NL192208C - Werkwijze voor het bereiden van met difterie-toxine verwante eiwitten. - Google Patents

Description

1 192208

Werkwijze voor het bereiden van met difterie-toxine verwante eiwitten

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de bereiding van een met difterie-toxine verwant eiwit, omvattende het kweken in een vloeibaar voedingsmedium, bij een temperatuur van 30°C tot 40°C, bij een 5 neutrale pH en onder aerobe omstandigheden, van een micro-organisme behorende tot Corynebacterium diphtheriae met een voor het met difterie-toxine verwante eiwit coderende mutantfang geïntegreerd in het bacteriële chromosoom.

Een dergelijke werkwijze is beschreven door T. Uchida et al. in the Journal of Biological Chemistry, 218 biz. 3838-3844 (1973). Deze bekende werkwijze, die hierna nader besproken zal worden, heeft het bezwaar 10 dat lage opbrengsten aan eiwitten verkregen worden.

Difterie-toxine is een eiwit dat bijzonder giftig is ten opzichte van eukaryotische cellen.

Een dergelijk toxine bestaat uit twee sub-eenheden, nl.: het B-fragment, dat gebonden kan worden aan receptoren die aanwezig zijn op het membraan van de eukaryotische cel, en het A-fragment dat giftig is en na binnendringen in de cellen de eiwitsynthese daarvan blokkeert.

15 Voor het difterie-toxine wordt gecodeerd door een gen, waarvan de primaire structuur recentelijk bepaald is. (C. Ratti, R. Rappuoli, E.G. Giannini, Nucleic Acid Research, 11_, 6589, 6595, (1983)), en dat aanwezig is in het DNA van enkele bacteriofagen (p, γ, ω,) die Corynebacterium diphtheriae kunnen infecteren (J.J.

Costa et al., J. Bacteriol., 148, 124-130 (1981); V. Freeman, J. Bacteriol. 61_, 675-688 (1951)).

Deze fagen kunnen na infecteren van de bacterie deze oplossen en hierdoor doden, waardoor zij 20 opgenomen worden in de bacteriële chromosomen, waar zij slapende blijven en gerepliceerd worden ais de bacterie gerepliceerd wordt.

Het DNA van de geïntegreerde faag zal tezamen met het bacteriële chromosoom overgedragen worden aan dochtercellen die derhalve het voor het eiwit coderende gen bevatten.

Op het ogenblik wordt difterie-toxine bereid door kweken van de PW8 stam en, na verwijdering van de 25 giftwerking met formol, gebruikt voor de bereiding van antidifterie-vaccin. In Journal of Virology, 45, no. 2, biz. 524-530 (1983), waarin de uit de stam PW8 geïsoleerde toxigene bacteriofaag ω'οχ+ vergeleken wordt met de toxigene bacteriofaag p,ox+, wordt de verhoogde toxineproductie door de stam PW8 toegeschreven aan de integratie van twee co,ax+ fagen op twee verschillende plaatsen in het PW8 chromosoom.

Recentelijk zijn mutanten van de β-faag verkregen door behandeling met nitrosoguanidine door Uchida et 30 al. (Nature New Biol., 233, 8-11, (1973)).

Deze mutantfagen, die geïntegreerd worden in het bacteriële chromosoom van het Corynebacterium diptheriae micro-organisme, coderen voor de synthese van met difterie-toxine verwante eiwitten, waarvan zij verschillen in structuur en/of functie vanwege de aanwezigheid van één of meer in het structurele gen van het toxine opgenomen mutaties.

35 Eiwitten van het bovengenoemde type zijn aangeduid als kruisreagerende materialen (CRM) daar zij een immunologische reactie geven met het difterie-toxine.

Van de verschillende geïsoleerde muntantfagen, zijn in het bijzonder de fagen onderzocht die voor de eiwitten CRM 176, CRM 197, CRM 228 en CRM 45 coderen (Uchida et al., J. Biol. Chem., 218, 3838-3844 (1973)).

