JPH0669389B2 - Ｌ‐α‐アスパルチル‐Ｌ‐フエニルアラニン低級アルキルエステルの製造方法 - Google Patents

Ｌ‐α‐アスパルチル‐Ｌ‐フエニルアラニン低級アルキルエステルの製造方法

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JPH0669389B2
JPH0669389B2 JP60138078A JP13807885A JPH0669389B2 JP H0669389 B2 JPH0669389 B2 JP H0669389B2 JP 60138078 A JP60138078 A JP 60138078A JP 13807885 A JP13807885 A JP 13807885A JP H0669389 B2 JPH0669389 B2 JP H0669389B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ペプチドの製造方法に関し、更に詳細には、
適当なN-アシル誘導体を酵素により加水分解してL-α‐
アスパルチル‐L-フェニルアラニンのC1〜C4低級アルキ
ルエステルを製造する方法に関するものである。
更にまた、本発明は適当なN-アシル誘導体を酵素により
加水分解して、慣用的にアスパルテームと称されるよく
知られた甘味剤を製造する方法に関するものである。
アスパルテーム、すなわちL-α‐アスパルチル‐L-フェ
ニルアラニンは、低カロリーの、食品および飲料に対す
る甘味剤として広く用いられ、その用途は、ベルギー国
特許第717,373号に開示され、特許請求されている。そ
してこの物質についての製造、抽出および精製方法につ
いては、多数の改良法が開示され、特許請求されてい
る。
文献によれば、微生物源または動物器官に由来する適当
な酵素、例えばL-アミノ酸アシラーゼを用いることによ
りその対応するD,L-（N-アシル）誘導体の混合物からL-
アミノ酸、例えばL-メチオニン、L-フェニルアラニン等
を製造したり、分離したりするためにアミノ酸（例え
ば、N-アシル置換アミノ酸）のN-アミノ保護基を除去す
るのに酵素を用いるという方法が知られている。
事実、酵素は、その極めて高度の特異性を考慮した場
合、通常大多数の化学反応に用いられる触媒または試薬
に比較して、はるかに優れた、生体反応における高活性
な触媒として作用する蛋白質である。
しかしながら、種々の方法で合成されたペプチドの末端
アミノ基に結合したN-保護基の加水分解を選択的に触媒
するために酵素が用いられることはあまり知られていな
い。
事実、ペプシン、キモトリプシンおよびプロテアーゼ等
の酵素は、通常、ペプチダーゼ活性、すなわちP-NH-CO-
P′（式中、ＰおよびＰ′はアミノ酸またはペプチド残
基を表わす。）のペプチド結合を加水分解し得るという
活性を示すか、アミド加水分解活性、すなわちA-CO-NH-
P（式中、Ｐはアミノ酸またはペプチド残基を表わし、
Ａは芳香族または脂肪族のカルボン酸残基を表わす。）
のアミド結合を加水分解し得る活性を示す。
例えば、牛の肝臓から抽出され、α‐N-アシルペプチド
ヒドロラーゼと定義された酵素がゲイド（Gade）および
ブラウンによって単離されたことが公知とされており
［ジェイ・バイオル・ケム（J.Biol.Chem.）253,14,501
2-5018］、この酵素はアシルトリアラニンとその他のト
リ‐およびジ‐ペプチドに対して異なる速度で活性を示
すことが公知とされている。ペニシリンアシラーゼと定
義され、よく知られたアシラーゼ類は、6-位のアミノ基
に種々の脂肪族または芳香族側鎖を有するペニシリン類
の酵素による加水分解により6-アミノペニシラン酸（6-
APA）を製造するために工業的に広く用いられている。
これらの酵素は、加水分解さるべき置換基の種々の性質
に従ってペニシリン類G-V-X-F等に作用するペニシリン
アシラーゼとして分類されている。
アスパルテーム製造の特定の領域においては、アシル‐
