DE3523018A1

DE3523018A1 - Verfahren zur herstellung von peptiden

Info

Publication number: DE3523018A1
Application number: DE19853523018
Authority: DE
Inventors: Stefano Pavia Mailand/Milano Cambiaghi; Franco Segrate Mailand/Milano Dallatomasina; Pietro Mailand/Milano Giardino; Enzo Melzo Mailand/Milano Murador
Original assignee: Farmitalia Carlo Erba SpA Mailand/milano; Farmitalia Carlo Erba SRL
Current assignee: Pfizer Italia SRL
Priority date: 1984-06-27
Filing date: 1985-06-27
Publication date: 1986-01-02
Also published as: FR2566800A1; GB8516281D0; IT8421622A0; JPS6121095A; BE902474A; GB2160870B; GB2160870A; US4668625A; IT8421622A1; FR2566800B1; JPH0669389B2; IT1176332B

Description

BESCHREIBUNG

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von L-a-Asparty l-L-phenylalanin-C -i-C. -niedrigalkylester durch enzymatische Hydrolyse eines geeigneten N-Acylderivats.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Herstellung eines gut bekannten Süßstoffs mit dem generic name Aspartam durch enzymatische Hydrolyse eines geeigneten N-Acylderivats.

Aspartam, d.h. L-a-Asparty1-L-phenylalaninmethylester, wird als Süßstoff für Nahrungsmittel und Getränke mit niedrigen Kalorienwerten vielfach verwendet, und seine Verwendung wird in der belgischen Patentschrift 717 373 beschrieben und beansprucht. Viele verbesserte Verfahren zur Herstellung, Extraktion und Reinigung dieser Substanz wurden in der Literatur beschrieben.

Aus der Literatur ist ein Verfahren bekannt, bei dem Enzyme zur Entfernung der N-Aminoschutzgruppen von Aminosäuren verwendet werden (zum Beispiel N-acylsubstituierte Aminosäuren) . Weiterhin ist ein Verfahren zur Herstellung und Abtrennung von L-Aminosäuren, wie L-Methionin und L-Phenylalanin, aus Gemischen der entsprechenden D,L-(N-Acyl)-Derivate unter Verwendung geeigneter Enzyme bekannt, wie L-Aminoacidacylase mikrobiellen Ursprungs oder aus tierischen Organen.

Enzyme sind in der Tat Proteinsubstanzen, die als sehr aktive Katalysatoren bei Bioreaktionen wirken, da sie hochspezi-. fisch sind. Sie sind wesentlich besser als die Katalysatoren oder Reagenzien, die normalerweise bei vielen chemischen Reaktionen verwendet werden.

Die Verwendung von Enzymen bei der selektiven Katalyse der Hydrolyse von N-Schutzgruppen, die an endständige Aminogruppen von Peptiden gebunden sind, welche auf unterschiedliche Arten synthetisiert wurden, ist wenig bekannt. 5

Tatsächlich besitzen Enzyme, wie Pepsin Chymotrypsin und Protease, im allgemeinen entweder peptidische Aktivität, d.h. sie können peptidische Bindungen P-NH-CO-P¹, worin P und P' Aminosäure- oder Peptidreste bedeuten, hydrolysieren, oder sie besitzen amidohydrolasische Aktivität, d.h. sie können die Amidbindung A-CO-NH-P hydrolysieren, worin P einen Aminosäure- oder Peptidrest und A einen Rest einer aromatischen oder aliphatischen Carbonsäure bedeuten.

Beispielsweise ist es bekannt, daß ein aus Ochsenleber extrahiertes Enzym, welches als a-N-Acylpeptidhydrolase definiert wurde, von Gade und Brown (J. Biol. Chem. 253, 14, 5012 - 5018) isoliert wurde. Es ist bekannt, daß es bei Acyltrialanin und anderen Tri- und Dipeptiden mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten aktiv ist. Eine sehr gut bekannte Klasse von Acylasen, die als Penicillinoacylasen definiert ist, wird vielfach industriell zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure (6-APA) durch enzymatische Hydrolyse von Penicillinen, die mit aliphatischen oder aromatisehen Nebengruppen an der Aminogruppe in 6-Stellung unterschiedlich substituiert sind, verwendet. Diese Enzyme werden als Penicillinacylasen, die auf Penicillinen G-V-X-F etc. wirken, entsprechend den unterschiedlichen Eigenschaften der zu hydrolysierenden Substituenten klassifiziert.

Auf dem speziellen Gebiet der Herstellung von Aspartam wird die chemische enzymatische Synthese von N-Acyl-L-a-aspartyl-L-phenylalaninmethylester unter Verwendung von Acyl-L-Aspartylderivaten und L-Phenylalaninmethylester als Ausgangsmaterialien durchgeführt.

