JPS59183688A - Ｌ−アスパラギン酸の製法 - Google Patents
Ｌ−アスパラギン酸の製法Info
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- JPS59183688A JPS59183688A JP58057229A JP5722983A JPS59183688A JP S59183688 A JPS59183688 A JP S59183688A JP 58057229 A JP58057229 A JP 58057229A JP 5722983 A JP5722983 A JP 5722983A JP S59183688 A JPS59183688 A JP S59183688A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
本発明は西了スパルターゼ活性を有するセラチア属に腐
する新蜆微生物及ｒト当該微生物を用いるＬ−アスパラ
ギン酸の公法に関す２）。 従来、セラチーｒ・マルセッセンスがアスパルターゼ活
性を有しており、この微生物を用いてフマール酸アンモ
ニウム（又はフマール酸とアンモニウム塩）からＬ−ア
スパラギン酸を酵素的（こ装造する方法が知られている
（特公昭５４”−Ｌ２５５３号、特公昭５７−１８８、
ｉ７号）。しかしながら上記方法で用いら２′している
セラチγ・マルセソセンスのアスパルターゼ活性（、ト
工業的に充分調足し、得るほどに高いとは云えないとい
う問題があった。 かかる状況に鑑み本発明者らは鋭意研究を爪ね１こ結果
、セラチア属に属する微生物の有す、ｈアスパルターゼ
活性を司る染色体フラグメントを切り出し、これをプラ
スミドに組み込んだのち、セラチγＩＧ：Ｓ 微生物＋
こ移入する。所謂セルフクローニンク４こより親株に比
して極めて高いアスパルターゼ活性を有する微生物を調
製すること齋こ成功すると共に、かくして得られる微生
物を用いればＬ−アスパラギン酸を極めて効率よく製造
しうＺ）ことを見出し本発明を完成するに至った。 穎 即ち２本発明はセラチア属に腐する微労物から採取し１
こアスパルターゼの遺伝情報を担うデオキシリポ核酸を
プラスミドに組み込んだハイブリッドプラスミドをセラ
千了属に属ｌ−る微ｔＥ吻（ご含有せしめた微生物及び
該微生物の培養液、該培養紋から採取した菌体もしくは
該菌体の処理粉をフマール酸ト了ン七ニアに作用さぜる
ことを特徴とＴるＬ−アスパラギン酸の製法である。 〔本発明微生物の調製法〕 本発明に８いてアスパルターゼの遺伝・１，１報を担う
デオキシリボ核酸
する新蜆微生物及ｒト当該微生物を用いるＬ−アスパラ
ギン酸の公法に関す２）。 従来、セラチーｒ・マルセッセンスがアスパルターゼ活
性を有しており、この微生物を用いてフマール酸アンモ
ニウム（又はフマール酸とアンモニウム塩）からＬ−ア
スパラギン酸を酵素的（こ装造する方法が知られている
（特公昭５４”−Ｌ２５５３号、特公昭５７−１８８、
ｉ７号）。しかしながら上記方法で用いら２′している
セラチγ・マルセソセンスのアスパルターゼ活性（、ト
工業的に充分調足し、得るほどに高いとは云えないとい
う問題があった。 かかる状況に鑑み本発明者らは鋭意研究を爪ね１こ結果
、セラチア属に属する微生物の有す、ｈアスパルターゼ
活性を司る染色体フラグメントを切り出し、これをプラ
スミドに組み込んだのち、セラチγＩＧ：Ｓ 微生物＋
こ移入する。所謂セルフクローニンク４こより親株に比
して極めて高いアスパルターゼ活性を有する微生物を調
製すること齋こ成功すると共に、かくして得られる微生
物を用いればＬ−アスパラギン酸を極めて効率よく製造
しうＺ）ことを見出し本発明を完成するに至った。 穎 即ち２本発明はセラチア属に腐する微労物から採取し１
こアスパルターゼの遺伝情報を担うデオキシリポ核酸を
プラスミドに組み込んだハイブリッドプラスミドをセラ
千了属に属ｌ−る微ｔＥ吻（ご含有せしめた微生物及び
該微生物の培養液、該培養紋から採取した菌体もしくは
該菌体の処理粉をフマール酸ト了ン七ニアに作用さぜる
ことを特徴とＴるＬ−アスパラギン酸の製法である。 〔本発明微生物の調製法〕 本発明に８いてアスパルターゼの遺伝・１，１報を担う
デオキシリボ核酸
本発明に係る微生物は前述の如く親株（こ較べて顕著昏
こ漫７几１こ７スパルターセｆ占゛ｉ生・ｅ・）イして
いる・υで、讃敗生物そ「目いてフマール分と・−′ノ
日ニアからＬ−アスパラキンＣｕを好；Ｊ、 ＩＣ、ｊ
４ｊ ｒ−することができる。 即 ら 、 不発゛・月（こ°ぺる 散生ぺ勿の」ｄ、
１ド改、１、亥ｊ音ａ ｔａ力１ら採取し７．：菌体Ｔ
、Ｌ ＜ ｊ’：Ｌ該閑・木の処、Ｐ物・２）”７一ル
酸トアノモニＴｇｃ作・１］さｆることｌこ工すＴ、
−７スパラギン酸を製造することかＣきる。 本発明に係る微生物を倍養する：こ１；ユクシて・：ま
炭素源９Ｍ素源、有澄栄朗、療、２；；ε・ニアχ・」
、ミ；Ｊノ、ｆどを含む、由常の栄（１（培地が更用で
きも。培メ；を宵、・１超・こよりｉテｊτうことかで
き、め」えは培地の、Ｈを５．０−・９．０に調整し、
微生物を後述し亡の；も１０〜４５℃、好ましくは２８
〜３７℃で好気的（こ培迷す、ｊＬはよい。又、−ヒー
己培上也（こぢいてＬ−アスパラキンＩｎ ’ａ？ ａ
ｘ水素源宗索源として用１−ハることかで火そ・１つし
３σ）添加員は約０．１〜５石で１＋：１ろυ）が選嶺
である。 酵素反応に：”：ｘ シてｆ′ｓ上記の引］＜シて叫ら
７する培養液のほかに該培養、１文カ）ら採Ｔメ（７１
こｉ貞体、該菌体の処理物をも用いることができ、ここ
）こ菌体の処理物としては例えば洗浄菌体。乾燥菌体。 菌体磨砕物。菌体の自己消化物、菌体の超音波処理物。 菌体抽出物又はこれらをゲル抱括法や吸着法等のそれ自
体公知の固定化方法により固定化したものがあげられる
。固定化したものの具体例としては菌体等を例えばポリ
アクリルアミドゲル、含硫多糖類ゲル（カラギーナン、
ファーセレラン等〕。 コラーゲンゲル、アルギン酸ゲル、ポリビニルアルコー
ルゲル、寒天ゲルで固定化したものがあげられ、ポリア
クリルアミドゲルによる場合は例えば特公昭５３−１８
３１号記載の方法により９又。含硫多糖類による場合は
例えは特開昭５３−６す ４８３号記載の方法Ｏこよネ固定化することができる。 コラーゲンゲル、アルギン酸ゲル、ポリビニルアルコー
ルゲル、寒天ゲル等による場合も９例えば特開昭５１−
１４４７８０号、特開昭４９−３０５８２号、特開昭４
９−８０２８５号、特開昭５１−１３３４８４号記載の
方法に従って固定化することができる。 基質たるフマール酸とアンモニアは種々の形で反応系に
供給することができ１例えばフマール酸アンモニウム塩
として供給してもよく９更にはフマール酸もしくはその
