie beispielsweise Essigsäureanhydrid. Vorteilhaft gewährt in der vorliegenden Erfindung die Verwendung von Ameisensäureanhydrid oder Essigsäureanhydrid als das Dehydrierungsmittel in Gegenwart einer Säure, wie beispielsweise Ameisensäure oder Phosphorsäure, die Erzeugung von N-Neohexyl-L-asparaginsäureanhydrid entweder aus N-Neohexyl-L-asparaginsäure oder N-geschützter-N-Neohexyl-L-asparaginsäure.
Reaktionsschema IV
Die Erzeugung der Peptid-Amid-Bindung von N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-α-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester kann durch Kondensation von N-Neohexyl-L-asparaginsäureanhydrid mit L-Phenylalanin entsprechend der Darstellung in Reaktionsschema IV ausgeführt werden. Die Erzeugung der Amid-Bindung erfolgt durch Umsetzen äquimolarer Mengen des Asparaginsäureanhydrids und Phenylalanins in einem inerten Lösemittel. Die Reaktion kann bei 20° bis 100°C ausgeführt werden. Beispielhafte inerte Lösemittel, die für die Verwendung in der Reaktion zur Erzeugung der Amid-Bindung geeignet sind, schließen ein: Toluol, Methylacetat, Ethylacetat, Tetrahydrofuran, Acetonitril, Dioxan und Dimethylformamid (DMF), die entweder organische Säuren enthalten, wie beispielsweise Essigsäure, Propansäure, Butansäure, Isobutansäure, oder die keine Säuren enthalten.
Die Kondensationsreaktion von N-Neo-L-asparaginsäureanhydrid mit L-Phenylalanin erzeugt eine Mischung von zwei Amid-Produkten: N-Neohexyl-α-Laspartyl-L-phenylalanin und N-Neohexyl-β-L-aspartyl-L-phenylalanin. N-Neo-Lasparaginsäureanhydrid ist ein unsymmetrisches Anhydrid, d. h. das Asparaginsäureanhydrid und die Asparaginsäure als Präkursor enthalten zwei verschiedene Carboxyl-Gruppen, die mit α und β bezeichnet werden und auf ihrer Stellung zu dem Stickstoff-Rest beruhen. Die Produkte des α- und β-Amids werden durch Reaktion von Phenylalanin entweder mit der α-Carboxyl-Gruppe oder der β-Carboxyl-Gruppe des Anhydrids erzeugt.
Aus der Kondensation von N-Neohexyl-L-asparaginsäureanhydrid und L-Phenylalanin werden sowohl α- als auch β-Asparaginsäureamide erhalten. Das Verhältnis der Isomere, die in dieser Kondensationsreaktion erhalten werden, beträgt in der Regel 2 : 1 bis 3 : 1.
Die Veresterung der Mischung von α- und β-Asparaginsäureamiden mit Methanol in Säure erzeugt eine Mischung des α- und β-Produktes. Der gewünschte N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-α-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester kann in reiner Form durch Kristallisation oder Säulenchromatographie dieser Mischung isoliert werden. Die Verwendung von Methanol und Wasser, wie sie beispielsweise in der US-P-5 728 862 beschrieben wird, deren Offenbarung hiermit als Fundstelle einbezogen ist, liefert eine hervorragende Gewinnung des α-Produkts in hoher Reinheit.
Alternativ kann N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-α-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester direkt unter Anwendung der Methode der Peptid-Kopplung nach der vorliegenden Erfindung über Kondensation von N-Neohexyl-L-asparaginsäureanhydrid mit L-Phenylalanin-Methylester entsprechend der Darstellung im Reaktionsschema V erzeugt werden.
Reaktionsschema V
Die Reaktion der Peptid-Kopplung kann unter den gleichen Bedingungen ausgeführt werden, wie sie für die Kopplung von L-Phenylalanin entsprechend der vorstehenden Beschreibung anwendbar sind. Diese Kopplungsreaktion erzeugt eine Mischung von N-(N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-α-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester und N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-β-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester normalerweise in einem Verhältnis von 2 : 1 bis 3 : 1. Der N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-α-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester kann mit hoher Reinheit durch Umkristallisation der Neotame-Mischung unter Verwendung von Methanol und Wasser oder durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Silicagel oder Harzen erhalten werden.
Reaktionsschema VI veranschaulicht eine noch andere Ausführungsform der Methode der Peptid-Kopplung nach der vorliegenden Erfindung für die Herstellung von N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-α-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester.
Reaktionsschema VI
In dieser Ausführungsform wird die Erzeugung der Peptid-Amid-Bindung von N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-α-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester durch Kondensation von L-Phenylalanin-Methylester mit einem gemischten Anhydrid von N-Neohexyl-L-asparaginsäure erreicht. Ein gemischtes Anhydrid ist ein Anhydrid, das sich von zwei verschiedenen Carbonsäure-enthaltenden Verbindungen ableitet oder das in situ aus einer Carbonsäure-enthaltenden Verbindung und einem Phosphorsäure-Derivat erzeugt werden kann, wie beispielsweise o-Phenylenphosphochloridit. Eine besondere Kategorie von gemischten Anhydriden sind die N-Carboxy- oder Leuch's Anhydride, die durch Behandlung einer Aminosäure, z. B. der β-geschützten Asparaginsäure, mit Phosgen hergestellt werden oder durch Erhitzen von Benzyloxycarbonylaminosäurechloriden. Diese gemischten Anhydride können mit hoher Ausbeute unter Anwendung der auf dem Gebiet bekannten Methoden erhalten werden.