Das so erhaltene N-Acyldipeptid wird dann normalerweise chemisch, beispielsweise durch Chlorwasserstoffsäure, hydrolysiert, wobei man das gewünschte Endprodukt, d.h. den L-a-Asparty1-L-phenylalaninester, erhält. 5

Das chemische Hydrolyseverfahren besitzt jedoch verschiedene Nachteile. Es ist nicht spezifisch, und es bilden sich unerwünschte Nebenprodukte, bedingt durch die hydrolytischen Peptidohydrolasereaktionen, wobei Asparaginsäure und Phenylalaninderivate gebildet werden. Es finden weiterhin Veresterungsreaktionen statt, bei denen demethylierte Aspartame gebildet werden, oder es finden Cyclisierungsreaktionen statt, bei denen Diketopiperazine, die unterschiedlich substituiert sind, gebildet werden.

Die Anwesenheit all dieser Nebenprodukte verringert die Ausbeute, und die Extraktionsphasen sind schwierig. Die gewünschte Verbindung kann nicht in der erforderlichen Reinheit erhalten werden, und es sind weitere chemische und biochemische Verfahren zur Gewinnung der wichtigen Nebenprodukte erforderlich, damit das Verfahren wirtschaftlich optimiert werden kann.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein enzymatisches Hydrolyseverfahren von N-Acylaspartam zur Verfügung zu stellen, bei dem Hydrolaseenzyme verwendet werden können. Insbesondere soll das erfindungsgemäße Verfahren unter einfachen Bedingungen, die bei der chemischen Hydrolyse angewendet werden, das gewünschte Endprodukt Aspartam in sehr hohen Ausbeuten ergeben, ohne daß unerwünschte Nebenprodukte gebildet werden.

Hydrolaseenzyme, die für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind, sind beispielsweise saure oder neutrale Proteasen, die unter geeigneten Bedingungen die amidische Bindung von N-Acylpeptid unter Bildung des gewünschten Peptids hydrolysieren.

Besonders bevorzugte Hydrolaseenzyme für das enzymatische Hydrolyseverfahren von N-Acylaspartam sind Deacylierungsenzyme, die man aus Mikrobenstämmen von Escherichia, Nocardia, Proteus, Penicillium oder Genus Streptomyces erhält und die im allgemeinen als Acylasen und insbesondere als Penicillinacylasen klassifiziert werden.

Das hydrolytische Verfahren kann durchgeführt werden, indem man entweder die freien oder immobilisierten Mikrobenzellen verwendet oder indem man die spezifischen Enzyme isoliert, welche in freier oder immobilisierter Form, die in an sich bekannter Weise erhalten wird, verwendet werden können. Die immobilisierten Formen können unter Verwendung von Harzen, Glas, Cellulose oder ähnlichen Substanzen erhalten werden, wobei ionische oder kovalente Bindungen an Fasern, die für das Substrat permeabel sind, erzeugt werden oder wobei eine Pfropfung auf die Fasern stattfindet. Die Verwendung von isolierten und im gewünschten Grad gereinigten Enzymen ist gegenüber der Verwendung des rohen Zellenextrakts bevorzugt, da die Extraktion und Reinigung im allgemeinen die Anwesenheit von verunreinigten Enzymen verringert oder beseitigt, wodurch eine Verringerung der Ausbeute bei dem enzymatischen Verfahren unter Bildung unerwünschter Nebenprodukte bewirkt wird.

Erfindungsgemäß erfolgt daher die Deacylierung bzw. Entacylierung bzw. Acylgruppenabspaltung der N-substituierten Peptide bevorzugt durch Behandlung dieser Verbindung in einem wäßrigen Medium mit einer enzymatischen Präparation, welche Acylaseaktivität aufweist.

Bevorzugt wird gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren ein N-substituiertes Derivat von L-a-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester mit einem isolierten und gereinigten Enzym, welches Acylaseaktivität aufweist, entacyliert.

Wie oben bereits erwähnt, sind die bevorzugten erfindungsgemäßen Hydrolaseenzyme solche in löslicher Form oder immobilisierter Form, wobei ein inertes Substrat verwendet wird, oder in mittels eines Vernetzungsverfahrens insolubilisierter Form. Diese Enzyme werden als Acylaseenzyme klassifiziert und sind bis jetzt hauptsächlich als Penicillinacylaseenzyme bekannt.