塩と無ジぬアンモニウム塩として供給してもよい。 フマール酸塩としては例えはフマール酸ナトリウム、フ
マール酸カリウムを好適に用いろことがでキ、無機アン
モニウム塩としては例えば塩化アン七ニウム、硫酸アン
モニウム、リン酸アンモニウム又はこれらの混合物を好
適に用いることができる。 フマール酸もしくはその塩と無機アンモニウム塩を用い
る場合には、これら２成分のモル比は１：１．５〜１：
２の間にあるのがＪ罰当である。 酵素反応は約５〜５０℃の広い温度範囲で実施すること
ができるが微生物の酵素の安定性を考慮して２０〜４５
℃で実施するのが好ましい。又。 酵素反応に際してそのｐＨは６〜ｌＯとなるよう実施す
るのが好ましい。尚、上記酵素反応に際してはカルシウ
ム、マグネシウム、マンガン、ストロンチウム等の２価
金属イオンを添加するのが好ましい。これらの２価金属
イオンの濃度は０，１〜１０ミリモル程度でよく、これ
により酵素の安定性を高めることができる。 反応は微生物菌体を用いる場合にはバッチ法で実施する
のが好ましく、培養後集菌した微生物菌体を前記した如
き基質溶液にけん濁しかくはんすることによってＬ−ア
スパラボン酸が生成する。 又、固定化微生物を用いる場合の反応は固定化微生物が
水に不溶性であるため９バツチ法によるのみならず９カ
ラム法（こよって連続的に実施することもできる。例え
ば固定化微生物をカラム（ど充填し、このカラムに基質
溶液を適当な速度で流下すれば、Ｌ−アスパラギン酸の
みを含む流出液が得られる。またバッチ法による場合は
基質溶液に固定化微生物をけん濁させ、かくはんするこ
とによってＬ−アスパラギン酸が生成する。この場合に
は反応終了液から固定化微生物を口過或いは遠心分離す
ることにより取得す２％ば再びこｎを反覆使用すること
ができる。上記反応を実施するにあたっては反応進行率
は微生物の量、温度０反応時間。 基質の流速（（ｐ＋ｆに線速度）ぞの・境により影響さ
２する。例えば、カラム法（こよる場合６４便川用ろ固
定化微生物の嘴（こ従い基質溶液の流下速度を、またバ
ッチ法による場合はその反応時間を適当に調整するここ
により反応進行率を１００％ｌこまで高める至適条件を
見出すことも容易である。 かくして反応腹中に生成蓄＃ｎ シｒコＬ−了スパラギ
ン酸の分ｉｉ！ｉ！：精製は。、・１當のイｌン交換樹
脂法りその他の公知方法を組合せて容易（こ行なうこと
ができる。 以上の如く本発明に係る微生物は従来知らｎているセラ
チγＩＪ４微生物の可するアスパルターゼ活性より格段
に高いアスパルターゼ活性を有し、かかる高アスパルタ
ーゼ活性の微生物を柑いることにより工業的に極めてイ
イ利にＬ−アスパラギン酸を製造し得る。 以下、実施例により本発明を更に評λ１１１１こ説明す
る。 尚、 実施例巾のアスパルターゼ活性は０．〕Ｍフマル
酸アンモニウム（ｐＨ８，，７、］ ｍ ＩＡ塩化マグ
ネシウム含符〕と菌体又は菌体処理物とを接触させ、３
７℃で１時１ｉ−＋］反応後反応液中θ）Ｌ−アスパラ
ギン酸ヲロイコノストック・メセンテＩコイデス２６０
を用いるバイオアッセイ法［Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅ
ｍ。 、、］７２．１５（１９４８）、］÷こよ；′）測定し
た。 実施例１ （１）染色体Ｄ Ｎ Ａの調製 セラチア・マルセンセンスＳｒ ４１をｌ ｌ （１）
Ｌ −ブロス（ペプトン１％、酵母エキス０．５％、
塩化ナトリウｌ−０，５％ 、塩化ナトリウム０．５％
、ｐＨ７゜諌 ２）に接接し、３０℃で４時間振どう培養し対数増殖期
の菌体を運心分Ｊ離により集め１こ。己の１体をリゾチ
ーム処理、 Ｓ ｉ） Ｓ処理してｔ３ ｒａ Ｌ 、
フェノール処理により除蛋白したのちエターノール処理
して染色体ＤＮＡを沈殿させ１こ。ついで゛癌性により
染色体ＤＮＡを抽出￥１腎製すること′こより染色体Ｄ
Ｎ Ａ ２，８２ｎ！ヲ得た。 （２） プラスミドＩＩＮＡの調製 でラチア番マルセッセンスＳｒ４］をＬ−ブロス５０＋
＋＋１に接種し、３０℃で振とう培養して対数増体を氷
冷したＯ、１Ｍ塩化マグネシウム溶ｔｙ ５０ 、ｎｔ
にけん濁したのち集菌し、氷冷した０、１Ｍ塩化力ん ルシウム−０，５Ｍショ糖溶液２５ｉ（こけ−４＝％シ
た。０℃で３０５＋間放置したのち集菌し、水冷したけ
ん濁した。このけ、ん濁液０．２−にエシエリシ了・コ
リに−１２から採取したプラスミドｐＡＣＹＣ１７７の
Ｄ Ｎ Ａ ｌ 、＃を加え、０℃で１時間放置した。 ４２℃で２時間処理したのちＬ−ブロス２ｄを加え３０
℃で９０分間培養した。この培養孜０．４ 、ｎｌをア
ンピシリン５００ ｐＶ＋ｎｘ を含むＬ７ブロス寒天
培地に塗布し、３０℃で１日培養した。 生じたコロ；−を釣菌・分離することにより、ｐＡｃｙ
ｃ１７７を含！するセラチア・マルセツセンス５ｒ４１
を得た。 このｐＡｃＹｃ１７７を含有せしめたセラチア・マルセ
ッセンス５ｒ４１を１１のＬブロスに接種して３０℃で
１８時時間上う培養した後、菌体を遠心分離により集め
た。ついで該菌体をリゾチーム処理、ＳＯ８処理により
溶菌させ、最終ＩＭになるよう３こ塩化ナトＩＪウムを
加えた後、’ １００，０００ｘ７．３０分の遠心分離
を行なった。上清を採収し、フエ／−ル処理した後エタ
ノールを加えＤＮＡを遠心分離により集めた。沈殿し１
こＤＮＡを１０ｍ、Ｍトリス−１９７ＬＭ Ｅｉ Ｄ
Ｔ Ａ （ＰＨ７，ｂ ）に溶解し、塩化セシウム・エ
チジウムブロマイド平衡密度勾配遠心法（こよりプラス
ミドＤ Ｎ Ａを５１精製した。かくして０．５ｎＭｉ
（７）ｐＡｃＹｃ１７７プラスミドＤＮＡを得た。 （３） ハイブリッドプラスミドの調製上記（１）で
得た染色体ＤＮＡＩＱμノ２．２）で向１こプラスミド
ＤＮＡ５μ７の各々に制限エンドヌクレアーゼＥｌ １
ｎａｌ［を通常の条件で作用させＤＮＡ鎖を完全（こ切
断した。１５′℃、１０分間の熱処理険１両反応欣を混
合しＴ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼを通常の条件下
で作用させてＤＮＡ鎖を連結させた。 （４） ハイブリッドプラスミドによる形質転換ｔａ
ｉ セラチア・マルセッセンス５ｒ４１を文献〔Ｍｏ
１ｃｃ、Ｇｅｎ、ＧＯｎ９ｔ、 、 １２４ 、
１ ９ ７ （］ ９ ７ ３） 、Ｍｏ１ａ
ｃ、Ｇｅｍ、Ｃｎｎｅｔ、 、 １５２ 、 ６
５ （１９７７）〕記記載法に準じて変異誘導処理
して細胞外ヌクレアーゼ欠＋ｆｆｌ ７％。制限ユーン
ドヌクレアーゼ欠損性の反異株を調製し。ついでこの変
異株をＮ−メチル−Ｎ′−二計ローエ）−ニトロングア
ニジンで変異誘導処理し、アンピシリン５μぴ／−を含
むＬ−フｏ ス寒天培地ｉこプレートあたｎ約１００コ
ロニーが生じるように・衾布し１こ。３０℃で１日培養