40 Meer in het bijzonder is het CRM 45 een eiwit bestaande uit een fragment A verwant met de structuur en functie van die van het difterie-toxine en een fragment B waarin geen segment voorkomt dat in staat is om het eiwit te binden aan de op het oppervlak van eukaryotische cellen aanwezige receptoren.

Het gevolg is dat CRM 45, niettegenstaande het een fragment A bezit, dat volledig werkzaam is jn vitro, geen in vivo werkzaamheid vertoont, daar het niet in staat is om in de cellen binnen te dringen.

45 Het fragment B bezit weliswaar, in ongewijzigde toestand, de hydrofobe structuur die noodzakelijk is om het fragment A naar het inwendige van de cel te brengen, doch is hiertoe niet in staat tengevolge van de afwezigheid van het segment voor de binding aan de receptoren. Vanwege deze eigenschappen, dat wil zeggen aanwezigheid van het werkzame fragment A, en de aanwezigheid in het fragment B van een structuur die nodig is om het fragment A in het inwendige van de cel te kunnen brengen, alsmede 50 afwezigheid van het gedeelte voor het herkennen van de receptoren van de celmembranen, is overwogen om het CRM 45 te gebruiken voor het bereiden van hybride-toxinen. Door vervangen van het ontbrekende segment door een stof zoals een antilichaam, monoclonaal antilichaam, hormoon of andere stof van biologische belang, die wel specifieke moleculen op het oppervlak van enkele cellen kan herkennen, zoals doelcellen, werd een hybride-toxine verkregen dat in staat is om slechts enkele soorten van cellen te doden. 55 Een dergelijk hybride-toxine kan een selectieve toepassing vinden in de farmacologie en vooral bij de behandeling van enkele typen tumoren (P. Bacha et al., J. Biol. Chem., 258,1565-1570, (1983)).

Het CRM 197 eiwit bezit hetzelfde molecuulgewicht als het difterie-toxine en bestaat uit fragmenten B die 192208 2 identiek zijn wat hun functie en structuur betreft aan die van het toxine en git een fragment A dat niet giftig is en van het oorspronkelijke fragment verschilt door een aminozuur. Het CRM 197 dat atoxisch is, is immunologische niet verschillend van het difterie-toxine en kan derhalve een vervangingsmiddel zijn voor het difterie-toxine zoals op het ogenblik gebruikt voor de bereiding van het vaccin. Een behandeling van 5 CRM 197 met formol is voldoende voor het verkrijgen van een bevredigend beschermingsniveau van difterie-antilichamen in Guinese biggetjes (M. Porro et al., J. Infect Dis., 142, 5 (1980)).

Tot nu toe zijn echter verdere ontwikkelingen van producten afgeleid van met het difterie-toxine verwante eiwitten en verkregen volgens de werkwijze als beschreven door Uchida, afgeremd door de lage opbrengsten bij het kweken van dergelijke eiwitten.

10 De onderhavige uitvinding beoogt nu een werkwijze te verschaffen voor de bereiding van met difterie-toxine veiwante eiwitten, die het mogelijk maakt om hoge opbrengsten aan dergelijke eiwitten te verkrijgen.

Meer in het bijzonder beoogt de uitvinding een werkwijze te verschaffen voor het bereiden van CRM 45 met opbrengsten van 50 Lf/ml tot 200 Lf/ml en CRM 197 met opbrengsten van 30 Lf/ml tot 60 Lf/ml. LF/ml geeft de eenheid van uitvlokking aan zoals beschreven door G. Ramon in C.R. Soc. Biol. (Parijs), 86, 15 661-671 (1922). Deze oogmerken worden bereikt door de werkwijze der onderhavige uitvinding, die gekenmerkt is, doordat het toegepaste micro-organisme twee voor het met difterie-toxine verwante eiwit coderende mutantfagën bevat, die op niet-tandem wijze aanwezig zijn op twee bevestigingsplaatsen in het bacteriële chromosoom, en men het kweken uitvoert in een voedingsmedium, dat een concentratie aan ijzerionen van 0,05-0,5 pg/ml bevat.

