CH629534A5

CH629534A5 - Verfahren zur herstellung von penicillinen und cephalosporinen.

Info

Publication number: CH629534A5
Application number: CH608076A
Authority: CH
Inventors: Eiji Kondo; Takashi Mitsugi
Original assignee: Shionogi & Co
Priority date: 1975-05-14
Filing date: 1976-05-14
Publication date: 1982-04-30
Also published as: CA1049431A; FR2310757B1; JPS51133488A; NL7605138A; FR2310757A1; DE2621618A1; GB1544844A; US4073687A

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren 20 zur Herstellung von Penicillin- oder Cephalosporin-Antibiotika der Formeln I, II oder III

oder

O

II

25 RCNH

(III)

(I)

COOM

30

COOM

O

Ii worin die Gruppierung der Formel RC- eine von einer a-Ami-nosäure, einem N-Ammoniumsalz einer a-Aminosäure oder von einer N-(Ci-Cio)-Acyl-a-aminosäure sich ableitende Acyl-gruppe und M Wasserstoff oder ein salzbildendes Metall oder ein Amin ist, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Aminoverbindung, gewählt aus einer Gruppe bestehend aus 6-Amino-penicillansäure, 7-Aminocephalosporansäure, 7-Aminodeaceto-xycephalosporansäure und ihrer Salze mit einem Ester der Formel

O

,lc

CH2OCCH3

(II)

COOM

40

oder O

à

RCNH-

RCOR1

O m worin die Gruppierung der Formel RC- die obige Bedeutung hat und R1 eine Ci-Cio-Alkylgruppe ist, mit Hilfe eines Myzels oder eines Myzelpräparates eines zur Gattung Aphanocladium oder Cephalosporium gehörenden Mikroorganismus enzyma-tisch acyliert.

2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäure Glycin, Phenylglycin, Cyclohexadie-nylglycin, Cyclohexylglycin, Thienylglycin, Furylglycin, Hydro-xyphenylglvcin, Chlorphenylglycin, Cyanophenylglycin, Alanin, Phenylalanin, Methionin, Serin, Tryptophan, Valin, Leucin, Threonin, Asparagin, Lysin oder a-Aminobuttersäure oder deren N-Benzoyl- oder N-Carbobenzoxy-Derivate ist.

3. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die a-Aminosäure D-a-Phenylglycin, D-a-(l,4-Cyclohe-xadienyl)-glycin, D-a-(p-Hydroxyphenyl)-glycin, D-a-(2-Thie-nyl)-glycin oder D-a-(3-Thienyl)-glycin ist.

4. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Ester ein Ci-Cs-Alkylester eines Mineralsäure-Additionssalzes genannter a-Aminosäure ist.

5. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Aphanocladium aranearum

(III)

COOM

50

O

II

worin RC- eine von einer a-Aminosäure, einem N-Ammonium-55 salz von a-Aminosäure oder von N-(Ci-Cio)-Acyl-a-Amino-säure abgeleitete Acylgruppe und M-Wasserstoff oder ein salzbildendes Metall oder Amin ist; dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man eine Aminoverbindung gewählt aus der Gruppe bestehend aus 6-Aminopenicillansäure, 7-Aminoce-60 phalosporansäure, 7-Aminodeacetoxycephalosporansäure oder ihrer Salze mit einem Ester der Formel

O

RCOOR1

65 worin RC- die obige Bedeutung hat und R' eine Ci-Cio-Alkyl-gruppe darstellt, mit Hilfe eines Myzels oder eines Myzelpräparates aus einem zum Genus Aphanocladium oder Cephalosporium gehörenden Mikroorganismus enzymatisch acyliert.

3

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Es wird berichtet, dass schon mehrere Penicilline und Cephalosporine durch enzymatische Acylierung unter Bildung von a-Aminoacyl-Seitenketten synthetisiert wurden, wie in SA-PS 62/3870; US-PS 3 152 050, DE-AS 1 945 607 und 2 050 982, N L-PS 7 117 613, FR-PS 2 188 608, BE-PS 808 288, 5 JP-OS 47-25 388,48-35 090,49-13 393 und 49-62 695 und anderen Publikationen.