し１このち、生じたコロニーのうちで小ｇいコロニーを
釣菌・カー惟して細胞外ヌクレアーゼ欠損性。 制限エンドヌクレアーゼた旧りかつアンビンリン感受性
の変異株を得た。この菌、体をＬブロス５０ｒｎｔｌこ
接種し、３０℃で振どう培養しその対数増殖期中期まで
主筒せしめた菌体を淋菌した。ついで水冷した０、 １
Ｍ 塊化マグネシウムｍ 孜５０ ｒａｔ ｋこけん
蜀したのちＪ［し、水冷しｒ：０．１”Ａ化カルシウム
−０，５’ Ｍショ糖溶液２５ｍ１にけん濁した。０℃
で３０分間放置しπのち集菌し、水冷した０、 １Ｍ塩
化カルシウム−〇、５Ｍシヨ薄５ｄにけん濁液た。この
細胞けん虫）液に（３）で得たＤＮＡ溶液を力ｒえて３
０分間水冷した後、４２℃で２分間熱処理すること：こ
よってＤＮＡを細胞内にとりこｔｔ＝ ｒ：。ついでこ
のけん濁液＋ｃＬブロス５０−を加え３０℃で２時間帳
とう培養した後、培養液の少梃をＬブロス寒天培地（ア
ンピシリン５０μグ／４．寒天１．５％含有）に塗布し
、３０℃で２４時間培養した。生シたコロニーのうちア
ンピシリン耐性、カナマイシン感受性のものをハイブリ
ッドプラスミドによる形質転換株として得た。かくして
得らｎた形質転換株をＬ−ブロス１１！で培養したのち
（２）と同様にしてハイブリッドプラスミドＤＮＡを採
取した。 （ｂｌ コノＤ Ｎ Ａ ヲエシエリシ丁・コリに−
１２からＮ−メチル−Ｎ／−ニトロ−Ｎ−ニトロングア
ニジンで変異誘起処理して得らｎ、るアスパルターゼ欠
損性変異株ＴＫ２３７に（４）と同様にしてとりこませ
、培地（Ｌ−グルタミン酸１＜、リンｅ第二カリウム０
．７％、リン酸第−カリウム０．３％、硫酸アンモニウ
ム０．１＜、ｆｆｌ酸マグネシウム・７水和物０．０１
％。寒天１．５％、アンピシリン２５μ７β）上に塗布
して３０℃で５日間培養し、形質転換株を得た。この形
質転換株を（２）と同様に処理してハイブリッドプラス
ミドＤＮＡを調製した。 ｔｃ＋ かくすること番こより得られたノｈイブＩＪ
・ンドプラスミドＤＮＡとセラチア・与ルセ・ンセンス
５ｒ４１を上記＋ａ＋と同様に処理して形質転換株を調
製し、アンピシリン５００μｐｚＷを含むＬブロス寒天
培地で培養することにより了スノ櫂ルターゼの遺伝子を
有するハイブリッドプラスミド（ｐＴＡ５０１〕を含み
高子スパルターゼ活性を有する形質転換株セラチア・マ
ルセツセンス’Ｉ’Ａ３００１（微工研菌寄第’？０１
冒号〕をｉ８１こ。 上記で得られたセラチア・マルセ・ソセンスＴＡ５００
１と原株セラチア・マルセ・ンセンス５ｒ４１のアスパ
ルターゼ活性を測定した。その結果は下記第１表に示す
通りである。 第 １ 表 上記第１表から本発明の微生物セラチア・フルセラセン
スＴＡ５００１ｉま原株几るセラチア・マ）Ｌｒセツセ
ンス５ｒ４１に比べ約８倍のアスパルターゼ活性を有す
ることが明らかである。 実施例 ２ は） プラスミドＤＮＡの調製 実施例１−（２＋に忘いてプラスミドｐＡＣＹＣ１７７
に代えてｐＢＲ３２２を用い、以乍同様にして処理する
ことによりプラスミドＤＮＡｐＢＲ３２２０，８ｑを得
たつ他方、実施しく１１で得たでラチア・フルセラセン
スＴ Ａ ５００１を°Ｊ５施例］−ｔ２１と同様ζこ
して処理することによりプラスミドＤ ＮＡ ｐＴ Ａ
５’０１ ０．６・ｊ’Ｊを得π３゜（２） ハイ
ブリッドプラスミ ドのＡ製上記（１）テ得りｐ Ｂ
Ｒ３２２５μ＠トＰ Ｔ Ａ ５０１させて両プラスミ
ドＤＮＡ鎖を切断した。６５℃、１０分間の熱処理後１
両反応液を混合しＴ４ＤＮＡ ＩＪガーゼを４常の条件
下で作用させてＤＮＡ鎖を連結させた。 （３） ハイブリッドプラスミド（こよる形質転換実
施例１ｉ４）と同様）こしてセラチア・フルセラセンス
５ｒ４１を（２）で得たＤ Ｎ Ａ 、ｇ欣で形質転換
し、アンピシリン５００μノ／ｄを含むｂブロスｉｆｃ
天４地を用いて生育する菌株を採取し商アスパルター
セ活性を有する微生物を選択することによりアスパルタ
ーゼの遺伝子を有するハイフリットプラスミド（ｐ ’
Ｌ’ Ａ ５０２ ）を含み高子スパルターゼ活性を有
する形質転換株セラチア・フルセラセンスＴＡ５００２
（ｆｆｉ工ｔｉＪ［”７０１６号）を４７’、＝。 上記で得らｎたセラチア・フルセラセンスＴＡ５００２
と原株セラチア・フルセラセンス５ｒ４１ノアスパルタ
ーゼ活性を測定した。その結果は下記第２表に示す通り
である。 第２表 （培地：実施例１で用い１こものと同一組成〕上記第２
表から本発明の微生物セラチア・フルセラセンスＴ Ａ
５００２は原株たるセラチア・フルセラセンス５ｒ４１
に比べ約２１倍のアスパルターゼ活性を有することが明
らかである。 又、セラチア・フルセラセンスＴＡ５００２のハイブリ
ッドプラスミドｐＴＡ５０２を抽出し。 制御層エンドヌクレアーぜＥ（・ｏＩｉｒ：とＳａｌ
Ｉで同ＲにＤＮＡ鎖をＩＪＪｉｆｕ、ｙこ。生じ）でＩ
Ｊ Ｉ〜Ａ析片を１盾のアガロースゲル′［：ｉｉ′Ａ
泳＠法で調へｒこ。その結果。 ｐＴＡ５０２！才ＰＢ ｌ（３２２プラスミドＤＮＡを
ｇｃｏＲ■とＳａｌ Ｔで切断して生じる大きいガのＤ
ＮＡ！祈片とｐ Ｔ Ａ ５ （１１由来のＤ Ｎ Ａ
断ｍｌと７））ら１戊ることかわかった。 実施例 ３ 巾 フマール酸アンモニウム３％。リン９！１力ＩＪ
ラム０．２％、（流管マグネシウム・７水和Ｑ勿０゜ト ０５％、コーンスチープリ力−４％、ミースイ２％を含
む培地（ｐＨ７，０）５００ｍｌ＋こセラチア・フルセ
ラセンスＴＡ５００１を［ｆｆ菌り、３０℃で１８時間
振とう培養した。培養液を遠心分ｌｉｔ Ｌ得らｎる生
菌体を生理食塩水にけん制した。つぃでこの菌体けん濁
液１２−（湿菌体６グ含有）と予め３７℃に保温しｙ：
３． ’２ ＜ゲニューゲルＷＧ４コペンハーゲンペ
クチンファクトリー社製のカラギーナン）水溶液４８ｍ
１．を加えてよく混合しにのち。 混合物を１Ｍ７マール酸アンモニウム／ｋ ｍ ｙ（＆
（ｐｉ−１８、５ 、１ｍ＋Ａ塩化マグネシウム含有
）牢番こ滴下することにより球状ゲル（ｌ′ｉ！径約３
ｍｍ）のアスパルターゼ活性を有する１司定化セラチア
、マルセッセンス５９．６Ｆ（湿重Ｍ〕を得た。この固
定化菌体１７の°Ｔアスパルターゼ活性１０５８．３
μｍｏｌｅ／ｈ、ｒであった。 （２）上記（１）で得られた固定化セラチア・マルセッ
センス６０ｇを外套管付きカラム（４Ｃ１１ｌ Ｘ ８
ｒ、ｒａ）につめ、３７℃にて４８時間インキュベー
ションして活性化（アスパルターゼ活性１５８２，００
Ｑ ｐ ｎ＋ｏｌｅ／／１７− ）後、同温度にてＩＭ
フマール巖アンモニウム溶液（ｐＨ３，５，］ｍＭ塩化
マグネシウム含有）１０００．．１１を１５０ｍｔ／ｒ
、ｒの流速で導通した。 流出液をｐｉ（２，８に調整することによりＬ−アスパ
ラギンｆ竣１２７グを得几。 実施例４ （１） 実施例３とｌＯ１様にして培養して得らｎｆ