20 De onderhavige uitvinding berust in wezen op de tamelijk verrassende vondst dat de Corynebacterium diphtheriae C7 (ATCC 27010) stam in zijn eigen chromosoom twee hechtingsplaatsen attB bezit waar het DNA van de faag opgenomen kan worden. De lysis van een faag volgens de Campbell methode (Epitomes Adv. Genetics, 11_, 101-145, (1982) zoals weergegeven in figuur 1A, veronderstelt het splijten van het circulaire DNA van de faag op een specifiek punt attP, en de integratie op een eveneens specifiek punt van 25 het bacteriële chromosoom, attB, welke de bevestigingsplaats genoemd wordt. Tot nu toe zijn in alle bekende configuraties één enkele attP plaats en één enkele attB geïdentificeerd.

Vastgesteld is nu, dat Corynebacterium diphtheriae C7 (ATCC 27010) stam in zijn chromosoom twee bevestigingsplaatsen bezit, attB1 en attB2> waar het DNA van de faag geïntegreerd kan worden. Door gebruik te maken van het TYE kweekmedium, zoals gemodificeerd door aanvraagster, zijn volgens de 30 lysigeniseringswerkwijze van de bacterie, de volgende lysigene stammen verkregen: monolysigenen, als de faag slechts eenmaal aanwezig is op de plaats attB, of attB2, twinlysigenen (tandem) als twee fagen gelijktijdig aanwezig zijn op een enkele attB plaats en niet-tandem twinlysigenen als twee fagen gelijktijdig aanwezig zijn, de ene op de plaats attB, en de andere op de plaats attB2 (figuur 1B).

Voor het verwezenlijken van de onderhavige uitvinding werd Corynebacterium diphtheriae C7 (ATCC 35 27010) geïnfecteerd met een muntantfaag die codeert voor het met het difterie-toxine verwante eiwit door uitzaaien op een CY kweekmedium.

Na 48 uur kweken bij 35°C werd lysis van de faagplaten waargenomen, die in hun inwendige een niet doorzichtige zone bevatten tengevolge van de groei van deze bacteriën, waarbij de faag geïntegreerd is in het bacteriële chromosoom.

40 De stammen werden steriel gekweekt en uitgezaaid op een CY medium of afzonderlijke kolonies te isoleren, die vervolgens geanalyseerd kunnen worden om de aanwezigheid van lysigene fagen aan te tonen volgens de ”faag vrijmakingsproef” (Miller et al., Virology, 29, 410-425, (1966)).

Een twinlysigeen onderzoek werd uitgevoerd op basis van het feit dat de lysigenen, die twee paren van de geïntegreerde faag bevatten, twee voor het met difterie-toxine verwante eiwit coderende genen bevatten, 45 zodat zij een dubbele hoeveelheid van dit eiwit kunnen vormen.

Platen zijn bereid uit het TYE kweekmedium die elk 3, 4, 6, 8,12 I.E./ml antitoxineserum bevatten en elk lysigeen is vervolgens onderzocht voor elke afzonderlijke serumconcentratie door plaatsoverdracht. Het door de verschillende lysigenen door diffusie op de agar-agar gevormde eiwit werd neergeslagen uit het in het medium aanwezige antilichaam, waardoor een halo ontstaat waarvan de grootte direct evenredig was met 50 de hoeveelheid door de afzonderlijke kolonies gevormd CRM.

In de platen die een antilichaam-concentratie bevatten van 3 I.E./ml vormden alle lysigenen een identieke halo. In de platen met een tussenliggende concentratie, 4-6 I.E./ml antilichamen, werden halo’s van verschillende afmetingen waargenomen, zeer kleine voor de monolysigenen en grotere voor de twinlysigenen.

55 In de platen die een antilichaam-concentratie bevatten van 8 tot 12 I.E./m! vertoonden alleen de twinlysigenen een neerslaghalo.

