JPH0789950B2 - ジフテリア毒素と免疫交さ性を有するタンパク質の製法 - Google Patents
ジフテリア毒素と免疫交さ性を有するタンパク質の製法Info
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- JPH0789950B2 JPH0789950B2 JP59020118A JP2011884A JPH0789950B2 JP H0789950 B2 JPH0789950 B2 JP H0789950B2 JP 59020118 A JP59020118 A JP 59020118A JP 2011884 A JP2011884 A JP 2011884A JP H0789950 B2 JPH0789950 B2 JP H0789950B2
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- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
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- C12R2001/15—Corynebacterium
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、ジフテリア毒素と免疫交さ性を有するタンパ
ク質をコード化しかつその染色体内にノンタンデムモー
ドで組込まれた２つの変異フアージを有するコリネバク
テリウム・ジフテリアエ（Corynebacterium diphtheria
e）に属する微生物を、鉄イオン0.05ないし0.5μg/mlを
含有する液状栄養培地中で、温度30ないし40℃、中性培
地雰囲気において、好気的条件下で培養することによつ
てジフテリア毒素と免疫交さ性を有するタンパク質を製
造する方法に係わる。
ク質をコード化しかつその染色体内にノンタンデムモー
ドで組込まれた２つの変異フアージを有するコリネバク
テリウム・ジフテリアエ（Corynebacterium diphtheria
e）に属する微生物を、鉄イオン0.05ないし0.5μg/mlを
含有する液状栄養培地中で、温度30ないし40℃、中性培
地雰囲気において、好気的条件下で培養することによつ
てジフテリア毒素と免疫交さ性を有するタンパク質を製
造する方法に係わる。
ジフテリア毒素は真核細胞に対して著るしい有毒性を発
揮するタンパク質である。
揮するタンパク質である。
このような毒素は２つのサブユニツトでなる。すなわ
ち、１つは真核細胞の膜上に存在する受容器に結合しう
るＢ−フラグメントであり、他の１つは毒性であつてか
つ細胞内に侵入後、タンパク合成を阻害するＡ−フラグ
メントである。
ち、１つは真核細胞の膜上に存在する受容器に結合しう
るＢ−フラグメントであり、他の１つは毒性であつてか
つ細胞内に侵入後、タンパク合成を阻害するＡ−フラグ
メントである。
ジフテリア毒素は遺伝子によつてコード化されており、
この遺伝子の一次構造が最近になつて決定され（C.Ratt
i,R.Rappuoli,E.G.Gianni「ヌクレイツク・アシツド・
リサーチ（Nucleic Acid Research）」11,6589,6595（1
983））、またコリネバクテリウム・ジフテリアエに感
染するいくつかの相関するバクテリオフアージ（β．
γ．ω）のDNAに存在することが知られている（J.J.Cos
taら「ジヤーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacter
iol.）」148,124〜130（1981）、V.Freeman「ジヤーナ
ル・オブ・バクテリオロジー」61,675〜688（195
1））。
この遺伝子の一次構造が最近になつて決定され（C.Ratt
i,R.Rappuoli,E.G.Gianni「ヌクレイツク・アシツド・
リサーチ（Nucleic Acid Research）」11,6589,6595（1
983））、またコリネバクテリウム・ジフテリアエに感
染するいくつかの相関するバクテリオフアージ（β．
γ．ω）のDNAに存在することが知られている（J.J.Cos
taら「ジヤーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacter
iol.）」148,124〜130（1981）、V.Freeman「ジヤーナ
ル・オブ・バクテリオロジー」61,675〜688（195
1））。
これらフアージは細菌に感染したのち、細菌を溶解させ
て死滅させるか、あるいは細菌の染色体内に組込まれ、
休眠状態を維持し、細菌が複製される場合には同時に複
製される。組込まれたフアージのDNAは、染色体ととも
に娘細胞に遺伝され、このようにして娘細胞はタンパク
質コード化遺伝子を含有するようになる。
て死滅させるか、あるいは細菌の染色体内に組込まれ、
休眠状態を維持し、細菌が複製される場合には同時に複
製される。組込まれたフアージのDNAは、染色体ととも
に娘細胞に遺伝され、このようにして娘細胞はタンパク
質コード化遺伝子を含有するようになる。
現在では、ジフテリア毒素はPW8菌株を培養することに
よつて製造されており、ホルマールで解毒化されたの
ち、抗ジフテリアワクチンの製造に使用されている。
よつて製造されており、ホルマールで解毒化されたの
ち、抗ジフテリアワクチンの製造に使用されている。
最近、Uchidaらは、ニトロソグアニジンによる処理によ
つて、フアージβの変異体を得ている（「ネーチヤー・
ニユー・バイオロジー（Nature New Biol.）」233,8−1
1（1973））。
つて、フアージβの変異体を得ている（「ネーチヤー・
ニユー・バイオロジー（Nature New Biol.）」233,8−1
1（1973））。
コリネバクテリウム・ジフテリアエのバクテリア染色体
内に組込まれる上記変異フアージは、ジフテリア毒素と
免疫交さ性を有するタンパク質の合成をコード化し、毒
素の構造遺伝子に挿入された１またはそれ以上の変異体
の存在のため、構造および／または機能について異なつ
たものとなる。
内に組込まれる上記変異フアージは、ジフテリア毒素と
免疫交さ性を有するタンパク質の合成をコード化し、毒
素の構造遺伝子に挿入された１またはそれ以上の変異体