こセラチア・マルセッセンスＴＡ５００’２の菌体８ｙ
−を生畦的食塩水５ｒｎ１にけん制し、これを予め４０
”Ｃニ保温ｔ、た２、２％ゲニューゲルＷ Ｇ （コペ
ンハーγンペクチンファクトリー社−専のカラギーナン
） 水Ｐａ ７’ｌ （１％ローカストビーンガムｋＭ
）８０７Ｉ＋７！をＱｏえて混合しｌこ。このｌ見合、
伎２冷却してゲル化させ、さらシこ２％騙化力・ｊラム
水溶＋ｌｔ ２５０ ｒＪを静かに加え３０分間静置し
１こ。得られるゲルを１辺３調のＣｒ一方体に成型し２
％塩化カリウム水溶液で洗浄した。得られるゲル９０．
１Ｖを冷エタノール１００−に浸、ｌコしこノｔ、こグ
ルタルアルデヒドを最終Ｇ度０．４９％になるよう；こ
加え。水冷下に１５か間静電して硬化処珪を行なった。 ついでゲルをろ取し２％塩化カリウム水ｒイｆ１５．で
洗浄すること（こよりアスパルターゼ活性を有する固定
化セラチア・マルセソセンス８５．０＆ＣＦＭ改貧）を
得た。こ２） ｔＭ］定化定休菌体１７スパルターゼ活
性は８４９８０１１Ｉｎ０１８／ｈｒであツ７Ｌ。 １：２） 上記（１）で得られた固定化ぎラチ了・マ
ルセッセンス１１１そ外套管付きカラム（１，６Ｃ−Ｉ
ｎ＞’、１２ ｃｍ ） ｉこ充填し３７℃（こてＩＭ
フマール酸アンモニウム水溶ｎｌ （ｐｉ−１８，５、
１−４化マグネシウム含有〕を６／ｎＩＪ／１１１−の
流速で連続して暮通し適時サンプリングしてアスパルタ
ーゼ活性を測定することにより安定性を調べたところ１
４日間；：条ｉ後も活性の低下は認めら汎なかった。 実施例５ 実施例３と同様にして培養して得らｎｒ＝セラチア・マ
ルセッセンスＴＡ５００２のＩｎ体１０５’を０．０５
Ｍリン酸緩衝液（ｐ）１８．５）５０Ｊにけん濁し、９
ｋｃで１０ ＞を間音波処理を行なった。遠心分離し
て得られる上澄収３５−を弱塩基性陰イγン交換樹脂デ
ュオラ、イト−Ａ７（米国、ダイアモンドジャムロック
ケミカル社製）ＧＯｍｔを充填し１こカラムに５ｖ＝０
．７５で室温下、導油した。ついで０，１Ｍリン酸緩衝
欣（ｐＨ８，５） ３００ ｍｌと０．４％グルタルア
ルデヒド３００ｄを含むｌ容！佼で３０２チ開架橋し、
グルタルアルデヒドを十分洗浄して固定化酵素を調製し
た。該固定化酵素を５０．、ｒ容量のカラムＩこ充填し
ｌ ＞Ａフマール酸アンモニウム（ｐ）ｌ ８．５ 、
ｌ ｍｌ＋！ 塩化マグネソウム含有）５０Ｃ’ｎ！
。 を２５０ｍＡ／ｈｒの流速で導、」シた。流出液を合わ
せｐ）ｉ ２．８に調整したのち析出する結晶をろ取す
ること１こよ（・ツト−アスパラギン酸、）８．９を碍
た。 実施例 ６ −）乙うチア・１ルセッセンス°ｒ、 Ａ、 ５００１
を用いて実施図５とｉ’［４項（こして１−）られ１こ
上澄「イｋを硫安分画（３０〜５０１尤飽、・ｉ、Ｉ）
しソ°）らノしに沈ｊ段を水５ ｍｌ（こｍ ｉｊ）
したのち。水に対して一夜透析し透析内硬を酵素液（ア
スパルターゼ４．１７品１どし１こ。この酵素液２−を
３．２％々゛二つ、−ゲル“／７ Ｇ ７Ｊ（客８反１
２＋Ｊと３７℃θ） ？ｍ ｌ６中（こて：ｙ、＊２合
しブこ。こθ〕ＩＪ％合、ｌαを２５Ｃ塩化カリウム水
溶、：フ中に、・４ドぐることにより球状ゲル（直径約
３）Ｒ〕を７８７−、−、。得ちれｆこ固定化アスパル
ターゼの活性：ｔ ２１３２０ μｍ０１ａ／ＩＬ７−
１５’ であった。 実施例 ７ フー？−ル酸了ンモニウム３％、リン酸”Ｅ’ １ ｈ
ｉラム０，２弘、硫酸マグネ／ラム・７水和物０．０
５％、コーノス千−プリカー４％、ミースト２ ｃｇｏ
’ｒ含む培地（ｐＨ７，０）ｓ Ｏｏｍｅ＋、：ニーｚ
−＞ｆｒ−マルセソセンスＴへ５００２をｊｌ−（菌し
３０℃で１８時間培養した。この培養液のｐＨイ、′：
γンモニ了水でｐｉ−１１３、５とし、７マール酸アン
亡ニウム６５ｆ！工５よびトリトンＸ−１００の５００
２グを添加してさらｔこ３７℃で５時Ｑｌ静置反応を行
なった。反応終了液をろ過、疏縮しｐＨ２，８に調整し
た。析出品をろ取することによりＬ−アスパラ１ニン酸
の粗結晶を得、ついでこれを水力−ら再結晶することに
よりＬ−アスパラギン酸４６．５９を得ｆこ。 し−−１ 自発手続補正書 昭和ぶど年７Ｊ４２７日 ３、 ｈｌｉ市をオろ者 ・Ｉｉ、 （／ｌとの関係 特許用Ｌｌ（ｉ大人１−シ
府大阪市東１メ、心修町ａ ｎ−＋２１番地（〒５４１
）（２９５） ＩＩＩ辺製桑株式会社 代表古松原一部 ・１８代理 人 大阪府大阪山淀川区＋；１１１ｉ鳴３ＴｉＪ１６番８９
弓（〒５３２９５、補止により増加する発明の数 補 正 の 内 容 １、明細書第１頁５行目乃至第２頁３行目の特許請求の
範囲を下記の通り訂正する。 「（１） セラチア属に属する微生物から採取したア
スパルターゼの遺伝情服を担うデオキシリボ核酸をプラ
スミドに組み込んだハイブリッドプラスミドをセラチア
属微生物に含有せしめた微生物。 （２） プラ囚ミドがｐＡｃＹｃｌ ７７である特許
請求の範囲第１項記載の微生物。 （３） プラスミドがｐＢＲ３２２である特許請求の
範囲第１項記載の微生物。 （４） セラチア属に属する微生物から採取し１こア
スパルターゼの遺伝情報を担うデオキシリボ核酸をプラ
スミドに組み込んだハイブリッドプラスミドを含有せし
めたセラチア属に属する微生物の培養液・該培養液から
採取した菌体もしくは該菌体の処理物をフマール酸とア
ンモニアに作用させることを特徴とするＬ−アスパラギ
ン酸の製法。 （５） フマール酸七了ンモニＹをフマール酸アンモ
ニウムとＬ７て１共・＠する・侍、、−Ｆ請求の範υｔ
Ｉ第４［Ｈｉｍｄ ｌｌｒ ｊを 「ｉ（ｉ＋ｌｄ ｆｉｔ Ｊ をこ訂旧ずろ。 ３、 同第６頁最下行の ［プ ラ ミ ド １ を 「プラスミド」 に訂正する。 喀、 同第１２筺下から２行目ｚ）） Ｉ Ｏ，］、 Ｍフマル、−７ψ１ を１’−ｌ、Ｑ
Ｍフマール酸」 ９こ訂正する１、５、同第１３頁１０
行目の ［塩化ナトリウム０．５％Ｊを削除する。 ６、同第１４頁１０行目の 「２時間」を 「２分間」 １こ訂正する。 ７、同第１６頁最下行の 「けん副成」 を 「けん詞し」 に訂正する。 ８．同第２２代６行目の （−ＤＮＡ断・乍」を １”ＤＮＡ断片」 ｔこ訂正する。 ９、同第２４頁１ｉｉ目の 「洗浄する１ を ［洗浄後基質溶液中で４８ｉｔ″？間インキユベーシゴ
ンして活性化する１ に打上す乙。 １０、 同第２４汀下から７行目末尾の「８」 を 「３」に訂正する。 １１、同第２５真下から２行目の ｒ２５０Ｊを ［２５ｊｌこ訂正する。
こ漫７几１こ７スパルターセｆ占゛ｉ生・ｅ・）イして
いる・υで、讃敗生物そ「目いてフマール分と・−′ノ
日ニアからＬ−アスパラキンＣｕを好；Ｊ、 ＩＣ、ｊ
４ｊ ｒ−することができる。 即 ら 、 不発゛・月（こ°ぺる 散生ぺ勿の」ｄ、