Das gemischte Anhydrid von N-Neohexyl-L-asparaginsäure wird bevorzugt hergestellt durch Reaktion der Asparaginsäure mit einem Acylierungsmittel, wie beispielsweise einem Alkyl- oder Arylsäurechlorid, Chlorformiat, Chlorcarbonat oder -imid. Die Reaktion wird im typischen Fall in Gegenwart einer nicht nukleophilen Base bei Umgebungstemperatur oder herabgesetzter Temperatur ausgeführt. Beispielhafte nicht nukleophile Basen schließen ein: Alkalicarbonate, wie beispielsweise Natriumcarbonat, Alkylamine, wie beispielsweise tert-Amine, Triethylamin oder N-Methylmorpholin, aromatische Amine, wie beispielsweise Pyridin. Die Reaktion kann in einem Lösemittel ausgeführt werden, wie beispielsweise Toluol, DMF, Acetonitril, Methylacetat und Dioxan. Alternativ können auch Amin-Basen als geeignete Reaktionslösemittel verwendet werden, wie beispielsweise Triethylamin oder Pyridin. Beispielhafte Acylierungsmittel schließen ein, ohne auf diese beschränkt zu sein: Säurechloride, wie beispielsweise Pivaloylchlorid, Isovalerylchlorid, Benzoylchlorid, p-Nitrobenzoylchlorid, Pentachlorbenzoylchlorid, Pentafluorbenzoylchlorid, Chlorformiate, wie beispielsweise tert-Butylchlorformiat, Isopropylchlorformiat, Isobutylchlorformiat, Chlorcarbonate, wie beispielsweise Isobutylchlorcarbonat, Ethylchlorcarbonat und dergleichen, oder Imide, wie beispielsweise N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxysuccinimid.
Wie vorstehend hingewiesen wurde, enthält N-Neohexyl-L-asparaginsäure zwei verschiedene Carboxyl-Gruppen, α- und β-, und es können beide diese Carboxyl-Gruppen in der Reaktion unter Erzeugung des gemischten Anhydrids teilnehmen. Dementsprechend ist eine der Carboxyl-Gruppen, das β-Carboxyl, wahlweise so geschützt, dass die Erzeugung des gemischten Anhydrids und die eventuelle Erzeugung der Peptid-Amid-Bindung selektiv an der α-Carboxyl-Gruppe erfolgt. Die β-Carboxyl-Gruppe kann mit jeder beliebigen Carboxyl-Schutzgruppe geschützt sein, die entweder in der Reaktion der Anhydriderzeugung oder der Reaktion der Peptid-Kopplung nicht reaktionsfähig ist und von dem Endprodukt, N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-α-aspartyl]-Lphenylalanin-1-methylester, ohne Racemisierung oder Abbau dieses Produktes entfernt werden kann. Wahlweise ist die β-Carboxyl-Gruppe durch Umwandlung in einen Ester-Teil geschützt. Beispielhafte Ester-Gruppen schließen ein: tert-Butylester, Silylester, Benzylester. Die Methoden zum Schützen und zur Schutzgruppenabspaltung von Carboxyl-enthaltenden Verbindungen sind für den Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt und wurden in T. W. Greene, et al., supra, beschrieben.
Die β-Carboxyl-Gruppe von N-Neohexyl-L-asparaginsäure wird einen Schritt vor der Reaktion der Anhydrid-Erzeugung geschützt. Wahlweise wird die β-Carboxyl-Gruppe vor der Erzeugung der N-Neohexyl-L-asparaginsäure durch reduzierende Alkylierung geschützt. β-Carboxylsäureester können auch durch Reaktion von N-Neohexyl-L-asparaginsäureanhydrid mit einem Alkohol erzeugt werden. Das Reaktionsschema VI veranschaulicht die Herstellung einer β-geschützten N-Neohexyl-L-asparaginsäure über reduzierende Alkylierung von einer β-geschützten L-Asparaginsäure mit 3,3-Dimethylbutyraldehyd. Die Reaktion der reduzierenden Alkylierung kann unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Bedingungen und Reagentien ausgeführt werden. Die β-geschützte N-Neohexyl-L-asparaginsäure, hergestellt nach der Methode von Reaktionsschema VI, kann mit einem Acylierungsmittel nach der Methode des Reaktionsschemas V entsprechend der vorstehenden Beschreibung behandelt werden, um ein gemischtes Anhydrid (R ist Alkyl oder Aryl) zu erzeugen. Die Erzeugung der Peptid-Amid-Bindung kann durch Kondensation des gemischten Anhydrids des β-geschützten N-Neohexyl-L-aspartats mit L-Phenylalanin-Methylester unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Bedingungen des Koppelns erreicht werden. N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-α-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester kann hergestellt werden durch Schutzgruppenabspaltung, d. h. durch Entfernung der β-Schutzgruppe von dem resultierenden β-geschützten N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-α-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester, indem die auf dem Gebiet bekannten Reaktionsbedingungen angewendet werden. Nach Erfordernis kann N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-α-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester durch Kristallisation aus Methanol/Wasser oder durch Säulenchromatographie weiter gereinigt werden.