Einige Beispiele für diese Enzyme sind Acylaseenzymen, die von Pilzen stammen und durch Fermentation verschiedener Spezies von Actinomycetes, filamentartigen Fungi und Hefen, wie beispielsweise

Alternatia Mucor
Aspergillus Penicillium Botrytis Phoma

Cephalosporium Streptomyces Cryptococcus Trichoderma Emericellopsis Trichophyton Epicoccum Trichosporon Epidermophyton Actinoplanes Fasarium Nocardia

erhalten werden oder die aus Bakterien stammen und durch Fermentation verschiedener Bakterienspezies, wie Aerobacter Flavobacterium Alcaligenes Micrococcus Bordetella Proteus
Cellulomonas Pseudomonas Corynebacterium Salmonella Erwinia Sarcina

Escherichia Xanthomonas B. megaterium B. subtilis Achromobacter

erhalten werden. Man kann auch enzymatische Präparationen verwenden, die man durch Extraktion tierischer Organe erhält, wie Acylasen aus Schweinenieren, und die die Hydrolyse von amidischen Bindungen zwischen der Carbonylgruppe ei-

ner organischen Säure und der Amingruppe von L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester ergeben.

Aspartam, d.h. L-a-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester, wurde bisher durch chemische Kondensation von L-Phenylalaninmethylester mit einer aktiven Form von N-substituierter L-Asparaginsäure mit einem organischen Säurerest, wie Ameisensäure, Essigsäure oder anderen (FR-PS 2 040 473 bzw. ÜS-PS 3 786 039), hergestellt. Es ist weiterhin bekannt, eine enzymatische Synthese zwischen L-Phenylalaninmethylester und einem N-substituierten L-Asparaginsäurederivat (BE-PS 882 603 bzw. US-PS 4 284 721), wie Benzyloxycarbonyl, Butyloxycarbonyl etc., in einem nichtwäßrigen Medium mit einem Enzym, welches als Metallproteinase bezeichnet wird, durchzuführen.

Das Zwischenprodukt, das entweder bei dem chemischen Verfahren oder bei der enzymatischen Synthese erhalten wird, ist N-substituierter L-a-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester und kann aus dem Reaktionsgemisch entweder durch Konzentration bis zur Kristallisation oder durch Extraktion oder durch andere Verfahren isoliert werden. Die Verbindung wird dann zur Entfernung der N-Schutzgruppe hydrolysiert, wobei man L-a-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester mit Süßungseigenschäften, die 200mal höher sind als die von Saccharose, erhält.

Die bekannten Verfahren, die zur Entfernung der N-Schutzgruppen angewendet wurden, bestehen hauptsächlich in einer chemischen sauren oder basischen Hydrolyse. Beispielsweise wird die N-Schutzgruppenabspaltung entweder in Anwesenheit einer starken Säure (US-PS 4 071 511) oder in Anwesenheit von Basen, wie Hydroxylamin oder Acety!hydrazin (US-PS 4 021 418 und GB-PS 2 098 220 bzw. US-PS 4 434 097), durchgeführt.

Wie zuvor angegeben, besitzen diese chemischen Acylgruppenabspaltungsverfahren vom industriellen Standpunkt aus viele

Nachteile, wie beispielsweise niedrige Ausbeuten, teure Reagenzien, und das erhaltene Produkt muß mehrfach gereinigt werden, damit die verschiedenen Nebenprodukte, die durch die Veresterung der freien Carbonsäuregruppe oder Hydrolyse der Ester oder der Peptidbindung entstanden sind, abgetrennt werden.

Die Nachteile der chemischen Hydrolyse von N-Schutzgruppen von Dipeptidalkylestern, wie L-a-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester, werden durch das erfindungsgemäße enzymatische Hydrolyseverfahren beseitigt.

Die bevorzugten Enzyme mit Entacylierungswirkung werden mittels Mikroorganismen, wie Penicillium, Stre ptomyces, Aspergillus, Escherichia coli, Nocardia, Proteus, erhalten. Sie werden nach besonderen Verfahren gereinigt, damit unerwünschte enzymatische Aktivitäten, beispielsweise die Esteraseaktivität, entfernt werden. Diese würde auf das zu hydrolysierende Produkt einwirken, d.h. auf den N-substituierten L-a-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester, wobei man entmethyliertes Aspartam erhalten würde.

Die obigen Enzyme werden nach geeigneten Verfahren an Harzen oder anderen geeigneten Substraten immobilisiert, damit das Verfahren wirtschaftlich wird. Es können die gleichen immobilisierten Enzyme somit für verschiedene Herstellungscyclen verwendet werden. Die gleichen Ergebnisse, wie sie oben beschrieben wurden, können erhalten werden, wenn die Enzyme in nichtimmobilisierter Form eingesetzt werden.

