DD239406A5

DD239406A5 - Verfahren zur herstellung von acyltripeptiden

Info

Publication number: DD239406A5
Application number: DD85274551A
Authority: DD
Inventors: Jeffrey L Ives; Frank Ch Sciavolino
Original assignee: ��@��Kk��
Priority date: 1984-03-30
Filing date: 1985-03-28
Publication date: 1986-09-24
Also published as: HU198086B; PL252659A1; FI851271A0; AU552919B2; PH21303A; ZA852335B; DK142485A; AU5647686A; DK142485D0; JPS60224699A; KR850006939A; ES541620A0; PT80181A; US4565653A; EP0157572A2; NZ211634A; PT80181B; AU4052385A; ES8605821A1; HUT37443A

Abstract

Acyltripeptide der folgenden Formel, deren pharmazeutisch akzeptable Salze und Zwischenstufen dafuer, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als immunostimulierende und antibakterielle Mittel, worin R C1-6-Alkyl, x eine ganze Zahl und 1 bis 4 ist. Formel

Description

239 401

Anwendungsgebiet der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auf neue Acyltripeptide, brauchbar als immunostimmulierende und antibakterielle Mittel, auf deren pharmazeutisch akzeptable Salze, Zwischenstufen dafür und auf Verfahren zu ihrer Herstellung.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Das relativ neue Gebiet der Immunopharmakologie und insbesondere der Ausschnitt, der sich mit Immunomodulation befaßt, entwickelt sich rasch weiter. Eine Vielzahl natürlich vorkommender Verbindungen ist untersucht worden, einschließ-

lieh das Tetrapeptid Tuftsin, chemisch bekannt als N -/"1-

2 (N -L-Threonyl-L-lysyl)-L-prolyiy-L-arginin. Viel Aufmerk-

samkeit ist auf synthetische Peptidoglycan-Derivate gerichtet worden, insbesondere solche, die als Muramyldipeptide bekannt sind. Bezüglich Zusammenfassungen des weiten Bereichs von Verbindungen, die als Immunomodulatoren und insbesondere als Immunostimulantien untersucht worden sind, wird verwiesen auf Dukar et al., Annu. Rep. Med. Chem., J_4, 14 6-167 (1979), Lederer, J. Med. Chem., Z3, 819-825 (1980) und auf J. Kralovec, Drugs of the Future, 8_, 615-638 (1983).

Immunostimulierende Peptide sind in einer Anzahl von Patentbeschreibungen beschrieben worden:

L-Alanyl- oC -glutarsäure-N-acyl-dipeptide Inder DE-OS 3 024 355, veröffentlicht 15. Januar 1981;

Tetra- und Penta-peptide mit D-Alanyl-L-glutamyl-Resten oder L-Alanyl-D-glutamyl-Resten in der GB-PS 2 053 231, veröffentlicht 4. Februar 1981,bzw. DE-OS 3 024 281, veröffentlicht 8. Januar 1981 und

N-Acyl-L-alanyl- «f-D-glutamyl-tripeptid-Derivate, in denen die C-endständige Aminosäure Lysin oder Diaminopimelinsäure ist, in der DE-OS 3 024 369, veröffentlicht 15. Januar 1981, und

Lactyl-tetrapeptide, zusammengesetzt aus N-Lactylalanyl-, Glutamyl-, Diaminopimelyl- und Carboxymethylamino-Bestandteilen, in der EP-11283, veröffentlicht 28. Mai 1980.

Weitere immunostimulierende Polypeptide der Formel (A)

R¹-(HNCHCO) -HN-CH-R³

I₂ ⁿ I

CO-NH-CH-R⁴

(A) (CH₂)3

R⁶-HN-CH-R⁵

1 2

worin R Wasserstoff oder Acyl ist, R unter anderem Wasser-

3 4 stoff, Niederalkyl, Hydroxymethyl, Benzyl ist, R und R

7 8 7

jeweils Wasserstoff, Carboxy, -CONR R , worin R Wasserstoff, Niederalkyl, gegebenenfalls substituiert durch Hydroxy, ist,

8 5

sind und R Mono- oder Dicarboxy-niederalkyl ist, R Wasserstoff oder Carboxy ist, mit der Maßgabe, daß, wenn eine der

4 5 Gruppen R und R Wasserstoff ist, die andere Carboxy oder

-CONR⁷R⁸ ist, R⁶ Wasserstoff ist, m 1 bis 3 und η 0 bis 2 ist, und deren Derivate, worin die Carboxy- und Aminogruppen geschützt sind, sind in den US-Patentschriften 4 311 640 und 4 322 341, den EP-Anmeldungen 25 482, 50 856, 51 812, 53 388, 55 846 und 57 419 offenbart.

Keines der auf dem Gebiet offenbarten Polypeptide hat eine basische Aminosäure in der von gen Formel besetzten Stellung.

basische Aminosäure in der von der Variablen R in der obi-

Kitaura et al., J. Med. Chem. 2_5, 335-337 (1982) berichten

2 '

N -( y -D-Glutamyl)-meso-2 (L),2 (D)-diaminopimelinsäure als Minimalstruktur mit der Fähigkeit zur Auslösung einer biologischen Reaktion, charakteristisch für die Verbindung der Formel (A), worin η 1 ist, R¹ CH₇CH(OH)-CO, R² CH-, ist, R³ und R jeweils -COOH ist, R -CONHCH₂COOh ist und R H ist. Die Verbindung der Formel (A) ist als FK-156 bekannt.

Ziel und Darlegung des Wesens der Erfindung

Neue Acyltripeptide der Formel (I)

0 D R°-C-NH-CH-COOH

(CH )

I k f

I f

CO-NH—CH-CO-NH-(CH₀) -CH-COOH

I Z X

(D

H₂N-CH-COOH D

- ⁴ - 239 4 ö 6

und pharmazeutisch akzeptable Salze hiervon sind wirksame Iinmunostimulantien oder Immunomodulatoren und antibakterielle Mittel. In der obigen Formel ist R Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und χ eine ganze Zahl von 1 bis 4.

Von dieser Erfindung umfaßt sind auch gewisse Verbindungen, brauchbar als Zwischenstufen zur Herstellung von Verbindungen der Formel (I) . Die Zwischenstufen haben Formeln (II) und (III)

0 D

Il - · ι

If-C-NH-CH-COOY¹

(CH₂)₂ O=C-O-Y²

0 D

R°-C-NH-CH-COOY¹

(CH₂,₂

I - 3 (HD

CO-NH—CH-CO-Y^J

HN-CH-CO-Y⁴

Λ 0 A

worin R° C, _g-Alkyl ist, Y , Y und Y jeweils eine Carboxyschutzgruppe ist, Y eine Carboxyschutzgruppe oder y, NHY⁵

-NH-(CH₉) -CH

^X ^- COOH

worin χ eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist, und Y eine Aminoschutzgruppe ist.

Die Konfiguration der Aminosäurereste, die die Verbindungen der Formel I bilden, ist in Bezug auf die pharmakologische Aktivität der Verbindungen von Bedeutung. Die stärkste Aktivität wird bei Verbindungen der Formel I beobachtet, die die in der Formel angegebene Stereochemie haben. Die Stereochemie relativ zu der der natürlichen Aminosäure wird als D- oder L- bezeichnet. Die Stereochemie des

NH₂ -NH(CH₉) -CH-COOH

-Restes kann entweder D- oder L- sein, wobei beide Epimeren den Verbindungen der Formel I mit der an anderen Stellen angegebenen Stereochemie starke Aktivität verleihen.

