DE2163792C2 - Verfahren zur Herstellung von Aminopenicillinen - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Aminopenicillinen

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Description

NH2
R—CH-COA (II)
in der R die oben genannte Bedeutung hat und A ein Alkoxyrest, Carboxyalkylthiorest, eine Aminogruppe oder Carboxyilkylamlnogruppe ist, :in Gegenwart von Phenylessigsäure und In Gegenwart eines Mikroorganismus oder eines Zellextraktes oder gereinigten Enzympräparates daraus, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Acetobact«r sp. IFO 13209, IFO 13210 oder IFO 13211, Aeromonas sp. IFO 13212, Mycop'.ana dimorpha IFO 13213, Xanthomonas sp. IFO 13215 oder Protamlnobacter alboflavus IFO 13221 Ist.
Bisher wurden Aminopenieilline durch die Kondensationsreaktion zwischen ^-substituierten ^-Aminosäuren und 6-Am'nopenicillansäure mit Hilfe chemischer Reaktionen hergestellt. Bei diesen bekannten Verfahren Ist es jedoch erforderlich, entweder die Amünogruppe der Aminosäuren zu schützen, um Ihre Umsetzung mit der Carboxylgruppe zu verhindern, oder dl« Aminogruppe vorher In einen Rest, z. B. eine Azldogruppe (Nj) umzuwandeln, der wieder in die Amir.oeruppe umgewandelt werden kann. Es ist somit notwendig, nach der Kondensationsreaktion entweder die Schutzgruppe von der Aminogruppe zu entfernen oder de,n ober, genannten Rest wieder In die Aminogruppe umzuwandeln. Ferner müssen diese Nebenstufen des Verfahrens unter milden Bedingungen durchgeführt werden, damit die an diesen Reaktionen beteiligten Komponenten nicht beeinflußt werden und damit Insbesondere die Penlcllllnkomponente oder die SS.ureamldblndung In der Seltenkette an der 6-Sicllung nicht gespalten wird. Durch diese milden Bedingungen wird die Ausbeute an gewünschten Aminopenicilllnen zwangsläufig verringert.
Inzwischen gilt öle Herstellung der Aminopenlcllline durch Mikroorganismen als vorteilhafter als die chemische Herstellung, well es nicht notwendig Ist, die Aminogruppe der Λ-Amlnosäure zu schützen, so daß die gewünschten Aminopenieilline in einer einzigen Stufe hergestellt werden können. Jedoch sind alle bisher versuchten Herstellungsverfahren mit !Hilfe von Mikroorganismen auf solche Verfahren beschränkt, bei denen Mikroorganismen verwendet werden, die in hohem Maße die Fähigkeit haben. Penicillin G, das keine Aminogruppe an der ,/-Stellung des N-Acylresiies enthält, aus Phenylessigsäure und 6-Aminopenicillansäure zu bilden. Diese bekannten Mikroorganismen zellen eine besonders starke Aktivität zur Bildung von Penicillin G und eine verhältnismäßig geringe Aktivität zur Bildung von Amlnopenleillinen. Beispielswelse Ist r"e Herstellung von j-Aminobenzylpeniclllln aus 6-Amlnopenlciilansäure und Phenylglyclnmethylester unter Verwendung eines solchen bekannten Mikroorganismus viel unvorteilhafter als Λ'β Herstellung von Penicillin G aus 6-Ainlnopenlclllansäure und Phenylesslgsäuremcthylcster unter den gleichen Bedingungen.
Die bekannten mikrowellen Verfahren sind somit vom Standpunkt der Großherstellung der Aminopeniclllane nicht sehr befriedigend.
Die ältere DE-PS 20 30 983 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von ar-Amlnobenzylpenlclllln durch Umsetzen von 6-Amlnopenlclllansäure mit ar-Amlnophenylesslgsäure oder deren Amid, Alkylester oder Alkalioder Erdalkalisalz In Gegenwart eines Enzyms, das dadurch gekennzeichnet Ist, daß man die Umsetzung In Gegenwart eines Enzyms von Pseudomonas melanogenum ATCC 17808, ATCC 14535 oder Pseudomonas ovalls ATCC 15175 und Phenylessigsäure als Verunreinigung enthaltender 6-Amlnopenlclllansäure durchführt.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß unter den Mikroorganismen der Gattungen Mycoplana, Protamlnobacter, Acetobacter, Aeromonas und Xanthomonas Mikroorganismen vorkommen, die eine neuartige Substratspezifltät aufweisen, d. h. Aminopenieilline aus «-substituierten ar-Aminosäurederlvaten und 6-Amlnopenlclllansäure zu bilden vermögen, abeir im wesentlichen unfähig sind. Penicillin G aus Phenylessigsäure und 6-Amlnopenlclllansäure unter den gleichen Bedingungen zu bilden, und daß unter Verwendung dieser Mikroorganismen Aminopenieilline glatt und einfach In hoher Ausbeute aus «-substituierten x-Amlnosäurederlvaten und 6-Amlnopenlclllansäure hergestellt werden können.
