JPS62275684A - 組換えベクタ−及びそれを有する細菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 （産業上の利用分野） 本発明は新規な組換えベクター及びそれを含む細菌に関
し、さらに詳しくは、デスチオビオチンからビオチンを
生合成する反応に関与する遺伝情報を担うデオキシリボ
核酸（ＤＮＡ）を組込んだ組換えベクター及びそれを含
有する細菌に関する。

（従来の技術） ビオチンは、動物、植物、微生物などにとって必要なビ
タミンであり、遺伝子組み変え技術の応用による工業的
な生産が強く望まれている物質である。しかし、ぎオチ
ン生合成反応に関与する遺伝情報の解析は、大腸菌につ
いては実施されている〔ジャーナル・オプ・バクテリオ
ロノー具、２０６５（１９６７）、ジャーナル・オプ・
バクテリオ口・シー１１２，８３０（１９７２）、ネー
チャーυ」。

６８９（１９７８）など〕ものの、大腸菌によるビオチ
ン産生量はきわめて微量であう、工業的実用化の点から
見ればまったく不十分なものであった。

一方、バチルス属に属する微生物を培養することによシ
ビオチンを産生ずる方法も知られており、大腸菌に比較
してはるかに多量のビオチンを産生ずる菌も見い出され
ている（例えば特開昭５６−１６０９９８号、同５８−
６０９９６号、同５８−１５２４９５号など）。しかし
、バチルス属細菌のビオチン生合成に関与する遺伝情報
の解析はほとんどなされておらず、それゆえ遺伝子組換
え技術にそれを応用することはきわめて困難な状態にあ
ったＯ （発明が解決しようとする問題点） そこで本発明者らは、かかる従来技術の下でバチルス属
細菌からビオチン生合成に関与する遺伝情報を担うＤＮ
Ａを採取すべく鋭意検討の結果、ピテ１ オチン生合成経路の最終経路である一スチオビオチンか
らビオチンを生合成する反応に関与する遺伝情報を担う
ＤＮＡ　（以下、ビオチン合成酵素をコードするＤＮＡ
と称することがある）の採取に成功し、かつそのＤＮＡ
を組込んだ組換えベクターによって形質転換された細菌
は高いビオチン産生能を有することを見い出し、本発明
を完成するに到った。

（問題点を解決するための手段） かくして本発明によれば、第一の発明として、ビオチン
産生能を有するバチルス属細菌から採取したデスチオビ
オチンからビオチンを生合成する反応に関与する遺伝情
報を担うＤＮＡを組み込んだ組換えベクターが提供され
、第二の発明として、ビオチン産生能を有するバチルス
属細菌から採取したデスチオビオチンからビオチンを生
合成する反応に関与する遺伝情報を担うＤＮＡを組み込
んだ組換えベクターによって形質転換または形質導入さ
れた細菌が提供される。

本発明において、ビオチン合成酵素をコードするＤＮＡ
を採取する目的に用いられる微生物は、バチルス属とく
にバチルス・スフエリカスに属するビオチン生産菌、す
なわちビオチン生合成の酵素系を有している微生物であ
る限シ、自然界から新たに分離された菌株でも既存の培
養菌株でもよく、また、これらの菌株を通常の微生物突
然変異誘発法（例えば、紫外線、Ｘ線、γ線照射などの
物理的処理やニトロソグアニノンなどの薬剤による化学
的処理による方法）で処理することによって得られた菌
株であっても良い。さらに、ビオチン産生能を高めるた
めに上記菌株にアクチチアソン酸り （すなわちアシドマイシン）またはアサチチアジン酸及
び５−（２−チェニル）吉草酸のそれぞれ単独、あるい
は双方に対する耐性を付与した菌株などであっても良い
。このような菌株の具体例としては１例えば、バチルス
・スフェＩＪ　カス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｈａｓｒｉ
ｃｕｓ　）　ＩＦＯ３５２５や、そのＮ−メチル−Ｎ′
−ニトロ−Ｎ−ニトロングアニジン処理変異株（微工研
寄託番号−６４２２、同一６４２１゜同−６１４３）な
どが例示される。

これら細菌株からビオチン合成酵素をコードするＤＮＡ
を採取する方法については特に限定された方法を用いる
必要はなく、例えば上記細菌株から弔１１ 全ＤＮＡを常法により単離精製し、無限酵素で切断した
あと、該制限酵素と同じ接着末端をＤＮＡに生じさせる
ことのできる制限酵素で切断したベクターと酵素的に結
合させ、得られた組換えベクターを用いてデスチオビオ
チンからビオチンへの生合成能の欠失したビオチン要求
性変異株を形質転換（または形質導入）し、得られた形
質転換株の中からビオチン産生能を付与された菌株を選
択すれば良い。

本発明において組換えベクターを構築するためのベクタ
ーとしては、前記ビオチン要求性変異株を形質転換（ま
たは形質導入）し得るものならどんなものでも良く、例
えばビオチン要求性変異株として大腸菌を用いる場合、
　ＥＫ系プラスミドベクターとしてストリンゼント凰の
ｐｓｃｌｏｌ　、　ｐＲＫ３５３゜ｐＲＫ６４６　、　
ｐＲＫ２４８　、　ｐＤＦ’４１など、リラックス型の
ものとしてＣｏ１Ｅ１　、　ｐＶｆ（５１、ｐＡｃ１０
５　、　Ｒ８Ｆ２１２４　。