の存在のため、構造および／または機能について異なつ
たものとなる。
上記種類のタンパク質は、これらがジフテリア毒素と免
疫交さ反応を生ずるため、「交さ反応物質（CRM）」と
称される。
疫交さ反応を生ずるため、「交さ反応物質（CRM）」と
称される。
分離されたいくつかの変異フアージの中でも、タンパク
質CRM176,CRM197,CRM228およびCRM45をコード化するも
のについて、特に検討されている（Uchidaら「ジヤーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Che
m.）」218,3838−3844（1973））。
質CRM176,CRM197,CRM228およびCRM45をコード化するも
のについて、特に検討されている（Uchidaら「ジヤーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Che
m.）」218,3838−3844（1973））。
さらに詳述すれば、CRM45は、ジフテリア毒素のものの
構造および機能に似たフラグメントＡと真核細胞の表面
上に存在する受容器にタンパク質を結合させうるセグメ
ントに欠けるフラグメントＢとによつて構成されるタン
パク質である。
構造および機能に似たフラグメントＡと真核細胞の表面
上に存在する受容器にタンパク質を結合させうるセグメ
ントに欠けるフラグメントＢとによつて構成されるタン
パク質である。
研究によれば、CRM45は、「イン・ビトロ」において充
分に活性なフラグメントＡを有するものではあるが、細
胞内に浸透しないため、「イン・ビボ」活性を全く有し
ていないことが判明している。逆に、フラグメントＢ
は、変化なく、細胞の内部にフラグメントＡを移動させ
るに必要な疎水性構造を有している。これらの特徴、す
なわち活性フラグメントＡの存在、フラグメントＡを細
胞内部に移動させるために要求される構造のフラグメン
トＢ中における存在、および細胞膜の受容器を認識させ
る領域の不存在、を考慮して、雑種毒素を形成するため
にCRM45を利用することが検討される。実際、抗体、単
クローン性抗体、ホルモンまたは生化学的に興味のある
他の物質などの、ターゲツト細胞の如きいくつかの細胞
の表面上で特殊な分子を認識しうる物質によつて、欠乏
するセグメントを置換えることにより、いくつかの細胞
のみを選択的に死滅させうる雑種毒素が得られている。
このような雑種毒素は薬学分野、とりわけいくつかの腫
瘍の治療に選択的に応用される（P.Bachaら「ジヤーナ
ル・オブ・ザ・バイオロジカル・ケミストリー」258,15
65−1570（1983））。
分に活性なフラグメントＡを有するものではあるが、細
胞内に浸透しないため、「イン・ビボ」活性を全く有し
ていないことが判明している。逆に、フラグメントＢ
は、変化なく、細胞の内部にフラグメントＡを移動させ
るに必要な疎水性構造を有している。これらの特徴、す
なわち活性フラグメントＡの存在、フラグメントＡを細
胞内部に移動させるために要求される構造のフラグメン
トＢ中における存在、および細胞膜の受容器を認識させ
る領域の不存在、を考慮して、雑種毒素を形成するため
にCRM45を利用することが検討される。実際、抗体、単
クローン性抗体、ホルモンまたは生化学的に興味のある
他の物質などの、ターゲツト細胞の如きいくつかの細胞
の表面上で特殊な分子を認識しうる物質によつて、欠乏
するセグメントを置換えることにより、いくつかの細胞
のみを選択的に死滅させうる雑種毒素が得られている。
このような雑種毒素は薬学分野、とりわけいくつかの腫
瘍の治療に選択的に応用される（P.Bachaら「ジヤーナ
ル・オブ・ザ・バイオロジカル・ケミストリー」258,15
65−1570（1983））。
CRM197はジフテリア毒素と同じ分子量を有し、かつこの
毒素のものと機能および構造について一致するフラグメ
ントＢと非毒性であつてかつアミノ酸１個のため元のフ
ラグメントとは異なるフラグメントＡとでなる。無毒で
あるCRM197はジフテリア毒素とは免疫学的に区別され、
したがつて、現在ワクチンの製造に使用されているジフ
テリア毒素の代用となる。実際、ホルマールによるCRM1
97の配合処理により、Guinea種の豚用のジフテリア抗体
の満足できる保護レベルが得られている（M.Porroら
「J.Infect Dis.」142,5（1980））。
毒素のものと機能および構造について一致するフラグメ
ントＢと非毒性であつてかつアミノ酸１個のため元のフ
ラグメントとは異なるフラグメントＡとでなる。無毒で
あるCRM197はジフテリア毒素とは免疫学的に区別され、
したがつて、現在ワクチンの製造に使用されているジフ
テリア毒素の代用となる。実際、ホルマールによるCRM1
97の配合処理により、Guinea種の豚用のジフテリア抗体
の満足できる保護レベルが得られている（M.Porroら
「J.Infect Dis.」142,5（1980））。
しかしながら、現在までのところ、ジフテリア毒素と免
疫交さ性を有しかつUchidaにより開示された方法によつ
て得られる生成物の開発については、このようなタンパ
ク質の培養合成の収率が低いため、制約を受けている。
疫交さ性を有しかつUchidaにより開示された方法によつ
て得られる生成物の開発については、このようなタンパ
ク質の培養合成の収率が低いため、制約を受けている。
本発明の目的は、ジフテリア毒素と免疫交さ性を有する
タンパク質をコード化しかつその染色体内にノンタンデ
ムモードで組込まれた２つの変異フアージを有するコリ
ネバクテリウム・ジフテリアエ（Corynebacterium diph
theriae）に属する微生物を、鉄イオン0.05ないし0.5μ
g/mlを含有する液状栄養培地中で、温度30ないし40℃、
中性培養雰囲気において、好気的条件下で培養すること
によつてジフテリア毒素と免疫交さ性を有するタンパク
質を製造する方法を提供することにある。
タンパク質をコード化しかつその染色体内にノンタンデ
ムモードで組込まれた２つの変異フアージを有するコリ
ネバクテリウム・ジフテリアエ（Corynebacterium diph
theriae）に属する微生物を、鉄イオン0.05ないし0.5μ
g/mlを含有する液状栄養培地中で、温度30ないし40℃、
中性培養雰囲気において、好気的条件下で培養すること
によつてジフテリア毒素と免疫交さ性を有するタンパク