L-アスパルチル誘導体とL-フェニルアラニンメチルエス
テルとを出発物質として、N-アシル‐L-α‐アスパルチ
ル‐L-フェニルアラニンのメチルエステルの化学的、酵
素的な合成が行なわれている。
このようにして得られたN-アシルジペプチドは、通常次
いで、化学的な加水分解、例えば塩酸による加水分解に
より最終的な所望の化合物、すなわちL-α‐アスパルチ
ル‐L-フェニルアラニンのメチルエステルを与える。
しかしながら、化学的な加水分解法においてはとりわけ
アスパラギン酸とフェニルアラニン誘導体とを形成する
ペプチド加水分解反応、脱メチル化したアスパルテーム
を形成するエステル化反応または最終的に置換基の異な
るジケトピペラジンを形成する環化反応が生じ、その非
特異性および望ましくない化合物を形成する等種々の欠
陥がある。
これら副生成物が全て存在するとその生成収率を低下さ
せるのみならず、所望の化合物を所望の純度で抽出層に
取り出すことが難しくなるので、反応の重要な副生成物
を回収し、経済的な観点からその方法を最適化するため
に、更に化学的および生化学的な方法を必要とすること
となる。
本発明の目的は、ヒドロラーゼ酵素を用いることを特徴
とするN-アシル‐アスパルテームの酵素による加水分解
方法を提供することである。特に、ここで開示しかつ特
許請求した方法は、化学的な加水分解に用いられる条件
よりも著しく簡単な条件下で、最終生成物アスパルテー
ムを極めて高収率で生成させ、かつ、望ましくない副生
成物の量を著しく低収率で生成させることができるもの
である。
本方法に適したヒドロラーゼ酵素は、例えば酸性または
塩基性のプロテアーゼであり、適当な条件下で所望のペ
プチドを形成しながらN-アシルペプチドのアミド結合を
加水分解する。
特に、N-アシル‐アスパルテームの酵素による加水分解
方法のための好ましいヒドロラーゼ酵素は、エシエリチ
ア（Escherichia）、ノカルディア（Nocardia）、プロ
テウス（Proteus）、ペニシリウム（Penicillium）また
はストレプトマイセス属の微生物菌株（microbic strai
n）から得られる脱アシル化酵素であり、通常はアシラ
ーゼとして分類され、更に具体的にはペニシリン‐アシ
ラーゼとして分類される。
加水分解プロセスは、遊離または固定化された微生物細
胞を直接用いて行なうこともできるし、特定の酵素を単
離し、これを遊離の形で用いるか、あるいは酵素を公知
の技術に従って、樹脂、ガラス、セルロースまたはこれ
らと同様な物質にイオン結合、共有結合または基質浸透
性の繊維にグラフトさせて用いることにより行なうこと
ができる。抽出または精製プロセスにより、通常は、望
ましくない副生成物を形成しかつ酵素反応の収率を低下
させる夾雑酵素の存在を低減させたり、除去したりする
ことができるので、粗製の細胞抽出物よりも、単離され
かつ所望する程度に精製された酵素を用いるのが好まし
い。したがって本発明によればN-置換ペプチドの脱アシ
ル化は、水媒体中この化合物をアシラーゼ活性を示す酵
素で処理して行なうのが好ましい。
本方法によれば、L-α‐アスパルチル‐L-フェニルアラ
ニンメチルエステルのN-置換誘導体を、単離し、精製し
かつアシラーゼ活性を示す酵素で脱アシル化するのが更
に好ましい。
上述したように、本発明に従って用いられるヒドロラー
ゼ酵素は、可溶形でも、適当な不活性基材に固定化され
ていても、交差結合方法により不溶化されていてもよ
く、これらはアシラーゼとして分類され、今日まで大部
分がペニシリンアシラーゼとして知られている。
これらの酵素の例としては、種々のアクチノマイセテス
（actinomycetes）、糸状菌および酵母の発酵によって
生じる菌類由来のアシラーゼがあり、これらの菌類には
例えば下記のものがある。