Die so hergestellten und ausgewählten Enzyme werden zu der wäßrigen Lösung oder zu einer bei unterschiedlichem pH-Wert mäßig gepufferten Lösung entsprechend dem verwendeten Enzym zugegeben. Es wird ein pH-Wert im Bereich von 2 bis 9, bevorzugt 5 bis 7, verwendet. Man arbeitet in Anwesenheit eines Aspartam-N-acylderivats bei einer Konzentration von 0,2

bis 260 g/l. Das Derivat besitzt die folgende Formel (I):

COOR¹

R-CO-NH-CH-CO-NH-Ch-CH₂-C₆H₅ (I) CH₂-COOH

worin R ein Wasserstoffatom oder eine freie oder substituierte Alkyl-, Alkenyl- oder Phenylalkylgruppe mit 1 bis 11 Kohlenstoffatomen bedeutet. Die Gruppe wird ausgewählt aus

~^CH3» -(^CH2*n^CH3' ^{worin n eine} Zahl von 1 bis 10 bedeutet, -C₆H₅, -CH₂-C₆H₅, -CH₂-CgH₄-OH, -CH₂-CgH₄-NO₂, -CgH₃(OCH₃)₂, -CH₂CgH₃(OH)₂, -CH₂-CH=CH-CH₂-CH₃, -CH₂-S-CH₂-CH=CH₂, -CH₂O-R¹ worin R¹ ausgewählt wird aus -CgH₅, -CH₃, ~(^CH2^m~^CH3' ^wor~ in m für 1 bis 5 steht, -CgH₄-CH₃, -CgH₄-OH; und R eine C--C₄~Niedrigalkylgruppe bedeutet.

Die Reaktion wird bei einer Temperatur von 10 bis 6O⁰C, bevorzugt 15 bis 40⁰C, während 1 bis 48 Stunden durchgeführt. Man arbeitet diskontinuierlich oder kontinuierlich, beispielsweise in einer Säule, entsprechend der Menge des Enzyms, welches in dem Reaktionsgemisch vorhanden ist, und entsprechend dem Verhältnis der Menge des Enzyms in Lösung oder in immobilisierter Form zur Menge an N-substituiertem Dipeptid, welches in dem Reaktionsgemisch vorhanden ist.

Die Ausbeuten der durchgeführten Reaktionen erreichen unter optimalen Bedingungen Werte, die über 80% liegen. Dadurch werden komplizierte und teure Reinigungsverfahren für die Gewinnung der nichtumgesetzten Verbindungen oder der unerwünschten Nebenprodukte, welche normalerweise vorhanden sind, wenn die Hydrolysereaktion der Aspartam-N-schutzgruppe mit einem chemischen Verfahren durchgeführt wird, unnötig. Das so erhaltene Aspartam wird dann nach an sich bekannten Verfahren extrahiert.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

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Die N-Acylderivate, deren Herstellung nicht besonders erläutert wird, werden in hohen Ausbeuten erhalten, indem man die in den Herstellungsverfahren A, B, C und D beschriebenen Methoden anwendet und geeignete acylierte Derivate als Ausgangsmaterialien verwendet.

Herstellungsverfahren A N-Phenylacetyl-L-a^ß-aspartyl-L-phenylalaninmethy!ester

66,6 g L-Asparaginsäure werden in 100 ml H-O suspendiert. 10% NaOH (200 ml) werden zugegeben, und das Gemisch wird auf 15 bis 17°C gekühlt. Eine Lösung aus 10% NaOH (100 ml) und Phenylacetylchlorid (70 ml) wird eine Stunde lang gleichzeitig zugetropft. Das Gemisch wird 3 Stunden bei 20⁰C gehalten, und dann wird 37%iger Chlorwasserstoff bis zu einem pH-Wert von 2 zugegeben.

Nach dem Abkühlen auf 0 bis 5⁰C und Filtration wird das Reaktionsgemisch getrocknet, wobei man N-Phenylacetylasparaginsäure (120 g), 99,77% Titer, erhält. 78 g N-Phenylacetylasparaginsäure werden in 80 ml Essigsäureanhydrid suspendiert. Das Gemisch wird 2 Stunden lang auf 8O⁰C erhitzt. g N-Phenylacetylasparaginsäureanhydrid werden nach dem Abkühlen und der Ausfällung mit einem Lösungsmittel erhalten. 52 g N-Phenylacetylasparaginsäureanhydrid werden in 52 ml Eisessigsäure suspendiert, und 100 ml Dichlorethan werden auf 10⁰C abgekühlt. Dazu werden 200 ml Dichlorethan, welches 40,2 g Phenylalaninmethylester enthält, zugegeben.

