ES2201812T3

ES2201812T3 - Acido n-3,3-dimetilbutil-l-aspartico y sus esteres procedimiento de preparacion, y procedimiento para preparar n-(-(3,3-dimetilbutil)-l-alfa-aspartil)-l-fenilalanina-1-metilester a partir de ellos.

Info

Publication number: ES2201812T3
Application number: ES99960662T
Authority: ES
Inventors: Indra Prakash; Marie-Christine D. Chapeau
Original assignee: Nutrasweet Co
Current assignee: Nutrasweet Co
Priority date: 1998-12-24
Filing date: 1999-12-08
Publication date: 2004-03-16
Anticipated expiration: 2019-12-08
Also published as: ATE248806T1; DE69911061T2; DE69911061D1; WO2000039075A1; AU1751700A; US6077962A; EP1140795A1; EP1140795B1

Abstract

Un compuesto representado por la fórmula en el que R1 y R2 son de forma independiente hidroxi o alcoxi que tienen de 1 a 6 átomos de carbono o juntos son oxígeno, formando uno de sus anhídridos; y Q es hidrógeno o (CH3)3C(CH2)2-.

Description

Ácido N-3,3-dimetilbutil-L-aspártico y sus ésteres, procedimiento de preparación, y procedimiento para preparar N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina-1-metiléster a partir de ellos.

Antecedentes del invento Campo del invento

Este invento se refiere al ácido N-3,3-dimetilbutil-L-aspártico y a sus derivados. El invento también se refiere a un procedimiento para preparar éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina (neotame) vía acoplamiento péptido de un derivado del novedoso ácido N-(3,3-dimetilbutil)-L- aspártico con L-fenilalanina o un éster de L-fenilalanina.

Técnica anterior relacionada

El éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina (neotame) es un agente edulcorante altamente intenso no nutritivo útil para conferir dulzor a una amplia variedad de productos alimenticios. Este edulcorante, descrito en la patente de EE.UU. Nº. 5.480.668, es aproximadamente 8.000 veces más dulce que la sacarosa, en base en peso. Por ello, pueden utilizarse cantidades muy pequeñas de este agente edulcorante para producir alimentos y productos alimenticios que presentan un sabor igual de dulce que los productos alimenticios altos en calorías disponibles en la actualidad.

La patente de EE.UU. Nº. 5.510.508 describe un método para preparar éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina de fórmula

1

que comprende tratar una disolución alcohólica de aspartame/ácido acético acuoso y 3,3-dimetilbutiraldehído, a temperatura ambiente, con hidrógeno a una presión igual o menor a 1 bar (0,1 MPa) en presencia de un catalizador basado en platino o paladio. El producto se purifica por precipitación y filtración después de eliminar el alcohol de la disolución a vacío.

La patente de EE.UU. Nº. 5.728.862 describe un método que comprende tratar una disolución de aspartame y 3,3-dimetilbutiraldehído en un disolvente orgánico con el agente reductor, hidrógeno en presencia de un catalizador. Tras eliminar el catalizador, se añade agua para formar una disolución acuosa/disolvente orgánico que contiene alrededor de 17% a alrededor de 30% del disolvente orgánico, en peso, a partir de la cual se obtiene el neotame por precipitación y filtración.

No obstante, sería deseable desarrollar métodos más eficaces y rentables para preparar neotame de alta pureza a partir de materiales disponibles o que puedan obtenerse fácilmente.

Compendio del invento

El invento se refiere al novedoso ácido N-(3,3-dimetilbutil)-L-aspártico y a sus derivados, por ejemplo, ésteres y anhídridos. Estos compuestos novedosos del ácido aspártico pueden prepararse por alquilación reductora de 3,3-dimetilbutiraldehído con ácido L-aspártico o sus derivados. El ácido N-(3,3-dimetilbutil)-L-aspártico también puede prepararse por alquilación reductora de 3,3-dimetilbutiraldehído con el éster dialquílico del ácido L-aspártico, seguido de hidrólisis de los grupos éster dialquílicos.

Este invento también se refiere a procedimientos para la preparación de éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina empleando una metodología de acoplamiento péptido. En estos procedimientos, puede formarse el enlace péptido amida del éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina vía acoplamiento péptido de un derivado inactivo del ácido N-(3,3-dimetilbutil)-L-aspártico con L-fenilalanina o un éster de L-fenilalanina. Puede obtenerse el éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina de alta pureza por cristalización directa del producto condensado o mediante transformación de grupo funcional adicional de ese producto, seguida de cristalización o cromatografía en columna.

Descripción detallada del invento

El invento va destinado al ácido N-(3,3-dimetilbutil)-L-aspártico novedoso y a sus derivados representados por la fórmula

2

en la que R^{1} y R^{2} son de forma independiente hidroxi o alcoxi inferior que tienen 1 a 6 átomos de carbono o juntos son oxígeno, formando un anhídrido; y Q es hidrógeno o (CH_{3})_{3}C(CH_{2})_{3}. Preferiblemente, Q es hidrógeno. Preferiblemente, R^{1} y R^{2} son hidroxi o metoxi.

Este invento también va también dirigido a métodos útiles para la preparación del éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina con alto rendimiento y de alta pureza vía acoplamiento péptido de derivados inactivos del ácido N-(3,3-dimetilbutil)-L-aspártico novedoso con L-fenilalanina, o su éster metílico.

El Esquema I muestra un método de preparación de ácido N-(3,3-dimetilbutil)-L-aspártico vía alquilación reductora del ácido L-aspártico utilizando 3,3-dimetilbutiraldehído.