１ド改、１、亥ｊ音ａ ｔａ力１ら採取し７．：菌体Ｔ
、Ｌ ＜ ｊ’：Ｌ該閑・木の処、Ｐ物・２）”７一ル
酸トアノモニＴｇｃ作・１］さｆることｌこ工すＴ、
−７スパラギン酸を製造することかＣきる。 本発明に係る微生物を倍養する：こ１；ユクシて・：ま
炭素源９Ｍ素源、有澄栄朗、療、２；；ε・ニアχ・」
、ミ；Ｊノ、ｆどを含む、由常の栄（１（培地が更用で
きも。培メ；を宵、・１超・こよりｉテｊτうことかで
き、め」えは培地の、Ｈを５．０−・９．０に調整し、
微生物を後述し亡の；も１０〜４５℃、好ましくは２８
〜３７℃で好気的（こ培迷す、ｊＬはよい。又、−ヒー
己培上也（こぢいてＬ−アスパラキンＩｎ ’ａ？ ａ
ｘ水素源宗索源として用１−ハることかで火そ・１つし
３σ）添加員は約０．１〜５石で１＋：１ろυ）が選嶺
である。 酵素反応に：”：ｘ シてｆ′ｓ上記の引］＜シて叫ら
７する培養液のほかに該培養、１文カ）ら採Ｔメ（７１
こｉ貞体、該菌体の処理物をも用いることができ、ここ
）こ菌体の処理物としては例えば洗浄菌体。乾燥菌体。 菌体磨砕物。菌体の自己消化物、菌体の超音波処理物。 菌体抽出物又はこれらをゲル抱括法や吸着法等のそれ自
体公知の固定化方法により固定化したものがあげられる
。固定化したものの具体例としては菌体等を例えばポリ
アクリルアミドゲル、含硫多糖類ゲル（カラギーナン、
ファーセレラン等〕。 コラーゲンゲル、アルギン酸ゲル、ポリビニルアルコー
ルゲル、寒天ゲルで固定化したものがあげられ、ポリア
クリルアミドゲルによる場合は例えば特公昭５３−１８
３１号記載の方法により９又。含硫多糖類による場合は
例えは特開昭５３−６す ４８３号記載の方法Ｏこよネ固定化することができる。 コラーゲンゲル、アルギン酸ゲル、ポリビニルアルコー
ルゲル、寒天ゲル等による場合も９例えば特開昭５１−
１４４７８０号、特開昭４９−３０５８２号、特開昭４
９−８０２８５号、特開昭５１−１３３４８４号記載の
方法に従って固定化することができる。 基質たるフマール酸とアンモニアは種々の形で反応系に
供給することができ１例えばフマール酸アンモニウム塩
として供給してもよく９更にはフマール酸もしくはその
塩と無ジぬアンモニウム塩として供給してもよい。 フマール酸塩としては例えはフマール酸ナトリウム、フ
マール酸カリウムを好適に用いろことがでキ、無機アン
モニウム塩としては例えば塩化アン七ニウム、硫酸アン
モニウム、リン酸アンモニウム又はこれらの混合物を好
適に用いることができる。 フマール酸もしくはその塩と無機アンモニウム塩を用い
る場合には、これら２成分のモル比は１：１．５〜１：
２の間にあるのがＪ罰当である。 酵素反応は約５〜５０℃の広い温度範囲で実施すること
ができるが微生物の酵素の安定性を考慮して２０〜４５
℃で実施するのが好ましい。又。 酵素反応に際してそのｐＨは６〜ｌＯとなるよう実施す
るのが好ましい。尚、上記酵素反応に際してはカルシウ
ム、マグネシウム、マンガン、ストロンチウム等の２価
金属イオンを添加するのが好ましい。これらの２価金属
イオンの濃度は０，１〜１０ミリモル程度でよく、これ
により酵素の安定性を高めることができる。 反応は微生物菌体を用いる場合にはバッチ法で実施する
のが好ましく、培養後集菌した微生物菌体を前記した如
き基質溶液にけん濁しかくはんすることによってＬ−ア
スパラボン酸が生成する。 又、固定化微生物を用いる場合の反応は固定化微生物が
水に不溶性であるため９バツチ法によるのみならず９カ
ラム法（こよって連続的に実施することもできる。例え
ば固定化微生物をカラム（ど充填し、このカラムに基質
溶液を適当な速度で流下すれば、Ｌ−アスパラギン酸の
みを含む流出液が得られる。またバッチ法による場合は
基質溶液に固定化微生物をけん濁させ、かくはんするこ
とによってＬ−アスパラギン酸が生成する。この場合に
は反応終了液から固定化微生物を口過或いは遠心分離す
ることにより取得す２％ば再びこｎを反覆使用すること
ができる。上記反応を実施するにあたっては反応進行率
は微生物の量、温度０反応時間。 基質の流速（（ｐ＋ｆに線速度）ぞの・境により影響さ
２する。例えば、カラム法（こよる場合６４便川用ろ固
定化微生物の嘴（こ従い基質溶液の流下速度を、またバ
ッチ法による場合はその反応時間を適当に調整するここ
により反応進行率を１００％ｌこまで高める至適条件を
見出すことも容易である。 かくして反応腹中に生成蓄＃ｎ シｒコＬ−了スパラギ
ン酸の分ｉｉ！ｉ！：精製は。、・１當のイｌン交換樹
脂法りその他の公知方法を組合せて容易（こ行なうこと
ができる。 以上の如く本発明に係る微生物は従来知らｎているセラ
チγＩＪ４微生物の可するアスパルターゼ活性より格段
に高いアスパルターゼ活性を有し、かかる高アスパルタ
ーゼ活性の微生物を柑いることにより工業的に極めてイ
イ利にＬ−アスパラギン酸を製造し得る。 以下、実施例により本発明を更に評λ１１１１こ説明す
る。 尚、 実施例巾のアスパルターゼ活性は０．〕Ｍフマル
酸アンモニウム（ｐＨ８，，７、］ ｍ ＩＡ塩化マグ
ネシウム含符〕と菌体又は菌体処理物とを接触させ、３
７℃で１時１ｉ−＋］反応後反応液中θ）Ｌ−アスパラ
ギン酸ヲロイコノストック・メセンテＩコイデス２６０
を用いるバイオアッセイ法［Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅ
ｍ。 、、］７２．１５（１９４８）、］÷こよ；′）測定し
た。 実施例１ （１）染色体Ｄ Ｎ Ａの調製 セラチア・マルセンセンスＳｒ ４１をｌ ｌ （１）
Ｌ −ブロス（ペプトン１％、酵母エキス０．５％、
塩化ナトリウｌ−０，５％ 、塩化ナトリウム０．５％
、ｐＨ７゜諌 ２）に接接し、３０℃で４時間振どう培養し対数増殖期
の菌体を運心分Ｊ離により集め１こ。己の１体をリゾチ
ーム処理、 Ｓ ｉ） Ｓ処理してｔ３ ｒａ Ｌ 、
フェノール処理により除蛋白したのちエターノール処理
して染色体ＤＮＡを沈殿させ１こ。ついで゛癌性により
染色体ＤＮＡを抽出￥１腎製すること′こより染色体Ｄ
Ｎ Ａ ２，８２ｎ！ヲ得た。 （２） プラスミドＩＩＮＡの調製 でラチア番マルセッセンスＳｒ４］をＬ−ブロス５０＋
＋＋１に接種し、３０℃で振とう培養して対数増体を氷
冷したＯ、１Ｍ塩化マグネシウム溶ｔｙ ５０ 、ｎｔ
にけん濁したのち集菌し、氷冷した０、１Ｍ塩化力ん ルシウム−０，５Ｍショ糖溶液２５ｉ（こけ−４＝％シ
た。０℃で３０５＋間放置したのち集菌し、水冷したけ
ん濁した。このけ、ん濁液０．２−にエシエリシ了・コ
リに−１２から採取したプラスミドｐＡＣＹＣ１７７の
Ｄ Ｎ Ａ ｌ 、＃を加え、０℃で１時間放置した。 ４２℃で２時間処理したのちＬ−ブロス２ｄを加え３０
℃で９０分間培養した。この培養孜０．４ 、ｎｌをア