Es wurde nun gefunden, dass die Acylierung, entsprechend dem vorliegenden erfindungsgemässen Verfahren, auch durch Einwirkung von pilzartigen Mikroorganismen, die zur Gattung io Aphanocladium oder Cephalosporium gehören, bewerkstelligt werden kann und dass die Wirkung, im Gegensatz zu üblichen bakteriellen Wirkungen, der Natur nach irreversibel ist.

Unter den zu acylierenden Aminoverbindungen sind zu nennen 6-Aminopenicillansäure, 7-Aminocephalosporansäure, 15 7-Aminodeacetoxycephalosporansäure und ihre Salze. Als Salze können jene der Carboxylgruppe genannt werden, einschliesslich solche Salze wie Alkalimetallsalze, Erdalkalimetallsalze und tertiäre Aminsalze; auch werden umfasst Säureadditionssalze an der Aminogruppe, einschliesslich der Mineralsäu- 20 resalze, wie Hydrochlorid, Hydrosulfat und Hydrocarbonat. Bevorzugte Salze sind Alkalimetallsalze an der Carboxylgruppe.

Die genannte Aminosäure kann Glycin, Phenylglycin, Cyclohexadienylglycin, Cyclohexylglycin, Tienylglycin, Furylglycin, Hydoxyphenylglycin, Chlorphenylglycin, Cyanophenyl- 25 glycin, Alanin, Phenylalanin, Methionin, Serin, Tryptophan,

Valin, Leucin, Threonin, Asparagin, Lysin, a-Aminobuttersäure und andere natürliche oder synthetisierte Aminosäuren sein. Sie können entweder in Form von D- oder L-Isomeren oder in Gemischen derselben, einschliesslich razemischen Gemischen, 30 vorhanden sein. Bevorzugte Beispiele derselben sind D-a-Phenylglycin, D-a-(l,4-Cyclohexadienyl)-gIycin, D-a-(p-Hydroxy-phenyD-glycin, D-a-(2-Thienyl)-glycin und D-a-(3-Thienyl)-Gly-cin.

Die genannten Ester können Ci-Cio-Alkylester sein, unter 35 welchen Methyl-, Äthyl- und Propyl-ester bevorzugt werden. Die Ester können N-Ammoniumsalze genannter Aminosäuren sein, beispielsweise Mineralsäure-Additionssalze der Aminogruppe.

Bevorzugte Ester sind Mineralsäure-Additionssalze von 40 Ci-Cs-Alkylester genannter a-Aminosäure. Andere Formen von bevorzugten Estern sind Ci-Cs-Alkanoylsalze an der a-Aminogruppe genannter Aminosäuren.

Die erfindungsgemäss erzeugten Produkte können durch die oben angeführten Formeln I, II oder III veranschaulicht 45 werden. Repräsentative Carboxylate sind Alkalimetallsalze, Erdalkalimetallsalze und tertiäre Aminsalze und repräsentative N-Ammoniumsalze sind Mineralsäuresalze und Ci-Cio-Alka-noylsäuresalze. Die Produkte können in N-Ci-Cio-acylierter Form anwesend sein, in welcher die Acylgruppe Alkanoyl, 50 Aroyl, Carbalkoxy, Carbaralkoxy oder ähnliche Acylgruppen bilden kann.

Bevorzugte erfindungsgemäss erzeugte Produkte sind Ampicillin, Cephalexin, Epicillin, Cefradin, Amoxycillin, Cefalo-glycin oder ihre Salze. 55

Die erfindungsgemäss erzeugten Produkte sind als antibakterielle Mittel für die Behandlung von durch bakterielle Infektionen verursachte Leiden und die auf Wirkstoffe empfindlich sind, nützlich. Einige dieser Produkte werden in klinischer Praxis laufend angewendet. Die genannten Verbindun- 60 gen sind auch für die Desinfektion von Tieren, Pflanzen oder Materialien nützlich und sind schon dem Fachmann wohlbekannt. Die Methoden für ihre Anwendung oder Verwendung sind gleichfalls in medizinischer, veterinärer, Praxis, bei der Behandlung von Federvieh, im Gartenbau, in der Botanik oder 65 anderen verwandten Gebieten wohlbekannt. Die genannten erzeugten Produkte sind auch als Zwischensubstanzen, z. B. für die Herstellung anderer Antibiotika, nützlich.