Gegenstand der Erfindung Ist das i.m Patentanspruch dargelegte großtechnisch vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung von Ji-Amlnopenlcllllnen (I) aus «-substituierten «-Aminosäurederivaten und 6-Amlnopeniclllan-
In der vorstehenden Formel (I) steht R für einen sechsgliedrigen cyclischen KohlenwasserstofTresi, z. B. einen Phenylrest, Cyclohexenylrest (I-Cyclohexenyl, 2-Cyclohexenyl oder 3-CycIohexenyl), einen Cyclohexadlenylrest (z. B. 1,3-Cyclohexadlenyl, 1,4-CycIohexadienyI, 1,5-CycIohexadienyl oder 2,5-CyclohexadIenyl) oder einen Cyclohexylrest, wobei alle diese Reste an ihrem Ring einfach oder mehrfach substituiert sein können, und die Substituenten Hydroxylgruppen und/oder Halogenatome (z. B. Brom und Chlor), sind. .->
In der Formel (II) ist R einer der oben genannten cyclischen Kohlenwasserstoffreste und A ein Alkoxyrest (z. B. Methoxy, Äthoxy. Propoxy, lsopropoxy, Allyioxy und Hexoxy), ein Carboxyalkylthlorest (z. B. ein Carboxymethylthlorest und Carboxyäthylthlorest), eine Aminogruppe oder Carboxyalkylaminogruppe (z. B. e?ne Carboxymethylamlnogruppe). Mit anderen Worten, die cr-substltuierten jr-Amlnosäurederivate (II) sind Alkylester der ar-substitulerien Jt-Aminosäuren der Formel »·
NH2
R—CH-COOH (II)
In der R die oben genannte Bedeutung hat. Thioester oder Amide dieser Säuren oder Dipeptide zwischen diesen Sauren und anderen Aminosäuren. Die jr-substituierten α-Aminosäuren der Formel (ΙΠ sind Phenylglycln, Cyclohexenylglycin, Cyclohexadienylglycln und Cyclohexylglycln, die an ihren Ringen einen oder mehrere der oben genannten Substituenten enthalten können. Als Beispiele von cr-substitulerten jr-Amlnosäuren (ΙΠ, deren cyclische Kohlenwasserstoffreste einen solchen Substituenten aufweisen, selen genannt: Monohydroxyphenyl- -" glycin, z. B. p-Hydroxyphenylglycln, Monohalogenphenylglycln, z. B. o-Chlorphenylglycln.
Monosubstitulerte Cyclohexadlenylglyclne, monosubstltulerte Cyclohexenylglycine und monosubstltuierte Cyclohexylglyclne können in der gleichen Welse wie die oben genannten monosubstltuierten Phenylglycine verwendet werden. Geeignet sind ferner Phenylglycln, Cyclohexadienylglycin, Cyclohexenylglycin und Cyclohexylglycln, die zwei oder mehr gleiche oder verschiedene Substituenten enthalten. Als Substituenten kommen -^ in diesem Fall beliebige Kombinasionen der oben genannten verschiedenen Subyjltuenten in Frage. Diese jcsubstltuierten α-Aminosäuren (W) sind zum Teil neu, jedoch können sie leicht beispielsweise mit Hilfe der Strecker-Reaktion aus Aldehyden, die den entsprechenden Rest R enthalten, hergestellt werden.
Es gibt optische Isomere der jeweiligen jr-substltuierten ar-Amlnosäurederlvate (II). Vom Standpunkt der antibakteriellen Wirksamkeit der erhaltenen Amlnopenlcilline (I) ist die Verwendung der D-Formen oder DL- '■■> Formen bezüglich des ar-Kohlenstoffatoms dieser Derivate (I) zu empfehlen.
Die 6-AmlnopeniciIiansä,-;re (III? kann In Form der freien Säure oder als Salz, z. B. als Hydrochlorld, Natriumsalz oder Kaliumsalz, verwendet werden. Lösungen, die ein Gemisch von Phenylessigsäure und 6-Amlnopenlcillansäure enthalten, werden durd Umsetzung von bekannter Penlclllinacylase mit Penicillin G hergestellt.