Das Reaktionsschema VII veranschaulicht noch eine weitere Ausführungsform der Methode der Peptid-Kopplung der vorliegenden Erfindung für die Herstellung von N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-α-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester.
Reaktionsschema VII
In dieser Ausführungsform wird die Erzeugung der Peptid-Amid-Bindung von N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-α-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester durch direkte Kondensation eines L-Phenylalaninesters mit einer N-Neohexyl-L-asparaginsäure unter Verwendung eines Mittels zur Peptid-Kopplung erreicht.
Verwendbare Pepti-Kopplungsmittel fungieren zur Erzeugung eines intermediär aktivierten Derivats eines Carbonsäure-Teils der N-Neohexyl-L-asparaginsäure. Das intermediär aktivierte Asparaginsäure-Derivat, das unter Umständen isoliert sein kann, unterliegt einer Reaktion mit dem Stickstoffrest von L-Phenylalanin-1-methylester unter Erzeugung der Peptid-Amid-Bindung von N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-α-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester. Ein Beispiel für ein aktiviertes Asparaginsäure-Derivat, das isoliert werden kann, ist ein β-geschütztes Aspartylsäurechlorid das einer Peptid-Kopplung über eine einfache Amid-Bildung durch Reaktion des Säurechlorids und des Phenylalanins oder Phenylalanin-Methylesters unterliegt. Beispiele von anderen isolierbaren aktivierten Derivaten schließen Hydrazide und aktive Ester ein. Hydrazid-Derivate von β-geschützter Asparaginsäure können unter Verwendung von Hydrazinhydrat oder derivatisierten Hydrazinen entsprechend den konventionellen Prozeduren erzeugt werden. Das Koppeln von β-geschützten Aspartylhydrazid-Derivaten kann durch Umwandlung des Hydrazids zu dem Azid gefolgt von einer Behandlung mit Phenylalanin oder Phenylalanin-Methylester erfolgen. Aktive Ester-Derivate von β-geschützter Asparaginsäure können unter Anwendung konventioneller Methoden der Veresterung erzeugt werden. Aktive Ester-Derivate, die in den Reaktionen der Peptid-Kopplung anwendbar sind, schließen ein, ohne auf diese beschränkt zu sein: Cyanomethylester, p-Nitrophenylester, o-Nitrophenylester, 2,4-Dinitrophenylester, 2,4,5-Trinitrophenylester, Pentachlorphenylester, Pentafluorphenylester, tert-Butyloxycarbonylaminosäure-Pentafluorphenylester, N-Hydroxyphthalimidester, N-Hydroxysuccinimidester, 1-Hydroxypyridinester, 5-Chlor-8-hydroxychinolinester und dergleichen. Das Koppeln von aktiven Ester-Derivaten mit Phenylalanin oder Phenylalanin-Methylester kann durch einfache Reaktion der zwei Stoffe unter konventionellen sauren, neutralen oder basischen Reaktionsbedingungen erfolgen. Alternativ kann die Reaktion der Kopplung des aktiven Esters unter Anwendung konventioneller Kopplungsreagentien katalysiert werden, wie beispielsweise Imidazol, 1-Hydroxybenzotriazol oder 3-Hydroxy-3,4-dihydro-chinazolin-4-on.
Im typischen Fall wird das aktivierte Asparaginsäure-Derivat nicht isoliert, wird jedoch unter den Reaktionsbedingungen als ein intermediäres Produkt erzeugt, das in der Erzeugung der Peptid-Amid-Bindung teilnimmt. Das intermediär aktivierte Asparaginsäure-Derivat wird vorzugsweise durch Reaktion einer βgeschützten N-Neohexyl-L-asparaginsäure mit einem Mittel zur Peptid-Kopplung hergestellt. Die β-Carboxyl-Gruppe der N-Neohexyl-L-asparaginsäure kann mit jeder beliebigen geeigneten Carboxyl-schützenden Gruppe geschützt werden, die in der Reaktion der Peptid-Kopplung nicht reaktionsfähig ist und die von dem Endprodukt, N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-α-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester, ohne Racemisierung oder Abbau des Produktes entfernt werden kann. Geeignete. β-geschützte Asparaginsäuren sind vorstehend beschrieben worden. Mittel zur Peptid-Kopplung, die in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, schließen ein, ohne auf diese beschränkt zu sein: Dicyclohexylcarbodümid (DCC), DCC/1-Hydroxybenzotriazol, DCC/N-Hydroxysuccinimid, 1-Isobutoxycarbonyl-2-isobutoxy-1,2-dihydrochinon (IIDQ), Carbonyldiimidazol, N-Ethyl-5-phenylisoxazolium-3'-sulfonat (Woodward's Reagens K), Benzotriazolyl-N-hydroxytris(dimethylamino)phosphonium-hexafluorphosphat (BOP). Die vorstehend beschriebenen Mittel zur Peptid-Kopplung und Verfahren zur Verwendung dieser Mittel und anderer lassen sich in jeder der zahlreichen Übersichtsarbeiten zu diesem Thema finden, wie beispielsweise bei M. Bodansky, et al., supra.