Das vorliegende erfindungsgemässe Verfahren wird auf diese Weise durchgeführt, dass man genannte Aminoverbindung mit genanntem Ester in Gegenwart von zum Genus Aphanocladium oder Cephalosporium gehörenden Mikroorganismus oder dessen Myzelpräparat in Berührung bringt.

Der Mikroorganismus, der zum Genus Aphanocladium gehört und in vorliegendem erfindungsgemässen Verfahren verwendet wird, kann sein Aphanocladium aranearum (Petch) Gams, besonders Aphanocladium aranearum MFC-52, Stamm ATCC 20453, deponiert am 24. März 1975 bei der «American Type Culture Collection» in Rockville, Maryland, USA.

Als zum Genus Cephalosporium gehörender und in vorliegendem erfindungsgemässem Verfahren verwendeter Mikroorganismus kann genannt werden Cephalosporium coremioides Raillo, besonders Cephalosporium coremioides Raille, wobei der Stamm IFO-8579 öffentlich zugänglich ist.

Sämtliche natürliche und künstliche Varianten, Mutanten oder angepasste Stämme, die sich von den zur Gattung Apho-nocladium oder Cephalosporium gehörenden Mikroorganismen ableiten und die gewünschte enzymatische Wirkung zeigen, werden von der vorliegenden Erfindung umfasst.

Diese Mikroorganismen können auf folgende Weise zum Zwecke der Verwendung in vorliegendem Verfahren fortgepflanzt resp. angereichert werden. Mikroorganismen werden in einem Kulturmedium unter aeroben Bedingungen mit Hilfe einer Schüttelkultur, stationären Kultur oder Kultur unter Belüftung geimpft, um genanntes Myzel zu erhalten. Das Kulturmedium kann ein übliches sein und kann solche Kohlenstoff-und Stickstoffquellen wie Bouillon, Hefeextrakt, Pepton, Maisquellwasser, Zucker, organische Säuren, Aminoverbindungen, Nitrat und andere Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, sowie anorganische Salze, wie Phosphat, Sulfat und Metallsalze, und wesentliche zum Wachstum des Pilzes notwendige Elemente, wie Vitamin und Aminosäuren, enthalten. Im Besonderen kann die Inkubation unter aeroben Bedingungen bei pH etwa 5 bis 8, vorzugsweise 6 bis 7, und bei einer Temperatur im Bereiche von 20 bis etwa 40 °C und während etwa 3 Stunden bis 10 Tagen durchgeführt werden. Es werden drei repräsentative Medien für die Vermehrung genannt und die aus einer wässri-gen Lösung von pH von etwa 7,0 bestehen und die enthalten a) Glukose 3,5%, Pepton 2,0%, Maisquellwasser 0,3%; b) Glukose 2,0%, Pepton 1,0%, Bouillon 0,3%, Hefextrakt 0,2%, Natriumchlorid 0,1% oder c) Rohrzucker 3,0%, Goldprotein 1,5%, Maisquellwasser 1,5%, DL-Methionin 0,5% und Kalziumcarbonat 0,15%.

Das Myzelpräparat enthält sämtliche Bestandteile, die für die Penicillin- oder Cephalosporin-Amidasewirkung genannter Mikroorganismen nützlich bzw. erforderlich sind, beispielweise in Form eines gewaschenen Myzels, das durch Isolierung des wie oben angeführt vermehrten Myzels aus der Nährlösung durch Filtrieren oder Zentrifugieren und anschliessend Waschen mit Wasser oder wässriger Lösung erhalten wurde; eines Myzelhomogenats, das durch Zerkleinern der Myzelien erhalten wurde; eines rohen oder gereinigten Enzyms, das möglicherweise an ein unlösliches Material gebunden ist; oder eines extrazellularen Enzyms in der Nährlösung des vermehrten Mediums oder dessen Präparates. Das vermehrte Medium kann gleichfalls zur Durchführung der erfindungsgemässen Reaktion eingesetzt werden.