Die Acyltripeptide der Formel (I) werden nach irgend einer verschiedener, dem Fachmann auf dem Gebiet bekannter Methoden hergestellt. Zur Methodik gehört die Bildung von Peptidbindungen zwischen Aminosäuren, die aufgrund ihrer Amino- und Carboxygruppen und häufig aufgrund des Vorliegens weiterer reaktiver Gruppen den Schutz der Gruppen und/oder die Aktivierung solcher Gruppen, insbesondere der Carboxygruppe, benötigen, um eine bestimmte Reaktion zu erzielen oder eine solche Reaktion zu optimieren.

Die insgesamt beteiligte Reaktionsfolge ist nachfolgend wiedergegeben :

H₂NCHCOOH ZNHCHCOOH

I j ²

CbZC₁, pH.9.0 „ ₍l

I ^Z

10°C~R.T.

j I

H₂NCHCOOH ZNHCHCOOH

D E

(3)

ZNHNH,

AcOH, CH₃CN

H₂NCHCONHNHz

(CH₂)

H₂NCHCONHNHz

D .2 AcOH

(4)

LAP~Enzym pH=8.5

H₂NCHCOOH j	^:H2^}3 2.	BSA CH C	,, ZNHCHCOOH „ J. st I
	H₂NCHCONHNHz	' 2	² _> I
(<	D	CbzCl	^(CH2>3
	(ί		ZNHCHCONH
5)		-
	(6)

SOCl₂, CH₂Cl

ZHNCHCONHNHZ D

H₃O

H₀NCHCOUH

I

ZHNCHCONHNHZ D

(7)

(8)

H₀NCHCOOH

I

COOH (9)

1. R-COCl

2.

pH=9.0

C₆H₅CH₂Br

3. HOSuc, CMEC

R-CONHCHCOOBZ

CO 0-

(10)

—•7 ···

NMM

(8)

R-CONHCHCOOBz (CH₂)₂ CONHCHCOOH L

ZHNCHCONHNHZ D

(H)

1. HOSuc, DCC

;—►

2. alpha-Z-Lysin ,

BSA

R-CONHCHCOOBz

j 2' 2 NHZ

CONHCHCONH-(CH₃)₄~CH—COOH

LD L (CH₂J₃

ZHNCHCONHNHZ

p_

(12)

H₂/10%Pd-C

2. NaIO₄, pH=l,0

R-CONHCHCOOH

NH

₂J₂

CONHCHCONH-(CH₃)₄-CH-COOH

H₂NCHCOOH

Di (13)

Z = Cbz = Benzyloxycarbonyl

BSA = Bis-trimethylsilylacetamid

CMEC = l-cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)carbodiimid-

metho-p-toluol - sulfonat HOSuc = N-Hydroxysuccinirnid NMM = N-Methylmorpholin R = (C_1-6)AIkYl DCC = Dicyclohexylcarbodiimid

Wie aus der obigen Reaktionsfolge ersichtlich, werden die Aminosäuren, die das Tripeptid der Formel (I) bilden, durch Verbinden der acylierten Glutaminsäure mit dem Diaminopimelinsäure-Lysin (oder basischen Aminosäure)-Dipeptid-Rest hergestellt. Der Dipeptid-Rest wiederum wird durch Binden von Diaminopimelinsäure an Lysin nach der obigen Reaktionsfolge hergestellt. Die Reihenfolge, in der die einzelnen Aminosäuren zur Herstellung des Tripeptids kombiniert werden, ist unerheblich.

In den hier gegebenen Beispielen sind bestimmte schützende und aktivierende Gruppen speziell veranschaulicht. Der Fachmann auf dem Gebiet wird jedoch erkennen, daß andere schützende oder aktivierende Gruppen hätten verwendet worden sein können. Die Wahl einer bestimmten Schutzgruppe hängt in hohem Maße von der Verfügbarkeit des nötigen Reagens, seinem Einfluß auf die Löslichkeit der "geschützten" Verbindung, seiner leichten Abspaltbarkeit und der Gegenwart weiterer Gruppen ab., die durch seine Verwendung beeinflußt werden könnten, d.h. seine Selektivität, oder seiner Abspaltung,

Beispielsweise wird es notwendig oder zumindest wünschenswert sein, bei vielen Umsetzungen die Aminogruppen und/oder die Carboxygruppen zu schützen. Der für die Tripeptidsynthese gewählte Syntheseweg kann die Entfernung einer oder der anderen oder beider Schutzgruppen erforderlich machen, um weitere Umsetzung an der regenerierten Amino- oder Carboxygruppe zu ermöglichen; d.h., die verwendeten Schutzgruppen

239 4

sind reversibel und in den meisten Fällen entfernbar, unabhängig voneinander. Außerdem hängt die Wahl einer Schutzgruppe für eine gegebene Aminogruppe von der Rolle der Aminogruppe im Gesamtreaktionsschema ab. Aminoschutzgruppen mit unterschiedlichen Labilitätsgraden, d.h. Leichtigkeit der Abspaltung, werden verwendet. Das gleiche gilt hinsichtlich der Carboxyschutzgruppen. Solche Gruppen sind auf dem Fachgebiet bekannt, und verwiesen wird auf die Übersichten von Bodansky et al., "Peptide Synthesis", 2. Auflage, John Wiley & Sons, N.Y. (1976); Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, N.Y. (1981); McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, N.Y. (1973); und auf Sheppard in "Comprehensive Organic Chemistry, The Synthesis and Reactions of Organic Compounds", Pergamon Press, N.Y. (1979), Herausgeber E. Haslam, Teil 23.6, S. 321-339.

Herkömmliche Amino- und Carboxyschutzgruppen sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt. Repräsentative Aminoschutzgruppen, keineswegs aber auf sie beschränkend, sind die folgenden: Benzyloxycarbonyl, substituiertes oder unsubstituiertes Aralkyl, wie Benzyl, Trityl, Benzhydryl und 4-Nitrobenzyl, Benzyliden, Arylthio, wie Phenylthio, Nitrophenylthio und Trichlorphenylthio; Phosphoryl-Derivate, wie Dimethylphosphoryl und 0,0-Dibenzylphosphoryl; Trialkylsilyl-Derivate, wie Trimethylsilyl; und andere sind in der US-PS 4 322 341 beschrieben und die durch diese Bezugnahme in die vorliegende Offenbarung mit einbezogen werden. Die bevorzugte Aminoschutzgruppe ist Benzyloxycarbonyl. Arbeitsweisen für die Substitution der Gruppe an einer gegebenen Aminogruppe sind gut bekannt. Im allgemeinen umfassen sie das Acylieren der geeigneten Aminoverbindung mit Benzyloxycarbonylchlorid (Benzylchlorformiat) in einem reaktionsinerten Lösungsmittel, z.B. Wasser, Methylenchlorid, Tetrahydrofuran, in Gegenwart einer Base. (Säureakzeptor), z.B. Natrium- oder Kaiiumhydroxid, wenn Wasser das Lösungsmittel ist, und wenn ein organisches Lösungsmittel verwendet wird,

in Gegenwart eines tertiären Amins, wie C. ,-Trialkylamine und Pyridin. Wenn ein wässriges Lösungsmittelsystem verwendet wird, wird der pH der Reaktion bei etwa 8 bis 10 und vorzugsweise bei pH 9 gehalten. Alternativ kann, wenn die Reaktionskomponente, d.h. die Verbindung, deren Aminogruppe zu schützen ist, basische Gruppen enthält, sie als Säureakzeptor dienen.