Esquema I

3

Típicamente, la reacción de alquilación reductora se lleva a cabo en agua, un disolvente de alcohol alquílico inferior o sus mezclas. Se prefieren disolventes de alcohol alquílico inferiores, por ejemplo, metanol, etanol, propanol, isopropanol y butanol. Típicamente, la reducción se lleva a cabo utilizando paladio sobre carbono en una atmósfera de hidrógeno. Otros catalizadores de hidrogenación que pueden utilizarse incluyen platino sobre carbono, negro de platino, negro de paladio, níquel sobre catalizadores homogéneos de hidrogenación de sílice o alúmina, níquel Raney, negro de rutenio, rutenio sobre carbono, óxido de paladio, hidróxido de paladio sobre carbono, negro de rodio, rodio sobre carbono o alúmina. Otros agentes reductores útiles incluyen cianoborohidruro de sodio, borohidruro de litio o de sodio. De manera opcional, se añade una base, por ejemplo, bicarbonato de sodio, carbonato de sodio, bicarbonato de potasio, carbonato de potasio, carbonato de litio o una base orgánica, para disolver el ácido aspártico. Si la reacción se lleva a cabo en ausencia de base, tiene lugar la dialquilación y puede obtenerse ácido N,N-di-(3,3-dimetilbutil)-L-aspártico.

De manera alternativa, como se muestra en el Esquema II, puede obtenerse ácido N-(3,3-dimetilbutil)-L-aspártico a través de un procedimiento de dos etapas de alquilación reductora de ácido L-aspártico di-protegido con 3,3-dimetilbutiraldehído seguido de la eliminación de los grupos carboxilo protectores. Cada uno de los grupos carboxilo del ácido L-aspártico se encuentran protegidos por un grupo protector apropiado. Los grupos protectores-carboxilo que son apropiados para ser utilizados en el presente invento son los que por un lado son estables frente a las condiciones de reacción de la alquilación reductora y por otro pueden eliminarse del producto final sin racemización o degradación de dicho producto. De manera opcional, los grupos carboxilo están protegidos mediante la conversión en grupos éster. Grupos éster ejemplares incluyen ésteres de alquilo C_{1}-C_{4}, ésteres de alquilo C_{1}-C_{4} sustituido o ésteres de sililo. Los métodos para proteger y desproteger los compuestos que contienen grupos carboxilo son bien conocidos por los expertos en la técnica y se describen en T.W. Greene, et al., "Protective Groups in Organic Synthesis", Segunda Edición, John Wiley & Sons, New Cork (1991). En esta secuencia de reacción, la alquilación reductora puede llevarse a cabo de la misma manera sin la adición de una base, y empleando los mismos catalizadores de hidrogenación o agentes reductores que se han descrito anteriormente. La reacción también puede llevarse a cabo en disolventes orgánicos tales como acetato de etilo, acetato de propilo, acetato de isopropilo, acetato de butilo, tetrahidrofurano (THF), éter dietílico, éter tert-butilmetílico y tolueno.

Esquema II

4

Como se habrá notado previamente, otra realización de este invento va dirigida a métodos para preparar éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina vía acoplamiento péptido de un derivado inactivo del ácido N-(3,3-dimetilbutil)-L-aspártico con L-fenilalanina o un éster de L-fenilalanina. De acuerdo con el presente invento, el derivado inactivo del ácido N-(3,3-dimetilbutil)-L-aspártico incluye el anhídrido o anhídridos mezclados del ácido aspártico, así como también derivados activos intermedios, que pueden o no aislarse, formado por tratamiento del ácido aspártico, o un ácido aspártico protegido, con un agente de acoplamiento péptido. Los métodos de acoplamiento péptido son bien conocidos por los expertos en la técnica y se describen en M. Bodansky, et al., "The Practice of Peptide Synthesis, Reactivity and Structure, Concepts in Organic Chemistry" Volumen 21, Segunda Edición Revisada, Springer-Verlag, New York, New York (1994).

En una primera realización del método de acoplamiento péptido de este invento, el enlace amida péptido del éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina se forma por condensación de L-fenilalanina o éster metílico de L-fenilalanina con el anhídrido del ácido N-(3,3-dimetilbutil)-L-aspártico, en lo sucesivo anhídrido N-neohexil-L-aspártico. El Esquema III muestra la preparación de anhídrido N-neohexil-L-aspártico y el Esquema IV ilustra la preparación de éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina a través de esta primera realización. En las estructuras de los siguientes Esquemas III a IV, el grupo N-(3,3-dimetilbutil), o neohexilo, se abrevia como "Neo".

Esquema III

5

El anhídrido N-neohexil-L-aspártico puede prepararse por deshidratación del ácido N-neohexil-L-aspártico empleando un agente deshidratante. Las reacciones de deshidratación son conocidas por los expertos en la técnica y pueden llevarse a cabo empleando condiciones de reacción conocidas. Agentes deshidratantes ejemplares incluyen pentóxido de fósforo, tricloruro de fósforo, ácido fosfórico, anhídrido de ácido, tales como anhídrido acético y anhídrido fórmico, carbodiimidas, tales como diciclohexil carbodiimida (DCC).

De manera opcional, antes de la formación del anhídrido, el grupo amino del ácido N-neohexil-L-aspártico puede protegerse mediante la formación de ácido N-neohexil-L-aspártico N-protegido. Los grupos protectores-amino que son útiles para ser utilizados en este invento deben ser estables frente a las condiciones de reacción de deshidratación y debe ser posible su eliminación de la N-neohexil-L-\alpha-aspartil-L-fenilalanina o su éster metílico sin racemización. Generalmente, los grupos protectores-amino apropiados son grupos protectores de tipo carbamato o amida. Grupos protectores-amino ejemplares incluyen formilo, acetilo, benciloxicarbonilo, tert-butoxicarbonilo y p-metoxibenciloxicarbonilo. Los métodos para proteger y desproteger los compuestos que contienen nitrógeno empleando estos grupos son bien conocidos por los expertos en la técnica y se describen en T.W. Greene, et al., supra.