Das Substrat kann verwendet werden in Form von Pulver, Suspension, in Lösung, in hydrophilem organischem Lösungsmittel oder wässriger Lösung. Bevorzugte hydrophile organische Lösungsmittel sind Alkohole, Acetone und Glykole. Diese Lösungsmittel werden bei einer Konzentration verwendet, welche die gewünschte enzymatische Reaktion nicht hemmt. Als bevorzugte wässrige Lösung kann eine Pufferlösung oder eine vermehrtes Nährmedium als solches verwendet werden, wobei auch ein wässriges Medium für die Reaktion, wie destilliertes Wasser, eingesetzt werden kann. Aerobe Bedingungen

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sind nicht wesentlich. Falls die Mikroorganismen ß-Lactamase enthalten, können Penicilline zugefügt werden, um die ungünstige Wirkung zu hemmen. Bevorzugte Bedingungen für die Reaktion sind ein pH von etwa 5 bis etwa 8, eine Temperatur im Bereiche von etwa 20 bis etwa 40 °C und ein Schütteln oder 5 Rühren während 5 bis etwa 50 Stunden. Diese Bedingungen variieren in Abhängigkeit von der Art der Ausgangsmaterialien, der Konzentration, der Art des verwendeten Mikroorganismus, der Charakter des Kulturmediums und der Kulturmediums und der Arbeitsmethoden. Gewünschtenfalls kann zum 10 Reaktionsgemisch eine Säure, eine Base oder eine Pfufferlö-sung zugefügt werden, falls sich der pH des Mediums auf ungünstige Weise ändert. Die Konzentration des Ausgangsmaterials beträgt etwa 0,1 bis etwa 5%, vorzugsweise weniger als 2%. 15

Nach Ablauf der Reaktion werden das Myzel, das Myzelpräparat oder unlösliche Materialien vom Reaktionsgemisch abgetrennt, z. B. durch Filtrieren, Zentrifugieren, Adsorption, Denaturieren oder durch Kombination dieser Methoden und die so gebildeteten Produkte können mittels verschiedenarti- 20 ger Methoden separiert werden, z. B. durch Adsorption, fraktionierte Extraktion, durch Ablagerung, Ausfällung oder ähnliche Methoden und die Produkte können dann isoliert und mittels auf diesem Gebiete üblicher Methoden gereinigt werden, z. B. Umkristallisieren, Adsorption, Chromatographieren, 25 Ionenaustausch, Umfällung, Lyophylisieren, Gegenstromverteilung und ähnliche Methoden. Während der Aufarbeitung kann der Wasserstoff der Carboxylgruppe durch andere Kationen unter Bildung eines Salzes ersetzt werden oder die Seiten-kette-Aminogruppe kann ein Salz mit z. B. einer Mineralsäure, 30 mit einer 1 bis 10 Kohlenstoffatome enthaltenden Sulfonsäure oder mit anderen Säuren bilden.

Das oben beschriebene erfindungsgemässe Verfahren wird mittels einiger bevorzugter Ausführungsformen näher erläutert.

35

Beispiel 1

In 100 ml eines Mediums bestehend aus einer wässrigen Lösung vom pH von 7,0 und welches Medium 3,5% Glukose, 2,0% Pepton und 0,3% Maisquellwasser enthält, wird Aphanocladium aranearum ATCC 20453 geimpft und das Medium wird 40 unter Schütteln bei 28 °C während drei Tagen gezüchtet. Die Brühe wird durch ein Gewebe filtriert, um das Myzel zu sammeln, mit entionisiertem Wasser gewaschen und, zwecks Entfernung des Wasserüberschusses, zusammengedrückt.