Für das Verfahren gemäß der Erfindung werden die folgenden Mikroorganismen verwendet: ::i
Mycoplana dlmorpha IFO 13213, Protamlnobacter alboflavus IFO 13221, Acetobacter sp. IFO 13209, Acetobacter sp. IFO 13210, Acetobacter sp. IFO 13211, Aeromonas sp. IFO 13212 und Xanthomonas sp. IFO 13215. In der vorliegenden Beschreibung wird für die Gattung Acetobacter die Nomenklatur gemäß »Sergey's Manual of Determinative Bacteriology«, 7. Auflage (1957), verwendet. Die 1FO-Nummern sind die Zugangsnummern der beim Institute for Fermentation, Osaka, Japan, hinterlegten Mikroorganismen. 4«
Alle Mikroorganismen, die für das Verfahren gemäß der Erfindung geeignet sind, sind somit Bakterien, die • zur Familie Pseudomonadaceae gehören.
Indem 1) ein jr-substllulertes ar-Amlnosäurederivat (Π) und 2) 6-AmlnopenlcIllansäure der enzymatlschen Wirkung eines solchen Mikroorganismus mit der genannten Substratspezlfltät unterworfen werden. Ist es möglich, diesen Mikroorganismus In einem Kulturmedium zu züchten, das ein ^-substituiertes ^-Aminosäure- 4* derivat (II) und 6-Aminopenicillansäure enthält, jedoch Ist es allgemein zu empfehlen, einet, solchen Mikroorganismus vorher In einem gewöhnlichen Kulturmedium zu züchten und die erhaltene Kulturbrühe oder Ihr verarbeitetes Material zu verwenden.
Die Kultivierung der Mikroorganismen kann unter Belüftung und unter Rühren, Schütteln oder unter statischen Bedingungen durchgeführt werden. Im allgemeinen Ist die Kultivierung unter aeroben Bedingungen > <' vorteilhaft.
Geeignet sind Kulturmedien, die Fleischextrakt, Hefeextrakt, Pepton, Caselnhydrolysate, Malsquellwasser und andere natürliche Substanzen, die Im allgemeinen für die Kultivierung verwendet werden, einzeln oder In Kombinationen enthalten. Diese Medien können wahlweise durch Kohlenstoffquellen wie Zucker, organische Säuren, n-Parafflne, anorganische oder organische Stickstoffverbindungen, die Stickstoff In Amlnoform >? und/oder Nitratform enthalten. Phosphate, Mangansalze, Natriumchlorid, andere Ionische Metalle und/oder Vitamine ergänzt werden. Die: Medien werden vorzugsweise auf pH 6 bis 8 eingestellt. Bevorzugt werden Kultivierungstemperaturen von 20 bis 40° C, Insbesondere von 28 bis 37° C. Die Kultlvlerungsdauer Ist verschieden In Abhängigkeit von der Kultivierungsvorrichtung, der Zusammensetzung des Mediums und der Kultivierungstemperatur, jedoch ist es zu empfehlen, die Kultivierung s:u dem Zeltpunkt abzubrechen, zu dem die Aktivität «' zur Synthetisierung von Amlnopenlclllln das Maximum von dem späten Stadium der logarithmischen Wachstumsphase zum frühen Stadium der stationären Phase erreicht. Im allgemeinen werden mit einer Kultlvlerungsdauer von 16 bis 40 Stunden gute Ergebnisse erhalten.
Die In dieser Welse erhaltenen Kulturbrühen oder Ihre verarbeiteten Bestandteile eignen sich für die enzymatlsche Synthese von Amlnopenlcllllnen (1) beim Verfahren gemäß der Erfindung. Der hler gebrauchte Ausdruck "* »verarbeitete Materlallen oder Bestandteile der Kulturbrühen« bezeichnet alle Materlallen, die durch eine geeignete Behandlung oder geeignete Behandlungen der Kulturbrühe zur Steigerung der Aktivität für die Synthetisierung von Amlnopenlclllinen gebildet und In eine für die enzymatlsche Reaktion vorteilhafte Form gebracht
werden. Wenn beispielsweise diese Aktivität in den Bakterienzellen vorliegt, sind die verarbeiteten Materlallen beispielsweise 1) Zellsuspensionen, die durch Suspendieren der aus den Kulturbrühen isolierten und dann gewnschenen Zellen in Pufferlösungen verschiedener Konzentrationen herstellbar sind, 2) Zellextrakte, die mit Hilfe bekannter Extraktionsverfahren aus den Zellen erhältlich sind, und 3) gereinigte Enzympräparat, die die Aktivität zur Synthetisierung von Aminopenlcllllnen aufweisen und nach bekannten Verfahren aus den Zellextrakten herstellbar sind. In Fallen, in denen die Aktivität außerhalb der Bakterienzellen vorliegt, kommen als verarbeitete Materialien beispielsweise 1) die durch Entfernung der Zellen aus den Kulturbrühen erhältlichen Kulturflüsslgkeiten und 2) gereinigte Enzympräparate in Frage, die die Aktivität für die Synthetisierung von Aminopenicillinen aufweisen und durch Reinigung der Kulturfiüsslgkeiten nach den für Enzyme allgemein bekannten Verfahren herstellbar sind.