ンピシリン５００ ｐＶ＋ｎｘ を含むＬ７ブロス寒天
培地に塗布し、３０℃で１日培養した。 生じたコロ；−を釣菌・分離することにより、ｐＡｃｙ
ｃ１７７を含！するセラチア・マルセツセンス５ｒ４１
を得た。 このｐＡｃＹｃ１７７を含有せしめたセラチア・マルセ
ッセンス５ｒ４１を１１のＬブロスに接種して３０℃で
１８時時間上う培養した後、菌体を遠心分離により集め
た。ついで該菌体をリゾチーム処理、ＳＯ８処理により
溶菌させ、最終ＩＭになるよう３こ塩化ナトＩＪウムを
加えた後、’ １００，０００ｘ７．３０分の遠心分離
を行なった。上清を採収し、フエ／−ル処理した後エタ
ノールを加えＤＮＡを遠心分離により集めた。沈殿し１
こＤＮＡを１０ｍ、Ｍトリス−１９７ＬＭ Ｅｉ Ｄ
Ｔ Ａ （ＰＨ７，ｂ ）に溶解し、塩化セシウム・エ
チジウムブロマイド平衡密度勾配遠心法（こよりプラス
ミドＤ Ｎ Ａを５１精製した。かくして０．５ｎＭｉ
（７）ｐＡｃＹｃ１７７プラスミドＤＮＡを得た。 （３） ハイブリッドプラスミドの調製上記（１）で
得た染色体ＤＮＡＩＱμノ２．２）で向１こプラスミド
ＤＮＡ５μ７の各々に制限エンドヌクレアーゼＥｌ １
ｎａｌ［を通常の条件で作用させＤＮＡ鎖を完全（こ切
断した。１５′℃、１０分間の熱処理険１両反応欣を混
合しＴ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼを通常の条件下
で作用させてＤＮＡ鎖を連結させた。 （４） ハイブリッドプラスミドによる形質転換ｔａ
ｉ セラチア・マルセッセンス５ｒ４１を文献〔Ｍｏ
１ｃｃ、Ｇｅｎ、ＧＯｎ９ｔ、 、 １２４ 、
１ ９ ７ （］ ９ ７ ３） 、Ｍｏ１ａ
ｃ、Ｇｅｍ、Ｃｎｎｅｔ、 、 １５２ 、 ６
５ （１９７７）〕記記載法に準じて変異誘導処理
して細胞外ヌクレアーゼ欠＋ｆｆｌ ７％。制限ユーン
ドヌクレアーゼ欠損性の反異株を調製し。ついでこの変
異株をＮ−メチル−Ｎ′−二計ローエ）−ニトロングア
ニジンで変異誘導処理し、アンピシリン５μぴ／−を含
むＬ−フｏ ス寒天培地ｉこプレートあたｎ約１００コ
ロニーが生じるように・衾布し１こ。３０℃で１日培養
し１このち、生じたコロニーのうちで小ｇいコロニーを
釣菌・カー惟して細胞外ヌクレアーゼ欠損性。 制限エンドヌクレアーゼた旧りかつアンビンリン感受性
の変異株を得た。この菌、体をＬブロス５０ｒｎｔｌこ
接種し、３０℃で振どう培養しその対数増殖期中期まで
主筒せしめた菌体を淋菌した。ついで水冷した０、 １
Ｍ 塊化マグネシウムｍ 孜５０ ｒａｔ ｋこけん
蜀したのちＪ［し、水冷しｒ：０．１”Ａ化カルシウム
−０，５’ Ｍショ糖溶液２５ｍ１にけん濁した。０℃
で３０分間放置しπのち集菌し、水冷した０、 １Ｍ塩
化カルシウム−〇、５Ｍシヨ薄５ｄにけん濁液た。この
細胞けん虫）液に（３）で得たＤＮＡ溶液を力ｒえて３
０分間水冷した後、４２℃で２分間熱処理すること：こ
よってＤＮＡを細胞内にとりこｔｔ＝ ｒ：。ついでこ
のけん濁液＋ｃＬブロス５０−を加え３０℃で２時間帳
とう培養した後、培養液の少梃をＬブロス寒天培地（ア
ンピシリン５０μグ／４．寒天１．５％含有）に塗布し
、３０℃で２４時間培養した。生シたコロニーのうちア
ンピシリン耐性、カナマイシン感受性のものをハイブリ
ッドプラスミドによる形質転換株として得た。かくして
得らｎた形質転換株をＬ−ブロス１１！で培養したのち
（２）と同様にしてハイブリッドプラスミドＤＮＡを採
取した。 （ｂｌ コノＤ Ｎ Ａ ヲエシエリシ丁・コリに−
１２からＮ−メチル−Ｎ／−ニトロ−Ｎ−ニトロングア
ニジンで変異誘起処理して得らｎ、るアスパルターゼ欠
損性変異株ＴＫ２３７に（４）と同様にしてとりこませ
、培地（Ｌ−グルタミン酸１＜、リンｅ第二カリウム０
．７％、リン酸第−カリウム０．３％、硫酸アンモニウ
ム０．１＜、ｆｆｌ酸マグネシウム・７水和物０．０１
％。寒天１．５％、アンピシリン２５μ７β）上に塗布
して３０℃で５日間培養し、形質転換株を得た。この形
質転換株を（２）と同様に処理してハイブリッドプラス
ミドＤＮＡを調製した。 ｔｃ＋ かくすること番こより得られたノｈイブＩＪ
・ンドプラスミドＤＮＡとセラチア・与ルセ・ンセンス
５ｒ４１を上記＋ａ＋と同様に処理して形質転換株を調
製し、アンピシリン５００μｐｚＷを含むＬブロス寒天
培地で培養することにより了スノ櫂ルターゼの遺伝子を
有するハイブリッドプラスミド（ｐＴＡ５０１〕を含み
高子スパルターゼ活性を有する形質転換株セラチア・マ
ルセツセンス’Ｉ’Ａ３００１（微工研菌寄第’？０１
冒号〕をｉ８１こ。 上記で得られたセラチア・マルセ・ソセンスＴＡ５００
１と原株セラチア・マルセ・ンセンス５ｒ４１のアスパ
ルターゼ活性を測定した。その結果は下記第１表に示す
通りである。 第 １ 表 上記第１表から本発明の微生物セラチア・フルセラセン
スＴＡ５００１ｉま原株几るセラチア・マ）Ｌｒセツセ
ンス５ｒ４１に比べ約８倍のアスパルターゼ活性を有す
ることが明らかである。 実施例 ２ は） プラスミドＤＮＡの調製 実施例１−（２＋に忘いてプラスミドｐＡＣＹＣ１７７
に代えてｐＢＲ３２２を用い、以乍同様にして処理する
ことによりプラスミドＤＮＡｐＢＲ３２２０，８ｑを得
たつ他方、実施しく１１で得たでラチア・フルセラセン
スＴ Ａ ５００１を°Ｊ５施例］−ｔ２１と同様ζこ
して処理することによりプラスミドＤ ＮＡ ｐＴ Ａ
５’０１ ０．６・ｊ’Ｊを得π３゜（２） ハイ
ブリッドプラスミ ドのＡ製上記（１）テ得りｐ Ｂ
Ｒ３２２５μ＠トＰ Ｔ Ａ ５０１させて両プラスミ
ドＤＮＡ鎖を切断した。６５℃、１０分間の熱処理後１
両反応液を混合しＴ４ＤＮＡ ＩＪガーゼを４常の条件
下で作用させてＤＮＡ鎖を連結させた。 （３） ハイブリッドプラスミド（こよる形質転換実
施例１ｉ４）と同様）こしてセラチア・フルセラセンス
５ｒ４１を（２）で得たＤ Ｎ Ａ 、ｇ欣で形質転換
し、アンピシリン５００μノ／ｄを含むｂブロスｉｆｃ
天４地を用いて生育する菌株を採取し商アスパルター
セ活性を有する微生物を選択することによりアスパルタ
ーゼの遺伝子を有するハイフリットプラスミド（ｐ ’
Ｌ’ Ａ ５０２ ）を含み高子スパルターゼ活性を有
する形質転換株セラチア・フルセラセンスＴＡ５００２
（ｆｆｉ工ｔｉＪ［”７０１６号）を４７’、＝。 上記で得らｎたセラチア・フルセラセンスＴＡ５００２
と原株セラチア・フルセラセンス５ｒ４１ノアスパルタ
ーゼ活性を測定した。その結果は下記第２表に示す通り
である。 第２表 （培地：実施例１で用い１こものと同一組成〕上記第２
表から本発明の微生物セラチア・フルセラセンスＴ Ａ
５００２は原株たるセラチア・フルセラセンス５ｒ４１
に比べ約２１倍のアスパルターゼ活性を有することが明