Figuur 2 toont een foto van een TYE plaat die 6 I.E./ml antilichaam bevat, waardoor het mogelijk is om 3 192208 drie halo’s van verschillende lysigenen: monolysigenen {kleine halo), tandem-twinlysigenen (halo A) en niet-tandem twinlysigenen (halo B).

Het aantonen dat de lysigenen met de grote halo twee in hun respectievelijk chromosomen geïntegreerde fagen bevatten, is uitgevoerd door de moleculaire opbouw van de fagen vast te stellen door 5 zuivering van het chromosomaal DNA volgens de bekende werkwijzen. Uit figuur 1B blijkt dat splijting van het faag-DNA op de punten A en B met een beperkend enzym, leidt tot de vorming van een AB fragment, terwijl bij gebruik van hetzelfde enzym voor het monolysigeen, twee fragmenten A en B veikregen worden, die beide een deel van het bacteriële chromosoom bevatten, vier fragmenten voor het niet-tandem twinlysigeen en drie voor het tandem twinlysigeen.

10 De analyses uitgevoerd volgens de Southern vlek methode (J. Mol, Biol., 98, 503-517, (1975) onder toepassing van het βΒβιη 4 fragment met een gelabelde attP plaats weergegeven in figuur 3, komen zowel wat aantal als plaatsen van de banden overeen met die welke voorspeld zijn op basis van de analyse van figuur 1B.

In figuur 3 geeft het DNA van de faag een enkele band (A), die van het monolysigeen twee banden (B), 15 die van het niet-tandem twinlysigeen vier banden (C), terwijl het tandem twinlysigeen drie banden geeft, waarvan één tezamen met die van faag (D) beweegt.

De stabiliteit van de twinlysigenen is onderzocht door uit oude kweken (5 dagen oud) afzonderlijke kolonies te nemen, deze te enten op een CY medium en met de halo-methode de aanwezigheid van één of twee fagen aan te tonen. De analyse gaf de volgende resultaten: de tandem twinlysigenen waren buitenge-20 woon instabiel tengevolge van het ontbreken van een faag en werden derhalve omgezet in monolysigenen. Uit 250 onderzochte kolonies ontstonden ongeveer 180 monolysigenen, terwijl de twinlysigenen van het niet-tandem type buitengewoon stabiel waren: uit 450 onderzochte kolonies ontstond geen enkel monolysigeen.

De C7 stam werd geïnfecteerd met de β45 mutant-faag die codeert voor het CRM45 eiwit en de β197 25 faag die codeert voor het CRM 197, waarbij de volgende lysigene stammen geïsoleerd zijn: C7 (β45)Μ3 en C7 (β197)Μδ (monolysigenen), C7 (β45)Μ11 en C7 (β197)Μ8 (tandem-twinlysigenen), en C7 (β45)Μβ en C7 (β197)Μ1 (niet-tandem-twiniysigenen). De volgens de uitvinding toe te passen stammen C7 (β45)Μ8 en C7 (β197)Μ1 zijn gedeponeerd bij de American Type Culture Collection Accession onder de aanduiding ATCC-39526 en ATCC-39255.

30 De verschillende lysigene stammen zijn onderzocht op vorming van CRM 45 en CRM 197 door kweken onder aerobe omstandigheden en in een vloeibaar voedingsmedium met een concentratie aan ijzerionen van 0,05 pg/ml tot 0,5 pg/ml, bij voorkeur 0,1 pg/ml, bij een temperatuur van 30°C tot 40°C, bij voorkeur van 35eC tot 37°C, bij een pH van neutraal gedurende een periode die nodig was om een aanzienlijke hoeveelheid eiwitten in het kweekmedium te vormen.

35 Het eiwit werd vervolgens geïsoleerd en gezuiverd volgens een van de aan de deskundige bekende werkwijzen.

De bij de werkwijze gebruikte kweekmedia waren de volgende: TYF medium voor het vormen van de precipitatie halo 40 Het volgende medium is gemodificeerd ten opzichte van het oorspronkelijke Pappenheimer medium (Inf.lmn., 18, 203-209 (1977)) en bezit de volgende samenstelling: tryptose: 10 g, gistextract: 5 g; NaCI: 5g; KH2P04: 5g; water: 1 liter.