Die R-CO-Acylgruppe wird in die Glutaminsäure-Reaktionskomponente (Verbindung 9 in der obigen Reaktionsfolge) nach Standard-Acylierungsarbeitsweisen, wie durch Umsetzen der Glutaminsäure mit dem geeigneten Säurechlorid oder -bromid in einem reaktionsinerten Lösungsmittel eingeführt. Begünstigte Bedingungen sind wässrige Systeme, z.B. wässriges Aceton, und ein pH von 9,0, wobei der pH durch Zugabe einer geeigneten Base, wie Natrium- oder Kaliumhydroxid, bei 8,5 bis 9,0 gehalten wird. Nicht-wässrige Lösungsmittel können auch verwendet werden. In solchen Fällen jedoch wird eine organische Base, vorzugsweise ein tertiäres Amin, wie Triethylamin, N-Methylmorpholin oder Pyridin, als Base verwendet.

Die Acylierung kann natürlich mit Hilfe des geeigneten Säureanhydrids (einfach oder gemischt) nach Standardarbeitsweisen erfolgen. Wenn für diese Acylierungsstufe ein Anhydrid verwendet werden soll, sind gemischte Anhydride, insbesondere solche, die sich von einer niedermolekularen Carbonsäure ableiten, und insbesondere die gemischten Carbonsäure-Kohlensäure-Anhydride begünstigt.

Repräsentative Carboxyschutzgruppen sind verschiedene Ester, wie Silylester, einschließlich Trialkylsilylester, Trihalogensilylester und Halogenalkylsilylester; bestimmte Hydrocarbylester, wie C₁ .-Alkyl-, insbesondere t-Butyl-Gruppen; Benzyl- und substituierte Benzylester, Benzhydryl und Trityl; Phenacyl- und Phthalimidomethylester; bestimmte substituierte Hydrocarbylester, wie Chlormethyl-, 2,2,2-Trichlor-

ethyl-, Cyanomethyl-; Tetrahydropyranyl-; Methoxymethyl-; Methylthiomethyl-; geschützte Carbazoyl-, wie -CONH-NHR , worin R eine Aminoschutzgruppe, wie oben offenbart, insbesondere Benzyloxycarbonyl, ist; und weitere, wie in der US-PS 4 322 341 beschrieben und deren Offenbarungsgehalt durch diese Bezugnahme in die vorliegende Anmeldung mit einbezogen wird. Die bevorzugte Carboxyschutzgruppe ist

5 5

-CONH-NHR , worin R Benzyloxycarbonyl ist, wobei die bevorzugte Gruppe als Benzyloxycarbonylcarbazid bezeichnet wird. Eine stark bevorzugte Carboxyschutzgruppe ist die Benzylgruppe.

Die geschützten Amino- und Carboxygruppen werden nach dem Fachmann auf dem Gebiet bekannten Arbeitsweisen in die ungeschützten Amino- und Carboxygruppen übergeführt. Die Benzyloxycarbonylgruppe und die Benzylgruppe, die bevorzugten Schutzgruppen für Amino- und Carboxy- (als Teil der geschützten Carbazoyl-Gruppe) Gruppen werden durch katalytisches Hydrieren über Palladium, insbesondere Palladium-auf-Koh'lenstof f, abgespalten.

Selektiertes Abspalten einer Benzyloxycarbonylcarbazid-Schutzgruppe von meso-Diaminopimelinsäure-dibenzyloxycarbonylcarbazid (Produkt von folgendem Beispiel 3) erfolgt bequem mit Hilfe von Leucin-Aminopeptidase (LAP). Die Reaktion erfolgt in einem wässrigen Lösungsmittel, insbesondere in einem Gemisch aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel (wie einem C._₄-Alkanol, Tetrahydrofuran, Dioxan) bei einem alkalischen pH, wobei der pH-Bereich von 8 bis 10 begünstigt und ein Wert von 8,5 bevorzugt ist.

Aktivieren von Carboxygruppen als Maßnahme zur Beschleunigung einer gegebenen Reaktion ist eine dem Fachmann auf dem Gebiet bekannte Methodik. Besonders brauchbar bei der hier beschriebenen Reaktionsfolge ist die Verwendung von Anhydriden, insbesondere cyclischen Anhydriden, und aktivierten Estern, wie den von N-Hydroxyphthalimid und N-Hydroxysuccin-

imid abgeleiteten, die beide bei Peptidsynthesen eingesetzt werden.

Bei der hier beschriebenen Reaktionsfolge enthalten Zwischenstufenverbindungen der Formeln (2) und (6) ^-substituierte Glycin-Reste und werden bequem in 2,5-Oxazolidindion-Derivate (N-Carboxyanhydride) der Formeln (3) bzw. (7) umgewandelt. Die Anhydride erleichtern die nachfolgenden Reaktionen, denen die Verbindungen der Formeln (3) und (7) unterworfen werden. Sie werden durch Umsetzen der Aminosäurevorstufen der Formeln (2) und (6) mit einem Reagens, wie PCl₅ oder SOCl₂, gebildet.

Die aktivierten N-Hydroxysuccinimidester.. (z.B. Formel (10)) beschleunigen die nachfolgenden Reaktionen an der aktivierten Estergruppe. Wie der erfahrene Fachmann weiß, könnten andere aktivierende Gruppen verwendet werden. Eine Gruppe von besonderem Interesse ist die N-Hydroxyphthalimido-Gruppe, die in der gleichen Weise wie die N-Hydroxysuccinimidogruppe verwendet wird. In beiden Fällen wird ein wasserabspaltendes Kupplungsmittel zur Bildung des aktivierten Esters eingesetzt. Repräsentativ für solche Kuppler sind i-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat, Dicyclohexylcarbodiimid, Ν,Ν'-Carbonyldiimidazol, N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid, Ethoxyacetylen, Diphenylketen und N-Ethyl-5-phenylisoxazoliene-3'-sulfonat. Die Reaktionsbedingungen für den Einsatz solcher Kuppler sind in der Literatur gut beschrieben. Im allgemeinen umfassen sie die Verwendung eines reaktionsinerten Lösungsmittels und die Anwendung von Temperaturen im Bereich von Raumtemperatur bis 100°C. Die oben erwähnten Carbodiimid-Reagentien sind begünstigt, da sie die Anwendung von Raumtemperatur zulassen und zufriedenstellende Ausbeuten an den gewünschten Estern liefern.