Die Kondensationsreaktion zwischen Π einem jr-subsiltuierten jr-Amlnosäurederlvat (II) und 2) 6-Amlnopenicülansäure zur Bildung eines entsprechenden Amlnopenlclillns (I) verläuft glatt, wenn die beiden Verbindungen mit der oben genannten Kulturbrühe oder Ihrem verarbeiteten Material in einem wäßrigen Medium zusammengeführt werden. Unter einem »wäßrigen Medium« Ist im Rahmen dieser Beschreibung ein Medium zu verstehen, das hauptsächlich aus Wasser besteht. Beispielsweise kann das wäßrige Medium ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel, z. B. einen niederen Alkohol (z. B. Methanol, Äthanol oder Isopropanol), oder Aceton enthalten. Die Konzentration dieses organischen Lösungsmittels beträgt vorzugsweise weniger als etwa 40 Vol.-",., insbesondere weniger als etwa 20 Vol.-V bezogen auf das Gesamtvolumen des fertigen Mediums. Im allgemeinen ist es zu empfehlen, das wäßrige Medium auf pH 4 bis 8, Insbesondere auf einen pH-Wert von etwa 5 bis 7 einzustellen. Die Reaktionszeit variiert mit der Konzentration des Substrats, dem Gr.-/> der Aktivität der KulturbrQhe oder des verwendeten verarbeitetet! Maerials zur Synthetisierung von Ämlnopenlc'Hlnen und der Reaktionstemperatur, jedoch Hegt sie im allgemeinen im Bereich von etwa 0,5 bis 5 Stunden. Die Reaktionstemperatur liegt vorteilhaft im Bereich von er*a 10 bis 50° C. Besonders vorteilhaft ist eine Temperatur von etwa 20 bis 40° C. Die Substralkonzentratlon wird hauptsächlich in Abhängigkeit vom Grad der Aktivität zur SynthetisL'rung von Amlnopenlcillinen gewählt.
Im allgemeinen wird die auf das gesamte wäßrige Medium bezogene Konzentration der 6-AmlnopenlcilIlnsäure aus einem Bereich von etwa 0.1 bis 5% (Gewicht/Volumen) und die Konzentration des j-substltulerten a-Aminosäurederivats (II) aus einem Bereich von etwa 0,1 bis 10'\, (Gewicht/Volumen) gewählt. Vorteilhaft wird das Jt-substituierte a-Aminosäurederivat ill) In wenigstens äquimolarer Konzentration, Insbesondere In einer Menge von wenigstens 2 Mol pro Mol der eingesetzten 6-Aminopenicillansäure verwendet.
Das in dieser Weise hergestellte Amlnopenlcillin Ί) läßt sich leicht aus dem Reaktionsgemisch Isolieren und nach bekannten Verfahren, z. B. durch Chromatographie, unter milden Bedingungen reinigen.
Das Verfahren gemäß der Erfindung hat insbesondere die folgenden Vorteile:
1) Es Ist möglich, die Amlnopeniciiline (I) In hoher Ausbeute aus den jr-substltulerten ar-Amlnosäurederivaten (11) und der 6-AmlnopenlcllIansäure ohne Spaltung des /J-Lactamrlnges der Penicilline herzustellen.
2) Es ist möglich, die Lösungen, die ein Gemisch von Phenylessigsäure und 6-Aminopenicillansäure enthalten, die durch Behandlung von billigem Penicillin G mit der bekannten Penicllllnacylase erhältlich Ist, direkt zu verwenden, da Penicillin G nicht In wesentlichem Maße gebildet wird, auch wenn Phenylessigsäure gleichzeitig In dem Reaktionssystem für die Herstellung von Amlnopenlclllln vorhanden Ist.
3) Die Kultivierung der zu verwendenden Mikroorganismen Ist sehr leicht.
4) Die gebildeten Amlnopeniciiline lasbcn sich sehr leicht aus den Reaktionsgemischen isolieren.