Etwa 9 g des so erhaltenen nassen Myzels werden in 100 ml 45 entionisiertem Wasser, das 0,1 g 7-Aminodeacetoxycephalo-sporansäure und 0,5 g D-a-Phenylglycinmethylester-hydrochlo-rid enthält, suspendiert. Die Suspension wird auf ein pH von etwa 6,0 mit einer wässrigen Lösung von IN Natriumcarbonat eingestellt und bei 30 °C während 16 Stunden gerührt, wäh- 50 renddem der pH bei 6,0 aufrechterhalten wird. Die Suspension wird dann zwecks Entfernung des Myzels filtriert und bei 0 °C über Nacht aufbewahrt. Nach Filtrieren des kristallisierten D-a-Phenylglycins wird das Filtrat auf ein pH von 4,0 mit IN Chlorwasserstoffsäure eingestellt. Dieses Präparat wird durch 55 eine Säule von 60 ml eines Ionenaustauschharzes («Dowex» 50 W • 8) durchfliessen gelassen und mit 0,2 M einer Zitronen-säure-Pufferlösung vom pH 4,5 behandelt und die Säure wird dann mit dem 0,2 M Zitronensäure-Puffer gewaschen. Aus der ersten Fraktion wird eine kleine Menge von D-a-Phenylglycin- 60 methylester und 7-Aminodeacetoxycephalosporansäure gewonnen. Zu der nächsten antibiotisch aktiven Fraktion werden 3 Gew.-% Aktivkohle zugefügt und das Gemisch wird nach Rühren während 30 Minuten filtriert. Die Aktivkohle wird gesammelt und mit 50%igem Methanol eluiert und das Eluat 65 wird dann unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wird mit Methanol und Äthylacetat behandelt und man erhält 53 mg an Feststoff des rohen Produktes.

Das weisse Pulver wird aus einem Gemisch von Methanol und Äthylacetat umkristallisiert und man gelangt zu 23,8 mg von7ß-(D-a-Phenylglycyl)-aminodeacetoxycephalosporan-säure (Cefalexin)-monohydrat mit F von 185 bis 190 °C (Zers.). LR. vmaxNuio11763,1690,1590 cm"1.

Beispiel 2

Unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen werden 0,1 g von 6-Aminopenicillansäure mit D-a-phenylglycin-methyl-esterhydrochlorid unter Verwendung von Aphanocladium aranearum ATCC 20453 reagieren gelassen. Das Produkt wird auf Aktivkohle, nach Einstellen des pH des Reaktionsgemisches auf 6,0 mit einer wässrigen Natriumhydroxidlösung, adsorbiert. Unter Befolgung der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensschritte wird das Produkt aus der Aktivkohle eluiert und umkristallisiert und man erhält 37,9 mg von Natrium-6ß-(D-a-phenyl-glycyl)-aminopenicillat (Natriumampicillin). Schmelzpunkt 221 bis 226 °C (Zers.). I.R. vmaxN"io11770,1691,1600 cm"1.

Béispiel 3

Unter den Beispiel 1 beschriebenen ähnlichen Bedingungen wird 0,1 g 7-Aminodeacetoxycephalosporansäure mit D-a-Phe-nylglycinmethylester-hydrochlorid unter Verwendung von Aphanocladium aranearum ATCC 20453 bei 30 °C, während 16 Stunden und bei einem pH von 6,0 umgesetzt. Die papierschei-ben-mikrobiologische Probe des Reaktionsgemisches unter Verwendung von Bacillus subtilis PCI-219 zeigte, dass 0,118 g von Cefalexin erzeugt wurde und mit einer 72,8%igen Ausbeute.

Beispiel 4

Unter den in Beispiel 1 beschriebenen ähnlichen Bedingungen werden 0,25 g von 7-Aminodeacetoxycephalosporansäure mit D-a-Phenylglycin-hydroclorid-methylester unter Verwendung von Aphanocladium aranearum ATCC 20453 bei 30 °C, während 23 Stunden, bei einem pH von 6,0, reagieren gelassen. Es werden im Reaktionsgemisch mittels einer mikrobiologischen Probe 0,292 g Cefalexin gefunden, was einer Ausbeute von 71,9% entspricht.