Die erfindungsgemäßen Produkte sind als Mittel in Säugern, Menschen eingeschlossen, für klinische und therapeutische Be-

handlung von durch verschiedene pathogene Mikroorganismen, insbesondere gramnegative Bakterien, verursachtenErkrankungen brauchbar. Sie sind auch als Immunostimulantien in Säugern, Menschen eingeschlossen, mit erhöhtem Infektionsrisiko aufgrund bestehender oder klinisch induzierter Immunosuppression brauchbar.

Die Testarbeitsweise, die männliche C₃H/HeN-Mäuse des Charles River-Zuchtlaboratoriums einsetzt, wird nachfolgend wiedergegeben. Die Mäuse wurden 5 Tage vor iher Verwendung akklimatisiert und dann entweder subkutan (se) oder oral (po) mit verschiedenen Verdünnungen (10, 1 und 0,1 mg/kg) der Testverbindung oder Placebo (von fiebererregenden Stoffen freie Salzlösung) unter Verwendung eines Volumens von 0,2ml behandelt. Die Behandlungsvorschrift hing vom verwendeten infektiösen Organismus ab: -24 bis 0 h vor dem Immunitätstest auf Klebsiella pneumoniae, und -6, -5, -4 und -1 Tag vor Immunitätstest auf Escherichia coli oder Pseudomonas aeruginosa. Beim Immunitätstest wurde intramuskulär (im) in die Hüfte im Falle von K. pneumoniae oder intraperitoneal (ip) im Falle von E. coli und P. aeruginosa verabreicht. Für den Immunitätstest wurde ein Volumen von 0,2 ml verwendet. Die Mortalität wurde nach 7 Tagen im Falle von K. pneumoniae und nach 3 Tagen im Falle der anderen beiden Mikroorganismen-Immunitätstests aufgezeichnet.

Kulturherstellung:

K. pneumoniae: Die Kultur wurde zur Reinheit von gefrorenem Blutvorrat auf Hirn-Herz-Infusions(BHI)-Agar gestrichen. 3 Kolonien wurden aus der 18 h-Plattenkultur herausgenommen und in 9 ml BHI-Brühe gebracht. Die Brühenkultur wurde 2 h bei 37 C auf einem Rotationsschüttler gezüchtet, worauf 0,2 ml auf die Oberfläche mehrerer BHI-Agar-Schrägflachen gestrichen wurden. Nach 18stündiger Inkubation bei 37 C wurden die Schrägflächen mit BHI-Brühe gewaschen, die Dichte der Kultur mit einem Spectronic 20 eingestellt und die

geeignete Verdünnung vorgenommen, um in Mäusen einen LD₁ Immunitätstestwert zu erreichen (etwa 250 KBE/Tier; KBE = koloniebildende Einheit).

E. coli oder P. aeruginosa: Die Kultur wurde wegen der Reinheit auf die Oberfläche einer BHI-Agarplatte von gefrorenem Blutvorrat aufgestrichen. Nach der Inkubation über Nacht wurden mehrere Kolonien in 100 ml Difco-Nähr-Agar, in einem 250 ml Erlenmeyerkolben enthalten, gebracht. Nach 18stündiger Inkubation bei 30 C auf einem New Brunswick-Rotationsschüttler erfolgte eine 1:10-Verdünnung in 30 ml frischer Nährbrühe. Die Kultur wurde bei 30°C (Rotationsschüttler, 200 UpM) 3 h inkubiert, die Dichte mit einem Spectronic auf 78 % eingestellt und die geeignete Verdünnung in BHI-Brühe vorgenommen, um durch intraperitoneale Injektion in Mäuse eine LD_g zu erzielen.

Als antibakterielle oder immunostimulierende Mittel in Menschen angewandt werden die erfindungsgemäßen Verbindungen oral, subkutan, intramuskulär, intravenös oder intraperitoneal, im allgemeinen in Mittelform, verabreicht. Solche Mittel oder Zusammensetzungen umfassen einen pharmazeutischen Träger, ausgewählt auf der Grundlage des gewählten Verabreichungsweges und pharmazeutischer Standardpraxis. Beispielsweise können sie in Form von Tabletten, Pillen, Pulvern oder Granulaten verabreicht werden, die solche Exzipientien, wie Stärke, Milchzucker, bestimmte Tontypen usw., enthalten. Sie können in Kapseln, im Gemisch mit den gleichen oder gleichwertigen Exzipientien verabreicht werden. Sie können auch in Form oraler Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Sirupen und Elixieren verabreicht werden, die aromatisierende und färbende Mittel enthalten können. Für orale Verabreichung der erfindungsgemäßen therapeutischen Mittel eignen sich für die meisten Anwendungen Tabletten oder Kapseln mit etwa 50 bis etwa 500 mg.

Der Arzt wird die Dosierung bestimmen, die für einen Einzel-

patienten die geeignetste ist, und sie wird mit dem Alter, dem Gewicht und der Reaktion des besonderen Patienten und dem Verabreichungsweg variieren. Im allgemeinen jedoch mag die Anfangsdosis bei Erwachsenen im Bereich von etwa 2 bis 100 mg/kg pro Tag in einzelnen oder unterteilten Dosen liegen. Die bevorzugte orale Dosierung liegt im Bereich von etwa 10 bis etwa 300 mg/kg/Tag. Die bevorzugte parenterale Dosis ist etwa 1,0 bis etwa 100 mg/kg/Tag; der bevorzugte Bereich etwa 0,1 bis etwa 20 mg/kg/Tag.

Die Erfindung lieferte auch pharmazeutische Zusammensetzungen, einschließlich Einheitsdosierungsformen, wertvoll zur Verwendung der hier beschriebenen Verbindungen für die hier offenbarten Nutzanwendungen. Die Dosierungsform kann in einzelnen oder Mehrfachdosen, wie zuvor bemerkt, gegeben werden, um die für einen besonderen Verwendungszweck wirksame Tagesdosierung zu erreichen.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

Ν,Ν'-Dibenzyloxycarbonyl-meso-diaminopimelinsäure

Zu einer Lösung von 209,4 g (1,1 Mol) meso-Diaminopimelinsäure in 2 200 ml Wasser, mit 2 η Natriumhydroxid auf pH 9,0 basisch gemacht und auf einem Eisbad auf 10 C gekühlt, wurden 450,5 g (2,64 Mol) Benzylchlorformiat über 30 min gegeben. Der pH wurde über die Zugabe hinweg mit 2 η Natriumhydroxid bei 9,0 gehalten. Nach 2,5 h wurde die Lösung dreimal mit 1 1 Ethylacetat extrahiert. Die wässrige Lösung wurde mit iO%iger Salzsäure auf pH 1,5 angesäuert und zweimal mit 1 1 Ethylacetat extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt, und das anfallende Öl wurde aus 920 ml Chloroform bei Raumtemperatur kristallisiert, um 170 g (34 %) des Titelprodukts zu ergeben: Schmp. 129-133°C; IR (KBr) 2700, 1720, 1600 cm"¹;

NMR (Dg-DMSO) £7,1-7,4 (m, 1OH), 5,2 (s, 4H), 4,0-4,2 (m, 2H), 1,2-1,6 (m, 6H); fyj = 0,0 (C = 1,2, MeOH).