Preferiblemente, el grupo protector de nitrógeno es tanto benciloxicarbonilo, formilo como acetilo y más preferiblemente formilo. El ácido N-benciloxicarbonil-N-neohexil-L-aspártico puede formarse por reacción del ácido N-neohexil-L-aspártico con cloroformiato de bencilo. El ácido N-formil-N-neohexil-L-aspártico puede prepararse por reacción del ácido N-neohexil-L-aspártico con un agente formilante tal como anhídrido fórmico o ácido fórmico y anhídrido acético. El ácido N-acetil-N-neohexil-L-aspártico puede prepararse por reacción del ácido N-neohexil-L-aspártico con un agente acetilante tal como anhídrido acético. De manera ventajosa, en el presente invento, la utilización de anhídrido fórmico o anhídrido acético, como agente deshidratante, en presencia de un ácido tal como ácido fórmico o ácido fosfórico, proporciona la formación de anhídrido N-neohexil-L-aspártico a partir tanto del ácido N-neohexil-L-aspártico como del ácido N-neohexil-L-aspártico N-protegido.

Esquema IV

6

La formación del enlace péptido amida del éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina puede lograrse por condensación del anhídrido N-neohexil-L-aspártico con L-fenilalanina, tal como se muestra en el Esquema IV. La formación del enlace amida ocurre haciendo reaccionar cantidades equimolares del anhídrido aspártico y fenilalanina en un disolvente inerte. La reacción puede llevarse a cabo a 20-100ºC. Disolventes inertes ejemplares, apropiados para su utilización en la reacción de formación del enlace amida, incluyen tolueno, acetato de metilo, acetato de etilo, tetrahidrofurano, acetonitrilo, dioxano y dimetilformamida (DMF) que contengan o no ácidos orgánicos, tales como ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico y ácido isobutírico.

La reacción de condensación del anhídrido N-neo-L-aspártico con L-fenilalanina produce una mezcla de dos productos amida, N-neohexil-\alpha-L-aspartil-L-fenilalanina y N-neohexil-\beta-L-aspartil-L-fenilalanina. El anhídrido N-neo-L-aspártico es un anhídrido asimétrico; es decir, el anhídrido aspártico y el ácido aspártico precursor contienen dos grupos carboxilo diferentes designados como \alpha y \beta, basado en su relación con el grupo de nitrógeno. Los productos amida \alpha y \beta se forman por reacción de la fenilalanina bien con el grupo \alpha-carboxilo o \beta-carboxilo del anhídrido.

Ambas amidas \alpha y \beta del ácido aspártico se obtienen a partir de la condensación del anhídrido N-neohexil-L-aspártico y L-fenilalanina. Generalmente, la relación de isómeros obtenida en esta reacción de condensación es de 2:1 a 3:1.

La esterificación con metanol de la mezcla de amidas \alpha y \beta del ácido aspártico, en un ácido, da lugar a la formación de una mezcla de producto \alpha y \beta. El éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina deseado puede aislarse en forma pura sometiendo a esta mezcla a cristalización o a cromatografía en columna. La utilización de metanol y agua, tal como se ha descrito, por ejemplo, en la patente de EE.UU. Nº.5.728.862, cuya descripción se incorpora en la presente memoria como referencia, proporciona un rendimiento excelente del producto alfa de alta pureza.

De manera alternativa, el éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina puede formarse directamente empleando el método de acoplamiento péptido del presente invento vía condensación del anhídrido N-neohexil-L-aspártico con éster metílico de L-fenilalanina, como se muestran en el Esquema V.

Esquema V

7

La reacción de acoplamiento péptido puede llevarse a cabo bajo las mismas condiciones útiles para el acoplamiento de L-fenilalanina, descrito anteriormente. Esta reacción de acoplamiento forma una mezcla de éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina y éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\beta-aspartil]-L-fenilalanina, generalmente, con una relación de 2:1 a 3:1. El éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina puede obtenerse con alta pureza por re-cristalización de la mezcla de neotame, empleando metanol y agua o mediante cromatografía en columna empleando gel de sílice o resinas.

El Esquema VI muestra otra realización del método de acoplamiento péptido de este invento para la preparación de éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina.

Esquema VI

8

En esta realización, la formación del enlace péptido amida del éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina se logra mediante condensación del éster metílico de L-fenilalanina con un anhídrido mixto del ácido N-neohexil-L-aspártico. Un anhídrido mixto es un anhídrido que procede de dos compuestos diferentes que contienen ácidos carboxílicos, o puede formarse in situ a partir de un compuesto que contiene ácido carboxílico y un derivado de ácido fosfórico, tal como o-fenilenfosfocloridita. Una categoría especial de anhídridos mixtos son los N-carboxi-anhídridos o anhídridos de Leuch, preparados mediante el tratamiento de un aminoácido, por ejemplo, ácido aspártico \beta-protegido, con fosgeno, o mediante calentamiento de cloruros de benciloxicarbonil aminoácidos. Estos anhídridos mixtos pueden obtenerse con alta eficiencia utilizando métodos conocidos en la técnica.

Preferiblemente, el anhídrido mixto del ácido N-neohexil-L-aspártico se prepara mediante reacción del ácido aspártico con un agente acilante, tal como cloruro de alquilo o arilo, cloroformiato, clorocarbonato o imida. Típicamente, la reacción se lleva a cabo en presencia de una base no nucleófila a temperatura ambiente o reducida. Bases no nucleófilas ejemplares incluyen, carbonatos alcalinos, tales como carbonato de sodio, aminas alquílicas, tales como aminas terciarias, trietilamina o N-metil morfolina y aminas aromáticas, tales como piridina. La reacción puede llevarse a cabo en un disolvente, tal como tolueno, DMF, acetonitrilo, acetato de metilo y dioxano. De manera alternativa, también pueden utilizarse aminas básicas, por ejemplo, trietilamina o piridina, como disolventes de reacción apropiados. Reactivos acilantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, cloruros de ácidos tales como cloruro de pivaloilo, cloruro de isovalerilo, cloruro de benzoilo, cloruro de p-nitro-benzoilo, cloruro de pentaclorobenzoilo, cloruro de pentafluorobenzoilo, cloroformiatos, tales como cloroformiato de butilo terciario, cloroformiato de isopropilo, cloroformiato de isobutilo, clorocarbonatos, tales como clorocarbonato de isobutilo, clorocarbonato de etilo y similares, o imidas tales como N-hidroxi succinimida, N-hidroxisuccinimida.