Man erhält 85 g der Titelverbindung nach der Extraktion mit Base, Einstellung auf einen sauren pH-Wert und Filtration.

Herstellungsverfahren B

N-Phenoxy-L-g-aspartyl-L-phenylalaninmethy!ester 35

Man verfährt wie beim Herstellungsverfahren A, verwendet

ORIGINAL INSPECTED

jedoch 77,2 g Phenoxyacetylchlorid anstelle von Phenylacetylchlorid als Ausgangsmaterial. Man erhält 110g der Titelverbindung.

Herstellungsverfahren C

N-p-Hydroxyphenylacetyl-L-g^ß-aspartyl-L-phenylalaninmethylester

Man arbeitet wie beim Herstellungsverfahren A, verwendet jedoch 60,4 g p-Hydroxyphenylacetylchlorid als Ausgangsmaterial. Man erhält 70,7 g der Titelverbindung.

Herstellungsverfahren D N-Propionyl-L-gyß-aspartyl-L-phenylalaninmethy!ester

Man arbeitet wie beim Herstellungsverfahren A, verwendet jedoch 41,8 g Propionylchlorid anstelle von Phenylacetylchlorid als Ausgangsmaterial. Man erhält 33,8 g der Titelverbindung.

Die Acylaseenzymverbindungen werden durch Fermentation mit den oben erwähnten Mikroorganismen in spezifischen Kulturbrühen hergestellt.

Herstellungsverfahren E

Acylaseenzym aus E. CoIi, ATCC 11105

Der Mikroorganismus wird in einer Kulturbrühe fermentiert, welche Hefeextrakt, Natriumglutamat, Phenylessigsäure, Ammoniumsalze enthält. Die Brühe ist so gepuffert, daß ein Anfangs-pH-Wert von 6,8 bis 6,9 gewährleistet ist.

Das optimale Wachstum wird in 10 bis 12 Stunden mit Zellen mit einem Trockengewicht von 300 bis 400 mg/100 ml Brühe erhalten.

ORiGiNAL INSPECTED

Nach der Fermentation werden die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt, gewaschen und einer Lysebehandlung mit n-Butylacetat unterworfen. Die Lysatverbindung wird ausgeflockt, geklärt und ultrafiltriert. Das bei der selektiven ültrafiltration erhaltene Konzentrat wird mit (NKN)₂SO₄ versetzt. Die ausgesalzene Verbindung besteht aus einer stabilen Acylase mit einer Aktivität von 600 bis 900 U/ml.

Beispieli

2 g N-Phenylacetyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester (erhalten gemäß Herstellung A) werden in 100 ml Wasser gelöst, wobei progressiv 10%ige NaOH zugegeben wird und das Gemisch bei 37°C und einem pH-Wert unter 7,5 geschüttelt wird. Nach Beendigung der Lösung, wird 1N NaOH oder 1N HCl zugegeben, um den pH-Wert auf 6,5 bis 6 einzustellen. Zu dem Gemisch werden 0,5 g der Enzymverbindung mit einer Acylaseaktivität von 50 U/g zugegeben, welche durch Immobilisierung der Verbindung der Herstellung E auf einem festen Substrat durch selektive Adsorption und Vernetzung mit Glutaraldehyd in Anwesenheit von Albumin erhalten wurde.

Das Reaktionsgemisch kann 23 Stunden lang bei einer Temperatur von 37⁰C unter Schütteln reagieren. Der pH-Wert wird bei 6-0,5 durch Zugabe von 1N NaOH gehalten. Gegen Ende der Reaktion wird das immobilisierte Enzym durch ein Glasfilter im Vakuum abfiltriert und mit 100 ml Wasser gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen werden vereinigt, und die Lösung wird durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HDFC) analysiert. Die Ausbeute bei der Hydrolyse von Phenylacetyl-L-a-aspartyl-L-phenylalaninmethylester beträgt 90% der Theorie, und nur 5% nichtumgesetzte Verbindung und 5% Nebenprodukte sind vorhanden.
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Das erhaltene Aspartam wird dann nach einem geeigneten Verfahren extrahiert und kristallisiert, wobei man wäßrige Lösungen mit niedrigem Salzgehalt verwendet. Die freie Phenylessigsäure wird durch Extraktion mit Lösungsmitteln oder durch Adsorption an Harzen abgetrennt und für weitere Herstellungsverfahren verwendet.