アルタナリア（Alternaria） ムコール（Mucor） アスペルギルス（Aspergillus） ペニシリウム（Penicillium） ボトリチス（Botrytis） フォーマ（Phoma） セファロスポリウム（Cephalosporium） クリプトコッカス（Cryprococcus） ストレプトマイセス（Streptmyces） エメリセロプシス（Emericellopsis） トリコデルマ（Trichoderma） エピコッカム（Epicoccum） トリコフィトン（Trichophyton） トリコスポロン（Tricosporon） エピデルモフィトン（Epedermophyton） アクチノプラネス（Actinoplanes） フザリウム（Fusarium） ノカルディア（Nocardia） また下記のような種々のバクテリア種の発酵によって生
成するバクテリア由来のアシラーゼがある。
エアロバクター（Aerobacter） フラボバクテリウム（Flavobacterium） アルカリゲネス（Alcaligenes） ミクロコッカス（Micrococcus） ボルデテラ（Bordetella） プロテウス（Proteus） セルロモナス（Cellulomonas） シュードモナス（Pseudomonas） コリネバクテリウム（Crynebacterium） サルモネラ（Salmonella） エルウイニィア（Erwinia） サルシナ（Sarcina） エシエリチア（Escherichia） キサントモナス（Xanthomonas） バチルス・メガテリウム（B.megaterium） バチルス・ズブチリス（B.subtilis） アクロモバクター（Achrombacter） 動物器官の抽出により得られる酵素、例えば豚の腎臓の
アシラーゼも、有機酸のカルボニル基とL-アスパルチル
‐L-フェニルアラニンメチルエステルのアミノ基との間
のアミド結合を加水分解することができる。
アスパルテーム、すなわちL-α‐アスパルチル‐L-フェ
ニルアラニンのメチルエステルは、有機酸残基、例え
ば、蟻酸、酢酸等でN-置換されたL-アスパラギン酸の活
性形と、L-フェニルアラニンメチルエステルとを化学的
に縮合させることにより、従来製造されていた（フラン
ス国特許第2,040,473号）。またL-フェニルアラニンメ
チルエステルとN-置換L-アスパラギン酸誘導体（ベルギ
ー国特許第882,603号）、例えばベンジルオキシカルボ
ニル、ブチルオキシカルボニル等との間の酵素的な合成
を非水媒体中メタルプロテイナーゼと称する酵素で行な
うことも知られている。
化学的な方法または酵素的な合成によって得られる中間
体、すなわちN-置換L-α‐アスパルチル‐L-フェニルア
ラニンメチルエステルは、濃縮結晶化、抽出またはその
他の操作により反応混合物から単離することができる。
次いでこの化合物を加水分解してN-保護基をはずすと、
サッカロースよりも200倍以上甘い性質を示すL-α‐ア
スパルチル‐L-フェニルアラニンメチルエステルを得る
ことができる。
N-保護基をはずすために用いられる公知の方法において
は、主として酸性または塩基性の加水分解が行なわれ
る。例えば、N-保護基の脱離は、強酸の存在（米国特許
第4,071,511号）または塩基、例えばヒドロキシルアミ
ンあるいはアセチルヒドラジンの存在（米国特許第4,01
21,418号および英国特許第2,098,220号）によって行な
うことができる。
前述したように、これらの化学的な脱アシル化方法に
は、工業的な観点から数多くの欠陥がある。例えば、収
率が低く、高価な試薬を必要とし、更には遊離のカルボ
キシ基のエステル化またはエステルあるいはペプチド結
合の加水分解によって生じる種々の副生成物を除去する
ために、得られる生成物を繰り返し精製しなければなら
ない。
ジペプチドアルキルエステル、例えばL-α‐アスパルチ
ル‐L-フェニルアラニンのN-保護基を化学的に加水分解
する際のこうした欠陥および限界は、本発明の方法に従
う酵素的な加水分解により克服される。
脱アシル化作用を示す好ましい酵素は、ペニシリウム、
ストレプトマイセス、アスペルギルス、エシエリチア・
コリ、ノカルディア、プロテウス等の微生物によって生
成せしめ、望ましくない酵素活性、例えば加水分解され