Como se ha indicado anteriormente, el ácido N-neohexil-L-aspártico contiene dos grupos carboxilo diferentes, \alpha- y \beta-, y cualquiera de estos grupos carboxílicos puede participar en la reacción para formar el anhídrido mixto. Por consiguiente, uno de los grupos carboxilo, el carboxilo-\beta, está protegido de manera opcional para que la formación del anhídrido mixto, y la eventual formación del enlace péptido amida, ocurra de manera selectiva en el grupo

\hbox{carboxilo- \alpha }

. El grupo carboxilo-\beta puede protegerse con un grupo protector-carbonilo que no sea reactivo ni en la reacción de formación del anhídrido ni en la reacción de acoplamiento péptido y que puede eliminarse del producto final, el éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina, sin racemización o degradación de dicho producto. De manera opcional, el grupo carboxilo-\beta se protege por conversión en un grupo éster. Grupos éster ejemplares, incluyen éster de tert-butilo, éster de sililo y ésteres de bencilo. Los métodos para proteger y desproteger los compuestos que contienen carboxilo son bien conocidos por los expertos en la técnica y se describen en T.W. Greene, et al., supra.

El grupo carboxilo-\beta del ácido N-neohexil-L-aspártico se protege en la etapa anterior a la reacción de formación del anhídrido. De manera opcional, el grupo carboxilo-\beta se protege en la etapa anterior a la formación del ácido N-neohexil-L-aspártico por alquilación reductora. También pueden formarse ésteres \beta-carboxílicos por reacción de anhídrido N-neohexil-L-aspártico con un alcohol. El Esquema VI muestra la preparación de ácido N-neohexil-L-aspártico \beta-protegido, mediante la alquilación reductora de ácido L-aspártico \beta-protegido con 3,3-dimetilbutiraldehído. La reacción de alquilación reductora puede llevarse a cabo empleando las condiciones y reactivos que se han descrito anteriormente. El ácido N-neohexil-L-aspártico \beta-protegido, preparado según el método de acuerdo con el método del Esquema VI, puede tratarse con un agente acilante, de acuerdo con el método del Esquema V, descrito anteriormente, para formar un anhídrido mixto (R es alquilo o arilo). La formación del enlace péptido amida puede lograrse por condensación del anhídrido mixto del N-neohexil-L-aspartato \beta-protegido con éster metílico de L-fenilalanina, empleando condiciones de acoplamiento descritas anteriormente. El éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina puede prepararse mediante la desprotección, es decir, eliminando el grupo protector-\beta, a partir del éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina \beta-protegido resultante empleando las condiciones de reacción conocidas en la técnica. Si se desea, es posible purificar posteriormente el éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina mediante cristalización a partir de metanol/agua o mediante cromatografía en columna.

El Esquema VII muestra otra realización del método de acoplamiento péptido de este invento para la preparación de éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina.

Esquema VII

9

En esta realización, se logra la formación del enlace péptido amida del éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina mediante condensación directa de un éster de L-fenilalanina con un ácido N-neohexil-L-aspártico empleando un agente de acoplamiento péptido. Los agentes de acoplamiento péptido apropiados actúan para formar un derivado intermedio activo del grupo ácido carboxílico del ácido N-neohexil-L-aspártico. El derivado intermedio activo del ácido aspártico, que puede aislarse o no, experimenta reacción con el grupo nitrógeno del éster 1-metílico de L-fenilalanina para formar el enlace péptido amida del éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina. Un ejemplo de derivado activo del ácido aspártico que puede aislarse es un cloruro de aspartilo \beta-protegido, que experimenta acoplamiento péptido mediante formación de amida simple por reacción del cloruro de ácido y fenilalanina o éster metílico de fenilalanina. Ejemplos de otros derivados activos aislables incluyen hidrazidas y ésteres activos. Los derivados hidrazida del ácido aspártico \beta-protegido puede formarse utilizando un hidrato de hidrazina o derivados de hidracinas de acuerdo con procedimientos convencionales. El acoplamiento de los derivados aspartil hidrazida \beta-protegidos puede lograrse mediante la conversión de la hidrazida en azida, seguida de tratamiento con fenilalanina o éster metílico de fenilalanina. Pueden formarse derivados éster activos del ácido aspártico \beta-protegido empleando técnicas de esterificación convencionales. Derivados éster activos útiles en las reacciones de acoplamiento péptido incluyen, pero no se limitan a, ésteres de cyanometilo, ésteres de p-nitrofenilo, ésteres de 2,4,5-trinitrofenilo, ésteres de pentaclorofenilo, ésteres de pentafluorofenilo, ésteres de tert-butiloxicarbonilamino pentafluorofenilo, ésteres de N-hidroxiftalimida, ésteres de N-hidroxisuccinimida, ésteres de 1-hidroxipiridina, ésteres de 5-cloro-8-hidroxi-quinolina y similares. El acoplamiento de los derivados éster activos con fenilalanina o éster metílico de fenilalanina puede lograrse por reacción simple de los dos materiales en condiciones de reacción ácidas, neutras o básicas convencionales. De manera alternativa, la reacción de acoplamiento de éster activo puede catalizarse empleando reactivos convencionales de acoplamiento, tales como imidazol, 1-hidroxibenzotriazol o 3-hidroxi-3,4-dihidro-quinazolin-4-ona.