質を製造する方法を提供することにある。
さらに詳述すれば、本発明の目的は、染色体内にノンタ
ンデムモードで組込まれた２つのβ45変異フアージをも
つC7（β45）M8菌株および染色体内にノンタンデムモー
ドで組込まれた２つのβ197フアージをもつC7（β197）
M1菌株を培養することにより、それぞれ、収率50ないし
200Lf/mlでCRM45をおよび収率30ないし60Lf/mlでCRM197
を製造できる方法を提供することにある。
ンデムモードで組込まれた２つのβ45変異フアージをも
つC7（β45）M8菌株および染色体内にノンタンデムモー
ドで組込まれた２つのβ197フアージをもつC7（β197）
M1菌株を培養することにより、それぞれ、収率50ないし
200Lf/mlでCRM45をおよび収率30ないし60Lf/mlでCRM197
を製造できる方法を提供することにある。
本発明は、本質的には、コリネバクテリウム・ジフテリ
アエC7（ATCC−27010）菌株が染色体内に、フアージDNA
が組込まれうる２つの付着部位（attB）を有していると
のかなり驚くべき事実の発見に基いている。
アエC7（ATCC−27010）菌株が染色体内に、フアージDNA
が組込まれうる２つの付着部位（attB）を有していると
のかなり驚くべき事実の発見に基いている。
Campbell氏法（Epitomes Adv.Genetics」11,101−145
（1982））によるフアージの溶原化法（lysigenic proc
ess）を第1A図に示すが、その方法は特定部位attpにお
ける環状フアージDNAの開裂および細菌染色体の同等の
特定部位attB（付着部位と呼ばれる）での一体化であ
る。現在までのところ、公知のいずれの配置において
も、１つのattP部位および１つのattB部位が一致してい
た。
（1982））によるフアージの溶原化法（lysigenic proc
ess）を第1A図に示すが、その方法は特定部位attpにお
ける環状フアージDNAの開裂および細菌染色体の同等の
特定部位attB（付着部位と呼ばれる）での一体化であ
る。現在までのところ、公知のいずれの配置において
も、１つのattP部位および１つのattB部位が一致してい
た。
これに対し、コリネバクテリウム・ジフテリアエC7（AT
CC27010）菌株は、その染色体内に、２つの付着部位att
B1およびattB2を有し、ここでフアージDNAが組込まれ
る。TYE培地（若干変更を加えたもの）を使用すること
により、前記細菌の溶原化工程において以下の溶原性菌
株、すなわちフアージがattB1およびattB2の一方にのみ
存在する場合にはモノ溶原菌（monolysogen）、２つの
フアージが一方のattB部位に同時に存在する場合にはツ
イン溶原菌（twinlysogens）（タンデム）、および２つ
のフアージがその１つがattB1にかつ他の１つがattB2に
同時に存在する場合にはツイン溶原菌（ノンタンデム）
が分離されることが新たに確認された（第1B図参照）。
CC27010）菌株は、その染色体内に、２つの付着部位att
B1およびattB2を有し、ここでフアージDNAが組込まれ
る。TYE培地（若干変更を加えたもの）を使用すること
により、前記細菌の溶原化工程において以下の溶原性菌
株、すなわちフアージがattB1およびattB2の一方にのみ
存在する場合にはモノ溶原菌（monolysogen）、２つの
フアージが一方のattB部位に同時に存在する場合にはツ
イン溶原菌（twinlysogens）（タンデム）、および２つ
のフアージがその１つがattB1にかつ他の１つがattB2に
同時に存在する場合にはツイン溶原菌（ノンタンデム）
が分離されることが新たに確認された（第1B図参照）。
本発明によれば、CY培地上で育種することにより、コリ
ネバクテリウム・ジフテリアエC7（ATCC27010）に、ジ
フテリア毒素と免疫交さ性を有するタンパク質をコード
化する変異フアージを感染させる。温度35℃で48時間育
種したのち、フアージの溶菌プレートが観察され、これ
らはその内側に上記細菌の成育による不透明域を有して
いる。この溶原菌ではフアージが細菌染色体内で組込ま
れている。ついで、菌株を無菌状態で取出し、CY培地で
育種して個体コロニーを単離し、つづいて溶原性フアー
ジの存在をチエツクするため「フアージ・リリース・ア
ツセイ」（Millerら「ビロロギー（Virology）」29,410
−425（1966））により分析する。
ネバクテリウム・ジフテリアエC7（ATCC27010）に、ジ
フテリア毒素と免疫交さ性を有するタンパク質をコード
化する変異フアージを感染させる。温度35℃で48時間育
種したのち、フアージの溶菌プレートが観察され、これ
らはその内側に上記細菌の成育による不透明域を有して
いる。この溶原菌ではフアージが細菌染色体内で組込ま
れている。ついで、菌株を無菌状態で取出し、CY培地で
育種して個体コロニーを単離し、つづいて溶原性フアー
ジの存在をチエツクするため「フアージ・リリース・ア
ツセイ」（Millerら「ビロロギー（Virology）」29,410
−425（1966））により分析する。
ツイン溶原菌のスクリーニングは、組込まれた２つのフ
アージを収容する溶原菌はジフテリア毒素と免疫交さ性
を有するタンパク質のためのコード化遺伝子２個を有す
るため、これらはこのタンパク質を２倍量合成できると
の事実に基いて行なわれる。
アージを収容する溶原菌はジフテリア毒素と免疫交さ性
を有するタンパク質のためのコード化遺伝子２個を有す
るため、これらはこのタンパク質を２倍量合成できると
の事実に基いて行なわれる。
それぞれジフテリア抗毒素血清３、４、６、８または12
U/mlを含有するTYE培地を使用してプレートを調製し、
つづいて移植板によつて個々の血清濃度について各溶原
菌をアツセイする。agar−agarを通つての拡散により、
各溶原菌によつて生成されたタンパク質は培地中に存在
する抗体から沈殿された暈輪（halo）を形成する。その
サイズは個体コロニーによつて生成されたCRMの量に直
接比例する。
U/mlを含有するTYE培地を使用してプレートを調製し、
つづいて移植板によつて個々の血清濃度について各溶原
菌をアツセイする。agar−agarを通つての拡散により、
各溶原菌によつて生成されたタンパク質は培地中に存在