In noch einer anderen Ausführung der vorliegenden Erfindung können die enzymatischen Verfahren zur Erzeugung der Peptid-Amid-Bindung von N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-α-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester entsprechend der Darstellung in Reaktionsschema VIII angewendet werden.
Reaktionsschema VIII
Nach dieser Ausführungsform kann N-Neohexyl-L-asparaginsäure mit L-Phenylalanin-Methylester in Gegenwart des Proteaseenzyms, Papain, umgesetzt werden, um α-Neotame zu schaffen. Ebenfalls kann N-geschützte N-Neohexyl-Lasparaginsäure zur Erzeugung des Peptid-gekoppelten Produktes verwendet werden. Die Entfernung der Stickstoff-Schutzgruppe liefert N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-α-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester. Das Lösemittel, in welchem die Reaktion ausgeführt wird, lässt sich so auswählen, dass das gewünschte Produkt in dem Lösemittel unlöslich oder nur gering löslich ist, was eine Verschiebung des Reaktionsgleichgewichts zugunsten der Erzeugung des Peptids zur Folge hat. Die Stickstoff-Schutzgruppen, die in dem enzymatischen Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, schließen alle beliebigen Schutzgruppen ein, die vorstehend diskutiert wurden. Bevorzugt sind Acetoacetyl, Acetyl, Benzoyl, Benzyloxycarbonyl, tert-Butyloxycarbonyl, Formyl, Isovaleryl, (p-Methoxybenzyl)oxycarbonyl oder Phenylacetyl. Vorzugsweise ist die Stickstoff-Schutzgruppe Benzyloxycarbonyl. Anwendbare Lösemittel, in denen die Reaktion der enzymatischen Kopplung ausgeführt werden kann, schließen solche ein, die mit Wasser mischbar oder unmischbar sind. Beispielhafte Lösemittel schließen organische Co-Lösemittel ein, wie beispielsweise Glycerin und andere Glykole, Acetonitril, Ethylacetat, tert-Amylalkohol und Triethylphosphat. Gemischte Lösemittelsysteme, wie beispielsweise Ethylacetat und tert-Amylalkohol, können ebenfalls angewendet werden.
Nachdem die Kopplungsreaktion unter Anwendung eines der vorstehend beschriebenen Verfahren abgeschlossen worden ist, können unter Anwendung typischer Prozeduren der Schutzgruppenabspaltung etwaige Schutzgruppen, die an dem Asparaginsäure-Teil vorhanden sind (z. B. Stickstoff-Schutzgruppen oder die β-Carboxyl-Schutzgruppe) entfernt werden. Der N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-α-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester kann durch Kristallisation aus Methanol/Wasser oder durch Säulenchromatographie weiter gereinigt werden.
Die folgenden Beispiele sind zur Veranschaulichung bestimmter bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung vorgesehen und sind nicht zur Beschränkung der Erfindung auszulegen.
Beispiel 1
N-Neohexyl-L-asparaginsäure
Prozess A
Es wurde L-Asparaginsäure (4 g, 0,03 Mol) zu einer Parr-Flasche zugegeben, die eine Lösung von Natriumhydrogencarbonat (5,04 g, 0,06 Mol) in Wasser (50 ml) enthielt, um eine klare Lösung unter Aufschäumen zu erzeugen. Danach wurde eine Lösung von 3,3-Dimethylbutyraldehyd (3 g, 0,03 Mol) in Methanol (50 ml) zu der Parr-Flasche gegeben, gefolgt von Pd/C (4% Palladium auf Kohlenstoff, 50% Feuchte, 0,4 g). Die Mischung wurde bei 50 psi und Raumtemperatur für 2 Tage hydriert. Sofern die Reaktion nicht abgeschlossen war, wurde frisches Pd/C (0,2 g) hinzugefügt und die Hydrierung für weitere 8 Stunden fortgesetzt. Die Mischung wurde durch ein Celite^®-Bett filtriert und das Bett mit Methanol (20 ml) gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden vereinigt und unter verringertem Druck bei 40° bis 50°C eingeengt. Der pH-Wert der zurückbleibenden wässrigen Lösung wurde mit konzentrierter Salzsäure auf 3 eingestellt.