Típicamente, el derivado activo de ácido aspártico no se aísla, pero se forma en condiciones de reacción como producto intermedio que participa en la formación del enlace péptido amida. Preferiblemente, el derivado activo intermedio de ácido aspártico se prepara por reacción de ácido N-neohexil-L-aspártico \beta-protegido con un agente de acoplamiento péptido. El grupo \beta-carboxilo del ácido N-neohexil-L-aspártico puede protegerse con cualquier grupo protector-carboxilo apropiado que no sea reactivo en la reacción de acoplamiento péptido y que pueda ser eliminado del producto final, el éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina, sin racemización o degradación de dicho producto. Los ácidos aspárticos \beta-protegidos apropiados se han descrito anteriormente. Agentes de acoplamiento péptido que son útiles en el método del presente invento incluyen, pero no se limitan a, diciclohexil carbodiimida (DCC), DCC/1-hidroxibenzotriazol, DCC/N-hidroxisuccinimida, 1-isobutoxicarbonil-2-isobutoxi-1,2-dihidroquinona (IIDQ), carbonildiimidazol, N-etil-5-fenilisoxazolio-3'-sulfonato (Reactivo de Woodward K), hexafluorofosfato de benzotriazolil-N-hidroxitris(dimetilamino)fosfonio (BOP). Los agentes de acoplamiento péptido descritos anteriormente y los métodos para la utilización de estos agentes, y otros, pueden encontrarse en cualquiera de las revisiones del asunto, por ejemplo M. Bodansky, et al., supra.

En otra realización de este invento, pueden utilizarse métodos enzimáticos para formar el enlace péptido amida del éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina, como se muestra en el Esquema VIII.

Esquema VIII

10

De acuerdo con esta realización, se puede hacer reaccionar el ácido N-neohexil-L-aspártico con éster metílico de L-fenilalanina, en presencia de la enzima proteasa, papaína, para proporcionar \alpha-neotame. También puede emplearse el ácido N-neohexil-L-aspártico N-protegido para formar el producto péptido acoplado. La eliminación del grupo protector de nitrógeno proporciona el éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina. El disolvente en el que se lleva a cabo la reacción puede escogerse de forma tal, que el producto deseado sea insoluble, o ligeramente soluble en el disolvente, dando como resultado un cambio en el equilibrio de reacción para favorecer la formación del péptido. Grupos protectores de nitrógeno, útiles en el método enzimático de este invento pueden incluir cualquiera de los grupos protectores descritos anteriormente. Preferiblemente, acetoacetilo, acetilo, benzoilo, benciloxicarbonilo, tert-butiloxicarbonilo, formilo, isovalerilo, (p-metoxibencil)oxicarbonilo o fenilacetilo. Preferiblemente, el grupo protector de nitrógeno es benciloxicarbonilo. Disolventes útiles en los que puede llevarse a cabo la reacción de acoplamiento enzimático incluyen los que son miscibles o inmiscibles con agua. Disolventes ejemplares incluyen co-disolventes orgánicos tales como glicerol y otros glicoles, acetonitrilo, acetato de etilo, alcohol tert-amílico y fosfato de trietilo. También pueden utilizarse sistemas de disolventes mixtos, tales como acetato de etilo y alcohol tert-amílico.

Una vez que se ha completado la reacción de acoplamiento empleando cualquiera de los métodos descritos anteriormente, cualquier grupo protector que se encuentre presente sobre el grupo de ácido aspártico (por ejemplo, grupos protectores de nitrógeno o grupos protectores de \beta-carboxilo) puede eliminarse empleando procedimientos típicos de desprotección. El éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina puede purificarse posteriormente mediante cristalización a partir de metanol/agua o mediante cromatografía en columna.

Se pretende que los siguientes ejemplos sean una ilustración de determinadas realizaciones preferidas del invento, y no suponen una limitación del invento.

Ejemplo 1 Ácido N-neohexil-L-aspártico

Procedimiento A

Se añadió ácido L-aspártico (4 g, 0,03 moles) a una botella Parr que contenía una disolución de bicarbonato de sodio (5,04 g, 0,06 moles) en agua (50 mL) para formar una disolución transparente, con efervescencia. A continuación, se añadió una disolución de 3,3-dimetilbutiraldehído (3 g, 0,03 moles) en metanol (50 mL) a la botella Parr, seguido de Pd/C (paladio sobre carbono al 4%, 50% de humedad, 0,4 g). La mezcla se hidrogenó a 50 psi/temperatura ambiente durante 2 días. Si la reacción no es completa, se añade Pd/C nuevo (0,2 g) y se continúa la hidrogenación durante 8 horas más. Se filtró la mezcla a través de un lecho de Celite*, y se lavó el lecho con metanol (20 mL). El filtrado y los lavados se combinaron y se concentraron a presión reducida a 40-50ºC. El pH de la disolución acuosa restante se ajustó a 3 con ácido clorhídrico concentrado. El precipitado sólido se filtró y se secó a vacío a 50ºC durante 4 horas para dar 4,75 g (73%) de ácido N-neohexil-L-aspártico bruto. Se formó un lodo a partir del producto bruto con etanol acuoso (47,5, 80% de etanol, 20% de agua) durante 15 minutos y se filtró para dar 3,3 g (51%) de ácido N-neohexil-L-aspártico de pureza > 98%. P. F. 184-186ºC; [\alpha]_{D} +12,35 (c=1, agua); RMN (D_{2}O) \delta 3,37 (t, 3H); 2,25-2,65 (m, 4H); 1,27-1,47 (m, 2H); 0,89 (s, 9H), Anal. calculado de C_{10}H_{19}NO_{4}; C, 55,28; H, 8,81; N, 6,45; Encontrado; C,55,35; H, 8,86; N, 6,50.