する抗体から沈殿された暈輪（halo）を形成する。その
サイズは個体コロニーによつて生成されたCRMの量に直
接比例する。
抗体濃度3U/mlのプレートでは、すべての溶原菌が同一
の暈輪を形成する。抗体を中位の濃度（４−6U/ml）で
含有するプレートでは、各種のサイズ（すなわちモノ溶
原菌では非常に小さく、ツイン溶原菌ではより大きい）
の暈輪が観察される。抗体濃度８ないし12U/mlのプレー
トでは、ツイン溶原菌のみが沈殿暈輪を形成する。
の暈輪を形成する。抗体を中位の濃度（４−6U/ml）で
含有するプレートでは、各種のサイズ（すなわちモノ溶
原菌では非常に小さく、ツイン溶原菌ではより大きい）
の暈輪が観察される。抗体濃度８ないし12U/mlのプレー
トでは、ツイン溶原菌のみが沈殿暈輪を形成する。
第２図は抗体6U/mlを含有するTYEプレートの写真であつ
て、この写真で、異なるサイズの３つの暈輪が識別で
き、これらは異なる溶原菌、すなわちモノ溶原菌（小さ
い暈輪）、タンデム形ツイン溶原菌（暈輪Ａ）およびノ
ンタンデム形ツイン溶原菌（暈輪Ｂ）に相当する。
て、この写真で、異なるサイズの３つの暈輪が識別で
き、これらは異なる溶原菌、すなわちモノ溶原菌（小さ
い暈輪）、タンデム形ツイン溶原菌（暈輪Ａ）およびノ
ンタンデム形ツイン溶原菌（暈輪Ｂ）に相当する。
次に、常法に従つて染色体DNAの精製によりフアージの
分子構成を明らかにすることによつて、大きい暈輪を有
する溶原菌はその各染色体内に組込まれた２つのフアー
ジを含有するものであることを証明する。
分子構成を明らかにすることによつて、大きい暈輪を有
する溶原菌はその各染色体内に組込まれた２つのフアー
ジを含有するものであることを証明する。
第1B図では、部位ＡおよびＢにおいて制限酵素によりフ
アージDNAを切断すれば１個のABフラグメントが得られ
るが、仮に同じ酵素をモノ溶原菌についても使用すると
すれば、２つのフラグメントＡおよびＢ（これらはいず
れも細菌染色体の一部を含有する）が得られるはずであ
り、同様にノンタンデム形ツイン溶原菌については４つ
のフラグメントが、またタンデム形ツイン溶原菌につい
ては３つのフラグメントが得られるはずであることがわ
かる。事実、第３に示す如く、32PでラベルしたattP部
位を含有するβBam4フラグメントを指標として使用して
Southern blotの方法（ジナーナル・オブ・モレキユラ
ー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）」98,503−517,（197
5））に従つて行なつた分析では、第1B図の分析に基い
て予想したものとバンドの数および位置の両方で一致し
た。
アージDNAを切断すれば１個のABフラグメントが得られ
るが、仮に同じ酵素をモノ溶原菌についても使用すると
すれば、２つのフラグメントＡおよびＢ（これらはいず
れも細菌染色体の一部を含有する）が得られるはずであ
り、同様にノンタンデム形ツイン溶原菌については４つ
のフラグメントが、またタンデム形ツイン溶原菌につい
ては３つのフラグメントが得られるはずであることがわ
かる。事実、第３に示す如く、32PでラベルしたattP部
位を含有するβBam4フラグメントを指標として使用して
Southern blotの方法（ジナーナル・オブ・モレキユラ
ー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）」98,503−517,（197
5））に従つて行なつた分析では、第1B図の分析に基い
て予想したものとバンドの数および位置の両方で一致し
た。
第３図において、フアージのDNA（Ａ）は１つのバンド
を、モノ溶原菌のDNA（Ｂ）は２つのバンドを、ノンタ
ンデム形ツイン溶原菌のDNA（Ｃ）は４つのバンドを与
え、一方、タンデム形ツイン溶原菌（Ｄ）は３つのバン
ドを与え、そのうちの１つはフアージのものとともに移
動している。
を、モノ溶原菌のDNA（Ｂ）は２つのバンドを、ノンタ
ンデム形ツイン溶原菌のDNA（Ｃ）は４つのバンドを与
え、一方、タンデム形ツイン溶原菌（Ｄ）は３つのバン
ドを与え、そのうちの１つはフアージのものとともに移
動している。
ツイン溶原菌の安定性を、古い培地（５日後のもの）か
ら個体コロニーを取出し、CY培地上で育種し、暈輪法に
より１または２つのフアージの存在を確認することによ
りチエツクした。分析では次の結果を示した。すなわ
ち、タンデム形ツイン溶原菌はフアージを失ないモノ溶
原菌に変化される傾向があるため安定性に乏しい。テス
トしたコロニー250のうち約180がモノ溶原菌となつた。
一方、ノンタンデム形ツイン溶原菌は極めて安定であつ
た。事実、テストしたコロニー450についてモノ溶原菌
は全く見られなかつた。
ら個体コロニーを取出し、CY培地上で育種し、暈輪法に
より１または２つのフアージの存在を確認することによ
りチエツクした。分析では次の結果を示した。すなわ
ち、タンデム形ツイン溶原菌はフアージを失ないモノ溶
原菌に変化される傾向があるため安定性に乏しい。テス
トしたコロニー250のうち約180がモノ溶原菌となつた。
一方、ノンタンデム形ツイン溶原菌は極めて安定であつ
た。事実、テストしたコロニー450についてモノ溶原菌
は全く見られなかつた。
本発明に従つて、C7菌株にCRM45タンパク質をコード化
するβ45変異フアージあるいはCRM197をコード化するβ
197フアージを感染させたところ、次の溶原菌が単離さ
れた。すなわち、C7（β45）M3およびC7（β197）M
5（モノ溶原菌）、C7（β45）M11、およびC7（β197）M
8（タンデム形ツイン溶原菌）およびC7（β45）M8およ
びC7（β197）M1（ノンタンデム形ツイン溶原菌）であ
る。
するβ45変異フアージあるいはCRM197をコード化するβ
197フアージを感染させたところ、次の溶原菌が単離さ
れた。すなわち、C7（β45）M3およびC7（β197）M
5（モノ溶原菌）、C7（β45）M11、およびC7（β197）M
8（タンデム形ツイン溶原菌）およびC7（β45）M8およ
びC7（β197）M1（ノンタンデム形ツイン溶原菌）であ
る。
このうち菌株C7（β45）M8およびC7（β197）M1は、寄
託機関であるアメリカン・タイプ・カルチヤー・コレク
シヨン・アクセツシヨンに寄託してあり、寄託番号はそ
れぞれATCC−39526およびATCC−39255である。