Der ausgefällte Feststoff wurde filtriert und im Vakuumofen bei 50°C für 4 Stunden getrocknet, um 4,75 g (73%) rohe N-Neohexyl-L-asparaginsäure zu ergeben. Das rohe Produkt wurde mit wässrigem Ethanol (47,5, 80% Ethanol, 20% Wasser) für 15 Minuten aufgeschlämmt und filtriert, um 3,3 g (51%) N-Neohexyl-L-asparaginsäure mit einer Reinheit >98% zu ergeben. Fp. 184°– 186°C; [α]_D +12,35 (c=1, Wasser); NMR (D₂O) δ 3,37 (t, 3H); 2,25–2,65 (m, 4H); 1,27–1,47 (m, 2H); 0,89 (s, 9H); anal. errechnet für C₁₀H₁₉NO₄; C, 55,28; N, 8,81; N, 6,45; Gefunden: C, 55,35; H, 8,86; N, 6,50.
Beispiel 2
N-Neohexyl-L-asparaginsäure-hydrochlorid
Prozess B
Es wurde Natriumhydrogencarbonat (1,68 g, 0,02 Mol) zu einer Parr-Flasche zugegeben, die eine Lösung von Dimethyl-L-aspartat-hydrochlorid (3,94 g, 0,02 Mol) in Wasser (10 ml) enthielt, gefolgt von einer Zugabe von 3,3-Dimethylbutyraldehyd (2,2 g, 0,02 Mol) in Methanol (100 ml) und Pd/C (4% Palladium auf Kohlenstoff, 50% Feuchte), 10 Gew.-% des Substrats. Die Mischung wurde bei 50 psi und Raumtemperatur für 1,5 Stunden hydriert und anschließend durch ein Celite^®-Bett filtriert und das Bett mit Methanol (10 ml) gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden unter verringertem Druck eingeengt. Die restliche wässrige Lösung wurde mit Diethylether (2 × 100 ml) extrahiert. Die organische Schicht wurde mit wässriger gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung (50 ml) gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt, um N-Neohexyl-L-asparaginsäure-Dimethylester (4,65 g, 95%) als ein Öl zu ergeben. NMR (CDCl₃) δ 3,67 (s; 3H); 3,50 (s, 3H); 3,57 (t, 3H); 2,37–2,70 (m, 4N); 1,20–1,40 (m, 2H); 0,80 (s, 9H).
Es wurde eine Mischung von N-Neohexyl-L-asparaginsäure-Dimethylester (15 g, 0,061 Mol) in 1 N Salzsäure (350 ml) am Rückfluss für 4 Stunden erhitzt, um eine klare Lösung zu erzeugen. Die Mischung wurde gefriergetrocknet, um N-Neohexyl-L-asparaginsäure-hydrochlorid als einen weißen Feststoff zu ergeben (14g, 91%), Fp. 133–138°C, [α]D +14,69 (c=1, Wasser); anal. errechnet für C₁₀H₁₉NO₄-HCl; C, 47,52; H, 7,92; N, 5,54; Cl, 14,05. Gefunden: C, 47,84; N, 8,14; N, 5,31; Cl, 13,08.
Beispiel 3
N, N-Di-Neohexyl-L-asparaginsäure
Zu einer Aufschlämmung von L-Asparaginsäure (4 g, 0,03 Mol) in 1 : 1 Methanol/Wasser (80 ml) wurde unvermischtes 3,3-Dimethylbutyraldehyd (3 g, 0,03 Mol) zugesetzt, gefolgt von Pd/C (4%, 50% Feuchte, 0,5 g). Die Mischung wurde unter Verwendung von H₂ (50 psi) bei Raumtemperatur für 2 Tage hydriert. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch ein Celite^®-Bett filtriert und das Bett mit Methanol (50 ml) gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden vereinigt und das Methanol unter Verwendung eines Rotationsverdampfers unter vermindertem Druck bei 40° bis 50°C entfernt, um die N,N-Di-Neohexyl-L-asparaginsäure als einen festen Niederschlag in Wasser zu ergeben. Der Feststoff wurde filtriert, mit Wasser (2 ml) gewaschen und in einem Vakuumofen bei 50°C für 4 Stunden getrocknet, um 3,2 g N,N-Di-Neohexyl-L-asparaginsäure (36%) zu ergeben, Fp. 197°–198°C, [α]_D -3 (c=1, Methanol); anal. errechnet für C₁₆H₃₁NO₄; C, 63,78; N, 10,29; N, 4,65. Gefunden: C, 63,43; H, 10,29; N, 4,70.
Beispiel 4
N-Neohexvl-L-asparaginsäureanhydrid
Prozess A
Es wurde Phosphortrichlorid (3,7 ml, 43 mMol) tropfenweise zu einer Aufschlämmung bei 10°C von N-Neohexyl-L-asparaginsäure (11,6 g, 53,4 mMol) in Eisessig (50 ml) zugegeben. Nach Beendigung der Zugabe (1/2 Stunde) wurde die resultierende klare Lösung bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Der resultierende feste Niederschlag wurde durch Vakuumfiltration aufgenommen, mit Essigsäure und Dichlormethan gewaschen und anschließend bei 35° bis 40°C für 3 Stunden getrocknet, um 3,62 g (69,8%) reines N-Neohexyl-L-asparaginsäureanhydrid zu ergeben.