ｐｃＲｌ　　、ｐＭＢ９　　、ｐＢＲ３１３、ｐＢＲ３
２２、ｐＢＲ３２４。

ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２７、ｐＢＲ３２８、ｐＫＹ２
２８９　　、ｐＫＹ２７００゜ｐＫＮ８０　　、ｐＫＣ
７、ｐＫＢ１５８　　、ｐＭＫ２００４　　、ｐＡｃＹ
ｃｌ　　。

ｐＡｃＹｃ１８４　、　ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、など、λ
ｇｔ系ファーノベクターとしてλｇｔ・λＣ９λｇｔ・
λＢ、λＷＥＳ−λＣ。

λＷＥＳ−λＢ、λｚＪｖ１ｒ・λＢ／、λＡＬＯ−λ
Ｂ、λＷＥＳ−Ｔ５６２２゜λＤａｍなどが用いられる
。これらのベクターのなかではグラスミドベクターがと
くに賞月される。

また、上記ビオチン要求性変異株としては、バチルス属
の遺伝情報を担うＤＮＡが該菌体内で発現可能な菌株で
あればいずれでも良く、そのような変異株は公知の方法
によって再現性よく得ることができる（例えばジャーナ
ル・オプ・バクテリオロノー（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
　）１１５．ｐ６６２．１９７３年：グロシーディング
・オツ・ナショナル・アカデミ、り・サイエンス・イン
ｅＵＳＡ　（Ｐｒｏ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　）６９　、　ｐ　２２
１９　、１９７２年：グイロロジ−（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
）４２．ｐ４７４．１９７０年など）。

例えばエシェリヒア・コリＣ６００１：グロシーディン
グ曖オプ・ナチュラルｅアカデミイ・オプ・サイエンス
７１４５７９（１９７４））を、ジャーナル壷オプ・バ
クテリオロジ−９４１９３０（１９６７）記載の方法に
準じて変異誘導処理して得られるデスチオビオチンから
ビオチンへの生合成能の欠如した菌株（以下、エシェリ
ヒア・コリに３と呼ぶ）を利用することができる。

形質転換の方法についてもなんら限定すべきものではな
く、例えば、ビオチン要求性変異株として上記エシェリ
ヒア・コリに３を用いる場合は、塩化カルシウムで菌体
を処理する常法に従って実施しうる（例えばジャーナル
・オプ・そレキュラー・バイオロジー■、１５４（１９
７０）参照）。

かくして得られろビオチン要求性変異株の形質転換体の
中から、バチルス属細菌由来のビオチン合成酵素をコー
ドするＤＮＡが組み込まれた組換えベクターによって新
たにビオチン産生能を付与された菌株を選択する場合は
、例えば、親株のビオチン要求性変異株が成育可能な培
地の組成から、ビオチンが実質的に除去された培地を用
いて、該形質転換株をスクリーニングし、該培地で生育
可能な菌株を選択すれば良い。

こうして得られる一例示形質転換菌株をエシェリヒア・
コリＫ　３　（ｐｓＢＯｌ　）と命名し、またエシェリ
ヒア・コリＫ　３　ＣＰＳＢＯＩ　）の培養菌体から単
離されるハイブリッドプラスミドをｐｓＢＯｌと命名し
、ｐｓＢＯｌの制限酵素切断点地図を第１図に示す。

第１図からｐｓＢＯｌ中に含まれるビオチンの生合成に
関与する遺伝情報を担うＤＮＡは、Ｍｂｏｌに始ま９、
Ｈｌｎｄｎｌ　、　Ｆ（ｉｎｄｌ［［、ＩｃｏＲｌ　、
　Ｓａｔ［、Ｈｌｎｄ［［、Ｐｓｔｌ＋ＥｃｏＲ１、Ｂ
ａｍＨｌの順に並ぶ約８．２　ｋｂのＤＮＡ断片（第１
図中の斜線を付した部分）中に存在することが理解され
よう。なお、この地図中のＭｂｏｌは出発点を示すもの
であシ、この部位以外にＭｂｏｌＺ＞１する可能性を否
定するものではない。

むろん本発明に含まれるビオチン合成酵素をコードする
ＤＮＡを組み込んだ組換えベクターは、ｐｓＢＯｌに限
るものではない。例えば、　ｐｓＢＯｌのもつ個有の制
限酵素切断サイトを利用し、前記ＤＮＡを組み込んだグ
ラスミドを新たにｐｓＢＯｌがら誘導することも可能で
あり、具体的にはｐｓＢＯｌを、例えば、制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩで完全分解したあと、酵素的な再結合反応を実施
し、得られたプラスミド混合物を用いてデスチオビオチ
ンからビオチンへの生合成能の欠如した菌株を形質転換
し、得られた形質転換株の中からビオチン産生能を付与
された菌株で、ｐｓａｏｔよりも小型のグラスミドを持
つ菌株を選択すれば良い。

こうして得られる一例示形質転換菌株をエシェリヒア・
コリＫ　３　（ｐｓＢＯ３）と命名し、またその培養菌
体から単離されるハイブリッドプラスミドをｐｓＢＯ３
と命名した。ｐｓＢＯ３の制限酵素切断点地図は第２図
に示すとうシであり、ビオチン合成酵素をコードするｆ
）ＮＡは、Ｍｂｏｌにはじま９　Ｈｌｎｄｌｌｌ　。