Beispiel 2 meso-Diaminopimelinsäure-di-N-carboxyanhydrid

Eine Suspension von 62,0 g (140 mMol) N,N-Dibenzyloxycarbonyl-meso-diaminopimelinsäure in 1 240 ml trockenem Methylenchlorid wurde unter Stickstoffatmosphäre auf 10 C gekühlt und in einer einzigen Portion mit 62,Og (300 mMol) Phosphorpen tachlorid behandelt. Die anfallende gelbe Lösung wurde 1 h bei 10 C gelagert und konnte sich 20 h auf Raumtemperatur erwärmen. Die anfallende Suspension wurde filtriert, das Produkt nacheinander mit trockenem Methylenchlorid gewaschen und unter Hochvakuum getrocknet, um 29,9 g (91 %) des Di-N-carboxyanhydrids zu ergeben: Schmp. 28O°C; IR (KBr) 3250, 1840, 1760 cm"¹; NMR (Dg-DMSO) S4,2-4,4 (m, 2H), 1,2-2,0 (m, 6H) .

Beispiel 3

meso-Diaminopimel in säur e-dibenzyloxy car bony 1 -carba ζ id-diacetat

Eine gerührte Lösung von 1,4 g (8,5 mMol) Benzylcarbazat in 4 ml Eisessig wurde auf 10°C gekühlt, und der anfallende Schlamm wurde mit 1,0g (4,1 mMol) meso-Diaminopimelinsäuredi-N-carboxyanhydrid behandelt. Die Reaktion konnte sich langsam auf Raumtemperatur für 2 h erwärmen und das anfallende Öl wurde mit Ether verrieben, um 2,37 g (95 %) des Titelprodukts zu ergeben: Schmp. 158-161°C; IR (Nuj öl) 2850, 1700 cm"¹; NMR (CD₃OD) £ 7,30 (s, 10H), 5,10 (s, 4H), 3,30 (m, 2H), 1,5-1,8 (m, 6H).

2 3 9

Beispiel 4

meso-Diaminopimelinsäure-{D)-mono-benzyloxycarbonylcarbazid

Eine Lösung von 26,2 g (43 mMol) meso-Diaminopimelinsäuredibenzyloxycarbonylcarbazid-dieacetat in 3 25 ml Methanol und 750 ml Wasser wurde mit 2 η Natriumhydroxid bis pH 8,5 behandelt. Die anfallende Lösung wurde mit 2200 Einheiten Leucinaminopeptidase (Sigma-Schweineniere, Typ III-Suspension, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA) behandelt und 5 Tage bei Raumtemperatur gerührt, wobei der pH mit 2 η Natriumhydroxid bei 8,5 gehalten wurde. Das Methanol wurde unter Vakuum entfernt, und die anfallende wässrige Lösung wurde zweimal mit 200 ml Ethylacetat gewaschen. Das Wässrige wurde auf eine HP-21-Harzsäule gebracht (HP 21 ist ein vernetztes Styrol/ Divinylbenzol-Copolymer in Perlenform mit einer Makronetzstruktur. Es ist erhältlich von V.G.F. Corporation, 420 Lexington Avenue, New York, NY). Die Säule wurde mit 2 1 Wasser gewaschen, und dann wurde das Produkt mit 50 % Methanol in Wasser eluiert. Das Eluat wurde eingeengt, um ein Produkt zu ergeben, das mit Ether verrieben, filtriert und getrocknet wurde, um 14,1 g (95%) des Titelprodukts zu ergeben: Schmp. 2O4-21O°C (Zers.); IR (Nujol) 2200-3600, 1720, 1660, 1580 cm"¹; NMR (CD₃OD) ζ 7,45 (s, 5H), 5,20 (s, 2H), 3,50 (m, 2H), 1,4-2,1 (m, 6H); fc*J^O= -16,8 (C = 1,0, AcOH).

Beispiel 5

N,N'-Dibenzyloxcarbonyl-meso-diaminopimelinsäure-mono-benzyloxycarbonylcarbazid

Eine Suspension von 11,8 g (35 mMol) meso-Diaminopimelinsäure-(D)-mono-benzyloxycarbonylcarbazid in 270 ml trockenem Methylenchlorid wurde mit 56,8 ml (280 mMol) Bis-trimethylsilylacetamid behandelt und unter Stickstoffatmosphäre 18h bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wurde auf

-15°C gekühlt und über 5 min mit 15,0 g (88 mMol) Benzylchlorformiat behandelt. Die Reaktion wurde 1 h bei -15°C gerührt und 18 h auf Raumtemperatur erwärmt. Die Lösung wurde mit verdünnter Salzsäure angesäuert, 1 h gerührt und dann filtriert, um 13,6 g (64%) des Titelprodukts zu ergeben: Schmp. 141-145°C; IR (KBr) 3300, 1740, 1715, 1695, 1660cm"¹; NMR (CD₃OD) £ 7,30 (s, 15H), 5,10 (s, 6H), 4,10 (m, 2H), 1,40-2,00 (m, 6H); [ocf* = +18,2 (C=O, 6, MeOH).

Beispiel 6

Benzyloxycarbonyl-meso-diaminopimelinsäure-mono-benzyloxycarbonylcarbazid

Zu einer reinen Lösung von 130 ml Thionylchlorid wurden 13,0 g (21 mMol) der Titelverbindung von Beispiel 5 gegeben. Die Lösung wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt, eingeengt und unter Hochvakuum 1 h getrocknet. Das anfallende Produkt wurde in 130 ml Essigsäure gelöst, mit 65 ml 1 η Salzsäure behandelt und 18h bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde eingeengt, und der anfallende Brei wurde in 100 ml Wasser gelöst und mit einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung neutralisiert. Die Suspension wurde 1 h gerührt, filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet, um 9,7 g (93%) des Titelprodukts zu ergeben: Schmp. 2O1-2O5°C (Zers.); IR (KBr) 3300, 1715, 1690, 1600 cm""¹; NMR (Dg-DMSO) <Γ 7 ,2-7 , 4 (bs, 10H), 5,25 (s, 2H), 5,20 (s, 2H), 4,40 (m, 2H), 1,6-2,5 (m, 6H); £*cJ^O = +35,1 (C = 0,4, MeOH).

Beispiel 7 N-Heptanoyl-D-glutaminsäure

Eine Lösung von 75,0 g (510 mMol) D-Glutaminsäure in 1 1 wässrigen Acetons (50:50) wurde mit 2 η Natriumhydroxid auf pH 9,0 eingestellt. Die anfallende Lösung wurde auf 10°C gekühlt und über 45 min mit 114,2 g (770 mMol) Heptanoyl-

chlorid behandelt, wobei der pH mit 2 η Natriumhydroxid bei 9,0 gehalten wurde. Die Reaktion konnte sich für 3 h auf Raumtemperatur erwärmen. Das Aceton wurde unter Vakuum entfernt und die anfallende wässrige Lösung wurde mit verdünnter Salzsäure angesäuert und dreimal mit 700 ml-Portionen Ethylacetat extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Das anfallende Öl wurde mit Hexan verrieben, um 109,8 g (83 %) des gewünschten Produkts zu ergeben: Schmp. 92-96 C; IR (Nujol) 3300, 2700-3250, 1720, 1625 cm"¹; NMR (DgDMSO) <6" 4,20 (m, 1H), 2,28 (t, 2H), 2,20 (t, 2H), 1,85-2,05 (m, 1H), 1,65-1,85 (m, 1H), 1,40-1,60 (m, 2H), 1,15-1,30 (m, 6H), 0,75 (t, 3H); foCj_Q = +9,6 (C = 1,0, MeOH).