らかである。 又、セラチア・フルセラセンスＴＡ５００２のハイブリ
ッドプラスミドｐＴＡ５０２を抽出し。 制御層エンドヌクレアーぜＥ（・ｏＩｉｒ：とＳａｌ
Ｉで同ＲにＤＮＡ鎖をＩＪＪｉｆｕ、ｙこ。生じ）でＩ
Ｊ Ｉ〜Ａ析片を１盾のアガロースゲル′［：ｉｉ′Ａ
泳＠法で調へｒこ。その結果。 ｐＴＡ５０２！才ＰＢ ｌ（３２２プラスミドＤＮＡを
ｇｃｏＲ■とＳａｌ Ｔで切断して生じる大きいガのＤ
ＮＡ！祈片とｐ Ｔ Ａ ５ （１１由来のＤ Ｎ Ａ
断ｍｌと７））ら１戊ることかわかった。 実施例 ３ 巾 フマール酸アンモニウム３％。リン９！１力ＩＪ
ラム０．２％、（流管マグネシウム・７水和Ｑ勿０゜ト ０５％、コーンスチープリ力−４％、ミースイ２％を含
む培地（ｐＨ７，０）５００ｍｌ＋こセラチア・フルセ
ラセンスＴＡ５００１を［ｆｆ菌り、３０℃で１８時間
振とう培養した。培養液を遠心分ｌｉｔ Ｌ得らｎる生
菌体を生理食塩水にけん制した。つぃでこの菌体けん濁
液１２−（湿菌体６グ含有）と予め３７℃に保温しｙ：
３． ’２ ＜ゲニューゲルＷＧ４コペンハーゲンペ
クチンファクトリー社製のカラギーナン）水溶液４８ｍ
１．を加えてよく混合しにのち。 混合物を１Ｍ７マール酸アンモニウム／ｋ ｍ ｙ（＆
（ｐｉ−１８、５ 、１ｍ＋Ａ塩化マグネシウム含有
）牢番こ滴下することにより球状ゲル（ｌ′ｉ！径約３
ｍｍ）のアスパルターゼ活性を有する１司定化セラチア
、マルセッセンス５９．６Ｆ（湿重Ｍ〕を得た。この固
定化菌体１７の°Ｔアスパルターゼ活性１０５８．３
μｍｏｌｅ／ｈ、ｒであった。 （２）上記（１）で得られた固定化セラチア・マルセッ
センス６０ｇを外套管付きカラム（４Ｃ１１ｌ Ｘ ８
ｒ、ｒａ）につめ、３７℃にて４８時間インキュベー
ションして活性化（アスパルターゼ活性１５８２，００
Ｑ ｐ ｎ＋ｏｌｅ／／１７− ）後、同温度にてＩＭ
フマール巖アンモニウム溶液（ｐＨ３，５，］ｍＭ塩化
マグネシウム含有）１０００．．１１を１５０ｍｔ／ｒ
、ｒの流速で導通した。 流出液をｐｉ（２，８に調整することによりＬ−アスパ
ラギンｆ竣１２７グを得几。 実施例４ （１） 実施例３とｌＯ１様にして培養して得らｎｆ
こセラチア・マルセッセンスＴＡ５００’２の菌体８ｙ
−を生畦的食塩水５ｒｎ１にけん制し、これを予め４０
”Ｃニ保温ｔ、た２、２％ゲニューゲルＷ Ｇ （コペ
ンハーγンペクチンファクトリー社−専のカラギーナン
） 水Ｐａ ７’ｌ （１％ローカストビーンガムｋＭ
）８０７Ｉ＋７！をＱｏえて混合しｌこ。このｌ見合、
伎２冷却してゲル化させ、さらシこ２％騙化力・ｊラム
水溶＋ｌｔ ２５０ ｒＪを静かに加え３０分間静置し
１こ。得られるゲルを１辺３調のＣｒ一方体に成型し２
％塩化カリウム水溶液で洗浄した。得られるゲル９０．
１Ｖを冷エタノール１００−に浸、ｌコしこノｔ、こグ
ルタルアルデヒドを最終Ｇ度０．４９％になるよう；こ
加え。水冷下に１５か間静電して硬化処珪を行なった。 ついでゲルをろ取し２％塩化カリウム水ｒイｆ１５．で
洗浄すること（こよりアスパルターゼ活性を有する固定
化セラチア・マルセソセンス８５．０＆ＣＦＭ改貧）を
得た。こ２） ｔＭ］定化定休菌体１７スパルターゼ活
性は８４９８０１１Ｉｎ０１８／ｈｒであツ７Ｌ。 １：２） 上記（１）で得られた固定化ぎラチ了・マ
ルセッセンス１１１そ外套管付きカラム（１，６Ｃ−Ｉ
ｎ＞’、１２ ｃｍ ） ｉこ充填し３７℃（こてＩＭ
フマール酸アンモニウム水溶ｎｌ （ｐｉ−１８，５、
１−４化マグネシウム含有〕を６／ｎＩＪ／１１１−の
流速で連続して暮通し適時サンプリングしてアスパルタ
ーゼ活性を測定することにより安定性を調べたところ１
４日間；：条ｉ後も活性の低下は認めら汎なかった。 実施例５ 実施例３と同様にして培養して得らｎｒ＝セラチア・マ
ルセッセンスＴＡ５００２のＩｎ体１０５’を０．０５
Ｍリン酸緩衝液（ｐ）１８．５）５０Ｊにけん濁し、９
ｋｃで１０ ＞を間音波処理を行なった。遠心分離し
て得られる上澄収３５−を弱塩基性陰イγン交換樹脂デ
ュオラ、イト−Ａ７（米国、ダイアモンドジャムロック
ケミカル社製）ＧＯｍｔを充填し１こカラムに５ｖ＝０
．７５で室温下、導油した。ついで０，１Ｍリン酸緩衝
欣（ｐＨ８，５） ３００ ｍｌと０．４％グルタルア
ルデヒド３００ｄを含むｌ容！佼で３０２チ開架橋し、
グルタルアルデヒドを十分洗浄して固定化酵素を調製し
た。該固定化酵素を５０．、ｒ容量のカラムＩこ充填し
ｌ ＞Ａフマール酸アンモニウム（ｐ）ｌ ８．５ 、
ｌ ｍｌ＋！ 塩化マグネソウム含有）５０Ｃ’ｎ！
。 を２５０ｍＡ／ｈｒの流速で導、」シた。流出液を合わ
せｐ）ｉ ２．８に調整したのち析出する結晶をろ取す
ること１こよ（・ツト−アスパラギン酸、）８．９を碍
た。 実施例 ６ −）乙うチア・１ルセッセンス°ｒ、 Ａ、 ５００１
を用いて実施図５とｉ’［４項（こして１−）られ１こ
上澄「イｋを硫安分画（３０〜５０１尤飽、・ｉ、Ｉ）
しソ°）らノしに沈ｊ段を水５ ｍｌ（こｍ ｉｊ）
したのち。水に対して一夜透析し透析内硬を酵素液（ア
スパルターゼ４．１７品１どし１こ。この酵素液２−を
３．２％々゛二つ、−ゲル“／７ Ｇ ７Ｊ（客８反１
２＋Ｊと３７℃θ） ？ｍ ｌ６中（こて：ｙ、＊２合
しブこ。こθ〕ＩＪ％合、ｌαを２５Ｃ塩化カリウム水
溶、：フ中に、・４ドぐることにより球状ゲル（直径約
３）Ｒ〕を７８７−、−、。得ちれｆこ固定化アスパル
ターゼの活性：ｔ ２１３２０ μｍ０１ａ／ＩＬ７−
１５’ であった。 実施例 ７ フー？−ル酸了ンモニウム３％、リン酸”Ｅ’ １ ｈ
ｉラム０，２弘、硫酸マグネ／ラム・７水和物０．０
５％、コーノス千−プリカー４％、ミースト２ ｃｇｏ
’ｒ含む培地（ｐＨ７，０）ｓ Ｏｏｍｅ＋、：ニーｚ
−＞ｆｒ−マルセソセンスＴへ５００２をｊｌ−（菌し
３０℃で１８時間培養した。この培養液のｐＨイ、′：
γンモニ了水でｐｉ−１１３、５とし、７マール酸アン
亡ニウム６５ｆ！工５よびトリトンＸ−１００の５００
２グを添加してさらｔこ３７℃で５時Ｑｌ静置反応を行
なった。反応終了液をろ過、疏縮しｐＨ２，８に調整し
た。析出品をろ取することによりＬ−アスパラ１ニン酸
の粗結晶を得、ついでこれを水力−ら再結晶することに
よりＬ−アスパラギン酸４６．５９を得ｆこ。 し−−１ 自発手続補正書 昭和ぶど年７Ｊ４２７日 ３、 ｈｌｉ市をオろ者 ・Ｉｉ、 （／ｌとの関係 特許用Ｌｌ（ｉ大人１−シ
府大阪市東１メ、心修町ａ ｎ−＋２１番地（〒５４１
）（２９５） ＩＩＩ辺製桑株式会社 代表古松原一部 ・１８代理 人 大阪府大阪山淀川区＋；１１１ｉ鳴３ＴｉＪ１６番８９
弓（〒５３２９５、補止により増加する発明の数 補 正 の 内 容 １、明細書第１頁５行目乃至第２頁３行目の特許請求の