Ejemplo 2 Hidrocloruro de ácido N-neohexil-L-aspártico

Procedimiento B

Se añadió hidrogenocarbonato de sodio (1,68 g, 0,02 moles) a una botella Parr que contenía una disolución de hidrocloruro de L-aspartato de dimetilo (3,94 g, 0,02 moles) en agua (10 mL), seguida de la adición de 3,3-dimetilbutiraldehído (2,2 g, 0,02 moles) en metanol (100 mL) y Pd/C (paladio sobre carbono al 4%, 50% de humedad), 10% en peso de substrato. La mezcla se hidrogenó a 50 psi a temperatura ambiente durante 1,5 horas, a continuación se filtró a través de un lecho de Celite* y se lavó el lecho con metanol (10 mL). El filtrado y los lavados se concentraron a presión reducida. La disolución acuosa residual se extrajo con éter dietílico (2 x 100 mL). La fase orgánica se lavó con una disolución acuosa saturada de hidrogenocarbonato de sodio (50 mL), se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y se concentró para dar el éster dimetílico del ácido N-neohexil-L-aspártico (4,65 g, 95%) en forma de aceite. RMN (CDCI_{3}) \delta 3,67 (s, 3H); 3,50 (s, 3H); 3,57 (t, 3H); 2,37-2,70 (m, 4H); 1,20-1,40 (m, 2H); 0,80 (s, 9H).

Se calentó a reflujo durante 4 horas una mezcla de éster dimetílico de ácido N-neohexil-L-aspártico (15 g, 0,061 moles) en ácido clorhídrico 1N (350 mL) para formar una disolución transparente. La mezcla se secó por congelación para dar hidrocloruro N-neohexil-L-aspártico en forma de sólido de color blanco (14 g, 91%), P.F. 133-138ºC, [\alpha]_{D} +14,69 (c=1, agua). Anal. calculado de C_{10}H_{19}NO_{4} \cdot HCl; C, 47,52; H, 7,92; N, 5,54; Cl,14,05. Encontrado: C, 47,84; H, 8,14; N, 5,31; Cl, 13,08.

Ejemplo 3 Ácido N,N-di-neohexil-L-aspártico

Se añadió 3,3-dimetilbutiraldehído puro (3 g, 0,03 moles) a un lodo de ácido L-aspártico (4 g, 0,03 moles) en metanol/agua 1:1 (80 mL), seguido de Pd/C (4%, 50% de humedad, 0,5 g). Se hidrogenó la mezcla empleando H_{2}(50 psi) a temperatura ambiente durante 2 días. La mezcla de reacción resultante se filtró a través de un lecho de Celite*, y el lecho se lavó con metanol (50 mL). El filtrado y los lavados se combinaron y se eliminó el metanol empleando un evaporador rotatorio a presión reducida a 40-50ºC para proporcionar el ácido N,N-dineohexil-L-aspártico en forma de precipitado sólido en agua. El sólido se filtró, se lavó con agua (2 mL) y se secó en un horno a vacío a 50ºC durante 4 horas para proporcionar 3,2 g de ácido N,N-di-neohexil-L-aspártico (36%), P.F. 197-198ºC, [\alpha]_{D} -3 (c=1, metanol). Anal. calculado de C_{10}H_{31}NO_{4}; C, 63,78; H, 10,29; N, 4,65; Encontrado: C, 63,43; H, 10,29; N, 4,70.

Ejemplo 4 Anhídrido N-neohexil-L-aspártico

Procedimiento A

Se añadió tricloruro de fósforo (3,7 ml, 43 mmoles), gota a gota, a ácido N-neohexil-L-aspártico en forma de lodo a 10ºC (11,6 g, 53,4 mmoles) en ácido acético glacial (50 ml). Tras completar la adición (0,5 hr), la disolución transparente resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Se recogió el precipitado sólido resultante mediante filtración a vacío, se lavó con ácido acético y cloruro de metileno, a continuación se secó a 35-40ºC durante 3 horas para dar 3,62 g (69,8%) de anhídrido N-neohexil-L-aspártico puro.

Ejemplo 5 Anhídrido N-neohexil-L-aspártico

Procedimiento B

Se disuelve hidrocloruro N-neohexil-L-aspártico en una disolución acuosa de bicarbonato de sodio bajo agitación. Se enfría la disolución, y se trata con cloruro de benciloxicarbonilo e hidróxido de sodio acuoso, añadidos poco a poco, de manera alternativa, bajo agitación enérgica. La mezcla de reacción resultante se agita a temperatura ambiente durante alrededor de 3 horas. Se extrae la disolución dos veces con éter dietílico y se acidifica con ácido clorhídrico concentrado hasta el punto final del azul de Congo. El ácido N-benciloxicarbonil-N-neohexil-L-aspártico se separa en forma de sólido o de aceite que solidifica lentamente. Se enfría la mezcla de reacción resultante a 10-15ºC durante varias horas y el sólido resultante se recoge por filtración, se lava con agua y se seca a vacío. El ácido N-benciloxicarbonil-N-neohexil-L-aspártico puede utilizarse según se obtiene o puede re-cristalizarse en un disolvente adecuado.

Se calienta a reflujo durante 0,5 a 5 horas una disolución de ácido N-benciloxicarbonil-N-neohexil-L-aspártico, en anhídrido acético con una cantidad catalítica de ácido fosfórico, se enfría a temperatura ambiente y se concentra a presión reducida, con calentamiento. El material residual se disuelve en agua y a continuación se neutraliza con hidróxido de sodio acuoso. Se recoge el precipitado resultante por filtración a vacío y se re-cristaliza para proporcionar anhídrido N-neohexil-L-aspártico considerablemente puro.