Beispiel 8 N-Heptanoyl-D-glutaminsäure-o^-benzy!ester

Eine Lösung von 108,8 g (420 mMol) N-Heptanoyl-D-glutaminsäure und 50,6 g (500 mMol) Triethylamin in 135 ml Dimethylformamid wurde mit 85,7 g (500 mMol) Benzylbromid behandelt und 60 h unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Die Reaktion wurde in 1 1 Ethylacetat gegossen und nacheinander mit zwei 500 ml-Portionen jeweils verdünnter Salzsäure und Wasser gewaschen. Das Ethylacetat wurde dann mit 500 ml 1 η Natriumhydroxid gewaschen. Die wässrig-basische Schicht wurde mit verdünnter Säure angesäuert und mit vier 500 ml-Portionen Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Ethylacetat-Extrakte wurden mit überschüssigem Dicyclohexylamin behandelt und 18h gerührt. Die Suspension wurde filtriert, in frischem Ethylacetat (400 ml) 2h aufgeschlämmt, erneut filtriert und unter Vakuum getrocknet, um 49,1 g Dicyclohexylaminsalz zu ergeben. Das anfallende Salz (14,0 g) wurde in verdünnter Salzsäure gerührt, filtriert und mit Ethylacetat gewaschen. Das wässrige Filtrat wurde zweimal mit Ethylacetat extrahiert und die organischen Schichten wurden vereinigt, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Das an-

fallende Öl wurde mit Hexan verrieben, um 7,9 g (86 % vom Salz) des Titelesters zu ergeben: Schmp. 76-79°C; IR (Nujol) 3300, 2700-3100, 1730, 1700, 1645 cm"¹; NMR (CDCl₃ ) <T 7 , 35 (s, 5H), 5,20 (s, 2H), 4,70 (m, 1H), 1,85-2,50 (m, 6H), 1,55 1,70 -(m, 2H), 1,10-1,40 (m, 6H), 0,75 (t, 3H); fc]_Ώ = 27,6 (C = 0,6, MeOH).

Beispiel 9

N-Heptanoyl-D-glutaminsäure-c^-benzyl-^-(N-hydroxysuccinimid)-diester

Eine Lösung von 7,68 g (22 mMol) N-Heptanoyl-D-glutaminsäureoo-benzylester und 6,1 g (51 mMol) N-Hydroxysuccinimid in 220 ml Ethylacetat wurde mit 22,9 g (51 mMol) 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat behandelt. Die Lösung wurde 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt und dann auf 150 ml Wasser gegossen. Die Schichten wurden getrennt und der Ethylacetat-Anteil wurde einmal mit Wasser, einmal mit Salzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Verreiben mit Ether ergab 8,0 g (82 %) des Titel-Diesters: Schmp. 85-89°C; IR (Nujol) 3350, 2800-3000, 1810, 1790, 1745, 1650 cm"¹; NMR (CDCl₃) S 7,30 (s, 5H), 5,20 (s, 2H), 2,8 (bs, 4H), 2,0-2,7 (m, 6H), 1,50-1,70 (m, 2H), 1,10-1,4 (m, 6H), 0,80 (t, 3H).

Beispiel 10

N-Heptanoyl-^-D-glutamyl- (od-benzylester)-benzyloxycarbonyl-(D)-meso-diaminopimelinsäure-(D)-benzyloxycarbonyl-carbazid

Eine Lösung von 4,22 g (9 mMol) der Titelverbindung von Beispiel 6 und 0,9 g (9 mMol) N-Methylmorpholin in 200 ml 20%igem wässrigem Tetrahydrofuran wurde mit 4,0 g (9 mMol) M-Heptanoyl-D-glutaminsäure-eO-benzyl-)'-(N-hydroxysuccinimid) diester (Produkt von Beispiel 9) behandelt. Die Reaktion wurde 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt, eingeengt und mit 60 ml 1 η Salzsäure und 200 ml Ethylacetat behandelt. Die or-

ganischen Schichten wurden vereinigt, einmal mit 1 η HCl, einmal mit Salzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Kristallisieren aus Ethylacetat ergab 4,94 g (69 %) des Titelprodukts. Schmp. 139-141°C; IR (Nujol) 3300-2550, 1680, 1640 cm"¹; NMR (D₆-DMSO) S7,30 (bs, 15H), 5,12 (s, 2H), 5,08 (s, 2H), 5,00 (s, 2H), 4,25 (m, 1H), 4,15 (m, 1.H), 4,00 (m, 1H), 2,25 (t, 2H), 2,10 (t, 2H), 1,20-2,00 (m, 16H), 0,80 (t, 3H); fa] = +22,4 (C = 0,3, MeOH).

Beispiel 11

N-Heptanoyl-y-D-glutamyl- (<*i-benzylester) -benzyloxycarbonyl-(D)-meso-diaminopimelinsäure-(D) -(benzyloxycarbonylcarbazid)-L- (N-hydroxy-succinimid)ester

Eine Lösung von 3,70 g (4,6 mMol) der Titelverbindung von Beispiel 10 und 0,64 g (5,52 mMol) N-Hydroxysuccinimid, 150 ml 50%iges wässriges Dioxan, wurde auf 10°C gekühlt und mit einer Einzelportion von 1,35 g (5,06 mMol) N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid behandelt. Die Lösung wurde 2 h bei 10⁰C, 18 h bei Raumtemperatur gerührt, wieder gekühlt und filtriert. Das Filtrat wurde eingedampft, wieder in Ethylacetat gelöst, filtriert und konzentriert. Der anfallende Feststoff aus dem Filtrat wurde mit Ether verrieben, um 3,50 g (85%) des Titel-Esters zu ergeben: Schmp. 107-110°C; IR (KBr) 3600, 3100, 3000, 2950, 1810, 1740, 1710, 1645 cm"¹; NMR (Dg-DMSO)£ 7,35 (bs, 15H), 5,12 (s, 2H), 5,10 (s, 2H), 5,00 (s, 2H), 4,50 (m, 1H), 4,30 (m, 1H), 4,10 (m, 1H), 3,40 (bs, 4H), 1,20-2,40 (m, 20H), 0,85 (t, 3H).