Beispiel 5

Unter den in Beispiel 1 beschriebenen ähnlichen Bedingungen werden 0,3 g 7-Aminodeacetoxycephalosporansäure mit D-a-Phenylglycin-metylester-hydrochlorid unter Verwendung von Aphanocladium aranearum ATCC 20453, bei 30 °C, während 19 Stunden, und bei einem pH von 6,0, umsetzten gelassen. Mittels einer mikrobiologischen Probe erhielt man aus dem Reaktionsgemisch 0,338 g Cefalexin, das ist mit 69,6%iger Ausbeute.

Beispiel 6

Unter Befolgung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens werden 6-Aminopenicillansäure mit D-a-Phenylglycin-methylester-hydrochlorid unter Bedingungen, wie sie in folge-der Tabelle angeführt werden und unter Verwendung von Aphanocladium aranearum ATCC 20453, reagieren gelassen. Das im Reaktionsgemisch erzeugte Natriumsalz von Ampicillin wird mittels einer mikrobiologischen Probe bestimmt und man erhielt Werte, die in derselben Tabelle angeführt werden.

Substratmenge (g/dl)

Reaktion

Ertrag an Ampicillin

6-APA1

PGM2

Dauer (h)

(g/dl)

(%)

0,1

1.0

17

0,1304

75,9

0,2

2,0

16

0,2380

69,3

0,3

3,0

15

0,4460

86,6

(30 °C, pH 6,0)

5

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1.6-Aminopenicillansäure 2. D-a-Phenylglycin-methylester-hydrochlorid.

Beispiel 7

Unter in Beispiel 1 beschriebenen ähnlichen Bedingungen werden 0,1 g 7-Aminodeacetoxycephalosporansäure mit D-cc-( 1,4-Cyclohexadienyl)-glycin-methylester-hydrochlorid unter Verwendung von Aphanocladium aranearum ATCC 20453 bei 30 °C während 22 Stunden bei einem pH von 6,0 reagieren gelassen. Es wurden im Reaktionsgemisch mittels einer mikrobiologischen Probe 0,109 g von 7ß-D-a-(l,4-Cyclohexadie-nyl)-g(ycyIaminodeacetoxycephalosporansäure (Cephradin, Rf: 0,35 0,109 g), nachgewiesen. Die Ausbeute betrug 67,3% berechnet auf Cefalexin.

Beispiel 8

Unter den von Beispiel 7 ähnlichen Bedingungen wurden 0,1 g 6-Aminopenicillansäure mit D-a-(l,4-Cyclohexadienyl)-gly-cin-methyl-ester-hydrochlorid und unter Verwendung von Aphanocladium aranearum ATCC 20453 während 22 Stunden bei 30 °C und einem pH von 6,0 reagieren gelassen. Im Reaktionsgemisch wurden 0,064 g von 6ß-D-a-(l,4-Cyclohexadienyl)-glycylaminopenicillansäure (Epicillin) gefunden, und zwar bei Ermittlung mittels einer mikrobiologischen Probe. Die Ausbeute betrug 37,4% berechnet auf Ampicillin.

Beispiel 9

Unter den in Beispiel 1 beschriebenen ähnlichen Bedingungen wurden 0,1 g 7-Aminodeacetoxycephalosporansäure mit Aminosäure-Derivaten, wie sie in folgender Tabelle eingezeichnet sind, unter Verwendung von Aphanoclaudium aranearum ATCC 20453 bei 28 °C während 18 Stunden reagieren gelassen unter Bildung der entsprechenden 7ß-(a-Aminoacyl)-aminode-acetoxycephalosporansäure-Derivate. Die RrWerte jedes Produktes von Dünnschichtchromatographie über Silicagel, entwickelt mit einem Gemisch von Äthylacetat, Essigsäure und Wasser 3:1:1 V0I./V0I., gleichfalls in genannter Tabelle eingezeichnet.