る生成物すなわちN-置換L-α‐アスパルチル‐L-フェニ
ルアラニンメチルエステルに作用するエステル化活性を
排除し、脱メチルしたアスパルテームを得るために特殊
な方法で精製するのが好ましい。
上記酵素は、同一の固定化酵素を繰り返し用いることに
より本方法を経済的にするために、適当な方法で樹脂そ
の他の適当な物質に固定化するのがよい。
酵素を固定化しない形で用いても明らかに上述と同じ結
果を得ることができる。
このようにして製造し、選択された酵素を、用いる酵素
に応じて水溶液もしくは種々のpH、すなわち２〜９、好
ましくは５〜７の範囲に緩衝化された水溶液に、下記の
式Ｉ ｛式中、Ｒは、水素または、炭素原子数１〜11の非置換
もしくは置換された、アルキル、アルケニルあるいはフ
ェニルアルキル基を表わし、好ましくは水素原子、−CH
3、−（CH2）nCH3（式中、ｎは１〜10の数）、−C6H5、
−CH2−C6H5、−CH2−C6H4−OH、−CH2−C6H4−NO2、−
C6H3（OCH3）２、−CH2−C6H3（OH）２、−CH2−CH＝CH
−CH2−CH2−CH2−Ｓ−CH2−CH＝CH2または−CH2−Ｏ−
Ｒ′［式中、Ｒ′は、−C6H5、−CH3、−（CH2）m-−CH
3（式中、ｍは１〜５の数）、−C6H4−CH3または−C6H4
−OHを示す。］を表わし、R1はC1〜C4の低級アルキルを
表わす。｝ で示された0.2〜260g／ｌの濃度のアスパルテームN-ア
シル誘導体の存在下添加する。
反応は、反応混合物中に存在する酸素の量および溶液中
または固定化された形の酵素の量と反応混合物中に存在
するN-置換ジペプチドの量との間の比に応じてバッチ式
またはカラム式で操作し、10〜60℃の温度、好ましくは
15〜40℃の温度で１〜48時間行なう。
反応を最適条件下で行なうと反応の収率は80％以上の高
い値となり、アスパルテームN-保護基の加水分解を化学
的に行なう際に通常必要とされる、未反応の化合物また
は望ましくない副生成物を回収するための複雑かつ高価
なプロセスを必要としなくなる。
このようにして得られるアスパルテームは公知の技術操
作に従って抽出することができる。
以下本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明
はこれらに限定されるものではない。
なお製造例を特に示さなかったN-アシル誘導体も、出発
物質として適当なアシル化誘導体を用い、製造例A,B,C
およびＤに記載したように操作することにより高収率が
得られる。
製造例Ａ N-フェニルアセチル‐L-αβ‐アスパルチル‐L-フェニ
ルアラニンメチルエステル L-アスパラギン酸66.6gを水100mlに懸濁させた。10％の
NaOH 200mlを加え、混合物を15〜17℃に冷却した。こ
れに10％のNaOH（100ml）とフェニルアセチルクロリド
（70ml）との溶液を同時に１時間かけて滴下した。
反応混合物を20℃に３時間保持し、次いで、37％の塩化
水素をpH2になるまで加えた。
０〜５℃に冷却し濾過した後、反応混合物を乾燥させる
と、力価99.77％のN-フェニルアセチルアスパラギン酸1
20gが得られた。
N-フェニルアセチルアスパラギン酸78gを無水酢酸80ml
に懸濁させた。反応混合物を80℃に２時間加熱した。冷
却し溶媒を用いて不溶化すると、N-フェニルアセチルア
スパラギン酸無水物70gが得られた。氷酢酸52mlとジク
ロルエタン100mlとに懸濁させ、10℃に冷却したN-フェ
ニルアセチルアスパラギン酸52gに、フェニルアラニン
メチルエステル40.2gを含有するジクロルエタン200mlを
加えた。
塩基で抽出後、pHを酸性値に調整し、濾過したところ標
記化合物85gが得られた。
製造例Ｂ N-フェノキシ‐L-α‐アスパルチル‐L-フェニルアラニ
ンのメチルエステル フェニルアセチルクロリドの代りにフェノキシ‐アセチ
ルクロリド77.2gを出発物質とする以外は製造例Ａに記
載したのと同様の操作をすることにより、標記化合物11
0gが得られた。