ＨｌｎｄＩ［［、ＥｅｏＲ）　、　ＢａｒｎＨＩの順に
並ぶ約４．５ｋｂのＤＮＡ断片（第２図中の斜線を付し
た部分）中に存在することが理解されよう。なお、この
約４．５ｋｂのＤＮＡ断片はもとの約８．２ｋｂのＤＮ
Ａ断片中の約３．５ｋｂの部分（すなわちＭｂｏＩから
ＥｃｏＲＩ　ｔでの部分）と約１　ｋｂの部分（すなわ
ちＩｃ　ｏＲＩからＢａｍＨＩまでの部分）が結合した
ものであるが、約１　ｋｂのＤＮＡ部分を別途ｐＢＲ３
２２に組込み、それ金ビオチン要求性変異株に形質転換
したところ、ビオチン産生能を示さなかったことから、
ビオチン合成酵素をコードする部分はＭｂｏｌからＥｃ
ｏＲＩまでの約３．５ｋｂの断片中に存在することが確
認された。

同様にｐｓＢＯ３を、例えば、制限酵素Ｈ１ｎｄｌｌで
完全分解し、Ｈｌｎｄ［［で切断した他のベクターと酵
素的な再結合を実施し、得られた形質転換菌株の中から
ビオチン産生能を付与された菌株を選択することによっ
てより小型のプラスミドを持つ菌株を得ることができる
。

こうして得られる形質転換株の例としては、エシェリヒ
ア・コリＫ　３　（ＰＳＢ１６　）　、エシェリヒア・
コリＫ　３　（ｐｓＢ１０３　）、エシェリヒア・コリ
に３（ＰＳＢ２０２　）などが挙げられる。これらの形
質転換株中に存在するプラスミドｐｓＢ１６　、　ｐｓ
Ｂ１０３又は、ｐＳＢ２０２の制限酵素切断地図は第３
〜５図に示すとうシであり、そのなかに組み込まれたバ
チルス属細菌由来のＤＮＡ断片の制限酵素切断地図は第
６図に示すとうりである。この結果からビオチン合成酵
素をコードするＤＮＡは、ＭｂｏＩに始ｔＦ）　Ｔａｑ
ｌ　。

ＲａａＩ　＊　Ｔａｑｌ　、　Ｒｓａｌ　、　ＭｂｏＩ
　、　Ｍｂｏｌ　、　ＨｌｎｄｌＩ　ｐＴａｑｌ　ｖ　
Ｔａｑｌ　ｒ　Ｔｍｑｌ　、　Ｈｉｎｄｌｌ［のＪ［に
並ぶ約１．５　ｋｂのＤＮＡ断片中に存在することが理
解されよう。

このようにして得られる組換えベクターの宿主としては
、エシェリヒア・コリＣ６００，エシェリヒア・コリＪ
Ｍ１０３などのごときエシェリヒア属細菌が例示される
が、必ずしもこれに限られるものではない。

例えば組換えベクターからビオチン合成酵素をコードす
るＤＮＡ断片を取り出し、バチルス属細菌を形質転換で
きるベクターに組み込んで、バチルス属細菌を改めて形
質転換（または形質導入）し、ビオチン生合成に関与す
る遺伝情報を増幅した形で菌体内に保持した・ぐチルス
属形質転換菌体を得ることも、当然、本発明に含まれる
。具体的には、例えば、ｐｓＢＯｌ　、　ｐｓＢＯ３、
ｐｓＢ１６　、　ｐｓＢ１０３あるいはｐｓＢ２０２と
、ｐＵＢｌｌｏ　（ジャーナル◆オプ・バクテリオロノ
ー（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｌｏｌ　）出、９．３１８゜１
９７８年）とから、バチルス属菌体内で自立増殖可能で
、かつビオチン合成酵素をコードするＤＮＡを組み込ん
だ組換えベクターを構築し、ジャーナル・オツ・ジェネ
ラル・マイクロパイオルジー１３０，２０３（１９８４
）記載の方法に準じてバチルス・スフエリカスＩＦＯ３
５２５を形質転換することによシ目的を達することがで
きる。

さらにシュードモナス属の細菌を宿主とし、ベクターと
してグラスミドＲ８ＦＩＯＩＯとその誘導体〔イン・プ
ラスミズ・オプ・メディカル、エンパイロナメンタルー
アンド参コマーシャル−インポータンス（Ｉｎ　Ｐｌａ
ｓｍｉｄｓ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ、　Ｅｎｖｉｒｏｎ
−ｍ＠ｎｔａｌ　ａｎｄ　Ｃｏｒｎｍｓｒｅｉａｌ　Ｉ
ｎｐｏｒｔａｎｅｅ　）　、　ｐ　４１１　。

１９７９年〕を用いることによっても、同様に目的を達
成することができる。

このようにして得られる形質転換体は、ビオチン産生能
に優れていること以外、親株と同じ性質を有する。従っ
て、宿主として用いる親株の場合と同様の条件で培養す
ることができる。

（発明の効果） かくして本発明によれば、ビオチン産生能を有するバチ
ルス属細菌から採取したビオチン合成酵素をコードする
ＤＮＡを組み込んだ組換えベクターで細菌を形質転換（
または形質導入ンすることによシ、ビオチン産生能に優
れた細菌を得ることができる。

（実施例） 以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。

実施例１゜ （１）全ＤＮＡ　Ｍ片の調製 バチルス・スフエリカスＩＦＯ３５２５のアクチチアノ
ン酸及び５−（２−チェニル）−吉草酸併用耐性株（微
工研菌寄託番号−６４２１）を１ｔのＬＢ培地（バクト
ドリグトン１チ、イーストイクストラクト０．５　％　
、　ＮａＣ４１％、グルコースＯ，１％；ＰＨ７，５に
調整）中２８℃で約５時間振盪培養を行ない、対数増殖
期に菌体を遠心分離によシ集めた。