Das Verfahren gemäß der Erfindung ist somit für die Großherstellung der Aminopenlcllllna M) sehr vorteilhaft.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden in den folgenden Beispielen beschrieben.
Der Versuch 1 veranschaulicht ein typisches Auswahlverfahren für die für die Zwecke der Erfindung geeigneten Mikroorganismen. Der Versuch 2 veranschaulicht die Charakteristiken des aus Flußwasser Isolierten Stammes Aeromonas sp. IFO 13212, einen der Im Versuch 1 ausgewählten Mikroorganismen, und der Versuch 3 veranschaulicht das typische Verfahren zur Herstellung "on l-Cyclohexsnylglycinmethylesler, einer neuen Verbindung, die als eines der jr-substltulerten jr-Am!nosäurederlvate (11) bei den In den Beispielen beschriebenen Versuchen verwendet wird.
Bei den nachstehend beschriebenen Versuchen und η d-n Beispielen beziehen sich die Prozentsäue auf Gewicht/Volumen, falls nicht anders angegeben. Gewichtstelle und Raumteile verhalten sich wie Gramm zu Kubikzentimeter.
Versuch I
Auswahl von Mikroorganismen, die für die Zwecke der Erllndung geeignet sind.
Die Mikroorganismen, die sich sowohl auf dem Medium A" und dem Medium B2), die nachstehend beschrieben werden, vermehren können, wurden aus dem Boden, aus Abwasser, Seewasser, Flußwasser, Früchten und aus der Luft isoliert. Aus diesen Isolierten Mikroorganismen wurden die erfindungsgemäß verwendet, die jr-AmlnobenzylpenlcllIln aus Phenylglyclnmethylester und 6-Aminopenicillansäure leicht und glatt anzuhäufen vermögen, jedocn nicht fähig sind, eine wesentliche Menge Penicillin G aus Phenylessigsäure und 6-Amlnopenlcillansäure unter der gleichen Bedingungen zu bilden, nach dem folgenden Verfahren ausgewählt:
Jeder der Isolierten Mikroorganismen wurde 2 Tage Im Medium E5) kultiviert. Die erhaltene Kulturbrühe wurde In 300 ml des Mediums C31 oder D41 In einem Erlenmeyerkolben geimpft und 40 Stunden bei 28° C unter
Schütteln kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren aus jeder erhaltenen Brühe Isoliert, mit einer 0.1-molaren Cltiai-Phosphal-Pufferlösung. die einen pH-Wert von 5,5 hatte, gewaschen und dann In 60 ml dieser Pufferlösung suspendiert, die pro ml 5 mg 6-Amlnopcnldllansaure und 20 mg D-Phenylglyclnmethylesler oder Phenylessigsäure enthielt. Die Suspensionen wurden I Stunde bei 37" C unter Schütteln bebrütet. Die Analyse der gebildeten Verbindung wurde nach der für Penicilline üblichen Methode, d. h. durch den Bloicsi sowie durch Bloautogruphle unter Verwendung von Staphylococcus aureus 2O9P als Testmlkroorganlsmus vorgenommen, wie In »Antibiotics & Chemotherapy«. 3. 50-54 (1953) beschrieben.
Die Mikroorganismen, die In dieser Welse ausgewählt wurden, sind nachstehend In Tabelle I genannt.
Tabelle
Mikroorganismus
Menge der angehäuften
Verbindung, mg/ml
a-Amino- Penicillin U benzylpenicillin
Mycoplana dimorpha IFO 13213 Acetobacter sp. IFO 13211 Acetobacter sp. IFO 13209 Acetobacter sp. IFO 13210 Aeromonas sp. IFO 13212 Xanihomonas sp. IFO 13215 Protaminobacter alboflavus IFO 13221
5.2 NB
4.6 NB
4.8 NB
4.5 NB
4.6 NB
4,2 NB
4,5 NB
»NB<i bedeutet. ι! (5 das Produkt nicht nachgewiesen werden konnte und daher seine Menge geringer war als etwa O1Dl mg/m!. ll1
1) Medium A
Bacio-Nutrlent Broth, dehydratlslen (Im Handel erhältlich) Eurocldln (J. Agr. Chem. Soc. [Japan] 29, 650 [1955)) : jr-Amlnobenzylpenlcillln Aaar
2) Medium B
D-Phenylglyclnmethylester (oder D-Phenylglycylglycln) Hefeextrakt M«SO, ■ 7 H;O NH4NO, K2HPO, Harnstoff Eurocldln (J. Agr. Chem. Soc. [Japan] 29. 650 [1955]) Agar
3) Medium C Fleischextrakt Hafeextraki Pepton
NaCI
D-Phenylgiyclnmeihylester
4) Medium D Fleischextrakt Hefeextrakt Pepton
NaC!