Beispiel 5
N-Neohexyl-L-asparaginsäureanhydrid
Prozess B
Es wurde N-Neohexyl-L-asparaginsäure-hydrochlorid in einer wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat unter Rühren aufgelöst. Die Lösung wurde gekühlt und mit Benzyloxycarbonylchlorid und wässrigem Natriumhydroxid behandelt, die portionsweise alternierend unter heftigem Rühren zugesetzt wurden. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für etwa 3 Stunden gerührt. Die Lösung wurde 2 Mal mit Diethylether extrahiert und bis zum Umschlagpunkt von Kongoblau mit konzentrierter Salzsäure angesäuert. Die N- Benzyloxycarbonyl-N-neohexyl-L-asparaginsäure setzte sich als ein Feststoff oder als ein Öl ab, das sich langsam verfestigte. Das angesäuerte Reaktionsgemisch wurde für mehrere Stunden bei 10° bis 15°C gekühlt und der resultierende Feststoff durch Filtration aufgenommen, mit Wasser gewaschen und unter Vakuum getrocknet. DieN-Benzyloxycarbonyl-N-neohexyl-L-asparaginsäure kann in der gewonnenen Form verwendet werden oder kann aus einem geeigneten Lösemittel umkristallisiert werden.
Es wurde eine Lösung von N-Benzyloxycarbonyl-N-neohexyl-L-asparaginsäure in Essigsäureanhydrid mit einer katalytischen Menge Phosphorsäure am Rückfluss für 0,5 bis 5 Stunden erhitzt, bis Raumtemperatur gekühlt und unter vermindertem Druck und Erhitzen eingeengt. Das zurückbleibende Material wurde in Wasser aufgelöst und anschließend mit wässrigem Natriumhydroxid neutralisiert. Der resultierende Niederschlag wurde durch Vakuumfiltration aufgenommen und umkristallisiert, um weitgehend reines N-Neohexyl-L-asparaginsäureanhydrid zu ergeben.
Beispiel 6
N-Neohexyl-α-Aspartame
Prozess A
Es wurde N-Neohexyl-L-asparaginsäureanhydrid und L-Phenylalanin zu wasserfreiem Dioxan gegeben und die Lösung bei 20° bis 80°C für 1 bis 8 Stunden gerührt. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde mit einem organischen Lösemittel verdünnt, das mit Wasser nicht mischbar war, wurde nacheinander mit wässrigem KHCO₃ gewaschen und anschließend mit wässriger HCl, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und bis zur Trockene unter vermindertem Druck eingedampft, um eine Mischung von Amiden zu ergeben: N-Neohexyl-α-aspartyl-L-phenylalanin und N-Neohexyl-β-L-aspartyl-L-phenylalanin. Die Amid-Mischung wurde in einer Lösung von Methanol/Salzsäure aufgelöst und das resultierende Reaktionsgemisch bei 20° bis 80°C für 1 bis 8 Stunden gerührt, um eine Mischung von N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-α-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester und N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-β-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester zu erzeugen. Die Umkristallisation der α- und β-Aspartame-Mischung aus Methanol/Wasser oder die Säulenchromatographie auf Silicagel unter Verwendung von Ethylacetat : Methanol : Hexan (60 : 30 : 10) als Eluierungsmittel lieferten reinen N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-α-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester.
Beispiel 7
N-[N-(3 3-Dimethylbutyl)-L-α-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester.
Prozess B
Es wurde eine Mischung von N-Neohexyl-L-asparaginsäureanhydridhydrochlorid (2g, 8,5 mMol) und L-Phenylalanin-Methylester in wasserfreiem Toluol (13 ml) bei 55° bis 60°C für etwa 3 Stunden erhitzt, bis Raumtemperatur gekühlt und über Nacht stehen gelassen. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde bis zur Trockene unter vermindertem Druck bei 40° bis 45°C eingeengt. Das restliche feste Material wurde in Ethylacetat (20 ml) aufgelöst, nacheinander mit Wasser (10 ml) wässriger KHCO₃ und wässriger HCl gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und bis zur Trockene unter vermindertem Druck eingedampft, um eine Mischung von N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-α-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester und N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-β-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester (3 g) zu ergeben. Die Umkristallisation der α- und β-Aspartame-Mischung aus Methanol/Wasser oder die Säulenchromatographie auf Silicagel unter Verwendung von Ethylacetat : Methanol : Hexan (60 : 30 : 10) als Eluierungsmittel lieferten reinen N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-α-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester.