この菌体からフェノール法〔バイオケミ・）々イオフイ
ズ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａ
ｃｔａ　）　７２　＋６１９〜，１９７３年〕により全
ＤＮＡを抽出、精製し、最終的に全ＤＮＡ　３．０　Ｉ
ｎ９を得た。

得られた全ＤＮＡ　５００μｇをとり、制限エンドヌク
レアーゼＭｂｏｌを加え、３７℃、３０分間反応させて
部分的に切断し、次いで反応物をアがロースグル電気泳
動にかけ、約４　ｋｂから約１０ｋｂのＤＮＡ断片を回
収した。

（２）ベクターｐＢＲ３２２の切断 アンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性をマーカーと
してもつＰＢＲ３２２（市販品、ファルマシア社製）を
制限エンドヌクレアーゼＢａｍｆ（Ｉで完全分解せしめ
た後、アルカリホスファターゼで処理した０ （３）再結合反応 （１）で調製したＤＮＡ断片（０，ｌμｇ）および（２
）で調製した開裂されたｐＢＲ３２２（０，１ｆｉｇ）
を１０ｍＭＭｇＣＡｚ　−１ｒｒＪ／ｉ　ＡＴＰおよび
１０ｍＭ０ｍＭブチオスレイトール−７，４の５０　ｍ
Ｍ　）リス−塩酸中でＴ４ＤＮＡ　リボーゼ０．３単位
と共に混合し、４℃で一晩反応させることによってＤＮ
Ａ断片をｐＢＲ３２２に組込んだハイブリッドプラスミ
ドを得た。

（４）ハイブリッドプラスミドの大腸菌への導入エシェ
リヒア・コリＤＨＩ　（モレキュラー・クローニング・
ア・ラゴラトリイ・マニュアル（Ｍｏ１ｓｃｕｌａｒ　
Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕ
ａｌ　）　ｐｅ５０５．１９８２年〕を１００４のψ培
地（イーストイクストラクト０．５％、バクトドリプト
ン２チ、ＭｇＳＯ４０，５−％：　ｐＨ７，６に調整）
中３７℃で約５時間振盪培養を行ない、対数増殖期に菌
体を遠心分離により集めた。この菌体をｔｒｂ　Ｉ液（
３０ｍＭ酢酸カリウム、１００　ｍＭ　ＲｂＣ２，１０
ｍＭ　ＣａＣｌ２゜５０　ｍＭ　ＭｎＣ４２１１５％グ
リセリン：　ｐＨ５，８に調整）４０Ｍで洗浄し、得ら
れた菌体をｔｆｂ　ＩＩ液（１０ｍＭ　ＭＯＰＳ　、　
７５　ｍＭ　ＣａＣ２２，１０ｍＭ　ＲｂＣ２，１５％
グリセリン：　ｐＨ６，５に調整）１０ｄに懸濁し、０
℃で９０分間靜装し、許容（コンピテント）細胞とした
。

この許容細胞懸濁液０．２　ｍに（３）で得たノ１イプ
リ、ドブラスミド０．１μｇを加えて０℃で３０分間靜
装した。４２℃で９０秒間保った後、ψ培地０．８−を
加えて３７℃で１時間培養したのち、この培養液０．１
１１Ｌ（を１０θμｇ、４ｎｌアンピシリンを含むＬＢ
培地の１．５％寒天培地に塗抹し、３７℃にて一晩培養
した。

次いで、出現したコロニー約２，５００個を爪楊枝で釣
菌し、１５μｍ７７０１テトラサイクリンを含むＬＢ培
地の１．５　％寒天培地に植菌し、３７℃にて一晩培養
した。これよシ、アンピシリンを含む培地上にて生育可
能であり、テトラサイクリンを含む培地上では生育不可
能なアンピシリン耐性、テトラサイクリン感受性株約１
０００株を得た。

（５）ハイブリッドプラスミドの単離 かくして得られたアンピシリン耐性、テトラサイクリン
感受性法を５つのグループに分け（その各グループは約
２００の異なる）１イブリツドグラスミドを含む）、５
０ｄｇのアンピシリンを含むＬＢ培地５９ｍ中で３７℃
で一晩振盪培養を行ない、遠心分離により菌体を集めた
。この菌体からピルン？イム（Ｂｌｒｎｂｏｉｒｎ　）
とドーリ−（Ｄｏｌｙ）の方法〔ヌクレイ、り番アシド
ーリサーチ（ＮｕｃｌｅＬｃＡｃｉｄ　Ｒｅｓ、　）ヱ
、　１５１３〜．（１９７９））によりグラスミドＤＮ
Ａを抽出した。このようにして得られたグラスミドＤＮ
Ａは、ベクターであるｐＢＲ３２２にバチルス・スフエ
リカスＩＦＯ３５２５より得た様々なりＮＡ断片が挿入
されたものであり、このハイプリ、ドグラスミドＤＮＡ
群における挿入ＤＮＡ断片の平均鎖長は約６　ｋｂであ
った。

（６）ビオチン要求性大８ｊｌＪ菌へのハイプリ、ドグ
ラスミドの導入 エシェリヒア・コリＣ６００からノセイ（Ｐａｌ）とり
ヒシュタイン（Ｌｉｃｈｓｔ・ｉｎ　）の方法〔ジャー
ナル・オプ・バクテリオ口・ノー（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ　）、亀４．ｐ１９３０，１９６７年〕に準じて
Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンで
変異誘導処理し、デスチオビオチンからビオチンへの生
合成能を欠失した変異株エシェリヒア・コリに３を得た
。これを１００ｍのＬＢ培地中３７℃で約２時間中振盪
培養し、対数増殖期に菌体を遠心分離により集めた。こ
の菌体をクシュナー（Ｋｕｓｈｎｅｒ）の方法〔ゾエネ
ティ、り・エンゾニアリング（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇ
ｉｎｅｅｒｉｎｇ　）　Ｐ−１７＋　１９７８年〕によ
シ許容細胞とした。