範囲を下記の通り訂正する。 「（１） セラチア属に属する微生物から採取したア
スパルターゼの遺伝情服を担うデオキシリボ核酸をプラ
スミドに組み込んだハイブリッドプラスミドをセラチア
属微生物に含有せしめた微生物。 （２） プラ囚ミドがｐＡｃＹｃｌ ７７である特許
請求の範囲第１項記載の微生物。 （３） プラスミドがｐＢＲ３２２である特許請求の
範囲第１項記載の微生物。 （４） セラチア属に属する微生物から採取し１こア
スパルターゼの遺伝情報を担うデオキシリボ核酸をプラ
スミドに組み込んだハイブリッドプラスミドを含有せし
めたセラチア属に属する微生物の培養液・該培養液から
採取した菌体もしくは該菌体の処理物をフマール酸とア
ンモニアに作用させることを特徴とするＬ−アスパラギ
ン酸の製法。 （５） フマール酸七了ンモニＹをフマール酸アンモ
ニウムとＬ７て１共・＠する・侍、、−Ｆ請求の範υｔ
Ｉ第４［Ｈｉｍｄ ｌｌｒ ｊを 「ｉ（ｉ＋ｌｄ ｆｉｔ Ｊ をこ訂旧ずろ。 ３、 同第６頁最下行の ［プ ラ ミ ド １ を 「プラスミド」 に訂正する。 喀、 同第１２筺下から２行目ｚ）） Ｉ Ｏ，］、 Ｍフマル、−７ψ１ を１’−ｌ、Ｑ
Ｍフマール酸」 ９こ訂正する１、５、同第１３頁１０
行目の ［塩化ナトリウム０．５％Ｊを削除する。 ６、同第１４頁１０行目の 「２時間」を 「２分間」 １こ訂正する。 ７、同第１６頁最下行の 「けん副成」 を 「けん詞し」 に訂正する。 ８．同第２２代６行目の （−ＤＮＡ断・乍」を １”ＤＮＡ断片」 ｔこ訂正する。 ９、同第２４頁１ｉｉ目の 「洗浄する１ を ［洗浄後基質溶液中で４８ｉｔ″？間インキユベーシゴ
ンして活性化する１ に打上す乙。 １０、 同第２４汀下から７行目末尾の「８」 を 「３」に訂正する。 １１、同第２５真下から２行目の ｒ２５０Ｊを ［２５ｊｌこ訂正する。
Claims (4)
- （１） セラーＦ′７′ｊｔ４に属する微生物から採
取したアスパルターゼの遺伝情報を担うデオキシリボ核
酸をプラスミドに組み込んだハイブリッドプラスミドを
セラチア属微生物に含有せしめた微生物。 - （２） ブラミドがｐ ＡＣＹＣＪ ７７である特許
請求の範囲第１６１記載の微生物。 - （３） プラスミドがｐＢＲ３２２°ごある９寺許請
求の範囲第１項記載の微生物。 - （４） セラチア属に属する微生物から採取した了ｘ
ハル５−セの遺伝情報を担うデオキシリボ核酸をプラ
スミドに組み込んだハイブリッドプラスミドを含有せし
めたセラチア属にｌｉ４する微生物の培養Ｙ反、該培養
液から採取した菌体もしくは該菌体の処理物をフマール
酸とアンモニアに作用させることを特徴とするＬ−アス
パラギン酸の製法。 ｔ５１ フマール酸とアンモニアをフマール酸アンモ
ニウムとして供恰する特許請求の範囲第４項記載の方法
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58057229A JPS59183688A (ja) | 1983-03-31 | 1983-03-31 | Ｌ−アスパラギン酸の製法 |
| US06/591,532 US4656136A (en) | 1983-03-31 | 1984-03-20 | Method for producing L-aspartic acid |
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| EP84103369A EP0123903B1 (en) | 1983-03-31 | 1984-03-27 | Method for producing l-aspartic acid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58057229A JPS59183688A (ja) | 1983-03-31 | 1983-03-31 | Ｌ−アスパラギン酸の製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59183688A true JPS59183688A (ja) | 1984-10-18 |
Family
ID=13049693
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58057229A Pending JPS59183688A (ja) | 1983-03-31 | 1983-03-31 | Ｌ−アスパラギン酸の製法 |
Country Status (4)
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|---|---|
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| EP (1) | EP0123903B1 (ja) |
| JP (1) | JPS59183688A (ja) |
| DE (1) | DE3482969D1 (ja) |
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| IL78703A (en) * | 1985-05-10 | 1993-02-21 | Benzon Alfred | Method of producing extracellular enzymes, the enzymes produced thereby and compositions containing them; a hybrid plasmid and a dna fragment comprising dna encoding the enzymes; a microorganism harbouring the plasmid; and a method for removing nucleic acids from biological materials |
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-
1984
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- 1984-03-27 EP EP84103369A patent/EP0123903B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
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|---|---|
| EP0123903A3 (en) | 1986-11-20 |
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