Ejemplo 6 N-neohexil-\alpha-aspartame

Procedimiento A

Se añaden anhídrido N-neohexil-L-aspártico y L-fenilalanina a dioxano seco y la disolución se agita a 20-80ºC durante 1-8 horas. La mezcla de reacción resultante se diluye con un disolvente orgánico que no sea miscible en agua, se lava sucesivamente con KHCO_{3} acuoso, a continuación con HCl acuoso, se seca sobre Na_{2}SO_{4} anhidro y se evapora a sequedad a presión reducida, proporcionando una mezcla de amidas: N-neohexil-\alpha-L-aspartil-L-fenilalanina y N-neohexil-\beta-L-aspartil-L-fenilalanina. La mezcla de amidas se disuelve en una disolución de metanol/ácido clorhídrico y la mezcla de reacción resultante se agita a 20-80ºC durante 1-8 horas para formar una mezcla de éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina y éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\beta-aspartil]-L-fenilalanina. La recristalización de la mezcla de \alpha- y \beta-aspartame a partir de metanol/agua o la cromatografía en columna sobre gel de sílice empleando acetato de etilo:metanol:hexano (60:30:10) como eluyente proporciona éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina puro.

Ejemplo 7 Éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L- fenilalanina

Procedimiento B

Se calentó a 55-60ºC durante 3 horas una mezcla de hidrocloruro N-neohexil-L-aspártico (2 g, 8,5 mmoles) y éster metílico de L-fenilalanina en tolueno seco (13 ml), se enfrió a temperatura ambiente, y se dejó en reposo durante la noche. La mezcla de reacción resultante se concentró a sequedad a presión reducida a 40-45ºC. El material sólido residual se disolvió en acetato de etilo (20 ml), se lavó sucesivamente con agua (10 ml), KHCO_{3} acuoso y HCl acuoso, se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro y se evaporó a sequedad a presión reducida para proporcionar una mezcla de éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina y éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\beta-aspartil]-L-fenilalanina (3 g). La recristalización de la mezcla de \alpha- y \beta-aspartame a partir de metanol/agua o la cromatografía en columna sobre gel de sílice empleando acetato de etilo:metanol:hexano (60:30:10) como eluyente proporciona éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina puro.

Ejemplo 8 N-neohexil-\alpha-aspartame

Procedimiento C

Se añadió una disolución de 3,3-dimetilbutiraldehido (1 mmol) en metanol (30 ml) a una disolución en metanol de éster \beta-t-butílico de ácido L-aspártico en una botella Parr, seguido de una adición de Pd/C (0,1 mmoles). La mezcla se hidrogenó a 50 psi a temperatura ambiente durante 1 hora. Si la reacción no es completa, puede añadirse más Pd/C y la hidrogenación continúa. La mezcla de reacción se filtró a través de un lecho de Celite*, y el lecho se lavó con metanol. El filtrado y los lavados se combinaron, y el metanol se eliminó a presión reducida. Se ajustó a 3 el pH de la disolución acuosa restante con ácido clorhídrico concentrado. El precipitado sólido se filtró y se secó en un horno a vacío para dar el hidrocloruro del éster \beta-t-butílico de ácido N-neohexil-L-aspártico puro. Se formó un lodo con el producto puro y metanol acuoso y se filtró para dar el hidrocloruro del éster \beta-t-butílico de ácido N-neohexil-L-aspártico puro con un rendimiento de 90%.

Se añadieron de forma secuencial hexafluorofosfato de benzotriazolil-N-hidroxitris(dimetianimo)fosfonio (BOP, 3,7 mmoles) y trietil amina (7,4 mmoles) a una disolución agitada de éster \beta-t-butílico de ácido N-neohexil-L-aspártico y hidrocloruro del éster metílico de fenilalanina (3,7 mmoles) en DMF/acetonitrilo (15/20 ml) y la mezcla resultante se dejó agitando a temperatura ambiente durante la noche. La adición de salmuera (60 ml) dio como resultado la formación instantánea de un precipitado de color blanco. La suspensión resultante se agitó durante 2 horas y se transfirió a un embudo de decantación. Se extrajo la fase acuosa con acetato de etilo (1 x 200 mL, 2 x 50-80 mL). Los extractos de acetato de etilo se combinaron y se lavaron sucesivamente con HCl 1N (2 x 100 mL), agua (1 x 100 mL), NaHCO_{3}saturado (2 x 100 mL), y salmuera (1 x 100 mL), y se secaron sobre MgSO_{4}, se filtraron y se evaporaron hasta dar un aceite de color amarillento con un rendimiento cuantitativo. Este aceite se disolvió en acetato de etilo (30 mL) y se trató con ácido clorhídrico (4,3 M, 20 mL), con agitación, durante 6 horas a temperatura ambiente. Se ajustó a 5,2 el pH de la mezcla y se transfirió a un embudo de decantación. Se separó la fase orgánica. La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (3 x 30 mL) y los extractos de acetato de etilo se secaron sobre MgSO_{4} anhidro, se filtraron y se evaporaron hasta sequedad. La recristalización del producto puro sobre metanol 25%- agua 75% (30 mL) dio 2,5 g de éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina puro.

Ejemplo 9 Síntesis enzimática de éster metílico de N-3,3-dimetilbutil-L-aspartil-L- fenilalanina (Neotame)

Se añadió papaína (180 mg) a una mezcla de disolución tampón de Mc Ilvaine (pH 5,5) y etanol (disolución tampón al 60%/etanol al 40%, volumen total; 3 mL) que contenía mercaptoetanol (100 mmoles), ácido neohexil-L-aspártico (200 mmoles) y éster metílico de L-fenilalanina (200 mmoles). La mezcla se agitó durante 20 horas a temperatura ambiente. Los productos de reacción pueden separarse por cromatografía utilizando acetato de etilo:metanol:hexano (60:30:10) como eluyente para proporcionar \alpha- neotame puro.