De pH werd ingesteld op een waarde van 7,4 en 2 ml Cacl2 (50%) aan het medium toegevoegd voor behandeling in de autoclaaf. Het neerslag laat men bezinken waarna men 2 ml/l toevoegt van een oplossing 45 II, 1 ml/l van een oplossing III en 12 ml/l van een zuivere agar-agar.

Tenslotte werd antidifterie paardenbloedserum toegevoegd in concentraties van 4, 6, 8 of 12 U/ml in overeenstemming met de te verwachten halo.

CY medium voor de vorming van CRM eiwitten

50 Gistextract: 20 g, caséïneaminozuren 10 g. 1%-tryptofaan 5 ml, KH2P04 5g, 1 liter water, worden bij een pH

7,4 aan de kook gebracht en worden nog steeds kokend op een Whatman filter gefiltreerd. Toegevoegd werden 2 ml van oplossing II, 1 ml van oplossing III en vervolgens werd het reactiemengsel in een autoclaaf geplaatst.

Voor het gebruik werd 3 ml van een oplossing van maltose van CACI2 per 100 ml medium toegevoegd.

192208 4

Oplossing II

MgS04.7H2O 22,5 g, alanine 115 mg, nicotinezuur 115 mg. Men voegt 1 ml water toe en geconcentreerd zoutzuur om de bestanddelen op te lossen, daarna 7,5 mg pimelinezuur, 5 ml. CuS04.5H20 (1%), 4 ml van een 1%-ZnS04.5H20,1,5 ml 1%-MnCI2.4H20 en 3 ml geconcentreerd zoutzuur, waarna aangevuld werd tot 5 100 ml.

Oplossing III

L-cystine 20 g; geconcentreerd zoutzuur 20 ml, water aanvullend tot 100 ml, Maltose-CaCI2 oplossing: Maltose 50 g, 2 ml 50% CaCI2,1 g KH2P04 en aanvullen tot 100 ml met water. De pH wordt ingesteld op 10 7,4 en de oplossing gefiltreerd op Whatman 40 papier, waarna de oplossing in een autoclaf geplaatst wordt.

Beschrijving van de tekeningen:

Figuur 1A: Lysigenisatie werkwijze volgens Campbell.

Het faag DNA wordt gebroken op een specifiek punt attP en geïntegreerd op een eveneens specifiek punt 15 attB van het bacteriële chromosoom.

Figuur 1B: Lysignesiseringswerkwijze bij Corynebacterium diphtheriae C7 (ATCC 27010). Het faag DNA wordt gebroken op het bevestigingspunt attP en kan geïntegreerd worden op één of twee van de bevestigingsplaatsen attB1 en attB2 die aanwezig zijn in het bacteriële chromosoom om monolysignen, tandem twinlysigenen en niet-tandem twinlysigenen te geven.

20 Figuur 2: Plaat met TYE medium dat 6 I.E./ml anti difterie serum bevat.

Er kunnen drie precipitatie halo’s onderscheiden worden, nl.: zeer kleine halo (monolysigenen), intermediaire halo A (tandem twinlysigenen) en grote halo B (niet-tandem twinlysigenen).

Figuur 3: Analyse van het DNA van de lysigenen volgens de Southern vlek methode. Het DNA is gesplitst met BamH1 en de fragmenten zijn gescheiden op agarose gel (1,3%) en overgebracht op 25 nitrocellulose, waarna zij gehybridiseerd zijn met het βΒβηη 4 fragment dat de met 32P gelabelde attP plaats bevatte. Het pBam 4 fragment komt overeen met het fragment AB van figuur 1B. Men ziet een enkel fragment AB in het faag DNA (A), twee fragmenten AB in het monolysigeen (B), vier fragmenten in het niet tandem twinlysigeen (C) en drie fragmenten in het tandem twinlysigeen (D).