Beispiel 8
N-Neohexyl-α-Aspartame
Prozess C
Zu einer Methanol-Lösung von L-Asparaginsäure-β-terf-butylester (1 mMol) in einer Parr-Flasche wurde eine Lösung von 3,3-Dimethylbutyraldehyd (1 mMol) in Methanol (30 ml) gegeben, gefolgt von der Zugabe von Pd/C (0,1 mMol). Die Mischung wurde bei 50 psi bei Raumtemperatur für 1 Stunde hydriert. Sofern die Reaktion nicht abgeschlossen war, kann frisches Pd/C zugesetzt werden und die Hydrierung fortgesetzt werden. Die Mischung wurde durch ein Celite^®-Bett filtriert und das Bett mit Methanol gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden vereinigt und das Methanol unter vermindertem Druck entfernt. Der pH-Wert der verbleibenden wässrigen Lösung wurde auf 3 mit konzentrierter Salzsäure eingestellt. Der ausgefällte Feststoff wurde filtriert und in einem Vakuumofen getrocknet, um rohes N-Neohexyl-L-asparaginsäure-β-tert-butylester-hydrochlorid zu ergeben. Das rohe Produkt wurde mit wässrigem Ethanol aufgeschlämmt und filtriert, um reines N-Neohexyl-L-asparaginsäure-β-tert-butylesterhydrochlorid mit einer Ausbeute von 90% zu ergeben.
Es wurde Benzotriazolyl-N-hydroxytris(dimethylamino)phosphonium-hexafluorphosphat (BOP, 3,7 mMol) und Triethylamin (7,4 mMol) nacheinander zu einer Lösung von N-Neohexyl-L-asparaginsäure-β-tert-butylester (3,7 mMol) und Phenylalaninmethylester-hydrochlorid (3,7 mMol) in DMF/Acetonitril (15/20 ml) unter Rühre zugegeben und das resultierende Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur über Nacht rühren gelassen. Die Zugabe von Salzlösung (60 ml) führte zu einer sofortigen Bildung eines weißen Niederschlags. Die resultierende Suspension wurde für 2 Stunden gerührt und in einen Trenntrichter gegeben. Die wässrige Phase wurde mit Ethylacetat extrahiert (1 × 200 ml, 2 × 50–80 ml). Die vereinten Ethylacetat-Extrakte wurden nacheinander mit 1 N HCl (2 × 100 ml), Wasser (1 × 100 ml), gesättigter NaHCO₃ (2 × 100 ml) und Salzlösung (1 × 100 ml) gewaschen, über MgSO₄ getrocknet, filtriert und eingedampft, um ein helles, gelbliches Öl mit quantitativer Ausbeute zu ergeben. Dieses Öl wurde in Ethylacetat (30 ml) aufgelöst und mit Salzsäure (4,3 M, 20 ml) unter Rühren für 6 Stunden bei Raumtemperatur behandelt. Der pH-Wert der Mischung wurde auf 5,2 eingestellt und diese in einen Trenntrichter gegeben. Die organische Schicht wurde abgetrennt. Die wässrige Schicht wurde mit Ethylacetat extrahiert (3 × 30 ml) und die vereinten Ethylacetat-Extrakte über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet, filtriert und bis zur Trockene eingedampft. Die Kristallisation des rohen Produkts aus 25%igem Methanol/75% Wasser (30 ml) ergab 2,5 g reinen N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-α-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester.
Beispiel 9
Enzymatische Synthese von N-3,3-Dimethylbutyl-L-aspartyl-L-phenylalanin-methylesfier (Neotame)
Es wurde Papain (180 mg) einer Mischung von Mcllvaine-Puffer (pH 5,5) und Ethanol (60% Puffer/40% Ethanol, Gesamtvolumen: 3 ml) mit einem Gehalt von Mercaptoethanol (100 mMol), Neohexyl-L-asparaginsäure (200 mMol) und L-Phenylalanin-methylester (200 mMol) gegeben. Die Mischung wurde für 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsprodukte konnten mit Hilfe der Chromatographie unter Verwendung von Ethylacetat : Methanol : Hexan (60 : 30 : 10) als Eluierungsmittel getrennt werden, um reines α-Neotame zu ergeben.

Claims

Verbindung, dargestellt durch die Formel:
worin R¹ und R² unabhängig Hydroxy oder Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen sind oder zusammengenommen Sauerstoff sind und ein Anhydrid davon bilden; und Q ist Wasserstoff oder (CH₃)₃C(CH₂)₂ ^–.
Verbindung nach Anspruch 1, worin Q Wasserstoff ist.
Verbindung nach Anspruch 1, worin R¹ und R² Wasserstoff oder Methoxy sind.
Verbindung N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-asparaginsäure.
Verbindung N,N-Di-(3,3-dimethylbutyl)-L-asparaginsäure.
Verbindung N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-asparaginsäureanhydrid.
Verfahren zum Herstellen von N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-asparaginsäure, umfassend den Schritt der reduktiven Alkylierung von L-Asparaginsäure und 3,3-Dimethylbutyraldehyd.
Verfahren zum Herstellen von N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-asparaginsäure oder von Derivaten davon, dargestellt durch die Formel
worin R¹ und R² unabhängig Hydroxy, niederes Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder zusammengenommen Sauerstoff sind, die ein Anhydrid erzeugen, und Q ist Wasserstoff oder (CH₃)₃C(CH₂)2 , wobei das Verfahren den Schritt der reduktiven Alkylierung von
worin R¹ und R² wie vorstehend beschrieben sind, mit 3,3-Dimethylbutyraldehyd umfasst.