託機関であるアメリカン・タイプ・カルチヤー・コレク
シヨン・アクセツシヨンに寄託してあり、寄託番号はそ
れぞれATCC−39526およびATCC−39255である。
いくつかの溶原性菌株について、好気的条件下、鉄イオ
ン0.05ないし0.5μg/ml、好ましくは0.1μg/mlを含有す
る液状栄養培地中で、温度30ないし40℃、好ましくは35
ないし37℃、pH中性において、培地中に多量のタンパク
質が生成されるに必要な時間育成することによつて行な
うCRM45およびCRM197の生成について試験した。つづい
て、タンパク質を回収し、当分野で公知の常法により精
製した。
ン0.05ないし0.5μg/ml、好ましくは0.1μg/mlを含有す
る液状栄養培地中で、温度30ないし40℃、好ましくは35
ないし37℃、pH中性において、培地中に多量のタンパク
質が生成されるに必要な時間育成することによつて行な
うCRM45およびCRM197の生成について試験した。つづい
て、タンパク質を回収し、当分野で公知の常法により精
製した。
上記方法で使用される培地について説明する。
沈殿暈輪を生成するためのTYE培地 元来のPappenheimerの組成（「Inf.Imm.」18,203−209
（1977））に若干の変更を加え、以下の組成とした。
（1977））に若干の変更を加え、以下の組成とした。
トリプトース 10g 酵母エキス 5g NaCl 5g KH2PO4 5g 水 1 pHを7.4に調整し、高温滅菌する前にCaCl2（50％）2ml
を添加する。沈殿物を静置させたのち、溶液II2ml/、
溶液III1ml/およびnoble agar−agar12ml/を添加す
る。最後に、馬血液抗ジフテリア血清を、期待される暈
輪に応じて濃度４、６、８または12U/mlで添加する。
を添加する。沈殿物を静置させたのち、溶液II2ml/、
溶液III1ml/およびnoble agar−agar12ml/を添加す
る。最後に、馬血液抗ジフテリア血清を、期待される暈
輪に応じて濃度４、６、８または12U/mlで添加する。
CRMタンパク質を生成するためのCY培地 酵母エキス20g、カザミノ酸10g、１％トリプトフアン5m
l、KH2PO45gおよび水１でなる液（pH7.4）を沸騰さ
せ、沸騰時Whatmanフイルタ上で過する。溶液II2ml、
溶液III1mlを添加し、ついで反応混合物をオートクレー
ブに導入する。使用前にマルトース−CaCl2の溶液を培
地100ml当り3mlの量で添加する。
l、KH2PO45gおよび水１でなる液（pH7.4）を沸騰さ
せ、沸騰時Whatmanフイルタ上で過する。溶液II2ml、
溶液III1mlを添加し、ついで反応混合物をオートクレー
ブに導入する。使用前にマルトース−CaCl2の溶液を培
地100ml当り3mlの量で添加する。
溶液II MgSO4・7H2O22.5g、アラニン115mg、ニコチン酸115mgを
用意し、ついでこれら成分を溶解させるため水1mlおよ
び濃HClを添加し、その後、ピメリン酸7.5mg、CuSO4・5
H2O（１％）5ml、１％ZnSO4・5H2O4ml、１％MnCl2・4H2
O1.5mlおよび濃HCl3mlを加え、最後に水を加えて全量10
0mlとする。
用意し、ついでこれら成分を溶解させるため水1mlおよ
び濃HClを添加し、その後、ピメリン酸7.5mg、CuSO4・5
H2O（１％）5ml、１％ZnSO4・5H2O4ml、１％MnCl2・4H2
O1.5mlおよび濃HCl3mlを加え、最後に水を加えて全量10
0mlとする。
溶液III Ｌ−シスチン20g、濃HCl20mlに水を加えて全量100mlと
する。
する。
マルトース−CaCl2溶液 マルトース50g、50％CaCl22ml、KH2PO41gに水を加えて
全量100mlとする。pHを7.4に調整し、溶液をWhatman40
紙上で過し、その後、溶液をオートクレーブに入れ
る。
全量100mlとする。pHを7.4に調整し、溶液をWhatman40
紙上で過し、その後、溶液をオートクレーブに入れ
る。
次に図面について説明する。
第1A図： Campbell氏法による溶原化工程 フアージDNAを特殊な部位attPで切断し、細菌染色体に
おける同等の特殊部位attBで一体化させる。
おける同等の特殊部位attBで一体化させる。
第1B図： コリネバクテリウム・ジフテリアエC7（ATCC27010）に
ついての溶原化工程 フアージDNAを付着部位attPで切断し、細菌染色体内に
存在する２つの付着部位attB1およびattB2で一体化し
て、モノ溶原菌、タンデム形ツイン溶原菌およびノンタ
ンデム形ツイン溶原菌を生ずる。
ついての溶原化工程 フアージDNAを付着部位attPで切断し、細菌染色体内に
存在する２つの付着部位attB1およびattB2で一体化し
て、モノ溶原菌、タンデム形ツイン溶原菌およびノンタ
ンデム形ツイン溶原菌を生ずる。
第２図： 抗ジフテリア血清6U/mlを含有するTYE培地でなるプレー
ト ３つの沈殿暈輪、すなわち、非常に小さい暈輪（モノ溶
原菌）、中位の暈輪Ａ（タンデム形ツイン溶原菌）およ
び大きい暈輪Ｂ（ノンタンデム形ツイン溶原菌）が識別
される。
ト ３つの沈殿暈輪、すなわち、非常に小さい暈輪（モノ溶
原菌）、中位の暈輪Ａ（タンデム形ツイン溶原菌）およ
び大きい暈輪Ｂ（ノンタンデム形ツイン溶原菌）が識別
される。
第３図： Southern blot法による溶原菌のDNAの分析DNAをBamH1で
消化し、アガロースゲル（1.3％）上でフラグメントを
分離し、ニトロセルロースに移入させ、その後、32Pで
ラベルしたattP部位を含有するβBam4フラグメントと交
雑させる。βBam4フラグメントは第1B図のフラグメント
ABに相当する。フアージDNA（Ａ）にはただ１つのフラ
グメントABが見られ、モノ溶原菌（Ｂ）では２つのフラ
グメントABが、ノンタンデム形ツイン溶原菌（Ｃ）では
４つのフラグメントが、さらにタンデム形ツイン溶原菌
（Ｄ）では３つのフラグメントが見られる。
消化し、アガロースゲル（1.3％）上でフラグメントを
分離し、ニトロセルロースに移入させ、その後、32Pで
ラベルしたattP部位を含有するβBam4フラグメントと交
雑させる。βBam4フラグメントは第1B図のフラグメント
ABに相当する。フアージDNA（Ａ）にはただ１つのフラ