次に（５）で得たハイブリッドプラスミドＤＮＡ群を各
グループごとに０．１μＳずつ上記許容細胞懸濁液０．
２Ｍに加えて０℃で３０分間静置した。４３．５℃で３
０秒間保った後、ＬＢ培地１．８Ｍを加えて３７℃で１
時間培養したのち、遠心分離によって集菌した。この菌
体を０．８５％ＮａＣＬで２回洗浄した後、０．８５チ
ＮａＣ１１ｍｌに懸濁した。次に菌体懸濁液０．１　ａ
／を５０μみゼア／ピシリンを含むＣＡ培地〔グリセリ
ン２チ、カブミノ酸（ビタミンフリー）１％、　Ｋ２ｔ
（ＰＯ４０，２チ、　Ｋｌ（２ＰＯ４０，１％。

ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０５チ、　ＦｅＳＯ４・７Ｈ
２００，００１％。

ＭｎＳＯ４−４〜６１（２００，００１％　、チアミン
塩酸塩０．００００１チ〕の１．５チ寒天培地に塗抹し
、３７℃にて二晩培讐した。生じた２つのコロニーはア
ンピシリン耐性、ビオチン非要求性であり、かくして目
的とするビオチンの生合成に関与する遺伝情報を担うＤ
ＮＡを組込んだハイブリッドプラスミドによる形質転換
株２株を得た。

（７）ハイブリッドプラスミドの屏析 （６）で得られた形質転換株２株を５０μｇ／ｆｌＬｌ
ア／ピシリンを含むＣＡ培地５ゴ中で一晩振盪培養して
遠心分離で集菌後、前述のピルンゴイムとドーリーノ方
法によりハイブリッドプラスミドＤＮＡを抽出した。

それぞれの株から得られたハイブリッドプラスミドＤＮ
Ａは、共に全鎖長約１２゜５　ｋｂであり、約８．２ｋ
ｂのＤＮＡ断片が挿入されていた。この２つのハイブリ
ッドグラスミドＤＮＡについて、各種の制限エンドヌク
レアーゼ（１３μｍＨ１＃　ＨｉｎｄＩＩＩ　＋　Ｐａ
ｔ　ｌ　ｔＥｃｏＲＩ　、　５ａｔＩ　）による切断パ
ターンを作成し比較したところ、まったく同一のノ４タ
ーンを有していることから２つのハイブリッドグラスミ
ドＤＮＡは同一のものでちることが判明した。なお、こ
のハイブリッドグラスミドはｓｇｔ■、　Ｘｈｏｌ　ｓ
　Ｋｐ”による切断点を有していないことも確認された
。このハイブリッドプラスミドＤＮＡ　ｔ−ｐｓＢＯｌ
と命名し、その制限エンドヌクレアーゼ切断地図を第１
図に示す。なお、第１図中の数字はｂｐの概略値を示し
たものである。

次１ｃ　ｐｓａｏｔプラスミドＤＮＡに挿入されている
ＤＮＡ断片がバチルス・スフエリカスＩＦ’０３５２５
のＤＮＡ断片であることを証明する為に、サデン・ハイ
プリダイゼーシ、ンを行なった。まず、（１）で抽出、
精製した全ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＥｃ　ｏＲ
Ｉで切断せしめたのち、生成物をアがロースグル電気泳
動にかけ、サデン（Ｓｏｕｔｈａｒｎ）の方法〔ジャー
ナルーオプ・モレキュラ拳バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．
Ｂｌｏｌ、）９８．ｐ５０３．１９７５年〕によシニト
ロセルロースフィルターニ移行シた。コレとは別にｐｓ
Ｂｏｌ　７°ラスミドＤＮＡ　１μｙを　Ｐによυ標識
してグローブＤＮＡとした。調製はリグビー（Ｒｔｇｂ
ｙ）らの方法〔ジャーナル・オプ・モレキュラーのバイ
オロジー（Ｊ、　Ｍｏ１．　ＢＬｏｌ　）　１１３　。

ｐ２３７．１９７７年〕に従ってニックトランスレージ
ジョンによシ行ない、１１４　Ｘ　１０　ｃ　ｐｒｎ／
Ａ／ｉ　ＤＮＡの比活性を有するプローブＤＮＡを得た
。このグローブＤＮＡ０．１μｇを使用して、先に用意
した二トロセルロースフィルターに対して以下の手順に
従いハイブリダイゼーションを行なった。まずフィルタ
ーをＳＳＣ（０，１５ＭＮ轟Ｃ２，０，０１５Ｍクエン
酸ナトリウム）の６倍濃縮液とＤｅｎｈａｒｄｔ液（０
，０２チウシ血清アルブミン、０．０２チポリビニール
ビロリドン、０．０２％フィコール）２０１ｔに熱処理
したサケ精子ＤＮＡを２０μＷとなるように加えて６５
℃で４時間予備的ハイブリダイゼーションを行なった。