Verfahren nach Anspruch 8, bei welchem die reduktive Alkylierung unter Verwendung von Palladium-auf-Kohlenstoff in einer Wasserstoffatmosphäre mit Natriumhydrogencarbonat ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei Q Wasserstoff ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei R¹ und R² Hydroxy sind. 12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei R¹ und R² Methoxy sind
Verfahren zum Herstellen von N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-alpha-aspartyl]-L-phenylalanin-1-metylester, umfassend die Schritte: (a) Kondensieren von N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-asparaginsäureanhydrid mit L-Phenylalaninmethylester, um eine Mischung von N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-alpha-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester und N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-beta-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester zu erzeugen; und (b) Abtrennen des N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-alpha-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylesters aus der Mischung.
Verfahren nach Anspruch 13, ferner umfassend den Schritt des Erzeugens von N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-alpha-asparaginsäureanhydrid durch Dehydratation einer N-geschützten N-(3,3-Dimethylbutyl)-asparaginsäure.
Verfahren nach Anspruch 14, bei welchem die Dehydratation der Asparaginsäure unter Verwendung von Essigsäureanhydrid ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 14, bei welchem die N-geschützte N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-asparaginsäure N-Formyl-N-(3,3-dimethylbutyl)-L-asparaginsäure, N-Acetyl-N-(3,3-dimethylbutyl)-L-asparaginsäure oder N-Benzyloxycarbonyl-N-(3,3-dimethylbutyl)-L-asparaginsäure ist.
Verfahren nach Anspruch 13, bei welchem der Schritt des Abtrennens durch Kristallisation erfolgt.
Verfahren zum Herstellen von N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-alpha-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester, umfassend die Schritte: (a) Kondensieren von N-(3,3-Dimethylbutyl)-asparaginsäureanhydrid mit L-Phenylalanin, um eine Mischung von alpha-L-Phenylalanin-N-neohexylasparaginsäureamid und beta-L-Phenylalanin-N-neohexyl-asparaginsäureamid zu erzeugen; (b) Verestern der Amid-Mischung, um eine Mischung zu erzeugen von: N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-alpha-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester und N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-beta-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester; und (c) Abtrennen des N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-alpha-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylesters von der Mischung.
Verfahren nach Anspruch 18, ferner umfassend das Erzeugen von N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-asparaginsäureanhydrid durch Dehydratation von N-geschützter N-(3,3-Dimethyl)-asparaginsäure.
Verfahren nach Anspruch 19, bei welchem die Dehydratation der Asparaginsäure ausgeführt wird unter Verwendung von Essigsäureanhydrid.
Verfahren nach Anspruch 19, bei welchem die N-geschützte N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-asparaginsäureist: N-Formyl-N-(3,3-dimethylbutyl)-L-asparaginsäure, N-Acetyl-N-(3,3-dimethylbutyl)-L-asparaginsäure oder N-Benzyloxycarbonyl-N-(3,3-dimethylbutyl)-L-asparaginsäure.
Verfahren nach Anspruch 18, bei welchem der Schritt des Abtrennens durch Kristallisation erfolgt.
Verfahren zum Herstellen von N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-alpha-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester, umfassend die Schritte: (a) Reduzieren eines Kondensationsproduktes von 3,3-Dimethylbutyraldehyd und beta-geschützter L-Asparaginsäure, um eine beta-geschützte N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-asparaginsäure zu erzeugen; (b) Erzeugen eines gemischten Anhydrids der beta-geschützten N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-asparaginsäure; (c) Kondensieren des gemischten Anhydrids mit L-Phenylalaninmethylester, um einen beta-geschützten N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-alpha-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester zu erzeugen; (d) Schutzgruppenabspaltung von dem beta-geschützten N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-alpha-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester, um N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-alpha-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester zu erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 23, ferner umfassend das Kristallisieren des N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-alpha-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylesters. 25. Verfahren zum Herstellen von N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-alpha-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester, umfassend die Schritte: (a) Reduzieren eines Kondensationsproduktes von 3,3-Dimethylbutyraldehyd und beta-geschützter L-Asparaginsäure, um eine beta-geschützte N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-asparaginsäure zu erzeugen; (b) Kondensieren der beta-geschützten N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-asparaginsäure mit einem L-Phenyialaninmethylester, um einen beta-geschützten N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-alpha-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester zu erzeugen; und (c) Schutzgruppenabspaltung von dem beta-geschützten N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-alpha-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester, um N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-alpha-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester zu erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 25, bei welchem der L-Phenylalaninester ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus L-Phenylalaninmethylester, L-Phenylalaninmethylester-hydrochlorid.
Verfahren nach Anspruch 25, ferner umfassend das Kristallisieren des N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-alpha-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylesters.
Verfahren zum Herstellen von N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-alpha-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester, umfassend das Behandeln einer Mischung einer N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-asparaginsäure und eines L-Phenylalaninmethylesters mit einem Proteaseenzym, um N-[N-(3,3-Dimethylbutyl)-L-alpha-aspartyl]-L-phenylalanin-1-methylester zu erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 28, bei welchem das Proteaseenzym Papain ist.