Beispiel 2

2 g N-Phenoxyacetyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester, erhalten gemäß Herstellung B, werden in 100 ml Wasser gelöst und unter Zugabe von 10%iger NaOH auf 35⁰C erhitzt. Der pH-Wert wird bei einem Wert nicht über 7,5 gehalten. Nach der Solubilisierung wird der pH-Wert auf 6,0 eingestellt, und 0,5 g Novozym-Acylase 217 mit 60 ü/g werden zugegeben. Das Enzym ist an einem geeigneten unlöslichen Substrat immobilisiert.

Das Gemisch kann 24' Stunden bei 35°C reagieren, wobei man schüttelt. Der pH-Wert wird durch Zugabe von 1N NaOH bei 6-0,5 gehalten. Das immobilisierte Enzym wird durch ein Glasfilter abfiltriert und wiedergewonnen. Es wird mit 10 ml Wasser gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen werden vereinigt, und die Lösung wird chromatographiert (HDFC). Man erhält eine Ausbeute von 93% der Theorie.

Beispiel 3

Die Reaktion wird wie in Beispiel 1 durchgeführt, ausgenommen, daß das Enzym an einem Ionenaustauscherharz adsorbiert wird und durch Vernetzung in Anwesenheit von Glutaraldehyd und eines Diamins entsprechend den bekannten Verfahren (Haynes, R.; Biochem. Biophys. Res. Commun. 2>6_, 235 (1969)) immobilisiert wird. Die Verbindung mit 16 U/g wird in einer Menge von 2 g pro 100 ml 2%ige Lösung von N-Phenylacetyl-L-

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aspartyl-L-phenylalaninmethylester verwendet. Die Reaktionsausbeute beträgt 80% nach 22 Stunden Reaktion.

Beispiel 4a

Die Reaktion wird wie in Beispiel 1 durchgeführt, ausgenommen, daß das Enzym durch Pfropfen an Celluloseacetatfasern nach bekannten Verfahren (Dinelli, D., Process Biochem 718, 9, (1972)) insolubilisiert wird. Die Verbindung besitzt 10.000 U/g, und 1 g Fasern wird verwendet, wobei man eine 90%ige Umwandlung unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen erhält.

Beispiel 4b

Die Reaktion wird wie in Beispiel 1 durchgeführt, ausgenommen, daß das Enzym an porösen Glasteilchen mit einem primären Amin und Aktivierung mit Glutaraldehyd insolubilisiert wird. Es wird eine kovalente Bindung des Enzyms mit dem Carbonylzwischenprodukt erzeugt. Die Verbindung besitzt 25 U/g, und 2 g des immobilisierten Enzyms werden verwendet. Man erhält eine 75%ige Umwandlung unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen.

Beispiel 5

Die Reaktion wird wie in Beispiel 1 durchgeführt, ausgenommen, daß die Enzympräparation E in löslicher Form verwendet wurde. 100 ml einer 2%igen Lösung von N-Phenylacetyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester werden mit 160 U Enzym, das aus Kulturbrühen von E. coli extrahiert wurde, versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 8 Stunden'lang bei 37⁰C und einem pH-Wert von 6 bis 6,5 gehalten. Unter diesen Bedingungen wurde eine Ausbeute an gewünschtem Produkt von 87% der Theorie erhalten.

Beispiel

3 g N-p-Hydroxyphenylacetyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester (erhalten gemäß Herstellung C) werden in 100 ml Wasser gelöst. Der pH-Wert wird auf 6 eingestellt, und die Lösung wird auf 40⁰C erhitzt. Dann wird 1 g Acylase (Penicillinacylase) aus E. coli, adsorbiert an einem Ionenaustauscherharz, mit einer Aktivität von 40 U/g zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird unter Schütteln 20 Stunden lang bei 40⁰C und einem pH-Wert von 5,5 bis 6,5 gehalten. Das immobilisierte Enzym wird dann abfiltriert, das Reaktionsgemisch wird chromatographisch (HDFC) analysiert. Bei der enzymatischen Hydrolyse werden 82% der Theorie an Aspartam gebildet.

Beispiel 7

Man arbeitet wie in Beispiel 6, ausgenommen, daß das Enzym, welches durch Extraktion der Kulturbrühe von Nocardia erhalten wurde, verwendet wird. Es wird in löslicher Form verwendet. Bei Durchführung der Reaktion bei den angegebenen Bedingungen wird N-p-Hydroxyphenylacetyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester in einer Ausbeute von 50% der Theorie . in Aspartam überführt.