Phenylessigsäure
5) Medium E Fleischextrakt Hefeextrakt Pepton
NaC!
pH 7,2
pH 7,2
0.8'\.
pH 7,2
2%
0,1 %
0,OK
0.01%
0,004%
0,01%
0,002%
2%
1,0% 0,5% 1,0% 0,5%
1,0% 0.5% 1,0% 0,5% 0,05%
1,0% 0,5* 1,0% 0,5%
Versuch 2
Charakteristiken von Acromonas sp. IFO 13212
* Kurze Stäbchen, 0,6 χ 1 bis 2 μ. Beweglich mit Hilfe von polaren Geißeln. Gramnegallv.
Agarkolonlen: kreisförmig, stumpfgclb, gewölbt, halblranspareni
Agar-Schr.igkultur: fadenförmig, stumpfgclb, glatt
LrJhe: trübe, mit Pelllkula
Lackmusmilch: sauer, koaguliert
i" Kartoffel: gelbl Ichbrau η
Indole gebildet
Nitrite aus Nitraten gebildet
Schwefelwasserstoffbildung
Katalase: positiv
1^ Saure und Gas aus vielen Kohlenhydraten
Stärke hydrolysiert
Die Zellen binden keinen freien Stickstoff aus der Atmosphäre.
Veisutii 3
A) Herstellung von DL-I-Cyclohexenylglycln
Eine Lösung von 4,4 Gew.-Teilen l-Cyclohexen-l-iildehyd In 8 Raumtellen Methanol wird zu einer Lösung von 2 Gew.-Teilen Natrlumcyanld und 2.36 Gew.-Teilen Ammonlumchlorld In 8 Raumtellen Wasser gegeben.
■> Das Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, worauf 20 Raumteile Wasser zugesetzt werden. Die erhaltene Aminonltrllverblndung wird mit 20 Raumtellen Benzol extrahiert. Die Benzolschlcht wird dreimal mit je 10 Raumtellen 6n-Salzsäure extrahiert. Die wäßrige Schicht wird 2 Stunden am Rückflußkühler erhitzt. Die harzartige Substanz wird mit Aktivkohle entfernt und das Flltrat auf etwa 15 Raumtelle eingeengt und mit konzentriertem wäßrigem Ammoniak (281VIg) auf einen pH-Wert von etwa 5,0 eingestellt, wobei sich rohe
■'·" Kristalle von DL-I-Cyclohexenylglycln abscheiden. Die Kristalle werden abfiltriert und In einer wäßrigen 1 niiatrlumhydroxydlösung gelöst. Nach Zusatz von Aktivkohle zur Lösung wird das Gemisch filtriert. Zum Flltrat wird Äthanol (halbes Volumen des Flltruts) gegeben. Das Gemisch wird gekocht, worauf sein pH-Wert mit Salzsäure auf etwa 5.0 eingestellt wird. Hierbei werden 1,1 Gew.-Teile DL-I-Cyclohexenylglycln In Form von farblosen Flocken vom Schmelzpunkt 242-243° C erhalten.
jD (KBr, errr'):
3160. 2960, 1605. 1490. 1400. 1345. 1274, 1145. 720.
NMR (Lösungsmittel: 1 n-NaOD):
*' 1.5-2,4(MuItIpIeU, 8H)
3,81 (Single», IH,-CH-COOH)
5.84 (Multiplen. IH. -CH=C-
B) Herstellung von DL-l-Cyclohexenylglyclnmethylester
10 Gew.-Teile DL-l-Cyclohexenylglycin werden In 100 Raumtellen Methanol suspendiert. Während die erhaltene Suspension auf etwa -15° C gekühlt wird, werden 80 Gew.-Teile Thionylchlorid zugetropft. Nach erfolgtem Zusatz wird das Gemisch 3 Tage bei 4° C stehen gelassen. Das Gemisch wird unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wird aus 20 Raumtellen eines Gemisches von Methanol und Dläthyläther (Volumenvers" haitnls 1:1) kristallisiert, wobei etwa 10 Gew.-Teile DL-I-Cyclohexenylglyclrmethylester erhalten werden.
NMR (in D2O), δ (ppm): 1,7B (4 Protonen an den C-4- und C-5-Kohlenstoffatomen des Ringes), 2,O5B (4 Protonen an den C-2- und C-6-Kohienstoffatomen des Rtnges), 3,925 (3 Protonen des Meihyirestes), 4,64s (1 Proton am ar-Kohlenstoffatom), 6,21B (1 Proton am olefinischen Kohlenstoff des Rings).