Figuur 4: Vorming van CRM 197 met de monolysigeen stam C7 (β197)Μ5: symbool O, de tandem 30 twinylsigeen stam C7 (β197)MS: symbool V; de niet tandem twinlysigeen stam C7 (β197)Μ1: symboolQ. De kleine zwarte rechthoeken geven de optische dichtheid van de kweekvloeistof aan. Verder toegelicht in Voorbeeld I.

De volgende voorbeelden lichten de uitvinding toe zonder haar echter te beperken.

35

Voorbeeld I

Men gebruikt 125 ml kolven die elk 10 ml van een CY medium bevatten, welke 15 minuten bij 120°C gesteriliseerd worden. De kolven worden geënt met een hoeveelheid overeenkomende met een platina oog van de volgende lysigene stammen: C7 (β197)Μ5, C7 (β197)Μ8 en C7 (β197)Μ1 die 24 uren bij 35°C op CY 40 platen gekweekt zijn.

De aldus geënte kolven worden een nacht bij 35°C gekweekt.

0,1 ml van elke kweekvloeistof wordt geënt in een Erlenmeyer kolf met een inhoud van 125 ml, die elk 10 ml van een ijzervrij CY medium bevatten aangevuld met 0,1 pg/ml Fe++, en vervolgens geplaatst op een roterende roerder die roert met een snelheid van 240 omwentelingen per minuut gedurende 45 uren bij een 45 temperatuur van 35°C.

Elke twee uren worden monsters onttrokken, waarvan de optische dichtheid en de in de bovenstaande vloeistof afgegeven hoeveelheden CRM 197 bepaald werden. De optische dichtheid bedroeg 590 nm met een Perkin-Elemer Mod. 35 spectrofotometer (lichtbaan 1 cm) en CRM 197 wordt bepaald met de immunoe-lectroforetische methode van Murfy et al., J. Clin. Microbiol., 7, 91-96 (1978)) en/of uitvlokking (G. Ramon, 50 C.R. Soc.Biol., 86, 661-671, (1922). Lf/ml geeft de eenheid van uitvlokking aan zoals beschreven door G. Ramon in C.R. Soc. Biol. (Parijs), 86, 661-671 (1922).

De verkregen resultaten zijn vermeld in figuur 4. De productie van CRM 197 begint niet alvorens de optische dichtheid van de kweekvloeistof een waarde best van 4,5-5 optische dichtheden (O.D.) overeenkomende met het einde van de logaritmische fase.

55 Ais het eindgedeelte van de laatstgenoemde fase begint, begint ook de massieve vorming van CRM 197 en gaat door tot het begin van de stationaire fase (ongeveer 20 uren), waarbij dan de maximale optische dichtheid en de maximale hoeveelheid CRM 197 waargenomen worden.

Claims (6)

1. Werkwijze voor de bereiding van een met difterie-toxine verwant eiwit, omvattende het kweken in een 55 vloeibaar voedingsmedium, bij een temperatuur van 30°C tot 40°C, bij een neutrale pH en onder aerobe omstandigheden, van een micro-organisme behorende tot Corynebacterium diphtherias met een voor het 192208 6 met difterie-toxine verwante eiwit coderende mutantfaag geïntegreerd in het bacteriële chromosoom, met het kenmerk, dat het toegepaste micro-organisme twee voor het met difterie-toxine verwante eiwit coderende mutantfagen bevat, die op niet-tandem wijze aanwezig zijn op twee bevestigingsplaatsen in het bacteriële chromosoom, en men het kweken uitvoert in een voedingsmedium, dat een concentratie aan ijzerionen van 5 0,05-0,5 pg/ml bevat.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het met difterie-toxine verwante eiwit CRM 45 eiwit is.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het micro-organisme de C7 (β45)Μ8 ATCC-39526 stam is.

4. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het met difterie-toxine verwante eiwit het CRM 197 eiwit is.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat het micro-organisme de C7 (β197)Μ, ATCC-39255 stam is.