Beispiel 8

Man arbeitet wie in Beispiel 1, ausgenommen, daß immobilisiertes Enzym, welches durch Extraktion aus einer Kulturbrühe von Proteus erhalten wurde, verwendet wurde. Das Enzym besitzt eine Aktivität von 25 U/g. Es wird in einer Menge von 1 g/100 ml Reaktionsgemisch verwendet. Unter diesen Bedingungen erhält man 48% der Theorie an Aspartam. 35

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Beispiel 9

3 g N-Propionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester, erhalten gemäß Herstellung D, werden in 100 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird auf 37⁰C erhitzt, und der pH-Wert wird auf 6,5 eingestellt. Zu dem Reaktionsgemisch werden 300 ü/g der enzymatischen Verbindung, erhalten durch Extraktion und Reinigung nach an sich bekannten Verfahren, der Kulturbrühe von E. coli. Das Reaktionsgemisch wird 24 Stunden lang bei der angegebenen Temperatur geschüttelt. Der pH-Wert wird bei 6,5 - 0,5 gehalte
über 40% der Theorie.

bei 6,5 - 0,5 gehalten. Die Endausbeute an Aspartam liegt

Beispiel 10

Man arbeitet wie in Beispiel 9, verwendet jedoch nicht N-Propionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester, sondern eine enzymatische Verbindung mit Acylaseaktivität, die bei einem pH-Wert von 6-1 auf einer Lösung, welche 0,5 g/l N-Undecylcarbonyl-L-aspartam enthielt, umgesetzt wurde. Die Hydrolyseausbeute beträgt 30% der Theorie.

Beispiel 11

2 g N-Formyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester werden in 100 ml Wasser, welches auf 37⁰C erhitzt wird, gelöst. Nach Beendigung der Lösung wird der pH-Wert mit 10%iger NaOH auf 6,5 bis 7 eingestellt. 250 U einer enzymatischen Verbindung mit einer Acylaseaktivität, die aus Pseudomonaskultur erhalten wurde, werden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 36 Stunden lang bei 37⁰C stehengelassen. Der pH-Wert wird dann auf 4 bis 4,5 eingestellt, und die Verbindung wird durch Konzentrieren abgetrennt. Die Ausbeute an L-a-Aspartyl· L-phenylalaninmethy!ester beträgt 20% der Theorie.

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Beispiel 12

Man arbeitet wie in Beispiel 2, ausgenommen, daß ein Enzym mit 18.000 U/g, das aus einer Kulturbrühe von Aspergillus extrahiert wurde, bei einer Konzentration von 2% von N-Phenoxymethyl-L-aspartam verwendet wurde. Die Hydrolyseausbeute beträgt 20% der Theorie.

Beispiel 13

Man arbeitet wie in Beispiel 1, ausgenommen, daß das Enzym nicht isoliert wurde, sondern daß die Zellen "in toto" immobilisiert wurden. 1 g feuchte Zellen, die man aus einer E.-coli-Kultur erhielt, wurde in 5 ml Phosphatpuffer 50 mM, pH 7,5, suspendiert. Die Lösung wird zu 0,5%igem Rinderserumalbumin und 1%igem Glutaraldehyd gegeben. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur werden die erhaltenen Pellets abfiltriert und mit Pufferphosphat 50 mM gewaschen. Die verwendete Verbindung besitzt eine Aktivität von 14 U/g, und sie wird in einer Menge von 2 g pro 100 ml einer 2%igen Lösung aus N-Phenylacety1-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester verwendet. Die Umwandlungsausbeute beträgt nach 8stündiger Inkubation bei 37°C 65% der Theorie.

Beispiel 14

Man arbeitet wie in Beispiel 2, ausgenommen, daß die Myceliummasse, die aus einer Streptomyceskultur erhalten wurde, nicht isoliert, sondern immobilisiert wurde. Das Vernetzungsverfahren ist analog zu dem in Beispiel 13 beschriebenen. Die vernetzte Myceliummysse wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und lyophilisiert. Die lyophilisierte Verbindung wird grob zerrieben und für die selektive Hydrolyse von N-Phenoxyacetyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester

verwendet. 2 g der Verbindung mit einer Aktivität von 12 ü/g werden pro 100 ml 2%iger Lösung des zu hydrolysierenden Produkts verwendet. Die Umwandlungsausbeute beträgt nach 8stündiger Inkubation bei 37⁰C 60% der Theorie. 5

Beispiel 15

1 g N-Propoxyacetyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester wird zu 100 ml auf 37°C erhitztes Wasser gegeben. Das Produkt wird aufgelöst, indem der pH-Wert mit 10%iger NaOH auf 6 eingestellt wird. Zu dem Reaktionsgemisch gibt man 250 U einer Enzymverbindung mit Acylaseaktivität, die aus Cephalosporiumkultur erhalten wurde. Das Gemisch wird 20 Stunden bei 37⁰C stehengelassen. Gegen Ende der enzymatischen Reaktion beträgt die Ausbeute 45% der Theorie.