グメントABが見られ、モノ溶原菌（Ｂ）では２つのフラ
グメントABが、ノンタンデム形ツイン溶原菌（Ｃ）では
４つのフラグメントが、さらにタンデム形ツイン溶原菌
（Ｄ）では３つのフラグメントが見られる。
第４図： 各溶原菌によるCRM197の生成状態を示すグラフ 記号○で示す曲線はモノ溶原性菌株C7（β197）M5によ
るCRM197の生成に係わり、記号▽で示す曲線はタンデム
形ツイン溶原性菌株C7（β197）M8による場合、記号□
で示す曲線はノンタンデム形ツイン溶原性菌株C7（β19
7）M1による場合に係わる。なお、記号■で示す曲線は
培地の光学密度の変化を表わす。
るCRM197の生成に係わり、記号▽で示す曲線はタンデム
形ツイン溶原性菌株C7（β197）M8による場合、記号□
で示す曲線はノンタンデム形ツイン溶原性菌株C7（β19
7）M1による場合に係わる。なお、記号■で示す曲線は
培地の光学密度の変化を表わす。
以下の実施例は本発明を説明するためのものであつて、
本発明を限定するものではない。
本発明を限定するものではない。
実施例１ それぞれCY培地10mlを収容するフラスコ（容積125ml）
を用意し、120℃で15分間殺菌した。各フラスコに、CY
プレート上で35℃において24時間育成しておいた溶原性
菌株、すなわちC7（β197）M5、C7（β197）M8およびC7
（β197）M1を白金耳１滴に相当する量で接種した。こ
のように接種したフラスコを35℃で１液培養した。
を用意し、120℃で15分間殺菌した。各フラスコに、CY
プレート上で35℃において24時間育成しておいた溶原性
菌株、すなわちC7（β197）M5、C7（β197）M8およびC7
（β197）M1を白金耳１滴に相当する量で接種した。こ
のように接種したフラスコを35℃で１液培養した。
各々の培地0.1mlを、それぞれ脱鉄火したCY培地10mlを
収容するエルレンマイヤーフラスコ（容積125ml）に接
種し、Fe++0.1μg/mlを添加し、回転撹拌機上、240rp
m.、45時間、温度35℃で培養を行なつた。
収容するエルレンマイヤーフラスコ（容積125ml）に接
種し、Fe++0.1μg/mlを添加し、回転撹拌機上、240rp
m.、45時間、温度35℃で培養を行なつた。
２時間毎にサンプル抽出し、それぞれについて、光学密
度および上澄液に放出されたCRM197の含量を測定した。
光学密度については、Perkin−Elmer Mod.35分光光度計
（光路1cm）を使用し、590nmで測定を行ない、CRM197の
含量については、ロケツト免疫電気泳動法（Murfyら
「ジヤーナル・オブ・クリニカル・ミクロバイオロジー
（J.Clin.Microbiol.）」７,91−96（1978））および／
またはフロキユレーシヨン法（G.Ramon「C.R.Soc.Bio
l.」86,661−671（1922））により測定した。なお、フ
ロキユレーシヨンの単位を、G.Ramonが前記「C.R.Soc.B
iol（パリ）」に報告している如くLf/mlで示した。得ら
れた結果を第４図に図示した。このグラフから見られる
ように、CRM197の生成は、培地の光学密度が対数増殖期
に相当する4.5ないし５（O.D.）に達する前には、開始
されない。この対数期の終末期になるにつれて、CRM197
の生成が始まり、定常期の開始まで続き（約20時間）、
この時点で最大光学密度およびCRM197の最大量が観察さ
れる。育成24時間を越ると、30時間後ではCRM197の生成
の減少は25％であり、45時間後では減少は75％である。
度および上澄液に放出されたCRM197の含量を測定した。
光学密度については、Perkin−Elmer Mod.35分光光度計
（光路1cm）を使用し、590nmで測定を行ない、CRM197の
含量については、ロケツト免疫電気泳動法（Murfyら
「ジヤーナル・オブ・クリニカル・ミクロバイオロジー
（J.Clin.Microbiol.）」７,91−96（1978））および／
またはフロキユレーシヨン法（G.Ramon「C.R.Soc.Bio
l.」86,661−671（1922））により測定した。なお、フ
ロキユレーシヨンの単位を、G.Ramonが前記「C.R.Soc.B
iol（パリ）」に報告している如くLf/mlで示した。得ら
れた結果を第４図に図示した。このグラフから見られる
ように、CRM197の生成は、培地の光学密度が対数増殖期
に相当する4.5ないし５（O.D.）に達する前には、開始
されない。この対数期の終末期になるにつれて、CRM197
の生成が始まり、定常期の開始まで続き（約20時間）、
この時点で最大光学密度およびCRM197の最大量が観察さ
れる。育成24時間を越ると、30時間後ではCRM197の生成
の減少は25％であり、45時間後では減少は75％である。
CRM197の生成プロツトの傾向は、各溶原菌について実質
的に同じであるが、生成はモノ溶原菌については20Lf/m
l、タンデム形ツイン溶原菌については30Lf/mlおよびノ
ンタンデム形ツイン溶原菌については60Lf/mlである。
的に同じであるが、生成はモノ溶原菌については20Lf/m
l、タンデム形ツイン溶原菌については30Lf/mlおよびノ
ンタンデム形ツイン溶原菌については60Lf/mlである。
実施例２ 実施例１と同じ方法によつて、C7（β45）M3、C7（β4
5）M11およびC7（β45）M8を調製した。
5）M11およびC7（β45）M8を調製した。
各培地0.1mlを、それぞれ脱鉄化したCY培地10mlを収容
するフラスコ（容積125ml）に接種し、Fe++0.1μg/mlを
添加した。各フラスコを回転撹拌機（240rpm）上、35℃
で36時間培養した。発酵開始から20時間後および30時間
後に取出したサンプルについて、光学密度および上澄液
中に放出されたCRM45の生成量を測定するために、実施
例１と同じ方法で分析した。
するフラスコ（容積125ml）に接種し、Fe++0.1μg/mlを
添加した。各フラスコを回転撹拌機（240rpm）上、35℃
で36時間培養した。発酵開始から20時間後および30時間
後に取出したサンプルについて、光学密度および上澄液
中に放出されたCRM45の生成量を測定するために、実施
例１と同じ方法で分析した。
得られた結果を次表に示す。
上述の結果では、CRM45の生成量の最大値は培養30時間