5 192208 Na 24 uur kweken, neemt de CRM 197 vorming af. Na 30 uren bedraagt de afname 25% en na 45 uren bedraagt de afname zelfs 75%. Het verloop van de vorming van CRM 197 is vrijwel dezelfde voor de verschillende lysigenen, terwijl de productie: 20 Lf/ml voor de monolysigenen bedraagt, 30 Lf/ml voor de j tandem twinlysigenen en 60 Lf/ml voor de niet tandem twinlysigenen bedraagt. Voorbeeld II Volgens dezelfde werkwijze als beschreven in voorbeeld 1 bereidt men entmedia van C7 (β45)Μ3, C7 (β45)Μ11 en C? (β45)Μ8. 0,1 ml van elke kweekvloeistof wordt geënt in 125 ml kolven die elk 10 ml van een ijzervrij CY medium 10 bevatten aangevuld met 0,1 pg/ml Fe++. De kolven worden 36 uren geïncubeerd bij een temperatuur van 35°C op een roterende roerder (240 omwentelingen per minuut). Monsters onttrokken na 20 en 30 uren van het begin van de fermentatie worden geanalyseerd op dezelfde wijze als beschreven in voorbeeld I ter bepaling van de optische dichtheid en de vorming van in de 15 bovenstaande vloeistof afgegeven CRM 45. De verkregen resultaten zijn samengevat in de onderstaande tabel: TABEL 1

20 Lysogene Optische Dichtheid CRM 45 pg/ml stammen 20 h 30 h 20 h 30h C7(p45)M3 4,5 9,7 16 31,5 C7 (β45)Μ11 4,5 9,8 22 42

25 C7(p45)M8 4,7 10 40 70 De bovengenoemde resultaten geven aan dat de maximale vorming van CRM 45 bereikt wordt na 30 uren kweken en vrijwel dezelfde is voor de monolysigenen als voor de tandem twinlysigenen en bijna tweemaal 30 zoveel voor de niet tandem lysigenen. Voorbeeld III Een voorkweekvloeistof van het lysigeen C7 (β45)Μ8 werd bereid als beschreven in voorbeeld I, en 2 ml van deze voorkweekvloeistof werden overgebracht in twee 2000 ml Erienmeyer kolven die elk 500 ml niet ijzer 35 bevattend CY medium bevatten, aangevuld me 0,1 pg/ml Fe++, en gekweekt onder roeren (240 omwentelingen per minuut) bij een temperatuur van 35°C gedurende 24 uren. 1000 ml van de verkregen lysigeen kweekvloeistof werd geënt in 40 liter van een CY kweekmedium met een concentratie aan Fe'1"* ionen van 0,1 pg/ml, aanwezig in een fermentatievat met een volume van 50 liter en gekweekt bij een temperatuur van 37°C door beluchten met een snelheid van 15 l/min vanaf de bodem 40 naar de top, roeren met een snelheid van 600 omwentelingen per minuut en handhaven van de pH van het kweekmedium op 6,5 tot 7,5 met een 20%-glucose oplossing of met 4N NaOH gedurende 40 uren. De hoeveelheid CRM 45 bedroeg na 30 uren kweken 200 Lf/ml. De verkregen kweekvloeistof werd gecentrifugeerd in een continu werkende centrifuge en het eiwit uit de bovenstaande vbeistof neergeslagen door ammoniumsulfaatoplossing met een verzadiging van 75%.

45 De verkregen suspensie werd gecentrifugeerd en het sediment werd na wassen met een fosfaatbuffer van pH 7,5 gezuiverd door een kolom gevuld met een ionenuitwisselende hars (dimethylammoniumethylcel-iulose). Het eiwit werd geïsoleerd door de kolom te elueren met een natriumchloridegradiënt waarbij de opbrengst 80% bedroeg. 50

6. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de concentratie aan ijzerionen in het vloeibare 15 voedingsmedium 0,1 pg/ml bedraagt. Hierbij 3 bladen tekening