その後、ＳＳＣの６倍濃縮液とＤｅｎｈａｒｄｔ液、０
．５％ＳＯ８からなるハイブリダイゼーションバッファ
ー２０ｄに熱処理したサケ精子ＤＮＡを５０μｇ／４ｎ
ｔとなるように加え、熱処理したグローブＤＮＡ０．１
μｇをさらに加えて、６７℃で１晩ハイブリタイゼーシ
ヨンした。次いでフィルターをハイブリダイゼーション
バッファーでよく洗い、さらにＳＳＣの６倍濃縮液中６
５℃で３０分間洗い、ＳＳＣの２倍濃縮液中６５℃で３
０分間洗い、これを２回繰返した後、風乾後オートラジ
オグラフィーした。この結果、全ＤＮＡ中にこのグロー
ブＤＮＡに対して反応する断片があることが確認テれ、
ｐｓＢＯ１プラスミド［）ＮＡ中の約８．２ｋｂ挿入Ｄ
ＮＡ断片はバチルス・スフエリカスＩＦＯ３５２５のＤ
ＮＡ断片であることが証明された。

一方、−１’−シェリヒア・コリのビオチンオ（ロンを
プローブとしてギブス（Ｇｌ　ｂｂｓ　）らの方法〔プ
ロシーディング・オブ・ナシ、ナル・アカデミツク・サ
イエンス・イン・ＵＳＡ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｉ、　
Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ）８１．ｐ３３６５．１９８４年〕に従
って、バチルス嗜スフエリカスｒＦＯ３５２５全ＤＮＡ
のＥｃｏＲＩ切断断片に対し、サデン・ハイブリダイゼ
ーションを実施した。この時、ＤＮＡ間で相補性があれ
ばハイブリダイズする条件でもハイブリダイズしなかっ
たことから、エシェリヒア・コリのビオチンオペロンと
バチルス・スフエリカスのＤＮＡとの間では相補性が極
めて低いこと、従ってｐｓＢＯｌの挿入ＤＮＡ断片はエ
シェリヒア・コリのものとは大きく異なることが判明し
た。

（８）形質転換の再現性の確認 ｐｓＢ０１プラスミドＤＮＡを用いて（６）で述べた方
法によシエシェリヒア・コリに３を再度形質転換したと
ころ、　ｐｓａｏｔをプラスミドとして所有するエシェ
リヒア・コリに３すべてがアンピシリン耐性、ビオチン
非要求性となった。これより、ｐｓＢＯ１プラスミドＤ
ＮＡはエシェリヒア・コリに３のデスチオビオチンから
ビオチンへの生合成能欠失を相補しうる遺伝情報を持っ
たバチルス・スフエリカスＩＦＯ３５２５のＤＮＡ断片
を少なくとも所有していることが判明した。

このｐｓＢＯ１プラスミドＤＮＡをプラスミドとして所
有するエシェリヒア・コリに３を工７エリヒア・コＩＪ
　Ｋ　３　（ｐｓＢＯｌ　）と命名した。なお、この菌
は寄託番号８３６８として微工研に寄託されている。

実施例２゜ （１）ハイブリッドプラスミドの再構築実施例１で得た
ｐｓＢＯｌ　ｆラスミドＤＮＡ　１μｇを制限エンドヌ
クレアーゼＫｃｏＲＩで完全分解し、得られた３種のＤ
ＮＡ断片の混合物１μｇを１０ｍＭＭｇＣ６２，１ｒｒ
１ＭＡＴＰおよび：ＯｍＭ０ｍＭブチオスライトールｐ
Ｈ７，４の５０ｍＭ）リス−塩酸中でＴ４ＤＮＡ　ＩＪ
　ｆｆ−ゼ３単位と共に混合し、４℃で一晩反応させる
ことにより再結合を行った。

（２）ビオチン要求性大腸菌の形質転換上記のＴ　４　
ＤＮＡ　ＩＪガーゼによる反応混合物０．１μｇを用い
ること以外は実施例１の（６）と同様にしてノ１イゾリ
ッドグラスミドによる形質転換株を得た。

（３）ハイブリッドプラスミドの解析 （２）で得られた形質転換株を５０μｇ／／ｌｌＩ！ア
ンピシリンを含むＣＡ培地５ｄ中で一晩振盪培養して遠
心分離で集菌後、前述のビルンデイムとト０−リーの方
法によシハイブリッドプラスミドＤＮＡを抽出した。抽
出したプラスミドＤＮＡのうち最小のものは、全鎖長的
８．８ｋｂであシ、ｐｓＢＯｌ　ｆラスミドＤＮＡから
約３．７ｋｂのＥｅ　ｏＲＩ切断断片が欠落したもので
あった。このハイブリッドプラスミドをｐｓＢＯ３と命
名し、その制限エンドヌクレアーゼ切断地図を第２図に
示す。

このｐｓＢＯ３ｆラスミドＤＮＡを所有するエシェリヒ
ア・ニア　リＫ　３　ヲエシェリヒア・コリＫ　３（ｐ
ｓＢＯ３）と命名した。（微工研寄託番号８３６９　）
。

実施例３゜ エシェリヒア・コＩＪ　Ｋ　３　（ｐｓＢＯｌ）　、エ
シェリヒア・コリＫ　３　（ｐｓＢＯ３）及びｐＢＲ３
２２をプラスミドとして所有するエシェリヒア・コリＣ
６００（ｐｓＢ３２２）の３種の菌株を、５０μＬ郁ア
ンピシリンを含むＣＡ培地（条件Ａ）または５０μｇＡ
ｌのアンビシリ／とＩＯμＷのＤＬ−デスチオビオチン
を含むＣＡ培地（条件Ｂ　）３ｍにそれぞれ植菌し、３
７℃で４日間振盪培養した。また５０μＷのアンピシリ
ンを含むＣＡ培地３Ｍにそれぞれ３株を植菌し、３７℃
で１日間振盪培養後、ピメリン酸を１ψｌどなるように
添加し、さらに３日間振盪培養を行った（条件Ｃ）。