Ausgangsaminosäure-Derivate Rf der Produkte

DL-Methionin-methylester 0,57 DL-Alanin-methylester DL-Phenylalanin-methylester D L-Serin-methylester

DL-Triptophan-methylester 0,39

DL-Valin-methylester

DL- a-Aminobuttersäure-methylester a-N-Benzoyl-D L-alanin-methylester 0,84

a-N-Carbobenzoxy-

D-phenylglycin-methylester 0,53

Beispiel 10

Unter den in Beispiel 9 beschriebenen ähnlichen Bedingungen wurden 0,1 g 6-Aminopenicillansäure mit den in folgender Tabelle angeführten Aminosäurederivaten, unter Verwendung von Aphanocladium aranearum ATCC 20453 bei 28 °C, während 18 Stunden, reagieren gelassen, wobei die entsprechenden 6 ß-( a-Aminoacyl)-aminopenicillansäure-Derivate erhalten wurden. Die RrWerte jedes Produktes am Dünnschichtchro-matogramm über Silicagel, entwickelt mit einem Gemisch von Nn-Butanol, Äthanol und Wasser 4:1:1 V0I./V0I., und die mittels mikrobiologischer Probe bestimmten Erträge sind in folgender Tabelle aufgenommen.

Ausgangs-Aminosäure-Derivate erzeugt in

Rfder

( y /ml)

Produkte

berechnet auf

Ampicillin

DL-Methionin-methylester

13

0,27

DL-Alanin-methylester

31

-

DL-Phenylalanin-methylester

+

-

DL-Serin-methylester

25

0,32

DL-Tryptophan-methylester

16

-

DL-Valin-methylester

36

-

DL-a-Aminobuttersäure-methylester

63

0,13

a-N-Benzoyl-DL-alanin-methylester

108

0,35

a-N-Carbobenzoxy-D-phenylglycin-

methylester

22

0,48

Beispiel 11

Unter den von Beispiel 1 ähnlichen Bedingungen wurden 0,1 g 6-Aminopenicillansäure mit D- a-(p-Hydroxyphenyl)-gly-cin-methylesterhydrochlorid unter Verwendung von Aphanocladium aranearum ATCC 20453 bei 30 °C während 23 Stunden bei pH 6,0 reagieren gelassen. Das Dünnschichtchromato-gramm des Reaktionsgemisches zeigte einen Fleck entsprechend 6 ß-D- a-(p-Hydroxyphenyl)-glycinamidopenicillansäure (amoxycillin).

Beispiel 12

Das Myzel Aphanocladium aranearum ATCC 20453 wurde homogenisiert unter Verwendung von 1,5-Gew.-Teilen Tonerde, verdünnt mit M-15-Phosphatpuffer bei einem pH von 5,0,6,0 und 7,0 und zentrifugiert. Es wurde zum überstehenden Ammoniumsulfat zugefügt bis zu einer Konzentration von 60% und die Enzymfraktion wurde ausgesalzen. Der erhaltene Niederschlag wurde in oben genannter Pufferlösung gelöst und über Nacht dialysiert, wobei eine rohe Enzymlösung erhalten wurde. Dieser Vorgang wurde bei einer Temperatur von 0 bis 4 °C vorgenommen.

Ein ml der Enzymlösung wurde dann auf 7-Aminodeacet-oxycephalosporansäure und D- a-Phenylglycin-methylester-hydrochlorid bei 37 °C umsetzen gelassen. Die Menge des erhaltenen Cefalexins im Reaktionsgemisch, bestimmt mittels mikrobiologischer Probe, ist in folgender Tabelle zusammengestellt.

Menge an Substrat Konzentration pH des erzeugtes Cefa-(mg/ml) v. Enzymprotein Mediums lexin(y/ml)

7-ADCA1 PGM2 (mg/ml) 1 Std. 3Std.