製造例Ｃ N-p-ヒドロキシフェニルアセチル‐L-αβ‐アスパルチ
ル‐L-フェニルアラニンのメチルエステル p-ヒドロキシフェニルアセチルクロリド60.4gを出発物
質とする以外は製造例Ａに記載したのと同様に操作する
ことにより、標記化合物70.7gが得られた。
製造例Ｄ N-プロピオニル‐L-αβ‐アスパルチル‐L-フェニルア
ラニンのメチルエステル フェニルアセチルクロリドの代りにプロピオニルクロリ
ド41.8gを出発物質とし、製造例Ａに記載したのと同様
に操作することにより標記化合物33.8gが得られた。
アシラーゼ酵素は、特定の培養液中上述の微生物で発酵
させることにより製造した。
製造例Ｅ E.Coli ATCC 11105からのアシラーゼ酵素 酵母抽出物、グルタミン酸ナトリウム、フェニル酢酸お
よびアンモニウム塩からなり初期のpHが6.8〜6.9となる
ように緩衝させた培養液で微生物に発酵させた。
10〜12時間で微生物は最も増殖し、セルラーゼの乾燥重
量は、培養液100ml当たり300〜400mgであった。
発酵が終了したら、遠心分離により細胞を分離し、洗浄
し、酢酸n-ブチルで分解処理した。
分解処理物を凝集させ、清澄化し限外濾過した。
選択的な限外濾過により得られる濃縮物を（NH4）2SO4
で塩析した。
塩析物、600〜900U／mlの活性を示す安定なアシラーゼ
からなっていた。
実施例１ N-フェニルアセチル‐L-アスパルチル‐L-フェニルアラ
ニンのメチルエステル（製造例Ａで得られた。）2gを水
100mlに溶解し、次第に10％NaOHを加え、この混合物を3
7℃ pH7.5以下で振盪し続けた。溶解後、1N NaOHまた
は1N HClを加えてpH値を6.5〜６に安定化させ、この混
合物に、アルブミンの存在下で選択的吸着およびグルタ
ルアルデヒドを用いた交差結合により製造例Ｅのアシラ
ーゼを固体の基材に固定化して得られた、50U／ｇのア
シラーゼ活性を示す酵素化合物0.5gを添加した。
反応混合物を37℃に加熱し、振盪しながら23時間反応さ
せ、その間1N NaOHを加えることによりpHを６±0.5に
保持した。反応を終えたら、グラスフィルターを通して
固定化された酵素を減圧濾過により分離し、水100mlで
洗浄した。
瀘液と洗浄液とを合わせ、この溶液を高速液体クロマト
グラフィー（HPLC）により分析したところ、理論値の90
％のフェニルアセチル‐L-α‐アスパルチル‐L-フェニ
ルアラニンのメチルエステルが加水分解され、未反応の
上記化合物はわずかに５％であり望ましくない生成物は
５％であった。
次いで低塩含有水溶液からの適当な製造方法に従って、
得られたアスパルテームを抽出し、結晶化させた。そし
て遊離のフェニル酢酸を溶媒抽出または樹脂への吸着に
より回収し、再び製造に使用した。
実施例２ 製造例Ｂにおいて得られたN-フェノキシアセチル‐L-ア
スパルチル‐L-フェニルアラニンのメチルエステル2gを
35℃に加熱した水100mlに溶解させ、10％のNaOHを加え
てpHを7.5以下に保持した。溶解後、pHを6.0に調整し、
60U／ｇのノボチムアシラーゼ217（Novozym acylasis
217）0.5gを適当な不溶性の基材に固定化して加えた。
混合物を振盪しながら35℃で24時間反応させ、その間1N
NaOHを加えることによりpHを６±0.5に保持した。グ
ラスフィルターで濾過することにより固定化させた酵素
を回収し、水10mlで洗浄した。
瀘液と洗浄液とを合わせ、この溶液をHPLCでクロマト分
離したところ、理論値の93％の収率で得られた。
実施例３ 酵素を公知の方法［ハイネス・アール；バイオケム・バ
イオフィズ・リス・コミュニ（Hynes R.;Biochem.Bioph
ys.Res.Commun）36,235（1969）］に従ってイオン交換
樹脂に吸着させ、グルタルアルデヒドとジアミンとの存
在下、交差結合により不溶化した以外は、実施例１にお
いて記載したのと同様に反応を行なった。
16U／ｇの化合物をN-フェニルアセチル‐L-アスパルチ