培養後、培養液１ｄを遠心分離して菌体を沈殿させ、そ
の上清を試験管に移した。次いで、この上清を１２０℃
で３０分間処理後、ラクトバシルスＯプランタラム（Ｌ
ａｅｔｏｂａｃｉｌｌｕａ　ｐｌａｎｔａｒｕｍＡＴＣ
Ｃ８０１４）による微生物定食法により上清中に蓄積し
たビオチンを定量した。

各々の場合におけるビオチンの蓄積量を第１表に示す。

第　　１　　表 第１表の結果から、本発明の微生物はエシェリヒア・コ
’）　Ｃ６００（ｐＢＲ３２２）に比べ大量のビオチン
を培地中に蓄積することが明らかである。

なお、本発明に係る微生物のビオチンの蓄積量は、エシ
ェリヒア・コリの種々のビオチン高産生変異株〔たとえ
ばジャーナル・オプ・パクテリオロノー（Ｊ、　Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ　）　１２２　ｐ６６、１９７５年〕と比
較しても高い値を示しており、このことからバチルス属
細菌に由来するビオチンの産生に関与する遺伝子の有用
性が理解されよう。

実施例４゜ （１）ハイブリッドプラスミドの再構築実施例２で得た
ｐｓＢＯ３プラスミドＤＮＡ　３μｓを制限エンドヌク
レアーゼＨｉｎｄｌｌで完全分解した。

これとは別にｐＢＲ３２２１μＪを制限エンドヌクレア
ーゼ旧１１ｄｌｌｌで完全分解した。次いでｐｓＢＯ３
を切断して得られた３種のＤＮＡ断片（１μｇ）と開裂
されたｐＢＲ３２２（１μｇ）を１０　ｍＭ　ＭｇＣ２
２，１ｒｎＭ　ＡＴＰおよび１０ｍＭ０ｍＭブチオスレ
イトールｐＨ７，４の５０　ｒｎＭ　トリス−塩酸中で
Ｔ　４　ＤＮＡリガーゼ３単位と共に混合し、反応混合
物を調製した。これをそれぞれ４℃で一晩反応させるこ
とによってハイブリット９グラスミドを得た。

（２）ビオチン要求性大腸菌の形質転換上記の反応混合
物１μｙを用いること以外は実施例１の（６）と同様に
してハイブリッドプラスミドによる形質転換株を得た。

（３）ハイブリッドプラスミドの解析 （２）で得られた形質転換株を５０μｇ〜アンピシリン
を含むＣＡ培地５ｍｌ！中で一晩振盪培養して遠心分離
で集菌後、前述のビルン？イムとドーリ−の方法により
ハイブリッドプラスミドＤＮＡを抽出した。抽出したプ
ラスミドＤＮＡのうち最小のものは全鎖長的６．２ｋｂ
でちった。このプラスミドはｐｓＢＯ３ＤＮＡの約２．
０　ｋｂ　Ｈ１ｎｄｌｌｌ切断断片が挿入されたもので
ら夛、ｐｓＢ１６と命名した。

この挿入断片中に含まれるバチルス・スフエリカスＩ　
Ｆｏ　３５２５由来のＤＮＡ断片はＭｂｏＩからＨｔｎ
ｄｌＩｌまでの約１．５ｋｂであり、その詳細な制限エ
ンドヌクレアーゼ切断地図は第６図に示すとうりである
。

なおｐｓＢ１６プラスミドＤＮＡを所有するエシェリヒ
ア・コリに３をエシェリヒアφコリＫ　３　（ｐｓＢ１
６）と命名した。

実施例５゜ 実施例４で用いたｐＢＲ３２２に代えてｐＵＣ９（市販
品、ファルマシア社製）を用いること以外は実施例４と
同様にして実験を行い、ｐｓＢ１６の場合と同様に約２
．０ｋｂのＤＮＡ断片を挿入した全鎖長約４．６ｋｂの
ハイブリッドプラスミド（ｐｓＢ１０３）を得た。次い
でこのｐｓＢ１０３を用いて実施例４と同様にしてエシ
ェリヒア・コリに３を形質転換することによシ、エシェ
リヒア・コリＫ　３　（ｐｓＢ１０３）を得た。

実施例６゜ 実施例４で用いたｐＢＲ３２２に代えてｐＵＣ８（市販
品、ファルマシア社製）を用いること以外は実施例４と
同様にして実験を行い、　ｐｓＢ１６の場合と同様に約
２．０ｋｂのＤＮＡ断片を挿入し九全鎖長約４．６ｋｂ
のハイブリッドプラスミド（ｐｓＢ２０２）を得た。

次いでこのｐｓＢ２０２を用いて実施例４と同様にして
エシェリヒア・コリに３を形質転換することによりエシ
ェリヒア・コリＫ　３　（ｐｓＢ２０２）を得た。

実施例７゜ エシェリヒア・コリＫ　３　（ｐｓＢＯｌ）　、エシェ
リヒア・コリＫ　３　（ｐｓＢＯ３）　、エシェリヒア
・コＩＪ　Ｋ　３（ｐｓＢ１６）、エシェリヒア・コリ
Ｋ　３　（ｐｓＢ１０３　）、エシェリヒア・コリＫ　
３　（ｐｓｎ２０２　）　、及びｐＢＲ３２２をプラス
ミドとして所有するエシェリヒア・コリＣ６００（ＰＢ
Ｒ３２２）の６種の菌株を、５０μｇ廓のアンピシリン
と１０μｇ／ｍｌのＤＬ−デスチオビオチンを含むＣＰ
培地〔グリセリン２チ、プロテオース、ペプトン５％、
カブミノ酸（♂タミンフリー　）　０．５チ、Ｋ２ＨＰ
Ｏ４０，１％、ＫＣｌ　０．０５％、ＭｇＳＯ４−７Ｆ
（２００，０５％、ＭｎＳＯ４”　４〜６　Ｆ（２００
，００１％、Ｆｅ１ｏ４”　７Ｈ２００，００１％、チ
アミン塩酸塩０．０００００２チ、ＰＩ″＋７．０〕３
ｒｆＬｌにそれぞれ植菌し、３７℃で４日間振盪培養し
た。