後に見られ、モノ溶原菌とタンデム形ツイン溶原菌とは
実質的に同じであり、ノンタンデム形ツイン溶原菌では
ほぼ２倍であることがわかる。
後に見られ、モノ溶原菌とタンデム形ツイン溶原菌とは
実質的に同じであり、ノンタンデム形ツイン溶原菌では
ほぼ２倍であることがわかる。
実施例３ 溶原菌C7（β45）M8の予培養物を実施例１と同様にして
調製し、この予培養物2mlを、それぞれ脱鉄化したCY倍
地500mlを収容した２つのエルレンマイヤーフラスコ
（容積2000ml）に移植し、Fe++0.1μg/mlを添加し、撹
拌（240rpm）しながら温度35℃で24時間培養した。得ら
れた溶原菌含有倍地1000mlを、溶液50のポツト形フア
ーメンタに収容されたFe++イオン濃度0.1μg/mlのCY倍
地40に接種し、温度37℃において、底部から頂部に向
つて15／分で通気し、600rpmで撹拌しかつ倍地のpHを
20％グルコース溶液または４規定NaOHで6.5ないし7.5に
維持しながら40時間培養を行なつた。発酵30時間後のCR
M45の量は200Lf/mlであつた。得られたブロス倍地に連
続流動遠心分離機で遠心分離し、上澄液に硫酸アンモニ
ウムを飽和度75％で添加することによりタンパク質を沈
殿させ、回収した。得られたスラリを遠心分離し、沈殿
物をpH7.5のリン酸塩緩衝液で洗浄後、イオン交換樹脂
（ジメチルアンモニウムメチルセルロース）を充填した
カラムを介して精製した。塩化ナトリウム溶離剤で溶出
することにより、収率80％でタンパク質が得られた。
調製し、この予培養物2mlを、それぞれ脱鉄化したCY倍
地500mlを収容した２つのエルレンマイヤーフラスコ
（容積2000ml）に移植し、Fe++0.1μg/mlを添加し、撹
拌（240rpm）しながら温度35℃で24時間培養した。得ら
れた溶原菌含有倍地1000mlを、溶液50のポツト形フア
ーメンタに収容されたFe++イオン濃度0.1μg/mlのCY倍
地40に接種し、温度37℃において、底部から頂部に向
つて15／分で通気し、600rpmで撹拌しかつ倍地のpHを
20％グルコース溶液または４規定NaOHで6.5ないし7.5に
維持しながら40時間培養を行なつた。発酵30時間後のCR
M45の量は200Lf/mlであつた。得られたブロス倍地に連
続流動遠心分離機で遠心分離し、上澄液に硫酸アンモニ
ウムを飽和度75％で添加することによりタンパク質を沈
殿させ、回収した。得られたスラリを遠心分離し、沈殿
物をpH7.5のリン酸塩緩衝液で洗浄後、イオン交換樹脂
（ジメチルアンモニウムメチルセルロース）を充填した
カラムを介して精製した。塩化ナトリウム溶離剤で溶出
することにより、収率80％でタンパク質が得られた。
第1A図はCampbell氏法による溶原化工程を説明する図、
第1B図はコリネバクテリウム・ジフテリアエC7について
の溶原化工程を説明する図、第２図は抗ジフテリア血清
を含有するTYE培地での培養状態を示す写真、第３図はS
outhen blot法による溶原菌DNAの分析結果を示す写真お
よび第４図は各溶原菌によるCRM197の生成状態を示すグ
ラフである。
第1B図はコリネバクテリウム・ジフテリアエC7について
の溶原化工程を説明する図、第２図は抗ジフテリア血清
を含有するTYE培地での培養状態を示す写真、第３図はS
outhen blot法による溶原菌DNAの分析結果を示す写真お
よび第４図は各溶原菌によるCRM197の生成状態を示すグ
ラフである。
Claims (7)
- 【請求項１】ジフテリア毒素と免疫交さ性を有するタン
パク質の製法において、ジフテリア毒素と免疫交さ性を
有するタンパク質をコード化しかつ染色体の２つの付着
部位においてノンタンデムモードで組込まれた２つの変
異フアージを有するコリネバクテリウム・ジフテリアエ
（Corynebacterium diphtheriae）に属する微生物を、
鉄イオン0.05ないし0.5μg/mlを含有する液状栄養培地
中で、温度30ないし40℃、pH中性において、好気的条件
下で培養することを特徴とする、ジフテリア毒素と免疫
交さ性を有するタンパク質の製法。 - 【請求項２】ジフテリア毒素と免疫交さ性を有するタン
パク質がCRM45タンパク質である特許請求の範囲第１項
記載の製法。 - 【請求項３】前記微生物が、染色体内にノンタンデムモ
ードで組込まれた２つのβ45変異フアージを有するC
7（β45）M8 ATCC−39526である特許請求の範囲第２項
記載の製法。 - 【請求項４】ジフテリア毒素と免疫交さ性を有するタン
パク質がCRM197タンパク質である特許請求の範囲第１項
記載の製法。 - 【請求項５】前記微生物が、染色体内にノンタンデムモ
ードで組込まれた２つのβ197変異フアージを有するC7
（β197）M1 ATCC−39255である特許請求の範囲第４項
記載の製法。 - 【請求項６】前記微生物の分離を、抗ジフテリア血清４
ないし12U/mlを含有する固状栄養培地を使用して行なう
特許請求の範囲第１項記載の製法。 - 【請求項７】前記液状栄養培地中の鉄イオンの濃度が0.
1μg/mlである特許請求の範囲第１項記載の製法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT19462/83A IT1193665B (it) | 1983-02-08 | 1983-02-08 | Procedimento per la produzione di un tossoide difterico con rese elevate |
| IT24020/83A IT1167672B (it) | 1983-12-05 | 1983-12-05 | Procedimento per la produzione di proteine correlate alla tossina difterica |
| IT19462A/83 | 1983-12-05 | ||
| IT24020A/83 | 1983-12-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6034918A JPS6034918A (ja) | 1985-02-22 |
| JPH0789950B2 true JPH0789950B2 (ja) | 1995-10-04 |
Family
ID=26327173