Beispiel 16

1 g N-Tolyloxyacetyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester wird in 100 ml H2O gelöst und nacheinander mit 10%iger NaOH bis zu einem pH-Wert von 6 bis 7 versetzt. Zu dem Gemisch gibt man 250 U einer enzymatischen Verbindung mit Acylaseaktivität, welche aus Actinplanes-utahensins-Kulturen isoliert wurde. Die Reaktion wird bei 37⁰C 24 Stunden lang durchgeführt. Die Hydrolyseausbeute des N-ToIyloxymethylderivats beträgt 40% der Theorie.

Claims

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DR. WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER · DR.-ING. DIPL.-ING. ANNEKÄTE WEISERT · DIPL.-PHYS. JOHANNES SPIES

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FARMITALIA CARLO ERBA S.p.Ä. Mailand, Italien

Verfahren zur Herstellung von Peptiden

PATENTANSPRÜCHE

1 . Verfahren zur Herstellung von L-a-Aspartyl-L-phenylalanin-C.-C.-niedrigalkylester, dadurch gekennzeichnet , daß ein N-Acylderivat der Formel I:

COOR¹

R-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CH^-CcH,- (I) , 2 6 5

CH₂-COOH

worin R eine freie oder substituierte Alkyl-, Alkenyl- oder Phenylalkylgruppe mit 1 bis 11 Kohlenstoffatomen bedeutet und R eine Cj-C.-Niedrigalkylgruppe bedeutet, enzymatisch hydrolysiert wird und der L-a-Aspartyl-L-phenylalaninniedrigester extrahiert und isoliert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Niedrigalkylester von L-a-Aspartyl-L-phenylalanin der Methylester der Formel:

COOCH₃

H-N-CH-CO-NH-CH-CH₀-C₄-Hc CH₂-COOH

ist.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß R ein Wasserstoffatom, -CH₃, -(CH₂)_nCH₃, worin η für eine Zahl von 1 bis 10 steht, -C₆H₅, -CH₂-C₆H₅, -CH₂-C₆H₄-OH, -CH₂-CgH₄-NO₂, -CgH₃(OCH₃)₂, -CH₂-C₆H₃(OH)₂, -CH₂-CH=CH-CH₂-CH₃, -CH₂-S-CH₂-CH=CH₂, -CH₂O-R¹, worin R¹ "CgH₅, "(^CH2⁾ _m"^CH3' worin m für 1 bis steht, bedeutet, -C₅H₄-CH₃, -CgH₄-OH bedeutet.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß die enzymatische Hydrolyse mit Hydrolaseenzymen durchgeführt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch g e k e η η -

zeichnet, daß die Hydrolaseenzyme aus Mikroorganismen erhalten werden.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet ,■ daß die Mikroorganismen aus der Gruppe Actinomyceten, Fungi und Bakterien ausgewählt werden.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß die verwendeten Actinomyceten Nocardia, Actinoplanes und Genus Streptomyces sind.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß die Fungi Alternatia, Aspergillus, Botrytis, Cephalosporium, Cryptococcus, Emericellopsis, Epicoccum, Epidermophyton, Fusarium, Mucor, Penicillium, Phoma, Trictoderma, Trichophyton, Genus Trichosporon sind.
9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Bakterien Aerobacter, Alcaligenes, Bordetella, Cellulosmonas, Corynebacterium, Erwinia, Escherichia Achromobacter, Flavobacterium, Micrococcus, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Sarcinia, Xanthomonas, Genus B. subtilis sind.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß die enzymatisch^ Hydrolyse entweder in Anwesenheit von Mikrobenzellen, die das gewünschte Enzym produzieren, oder durch getrennte Herstellung des Enzyms und seine Verwendung auf der Verbindung der Formel (I) durchgeführt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das getrennt hergestellte Enzym isoliert und gereinigt wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikrobenzellen oder die getrennt hergestellten Enzyme entweder auf einer inerten Substanz immobilisiert oder durch ein Vernetzungsverfahren insolubilisiert werden.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß die enzymatische Hydrolyse des N-Acylderivats der Formel (I) im allgemeinen in wäßriger Lösung bei einer Konzentration von 0,2 bis 260 g/l, die auf einen pH-Wert von 2 bis 9, vorzugsweise 5 bis 7, gepuffert ist, und bei einer Temperatur von 10 bis 60⁰C, bevorzugt von 15 bis 40⁰C, durchgeführt wird.