培養後、培養液１ゴを遠心分離して菌体を沈殿させ、そ
の上清を試験管に移した。次いで、この上清を１２０℃
で３０分間処理後、ラクトパシルス８グランタラム（Ｌ
ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌａｎｔａｒｕｍＡＴＣ
Ｃ８０１４）による微生物定量法により上清中に蓄積し
たビオチンを定量した。各々の菌株によるビオチンの蓄
積量を第２表に示す。

第　　２　　表 第２表の結果から、本発明の微生物はいずれもビオチン
産生能を有することが理解されよう。

【図面の簡単な説明】

第１〜５図はそれぞれｐｓＢＯｌ　ｆラスミドＤＮＡ　
。 ｐｓＢＯ３７’　５スミ）’ＤＮＡ％ｐｓＢ１６７’　
ラスｉ　ｌ’ＤＮＡ。 ｐｓＢ１０３７’　ラスミ）’　ＤＮＡ及びｐｓＢ２０
２ゾ、Ｆスミ’ｒ”　ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ
切断地図を示し、第６図はｐｓＢ１６に挿入されたバチ
ルス属細菌由来のＤＮＡ断片の制限エンドヌクレアーゼ
切断地図を示す。 特許出願人　日本ゼオン株式会社 第３図 第４図　　　　　第５図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ビオチン産生能を有するバチルス属細菌から採取し
   たデスチオビオチンからビオチンを生合成する反応に関
   与する遺伝情報を担うＤＮＡを組み込んだ組換えベクタ
   ー。 ２、前記ＤＮＡが、Ｍｂｏ I 、Ｔａｑ I 、Ｒｓａ I
   、Ｔａｑ I 、Ｒｓａ I 、Ｍｂｏ I 、Ｍｂｏ I 、Ｈｉ
   ｎｄII、Ｔａｑ I 、Ｔａｑ I 、Ｔａｑ I 、Ｈｉｎｄ
   IIIの順にならぶ制限酵素切断点を持つ約１．５ｋｂの
   ＤＮＡ断片を含むものである特許請求範囲第１項記載の
   組換えベクター。 ３、前記ＤＮＡが、Ｍｂｏ I 、ＨｉｎｄIII、Ｈｉｎｄ
   III、ＥｃｏＲ I の順にならぶ制限酵素切断点を持つ約
   ３．５ｋｂのＤＮＡ断片を含むものである特許請求範囲
   第１項記載の組換えベクター。 ４、前記ＤＮＡが、Ｍｂｏ I 、ＨｉｎｄIII、Ｈｉｎｄ
   III、ＥｃｏＲ I 、Ｓａｌ I 、ＨｉｎｄIII、Ｐｓｔ
   I 、ＥｃｏＲ I 、ＢａｍＨ I の順にならぶ制限酵素切
   断点を持つ約８．２ｋｂのＤＮＡ断片を含むものである
   特許請求範囲第１項記載の組換えベクター。 ５、ベクターがプラスミドである特許請求の範囲第１項
   記載の組換えベクター。 ６、ビオチン産生能を有するバチルス属細菌から採取し
   たデスチオビオチンからビオチンを生合成する反応に関
   与する遺伝情報を担うＤＮＡを組み込んだ組換えベクタ
   ーによって形質転換または形質導入された細菌。 ７、細菌がエシェリヒア属、バチルス属またはシュード
   モナス属に属するものである特許請求範囲第６項記載の
   細菌。 ８、前記ＤＮＡが、Ｍｂｏ I 、Ｔａｑ I 、Ｒｓａ I
   、Ｔａｑ I 、Ｒｓａ I 、Ｍｂｏ I 、Ｍｂｏ I 、Ｈｉ
   ｎｄII、Ｔａｑ I 、Ｔａｑ I 、Ｔａｑ I 、Ｈｉｎｄ
   IIIの順にならぶ制限酵素切断点を持つ約１．５ｋｂの
   ＤＮＡ断片を含むものである特許請求範囲第６項記載の
   細菌。 ９、前記ＤＮＡが、Ｍｂｏ I 、ＨｉｎｄIII、Ｈｉｎｄ
   III、ＥｃｏＲ I の順にならぶ制限酵素切断点を持つ約
   ３．５ｋｂのＤＮＡ断片を含むものである特許請求範囲
   第６項記載の細菌。 １０、前記ＤＮＡが、Ｍｂｏ I 、ＨｉｎｄIII、Ｈｉｎ
   ｄIII、ＥｃｏＲ I 、Ｓａｌ I 、ＨｉｎｄIII、Ｐｓｔ
   I 、ＥｃｏＲ I 、ＢａｍＨ I の順にならぶ制限酵素
   切断点を持つ約８．２ｋｂのＤＮＡ断片を含むものであ
   る特許請求範囲第６項記載の細菌。 １１、組換えベクターがハイブリッドプラスミドである
   特許請求の範囲第６項記載の細菌。