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59020118A Expired - Lifetime JPH0789950B2 (ja) | 1983-02-08 | 1984-02-08 | ジフテリア毒素と免疫交さ性を有するタンパク質の製法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4925792A (ja) |
| JP (1) | JPH0789950B2 (ja) |
| CA (1) | CA1212642A (ja) |
| CH (1) | CH660375A5 (ja) |
| DE (1) | DE3404434C2 (ja) |
| ES (1) | ES529698A0 (ja) |
| FR (1) | FR2540516B1 (ja) |
| LU (1) | LU85197A1 (ja) |
| NL (1) | NL192208C (ja) |
Families Citing this family (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5785973A (en) * | 1988-02-01 | 1998-07-28 | Praxis Biologics, Inc. | Synthetic peptides representing a T-cell epitope as a carrier molecule for conjugate vaccines |
| US5637303A (en) * | 1990-10-25 | 1997-06-10 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Use of a phospholipase D mutant of Corynebacterium pseudotuberculosis for vaccination |
| CA2094718A1 (en) * | 1990-10-25 | 1992-04-26 | Anthony J. Radford | Corynebacteria and related organisms as vaccine vectors |
| USH1985H1 (en) | 1992-01-09 | 2001-08-07 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Method for detecting biological toxins |
| DE69434079T2 (de) * | 1993-03-05 | 2005-02-24 | Wyeth Holdings Corp. | Plasmid zur Herstellung von CRM-Protein und Diphtherie-Toxin |
| GB9326174D0 (en) * | 1993-12-22 | 1994-02-23 | Biocine Sclavo | Mucosal adjuvant |
| US6818222B1 (en) | 1997-03-21 | 2004-11-16 | Chiron Corporation | Detoxified mutants of bacterial ADP-ribosylating toxins as parenteral adjuvants |
| GB9904582D0 (en) * | 1999-02-26 | 1999-04-21 | Nycomed Imaging As | Process |
| MX339524B (es) | 2001-10-11 | 2016-05-30 | Wyeth Corp | Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica. |
| US7785608B2 (en) * | 2002-08-30 | 2010-08-31 | Wyeth Holdings Corporation | Immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease |
| US7301554B2 (en) * | 2002-09-20 | 2007-11-27 | Ricoh Company, Ltd. | Light scanning device, scanning line adjusting method, scanning line adjusting control method, image forming apparatus, and image forming method |
| US7212708B2 (en) * | 2003-10-22 | 2007-05-01 | Jds Uniphase Corporation | Optical grating based multiplexer device with power tap capability |
| GB0505996D0 (en) | 2005-03-23 | 2005-04-27 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Fermentation process |
| IL308456A (en) | 2005-04-08 | 2024-01-01 | Wyeth Llc | A multivalent pneumomuroral protein-polysaccharide conjugate preparation |
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| IT1398927B1 (it) | 2009-06-25 | 2013-03-28 | Consorzio Interuniversitario Per Lo Sviluppo Dei Sistemi A Grande Interfase Csgi | Espressione batterica di un gene artificiale per la produzione di crm197 e derivati. |
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