ル‐L-フェニルアラニンのメチルエステルの２％溶液10
0ml当り2g量用いた。22時間反応させたところ反応収率
は80％であった。
実施例４ 酵素を公知の方法［デイネリ・ディー・プロセス バイ
オケム（Dinelli D.,Process Biochem）718,9,1972］に
従って、酢酸セルロース繊維にグラフトさせることによ
り不溶化させる以外は実施例１において記載したと同様
に反応を行なった。得られた化合物は10,000U／ｇであ
り、繊維1gを用いると実施例１に述べた条件で90％の転
化が起こった。
実施例４−２ その第１級アミノ基をグルタルアルデヒドにより活性化
させたり、カルボニル中間体に共有結合させることによ
り、酵素を多孔質ガラス粒子に不溶化させた以外は実施
例１において記載したと同様に反応を行なった。得られ
た化合物は25U／ｇであり、固定化された酵素2gを用い
ると、実施例１で述べた条件で75％の添加が起こった。
実施例５ 製造例Ｅの酵素を可溶形で用いた以外は実施例１におい
て記載したのと同様に反応を行なった。N-フェニルアセ
チル‐L-アスパルチル‐L-フェニルアラニンの２％溶液
100mlにE.Coli培養液から抽出された酵素160Uを加え
た。反応混合物を37℃、pH6〜6.5で８時間保持すると、
かかる条件で理論値の87％の収率で所望の生成物が得ら
れた。
実施例６ N-p-ヒドロキシフェニルアセチル‐L-アスパルチル‐L-
フェニルアラニンのメチルエステル（製造例Ｃにおいて
得られた。）3gを水100mlに溶解させ、pHを６に調整し
た。この溶液を40℃に加熱し、次いでE.Coriに由来し、
イオン交換樹脂に吸着させ、40U／ｇの活性を示すアシ
ラーゼ（ペニシリンアシラーゼ）1gを加えた。
反応混合物を振盪させながら、40℃、pH5.5〜6.5に20時
間保持した。次いで、固定化された酵素を濾過により分
離し、反応混合物をHPLCで分析したところ酵素による加
水分解で生成するアスパルテームの量が理論量の82％で
あった。
実施例７ 用いる酵素がノカルデイアの培養液の抽出物であり、可
溶形である以外は実施例６に記載したと同様にして行な
った。
上述した条件で反応を行なったところ、N-p-ヒドロキシ
フェニルアセチル‐L-アスパルチル‐L-フェニルアラニ
ンのメチルエステルが理論値の80％の収率でアスパルテ
ームに転化した。
実施例８ 用いられる固定化された酵素がプロテウスの培養液から
抽出によって得られ、25U／ｇの活性を示し、反応混合
物の1g／100ml量用いられる以外は実施例１において記
載したと同様にして反応を行なった。このような条件の
下、得られるアスパルテームの収率は理論値の48％であ
った。
実施例９ 製造例Ｄに従って得られるN-プロピオニル‐L-アスパル
チル‐L-フェニルアラニンのメチルエステル3gを水100m
lに溶解し、この溶液を37℃に加熱し、pHを6.5に調整し
た。
反応混合物に、E.coliの培養液を公知の方法に従って抽
出し、精製して得られた酵素300U／ｇを加えた。
反応混合物を上記表示温度で24時間振盪しながら保持す
るとともにpHを6.5±0.5に保持した。アスパルテームの
最終収率は理論値の40％以上であった。
実施例10 N-プロピオニル‐L-アスパルチル‐L-フェニルアラニン
のメチルエステルを、N-ウンデシルカルボニル‐L-アス
パルテームの0.5g／ｌを含有する溶液にpH6±１で反応
するアシラーゼ活性を示す酵素で置き換えた以外は実施
例９において記載したと同様に操作した。加水分解収率
は理論値の30％であった。
実施例11 N-ホルミル‐L-アスパルチル‐L-フェニルアラニンのメ
チルエステル2gを37℃に加熱した水100mlに溶解させ
た。溶解が完了したら、10％NaOHでpHを6.5〜７に調整
し、シュードモナス培養により得られるアシラーゼ活性
を示す酵素250Uを加えた。反応混合物を37℃で36時間放
置した。次いでpHを４〜4.5に調整し、濃縮により化合
物を分離した。L-α‐アスパルチル‐L-フェニルアラニ