S = Slnglett
B = breit
C) Herstellung von D-1-Cyclohexenylglycinmethylester
Zu einer mit 2 n-Natrfumhydroxyd auf pH 7,2 eingestellten Lösung von 10 Gew.-Tellen DL-1-Cyclohexenylglycinmethylesterhydrochlorid in 1000 Raumtellen Wasser wird 1 Gew.-Tell eines Im Handel erhältlichen Chymotrypsin (»ar-Chymotrypsln«, Cliiymotrypslnaktivität 50 Einheiten/mg) gegeben. Das Gemisch wird 2 Stunden bei 23° C bebrütet, wobei der pH-Wert durch Zusatz von 1 n-Natrlumhydroxyd bei 7,2 gehalten wird.
Das Raktlonsgemlsch wird mit 5 n-Natrlumhydroxyd auf pH 8,0 eingestellt und dann fünfmal mit je 1300 Raumteiler. Dläthyläther extrahiert. Die erhaltene Diathylätherschlcht wird bei 25° C unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei ein brauner öliger Rückstand erhalten wird. Nach Zugabe von 100 Raumtellen Methanol, das mit HCl gesättigt ist. wird das Gemisch unter vermindertem Druck eingedampft. Dem erhaltenen Rückstand werden 30 Raumtelle Diathyläther zugetropft. Das Gemisch wird eingedampft, wobei 3,5 Gew.-Telle
> Kallumphenylacetat von pH 7,0 enthalt, sterilisiert und mit Escherl- mu: 2,0, pH 8,5) wurde zentrifugiert um die Zellen zu sammeln. Die Das Gemisch wurde dann auf pH 1,0'H) D-Phenylglyclnälhylester- (Minuten) Menge des gebildeten die In den Beispielen i-6 und 8 pH O.D.*) Menge der III
21 63 792 chla coll ATCC 11105 bebrütet. Das Medium wurde 17 Stunden unter Schütteln bei 31° C kultiviert. Die erhal gewaschen und dann erneut In 1/15 molar Phosphatpufferlösung von 6.0 mit NaOH eingestellt und a- Aminobenzy !penicillins vurden genau nachgearbeitet entsprechend der Beschreibung dieser 9,1 5,8 1 gebildeten a-amino-
tene Kulturbrühe (optische Dichte bei 600 pH 6,0 suspendiert, um eine Zellsuspenslon zu ergeben, die eine 20fache optische Dichte derjenigen der Kultur 1 Stunde bei 37° C bebrütet, wobei wahrend dieser Zelt die Menge des gebildeten jr-Arnlnobenzylpenlclllln nach (mg/Ml) dargelegt. 2 benzylpenicillin**)
D-l-Cyclohexenylglyclnmelhylester erhalten werden. Spezifische Rotation: Ul)V = -115° (C = 0,5, 0,1 n-llCI). Zellen wurden mit 0,9'\,lger NaCl-Lösung brühe aufwies. Zu dieser Suspension wurden O,125l\. 6-Amlnopenlclllansäure der Bloassay-Methode gemessen wurde, die Bacillus subtllls PCI 219 verwendet und In »Antibiotics & Chemo 0,06 40 (mg/ml)
Das NMR-Spektrum dieses Esters Ist mit ( hydrochlorld und 0.2'\> Toluol gegeben. therapy» 3, 1953. 50-54 beschrieben lsi. Die Ergebnisse sind In der Tnhelle I genannt* 0,24 Kulturbrühe Zeit der 9,0 6,2 1 <0,01
Tabelle 1 0.35 enzymatischen 2 <0,01 |v
Inkubationszeit 0,52 Reaktion (Std.) 4 <0,01
Jem des Dl.-l-Cyclohexenylglyclnniethylesters Identisch. Versuch 2 9,0 6,2 1 <0,01
Versuchsberlchi und die enzymatlschen Reaktionen, 2 <0,01
Versuch 1 15 5 <0,01 .'I)
30 8,7 5,6 1 0,24
45 2 <0,01
In Übereinstimmung mit der Beschreibung des Beispiels 2 der OE-PS 2 43 986 werden 50 ml eines Kulturme 60 ■ 5 <0,01
diums, das 2,0% Malsquellwasser und 0,2'\ 9,0 4,1 1 <0,01
Die Kultivierung der Mikroorganismen 2 <0,01
der DE-OS 19 45 607 beschrieben sind, \ 5 <0,01
Beispiele. Die Ergebnisse sind In Tabelle 2 8,9 gutes 1 < 0,01 .1»
Tabelle 2 Wachstum 2 <0,01
Beispiel Mikroorganismus 6 <0,01
No. 8,2 gutes 1 <0,01 1>
Wachstum 2 <0,01
6 <0,01
1 Pseudomonas 0,61
sp. ATCC 21284 <0,01 41)
<0.01
2 Kluyvera. citrophila
ATCC 21285
45
3 Kluyvera citrophila
ATCC 21285
4 Rhodopseudomonas 50
spheroides
ATCC 21286
Microcoocus ureae
ATCC2L288 SS
5 Streptomiyces
phaeochromogenes
ATCC 21289 60
Nocardia globerula
ATCC 21292
65
Tabelle 2
Beispiel Mikroorganismus No.