1,0

2,5

5,0

82

69

1,0

2,5

5,0

6,0

316

500

1,0

2,5

5,0

7,0

177

145

1,0

5,0

7,0

180

170

3,0

7,5

2,0

6,0

393

643

1,0

2,5

2,0

6,0

205

282

1,0

5,0

2,0

6,0

247

429

' 7-Aminodeacetoxycephalosporansäure 2 D- a-Phenylglycin-methylester-hydrochlorid

Beispiel 13

1 ml der mittels der Methode von Beispiel 12 erhaltenen rohen Enzymlösung wurde mit 6-Aminopenicillansäure und D-a-Phenylglycin-methylester-hydrochlorid bei 37 °C reagieren gelassen. Die Menge des erzeugten Ampicillins im Reaktionsgemisch wurde mittels einer mikrobiologischen Probe ermittelt und die Ergebnisse sind in folgender Tabelle zusammengestellt.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

629 534

*6

Menge an Substrat Konzentration pH des erzeugtes Ampi-(mg/ml) v. Enzymprotein Mediums cillin

(y/ml)

6-APA" PGM2 (mg/ml) 1 Std. 3Std.

1,0

2,5

. 5,0

5,0

126

1.0

2,5

5,0

6,0

465

540

1,0

2,5 •

5,0

7,0

224

255

1,0

5,0

7,0

210

221

0,5

2,5

2,0

6,0

191

264

3,0

7,5

2,0

6,0

890

1370

1,0

■2,5

2,0

6,0

300

475

1,0

5,0

2,0

6,0

379

695

16-Aminopenicillansäure 2 D- a-Phenylglycin-methylester-hydrochlorid

Beispiel 14

Unter den in Beispiel 1 angeführten ähnlichen Bedingungen wurde 0,25 g 7-Aminocephalosporansäure mit 3,5 g D- a-Phe-nylglycinmethylester-hydrochlorid unter Verwendung von Aphanocladium aranearum ATCC 20453 bei 30 °C während 23 Stunden bei einem pH von 6,0 reagieren gelassen. Die Flecke von Cephaloglycin und Deacetylcephaloglycin zeigten sich auf einem Dünnschichtchromatogramm und es wurden 0,072 g gebildetes Cefaloglycin mittels mikrobiologischer Probe ermittelt.

Beispiel 15

5 Zu 100 ml eines sterilisierten Mediums, bestehend aus einer wässrigen Lösung vom pH von 7,0 und enthaltend 3,5% Glukose, 2,0% Pepton und 0,3% Maisquellwasser wurde Cephalosporium coremioides IFO-8579 eingeimpft und das Medium wurde bei 28 °C während drei Tagen geschüttelt. Die Brühe io wurde dann zentrifugiert und das Myzel zusammen, welches dann mit entionisiertem Wasser gewaschen wurde.

Das so erhaltene feuchte Myzel wurde in M/30-Phosphat-puffer vom pH 6,0 und 0,4 g 7-Aminodeacetoxycephalosporan-säure und D- a-Phenylglycin-methylester-hydrochlorid enthal-15 tend bei 28 °C während 24 Stunden suspendieren gelassen. Die Menge des im Reaktionsgemisch gebildeten Cefalexins betrug 0,095 g nach Ermittlung mit Hilfe einer mikrobiologischen Probe.

20 Beispiel 16

Unter den in Beispiel 15 angeführten ähnlichen Bedingungen wurde 6-Aminopenicillansäure mit D- a-Phenylglycin-me-thylester-hydrochlorid unter Verwendung des im Verfahren von Beispiel 15 erhaltenen Myzels umsetzen gelassen, wobei 25 0,08 g an Ampicillin, ermittelt mittels einer mikrobiologischen Probe, erzeugt wurden.

Claims

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PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung von Penicillin- oder Cephalo-sporin-Antibiotika der Formeln

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(Petch) Garns., ATCC 20453 oder Cephalosporium coremioides Raillo., IFO-8579 ist.
6. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeich- ' net, dass das Myzelpräparat ein gewaschenes Myzel oder ein rohes gereinigtes Enzym ist.
7. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung bei einem pH-Wert von 5,0 bis 8,0 erfolgt.
8. Verfahren nach Patentanpruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als genanntes acyliertes Penicillin- oder Cephalo-sporin-Antibiotikum ein Ampicillin, Epicillin, Amoxycillin, Cefalexin, Cefradin oder Cefaloglycin oder deren Salze erzeugt.

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