Claims

1. Un compuesto representado por la fórmula

11

en el que R^{1} y R^{2} son de forma independiente hidroxi o alcoxi que tienen de 1 a 6 átomos de carbono o juntos son oxígeno, formando uno de sus anhídridos; y Q es hidrógeno o (CH_{3})_{3}C(CH_{2})_{2}-.

2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que Q es hidrógeno.

3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que R^{1} y R^{2} son hidroxi o metoxi.

4. El compuesto ácido N-(3,3-dimetilbutil)-L-aspártico.

5. El compuesto ácido N,N-di-(3,3-dimetilbutil)-L-aspártico.

6. El compuesto anhídrido N-(3,3-dimetilbutil)-L-aspártico.

7. Un procedimiento para preparar ácido N-(3,3-dimetilbutil)-L-aspártico, que comprende la etapa de alquilación reductora del ácido L-aspártico y 3,3-dimetilbutiraldehído.

8. Un procedimiento para preparar ácido N-(3,3-dimetilbutil)-L-aspártico o sus derivados representado por la fórmula

12

en la que R^{1} y R^{2} son de forma independiente hidroxi o alcoxi inferior que tienen de 1 a 6 átomos de carbono o juntos son oxígeno, formando un anhídrido, y Q es hidrógeno o (CH_{3})_{3}C(CH_{2})_{2}-, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de alquilación reductora de

13

en la que R^{1} y R^{2} son como se ha descrito anteriormente, con 3,3-dimetilbutiraldehído.

9. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la alquilación reductora se lleva a cabo utilizando paladio sobre carbono en una atmósfera de hidrógeno con bicarbonato de sodio.

10. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que Q es hidrógeno.

11. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que R^{1} y R^{2} son hidroxi.

12. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que R^{1} y R^{2} son metoxi.

13. Un procedimiento para preparar éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina, que comprende las etapas de:

(a) condensar anhídrido N-(3,3-dimetilbutil)-L-aspártico con éster metílico de L-fenilalanina para formar una mezcla de éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina y éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\beta-aspartil]-L-fenilalanina; y

(b) aislar dicho éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina de dicha mezcla.

14. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, que además comprende la etapa de formar anhídrido N-(3,3-dimetilbutil)-L-aspártico por deshidratación de un ácido N-(3,3-dimetilbutil) aspártico N-protegido.

15. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que la deshidratación del ácido aspártico se lleva a cabo utilizando anhídrido acético.

16. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que ácido N-(3,3-dimetilbutil)-L-aspártico N-protegido es ácido N-formil-N-(3,3-dimetil-butil)-L-aspártico, ácido N-acetil-N-(3,3-dimetilbutil)-L-aspártico o ácido N-beniciloxicarbonil-N-(3,3-dimetil-butil)-L-aspártico.

17. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, en el que dicha etapa de asilamiento es mediante cristalización.

18. Un procedimiento para preparar éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina, que comprende las etapas de:

(a) condensar anhídrido N-(3,3-dimetilbutil)-aspártico con L-fenilalanina para formar una mezcla de amida del ácido \alpha-L-fenilalanina-N-neohexil-aspártico y amida del ácido \beta-L-fenilalanina-N-neohexil aspártico

(b) esterificar dicha mezcla de amidas para formar una mezcla de éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina y éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\beta-aspartil]-L-fenilalanina; y

(c) aislar de dicha mezcla dicho éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina.

19. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, que además comprende formar anhídrido N-(3,3-dimetilbutil)-L-aspártico por deshidratación de un ácido N-(3,3-dimetilbutil)aspártico N-protegido.

20. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 19, en el que la deshidratación del ácido aspártico se lleva a cabo utilizando anhídrido acético.

21. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 19, en el que el ácido N-(3,3-dimetilbutil)-L-aspártico N-protegido es ácido N-formil-N-(3,3-dimetil-butil)-L-aspártico, N-acetil-N-(3,3-dimetilbutil)-L-aspártico o ácido N-benciloxicarbonil-N-(3,3-dimetilbutil)-L-aspártico.

22. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, en el que dicha etapa de aislamiento es mediante cristalización.

23. Un procedimiento para preparar éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina, que comprende las etapas de:

(a) reducir un producto de condensación de 3,3-dimetilbutiraldehído y ácido L-aspártico \beta-protegido para formar ácido N-(3,3-dimetilbutil)-L-aspártico \beta-protegido;

(b) formar un anhídrido mixto de dicho ácido N-(3,3-dimetilbutil)-L-aspártico \beta-protegido;

(c) condensar dicho anhídrido mixto con éster metílico de L-fenilalanina para formar éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina \beta-protegido; y

(d) desproteger dicho éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina \beta-protegido para formar éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina.

24. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 23, que además comprende cristalizar dicho éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina.

25. Un procedimiento para preparar éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina que comprende las etapas de:

(b) condensar dicho ácido N-(3,3-dimetilbutil)-L-aspártico \beta-protegido con éster metílico de L-fenilalanina para formar éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina \beta-protegido; y

(c) desproteger dicho éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina \beta-protegido para formar éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina.

26. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 25, en el que dicho éster de L-fenilalanina se escoge en el grupo formado por éster metílico de L-fenilalanina, hidrocloruro del éster metílico de L-fenilalanina.

27. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 25, que además comprende cristalizar dicho éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina.

28. Un procedimiento para preparar éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina que comprende tratar una mezcla de ácido N-(3,3-dimetilbutil)-L-aspártico y éster metílico de L-fenilalanina con una enzima proteasa para formar éster 1-metílico de N-[N-(3,3-dimetilbutil)-L-\alpha-aspartil]-L-fenilalanina.

29. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 28, en el que dicha enzima proteasa es papaína.