Kiillvirtmihc
Pll
O.D.'
Zeil der Menge der
cnzymulischen gebildeten n-umino-
Reaktion (Std.) bcruylpcnicillin**)
(mg/ ml)
I 0,02
2 0,02
6 < 0.01
1 <0,01
2 <0.01
6 <0,01
Pseudomonas aeruginosa ATCC 15246
Arthrobacter simplex
ATCC 15799
8,0
7,9
6.3
5,4
♦) optische Dichte hei MH) ιημ **) gemessen nach der Hioassay-Meltunle £cni;iM Versuch 1
V CI'SÜLII .»
Nach u"er In Versuch 1 beschriebenen Methode wurden die In Tabelle 3 aufgerührten Mikroorganismen kultiviert, um Kulturen zu erhi-lten. die die In Tabelle 3 angegebenen optischen Dichten bei 600 ηιμ aufwiesen.
Unter Verwendung der so erhal'enen Mikroorganismen wurde 6-Amlnopenlclllansüure mit D-Phenylglyclnmethylester In Gegenwart von Phenylessigsäure unter folgenden Reaktionsbedingungen umgesetzt:
Für die In der Erfindung offenbarten Mikroorganismen wurde eine Mischung verwendet, die 0,50% 6-Amlnopenlclllansilure. eine iiqulmolare Menge (0,47'\.) D-Phenylglyclnmethylesterhydrochlorld. eine üquimolare Menge (O.32'\O Phenylessigsäure und die Mlkroorganlsmenzellen In einer Konzentration enthielt, die eine 5fache optische Dichte von der der Wachslumskultur In einer 0.2molaren Cllrat-Phosphat-Pufferlösung om pH 5.5 aufwies, und diese Mischung wurde !20 Minuten bei 37° C bebrütet.
Wahrend der Bebrütungszel'.en wurden die Mengen an jr-Amlnobenzylpenlclllln und/oder Penicillin G. die gebildet wurden, gemäß der Bloassay-Methode unter Verwendung von Bacillus subtllis PCI 219, wie In »Antibiotics & Chemotherapy« 3. (1953) 50-54 beschrieben, gemessen. Die Ergebnisse sind In Tabelle 3 dargelegt.
Tabelle 3 optisehe Dichte Zeit der Menge d. gebildeten Penicillin pH nach der 20
Mikroorganismen bei 600 πιμ der Inkubation Verbindung (mg/ml) G Inkubation
Wachstumskuliur (Minuten^ a-Amino-
benzyl- 0,00
penicillin 0,00
6,00 15 > 1,00 0,00
Acetobacter sp. 30 > 1.00 0,00
IFO 13209 45 > 1,00 0,00
60 > 1,00 0,00
90 > 1,00 0,00
120 >1.00 0,00
4,80 15 >l,00 0.00
Hycoplana 30 >l,00 0,00
dimorpha 45 > 1.00 0,00
IFO 13213 60 > 1,00 0,00
90 > 1,00 0,00 5,30
120 >l,00 0,00
6,20 15 > 1,00 0,00
Xathomonas sp. 30 > 1,00 0,00
IFO 13215 45 >1.00 0,00
60 > 1.00 0,00
90 > 1,00 0,00
120 >l,00 0,00
3,90 15 >1.00 0,00
Protaminobacter 30 >1.00 0,00
alboflavus 45 > 1.00 0.00
IFO 13221 60 >l,00 0.00 5,09
90 >l,00
120 >l,00
4,90
5,

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verfahren zur Herstellung von Amlnopenleillinen der Formel
    NH2 S
    R—CH-CONH
    in der R ein sechsgliedriger cyclischer Kohlenwasserstoff Ist, der an seinem Ring einfach oder mehrfach substituiert ist, wobei die Substituenten Hydroxylgruppen und/oder Halogenatome sind durch Umsetzen von 6-Aminopenicillansäure mit einem ^-substituierten jr-Aminosäurederlvat der Formel
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