Beispiel 12

N-Heptanoyl-/-D-glutamyl-(t^-benzylester)-benzyloxycarbonyl-(D)-meso-diaminopimelinsäure-(D)-(benzyloxycarbonylcarbazid) (L) -N^txf-benzyloxycarbonyl) -L-lysin

Eine Suspension von 0,75 g (2,7 mMol) e^-Benzyloxycarbonyl-L-

lysin in 30 ml trockenem Methylenchlorid wurde mit 2,2 g (10,7 mMol) Bis-trimethylsilyl-acetamid behandelt und 18 h bei Raumtemperatur gerührt. Diese Lösung wurde zu'einer gerührten Lösung des Esters von Beispiel 11 in 100 ml Methylenchlorid und 50 ml Tetra-hydrofuran bei 5°C gegeben. Die anfallende Lösung wurde 1 h bei 5°C gerührt und konnte sich langsam auf Raumtemperatur erwärmen. Die Lösung wurde eingeengt, mit 300 ml 0,7 m HCl-Lösung behandelt und dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Ethylacetatschichten wurden nacheinander mit Wasser und Salzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. Der Rückstand wurde in einer Mindestmenge heißen Ethylacetats gelöst, gekühlt und filtriert, um 2,06 g (80%) des Titelprodukts zu ergeben: Schmp. 154-157°C; IR (KBr) 3600-3100, 3000, 2900, 1740, 169O₇ 1640 cm ¹; NMR (Dg-DMSO) «^7,30 (bs, 20H), 5,14 (s, 2H), 5,09 (s, 2H), 5,02 (s, 2H), 4,98 (s, 2H), 4,30 (m, 1H), 4,15 (m, 1H), 3,95 (m, 2H), 3,00 (m, 2H), 2,20 (t, 3H), 2,15 (t, 3H), 1,10-2,10 (m, 22H), 0,85 (t, 3H).

Be'ispiel 13

N-Heptanoyl-/-D-glutamyl-L-meso-diamino-pimelinsäure-N^e-L-Iy s in

Eine Lösung von 1,0 g (0,94 mMol) des geschützten Tr.ipeptid-Produkts von Beispiel 12 und 250 mg 10% Palladium-auf-Kohle-Katalysator in 100 ml 20%iger vässriger Essigsäure wurde bei 3,45 bar (50 psi) Wasserstoffgas 24 h hydriert. Die Lösung wurde entgast, filtriert und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wurde in 80 ml 0,1 η Schwefelsäure gelöst, auf 5°C gekühlt und mit 0,44 g (2,06 mMol) Natriummetaperjodat behandelt. Die braune Lösung wurde 1 h bei 5 C gerührt, tropfenweise mit einer gesättigten Natriumbisulfit-LÖsung behandelt, bis sie klar war, und auf eine HP-21-Harzsäule gebracht. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen, und die gewünschte Verbindung wurde dann mit 50%igem wässrigem Methanol eluiert. Ab-

dampfen des Elutionsmittels ergab 0,46 g (88 %) des Titel-Acyltripeptids: Schmp. 22O°C (Zers.); IR (KBr) 3650-2700, 1710, 1650, 1600 cm"¹; NMR (D₂O) <£" 4,38 (m, 1H) > 4,22 (m, 1H), 4,10 (m, 2H), 3,25 (m, 2H), 2,45 (t, 2H), 2,35 (t, 2H), 1,2-2,25 (m, 22H), 0,85 (t, 3H). /tf/_D = -18,8 (C = 0,5, H₂O).

Beispiel 14

N-Heptanoyl-y-D-glutamyl-(«i-benzylester)-benzyloxycarbonyl-(D)-meso-diaminopimelinsäure-(D)-(benzyloxycarbazid)-(L) N^e-(N^a-acetyl)-L-lysin-methylester

Eine Lösung von 0,895 g (3,75 mMol) N^a-Acetyl-L-lysinmethylester-Hydrochlorid, 2,0 g (2,50 mMol) des geschützten Dipeptidprodukts von Beispiel 10 und 0,38 g (3,75 mMol) N-Methylmorpholin in 200 ml Tetrahydrofuran wurde auf O⁰C gekühlt und mit 0,51 g (3,75 mMol) 1-Hydroxybenzotriazol behandelt. Die anfallende Lösung wurde 10 min gerührt und mit 2,12 g (5,0 mMol) 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat behandelt. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und 72 h gerührt. Die Reaktion wurde dann eingeengt, und der Rückstand in 200 ml Ethylacetat gelöst und die Lösung mit 200 ml 2,5%iger wässriger Salzsäure gewaschen. Die anfallende Suspension wurde ohne Trennung der organischen und wässrigen Phase filtriert, um einen weißen Feststoff zu ergeben, der nach dem Umkristallisieren aus heißem Tetrahydrofuran und Diethylether 1,64 g (66%) des Titelprodukts ergab: Schmp. 174-176°C; IR (KBr) 3600-3100, 3000, 2950, 1740, 1690, 1660, 1640 cm"¹; NMR (Dg-DMSO)S 7,35 (bs, 15H), 5,13 (s, 2H), 5,09 (s, 2H), 5,00 (s, 2H), 4,30 (m, 1H), 4,18 (m, 2H), 4,00 (m, 1H), 3,60 (s, 3H), 3,05 (m, 2H), 2,22 (t, 2H), 2,15 (t, 2H), 1,10-2,10 (m, 22H), 1,85 (s, 3H), 0,85 (t, 3H).

Beispiel 15

-we-

N-Heptanoyl-J'-D-glutamyl-L-meso-diamino-pimelinsäure-N (N^a-acetyl-L-lysinmethylester)

Eine Lösung von 1,0g (1,01 mMol) des geschützten Tripeptid-Produkbs von Beispiel 14 und 250 mg 10 % Palladium-auf-Kohlenstoff in 50 ml 20%iger wässriger Essigsäure wurde 1 h unter 3,45 bar (50 psi) Wasserstoff hydriert. Die Lösung wurde entgast, filtriert und eingeengt. Der Rückstand wurde in 50 ml Wasser und 1 ml Tetrahydrofuran gelöst und der pH mit Schwefelsäure auf 2,0 eingestellt. Die Lösung wurde auf 5 C gekühlt und mit 475 mg (2,22 mMol) Natriummetaperjodat behandelt, 1 h gerührt und dann durch tropfenweise Zugabe einer gesättigten Natriumbisulfitlösung geklärt. Die Lösung wurde auf eine HP-21-Harzsäule gebracht, mit Wasser gewaschen und das Produkt mit 1 1 30%igen wässrigen Ethanols eluiert. Die Lösung wurde eingeengt und der anfallende Feststoff mit Ether verrieben, um 434 mg (70%) des gewünschten Produkts zu ergeben: Schmp. 140°C (Zers.); IR (KBr) 3600-3100, 2950, 2850, 1740, 1640, 1620; NMR (D₂O) <£~4,35 (m, 2H), 4,20 (m, 1H), 3,80 (m, 1H), 3,80 (s, 3H), 3,20 (m, 2H), 2,45 (t, 2H), 2,30 (t, 2H), 1,20-2,25 (m, 22H), 2,05 (s, 3H),-O;8£

(t, 3H); /UJ® ₅ = -22,2 (C = 0,5, H₂O). Beispiel 16

H-Heptanoyl-^-D-glutamyl-(«Γ-benzylester)-benzyloxycarbonyl-(D)-meso-diaminopimelinsäure-(D)-benzyloxycarbonyl)-L-N^e-(N^a-acetyl) -L-lysin

Eine Lösung von 0,50 g (2,67 mMol) N^a-Acetyl-L-lysin und 2,45 g (12,0 mMol) Bis(trimethylsilyl)-acetamid in 50 ml trockenem Methylenchlorid wurde 18h bei Raumtemperatur gerührt. Sie wurde dann über eine Spritze zu einer Lösung des Isobutylmischanhydrids des Produkts von Beispiel 10 bei -15°C gegeben, hergestellt durch Zugabe von 0,2 9 g (2,24mMol)