ンのメチルエステルの収率は理論値の20％であった。
実施例12 アスペルギルスの培養液から抽出され18,000U／ｇを示
す酵素をN-フェノキシメチル‐L-アスパルテームの濃度
の２％の濃度で用いた以外は実施例２において記載した
と同様に操作した。加水分解収率は理論値の20％であっ
た。
実施例13 酵素を単離せず、細胞全体を固定化した以外は実施例１
において記載したと同様に行なった。E.coli培養により
得られる湿潤細胞1gをpH7.5、50mMのリン酸緩衝液5mlに
懸濁させた。
この溶液に仔牛アルブミン0.5％およびグルタルアルデ
ヒド１％を加えた。室温で２時間放置した後、得られた
ペレットを濾過により分離し、50mMのリン酸緩衝液で洗
浄した。用いた酵素は、14U／ｇの活性を示し、N-フェ
ニルアセチル‐L-アスパルチル‐L-フェニルアラニンの
メチルエステルの２％溶液100ml当たり2g量用いた。
37℃で８時間インキュベーションした後の転化率は理論
値の65％であった。
実施例14 酵素を単離せず、ストレプトマイセス培養により得られ
る菌糸塊を固定化した以外は実施例２において記載した
のと同様に行なった。結合方法は、実施例13に記載した
のと同様であった。交差結合した菌糸塊を濾過により分
離し、水洗し、凍結乾燥した。凍結乾燥した化合物を粗
く磨り潰して、N-フェノキシアセチル‐L-アスパルチル
‐L-フェニルアラニンのメチルエステルの選択的な加水
分解のために用いた。12U／ｇの活性を示すこの酸素2g
を加水分解さるべき生成物の２％溶液100mlにに対して
用いた。
37℃で８時間インキュベーションした後の転化率は理論
値の60％であった。
実施例15 N-プロポキシアセチル‐L-アスパルチル‐L-フェニルア
ラニンのメチルエステル1gを37℃に加熱した水100mlに
加えた。10％NaOHでpHを調整しながら生成物を溶解させ
た。この反応混合物に、セファロスポリウム培養により
得られるアシラーゼ活性を示す酵素250Uを加えた。得ら
れた混合物を37℃で20時間放置した。酵素反応の終了時
に収率は理論値の45％であった。
実施例16 N-トリルオキシアセチル‐L-アスパルチル‐L-フェニル
アラニンのメチルエステル1gを水100mlに溶解し、次い
でpH6〜７となるまで10％のNaOHを加えた。この混合物
にアクチノプラネス・ウタヘンシス（Actinoplanes Uta
hensis）培養に由来するアシラーゼ活性を示す酵素250U
を加えた。この反応は、37℃で24時間行なった。N-トリ
ルオキシメチル誘導体の加水分解収率は理論値の40％で
あった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:37） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:745） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:045） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:66） (72)発明者 ピエトロ・ギアルデイノ イタリア国、ミラノ 20100、ヴイア・フ オウシエ 25 (72)発明者 エンゾ・ムラドール イタリア国、メルゾ（エム・アイ）20066、 ヴイア・カタニア ８ (72)発明者 ガスパレ・スプレアフイコ イタリア国、ピオルテロ（エム・アイ) 20096、ヴイア・シマブエ １／Ａ

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】Ｌ−α−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラ
    ニンのC1〜C4低級アルキルエステルの製造方法であっ
    て、 式Ｉ 〔式中、Ｒは、水素あるいは、炭素原子数１〜11の非置
    換もしくは置換された、アルキル、アルケニルまたはフ
    ェニルアルキル基を表わし、R1はC1〜C4の低級アルキル
    基を表わす。〕で示されるＮ−アシル誘導体をヒドロラ
    ーゼにより加水分解し、Ｌ−α−アスパルチル−Ｌ−フ
    ェニルアラニンの低級エステルを抽出し、単離すること
    を特徴とする方法。
  2. 【請求項２】Ｌ−α−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラ
    ニンの低級アルキルエステルが、式 で示されるメチルエステルである特許請求の範囲第１項
    記載の方法。
  3. 【請求項３】Ｒが水素原子、−CH3、−（CH2）nCH3（式
    中、ｎは１〜10の数）、−C6H5、−CH2−C6H5、−CH2−
    C6H4−OH、−CH2−C6H4−NO2、−C6H3（OCH3）２、−CH
    2−C6H3（OH）２、−CH2−CH＝CH−CH2−CH2−CH2−Ｓ
    −CH2−CH＝CH2、−CH2−Ｏ−Ｒ′〔式中、Ｒ′は、−C
    6H5、−CH3、−（CH2）ｍ−CH3（式中、ｍは１〜５の
    数）、−C6H4−CH3または−C6H4−OHを示す。〕からな
    る群から選択される特許請求の範囲第１項または第２項
    に記載の方法。
  4. 【請求項４】微生物から生成されるヒドロラーゼを用い
    る特許請求の範囲第１〜３項のいずれか１項記載の方
    法。
  5. 【請求項５】微生物が、アクチノマイセテス、菌類およ
    びバクテリアからなる群から選択される特許請求の範囲
    第４項記載の方法。
  6. 【請求項６】上記アクチノマイセテスが、ノカルディ
    ア、アクチノプラネスもしくはストレプトマイセス属で
    ある特許請求の範囲第５項記載の方法。
  7. 【請求項７】上記菌類が、アルタナリア、アスペルギル
    ス、ボトリチス、セファロスポリウム、クリプトコッカ
    ス、エメリセロプシス、エピコッカム、エピデルモフィ
    トン、フザリウム、ムコール、ペニシリウム、フォー
    マ、トリコデルマ、トリコフィトンもしくはトリコスポ
    ロン属である特許請求の範囲第５項記載の方法。
  8. 【請求項８】上記バクテリアが、エアロバクター、アル
    カリゲネス、ボルデテラ、セルロモナス、コリネバクテ
    リウム、エルウイニア、エシエリチア、アクロモバクタ
    ー、フラボバクテリウム、ミクロコッカス、プロテウ
    ス、シュードモナス、サルモネラ、サルシナ、キサント
    モナス属もしくはバチルス・ズブチリスである特許請求
    の範囲第５項記載の方法。
  9. 【請求項９】所望のヒドロラーゼを生成する微生物細胞
    の存在下、または別にヒドロラーゼを製造し、次いでヒ
    ドロラーゼを式Ｉの化合物に作用させることにより加水
    分解させる特許請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１
    項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】上記別に製造したヒドロラーゼを単離
    し、精製したものを用いる特許請求の範囲第９項記載の
    方法。
  11. 【請求項１１】上記微生物細胞または上記別に製造した
    ヒドロラーゼを不活性基材に固定化するか、または交差
    結合法により不溶化したものを用いる特許請求の範囲第
    ９項または第10項に記載の方法。
  12. 【請求項１２】pH2〜９に緩衝化され、上記式Ｉで示さ
    れるＮ−アシル誘導体を0.2〜260g／の濃度で含有す
    る水溶液を、10〜60℃の温度で酵素的に加水分解する特
    許請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載の方
    法。
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