Isobutylchlorformiat zu einer Lösung von 1,78 g (2,2 mMol) des Produkts des Beispiels 11 und 0,24 g (2,2 mMol) N-Methylmorpholin in 100 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran bei -15 C. Das anfallende Reaktionsgemisch wurde 1 h bei -15°C und 3 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde eingeengt, in 200 ml Ethylacetat gelöst und in 200 ml 2,5%iger wässriger Salzsäure gewaschen. Die Ethylacetatschicht wurde getrennt und eingeengt, um einen weißen Feststoff zu ergeben, der mit Ether verrieben wurde, um 1,37 g (63 %) Produkt zu ergeben; Schmp. 17O-175°C; IR (KBr) 3600-2850, 1740, 1680, 1750, 1600 cm"¹; NMR (Dg-DMSO) ^7,35 (bs, 15H), 5,12 (s, 2H), 5,08 (s, 2H), 5,02 (s, 2H), 4,30 (m, 1H), 4,15 (m, 2H), 4,0 (m, 1H), 3,05 (m, 2H), 2,2 (m, 2H), 2,15 (t, 2H), 1,90 (s, 3H), 1,15-1,85 (m, 22H), 0,85 (t, 3H).

Herstellung 17

N-Heptanoyl-Z-D-glutamyl-L-meso-diaminopimelinsaure-N -(N-acetyl)-L-lysin

Eine Lösung von 1,2 g (1,23 mMol) Produkt von Beispiel 16 in 50 ml 20%iger wässriger Essigsäure wurde mit 330 mg 10% Palladium-auf-Kohlenstoff-Katalysator behandelt und bei 3,45 bar (50 psi) Wasserstoff 1 h hydriert. Die Lösung wurde entgast, filtriert und eingeengt. Das anfallende öl wurde in 50 ml Wasser gelöst, -auf- 5°C gekühlt und mit Schwefelsäure auf pH 1,5-2,0 angesäuert. Die anfallende Lösung wurde dann mit 0,58 g (2,7 mMol) Natriummetaperjodat behandelt, 1 h gerührt, dann mit einer gesättigten Natriumbisulfitlösung behandelt, bis sie klar war. Sie wurde dann auf eine HP-21-Harzsäule gebracht und die Säule mit 250 ml Wasser gewaschen. Eluieren mit 250 ml 50%igem wässrigem Methanol ergab nach Einengen 0,55 g (74%) des gewünschten Produkts: Schmp. 22O°C (Zers.); IR (KBr) 3600-2900, 2850, 1720, 1640, 1540 cm"¹; NMR (D₂O) ^" 4,30 (bm, 3H), 3,80 (t, 1H), 3,25 (m, 2H), 2,45 (t, 2H)₇ 2,35 (t, 2H), 1,2-2,3 (m, 22H), 2,05 (s, 3H), 0,85 (t, 3H); foO _Ώ =-17,6 (C = 0,5, H₂O).

Beispiel 18

N-Heptanoyl- /-D-glutamyl- (cxf-benzylester) -L-meso-diaminopimelinsäure-/"(D)-benzyloxycarbonyl-(D)-benzyloxycarbonylcarbazid./-N -oc-benzyloxycarbony 1-L-ornithin

Eine Suspension von 0,59 σ (2,2 mMol) tf-Benzy loxy carbony 1-L-ornithin in 80 ml trockenem Methylenchlorid wurde mit 1,81 g (8,9 mMol) Bis-(trimethylsilyl)acetamid behandelt und 3 h bei Raumtemperatur gerührt. Die anfallende Lösung wurde zu einer Lösung des Produktesters von Beispiel 11 in 70 ml trockenem Tetrahydrofuran gegeben und 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Die anfallende Lösung wurde eingeengt und das zurückbleibende Öl mit 500 ml 0,7 η wässriger Salzsäure und 350 ml Ethylacetat behandelt. Die Zweiphasen-Lösung wurde 1,5 h gerührt, getrennt und die organische Schicht eingeengt und mit Ethylether verrieben, um 1,95 g (84%) des Titelprodukts zu ergeben: Schmp. 167-171⁰C; IR (KBr) 3 600-3100, 2950, 1740, 1695, 1640; NMR (D,-DMSO) £7,40 (m, 20H), 5,12 (s, 2H), 5,10 (s, 2H), 5,05 (s, 2H), 5,00 (s, 2H), 4,30 (m, 1H), 4,18 (m, 1H), 4,00 (m, 2H), 3,10 (m, 2H), 2,25 (t, 2H), 2,15 (t, 2H), 1,05-2,10 (m, 20H), 0,85 (t, 3H).

Beispiel 19

N-Heptanoyl-oi-D-glutamyl-L-meso-diaminopimelinsäure-N -L-ornithin

Eine Lösung von 1,40 g (1,33 mMol) des Produkts von Beispiel 18 und 400 mg 10% Palladium-auf-Kohlenstoff in 150 ml 20%iger wässriger Essigsäure wurde bei 3,1 bar (45 psi) Wasserstoff 45 min hydriert. Die Lösung, wurde entgast, filtriert und eingeengt, und das anfallende Öl in 50 ml Wasser gelöst und mit konzentrierter Schwefelsäure auf pH 2,0 angesäuert. Die anfallende Lösung wurde bei 5 C gekühlt und in einer Portion mit 0,57 g (2,66 mMol) Natriummetaperjodat behandelt. Die anfallende braune Lösung wurde 1,5 h gerührt,

mit einer gesättigten Natriumbisulfitlösung gerührt, bis sie klar war, dann auf ein HP-21-Harzsäule gebracht. Die Säule wurde mit 750 ml Wasser gewaschen und das gewünschte Produkt mit 400 ml 50%igem wässrigem Methanol eluiert. Die produkthaltigen Fraktionen wurden eingeengt, um 0,52 g (71 %) des gewünschten Produkts zu ergeben: Schmp. 23O°C (Zers.); IR (KBr) 3600-3100, 2950, 1640, 1590; NMR (D-DMSO) 6 4,30 (m, 2H), 3,95 (m, 2H), 3,15 (m, 2H), 2,30 (t, 2H), 2,22 (t, 2H), 1,2-2,20 (m, 20H), 0,95 (t, 3H).

Claims

Z J Erfindungsanspruch

1. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel

0
Il

R^Q-C-NH-CH-COOH

NH₀

I *~* I ²

CO-NH-CH-CO-NH-(CH₂I_x-CH-COOH

(I)

(CH₂)

H₂N-CH-COOH D

worin R Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und χ eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist, gekennzeichnet dadurch, daß eine Verbindung der Formel

R⁰ -C-NH-CH-COOBz

(CH₀). NHZ

I ^{2 2} I

CO-NH-CH-CO-NH-(Ch₉) -CH-COOH

(CH₇),

I ^{2 3}

ZHN-CH-C0NHNHZ D ,

worin Bz Benzyl ist, Z Benzyloxycarbonyl ist und χ eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist, über Palladium-auf-Kohlenstoff katalytisch hydriert wird und gegebenenfalls ein pharmazeutisch akzeptables Salz des Produkts gebildet wird.

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die katalytische Hydrierung in wässriger Essigsäure als Lösungsmittel durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß R° Hexyl und χ 3 oder 4 ist.