FR2505872A1 - Nouveaux plasmides derives d'actinomycetes - Google Patents

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Abstract

NOUVEAUX PLASMIDES DERIVES D'ACTINOMYCETES. CES PLASMIDES, PAR EXEMPLE LE PSF689, ONT AU MOINS UN SITE DE COUPURE DE RESTRICTION POUR UNE ENZYME DE RESTRICTION SPECIFIQUE ET UNE MASSE MOLECULAIRE INFERIEURE A 1,010.

Description

La présente invention concerne de nouveaux plasmides et, plus précisément,
des plasmides dérivés d'Actinomycètes.
Les plasmides, qui sont des éléments extra-
chromosomiques, sont utilisables comme vecteurs pour le clonage de gènes intéressants dans la technologie
de l'ADN recombinant.
Jusqu'à présent, on utilisait dans les études sur la recombinaison de l'ADN, l'Escherichia coli et le Bacillus subitilis comme hôtes, et des plasmides
dérivés de Col El et le staphylocoque comme vecteurs.
On savait par exemple qu'il était difficile d'exprimer une information génétique Gram-positive dans des
bactéries Gram négatives et on pense qu'il est préfé-
i 5 rable d'utiliser des hôtes et des vecteurs tous dérivés d'Actinomycètes dans des opérations de
recombinaison génétique de gènes dérivés d'Actinomycètes.
Par ailleurs, les Actinomycètes sont des bactéries importantes pour la production d'antibiotiques utiles et de substances physiologiquement actives, et on compte beaucoup sur eux car il est possible de produire de nouvelles substances utiles en améliorant les
souches par la technologie de l'ADN recombinant.
Bien que les plasmides dérivés d'Actinomycètes décrits dans les demandes de brevet japonais (OPI) 133397/80, 133398/80 et 124799/80 (le terme d"'OPI' utilisé ici désigne une 'demande de brevet japonais publiée non encore examinée"), etc, soient connus, ils ne se prêtent pas toujours à une utilisation
comme plasmides car ils présentent des masses molé-
culaires importantes ou comportent des enzymes de restriction ayant plusieurs sites de coupure En conséquence, la Demanderesse a réalisé la présente invention en isolant des plasmides utilisables comme vecteurs dans la technologie de l'ADN recombinant appliquée aux Actinomycetes et pour en étudier les propriétés. Les plasmides de l'invention sont caractérisés en ce qu'ils présentent au moins un site de coupure pour un enzyme de restriction spécifique et en ce qu'ils ont une masse moléculaire inférieure à 1,0 x 107 On préfère en particulier les plasmides dénommés p SF 588, p SF 765, p SF 701-1, p SF 619 La figure 1 représente une carte
de restriction du plasmide p SF 588.
La figure 2 représente une carte
de restriction du plasmide p SF 619.
La figure 3 représente une carte
de restriction du plasmide p SF 689.
La figure 4 représente une carte
de restriction du plasmide p SF 701-1.
La figure 5 représente une carte
de restriction du plasmide p SF 765.
et p SF 689.
des enzymes des enzymes des enzymes des enzymes des enzymes Dans la figure 2, bien que les sites de coupure du Bam HI et du ps TI soient représentés au méme point, ils ne sont pas superposés mais proches
l'un de l'autre.
Les plasmides de l'invention cités en
exemple ont les propriétés physicochimiques et enzy-
matiques indiquées dans le Tableau 1 ci-après.
Cu 0 N. Co Lrb 1 C> Ln tu (ssexa DTU Opvo V (IL 61) eep-úTp Ip IZ d X 6 o Touz Azua UT'Po Mqa W) Tn DTVO aud ea Tu Tno 9 T Oul Osseux u G a Tq IG Au OD e T V -4 a anonbu OI VT zainseui ue Q laandnoo P OPT'usu Td unp enb Tu O 2 l Da T 9 Gd O Ds O 2 D Ttu nu e Tqduabolo-qd aun Gaptraza v quvqs Tsuop apomqgw (M 61) SZú-Slú 116 ' 60 TOFúl 2 e Tn Da T Ow 90 Truanor) ea Tlnb 9 TOUI Osseux e T la Tno Tvo V qa sntiaqqà slueulbuai s GT x Gs-Tetl-e V luo Tio Taqsoa op am Kzue aun DG Ale OP Ttusu Td n P NCVT a DIT 22 q ?,Iuvqs Tsu OD a PO Mq 9 W (q m 9 'f t, L d t, 1 ' 6 z 9 9 O à E Sg Lqsd 1-1 O LO Esd 699 J Sd 619 âSd gegasd 'f P 9 1 v Z'6 6 'S O,ú
1 O T 9 O O O O O
E 1 z z z ' E O 1 O
0 O 1 9 T 1 O O 1
0 1 E E 1 E O O O
0 O O O O O O O T
In,4 S jeclK 1-49 cl ldu S 1-4 s S I Rma rllpu TH r ama 11,615 q (q enb Tuo 2 loelq (v adoosozo Tui enb TIVMAZ np Opoqq 9 N -ue apoqqgw (-9 oi X) Oa Tv Tnog Toui assew UOTIO Taqsoz op GWAZU Oi T op Gananoo op Sa ITS op ezqmo N
1 úIVEIIIENI
Plus précisément, ces plasmides ont une masse moléculaire inférieure à 1, 0 x 10 et ont au moins un
site de coupure pour ure enzyme de restriction spéci-
fique A titre d'exemple, le p SF 689 a au moins un site de coupure pour chacun des quatre types d'enzymes de restriction Bg ZII, Bam HI, Sst I et Pst I. Les cartes des coupures obtenues sur la base des enzymes de restriction de ces plasmides sont telles que représentées dans les figures 1-5 Dans ces dessins, les numéros indiquent la masse moléculaire
moyenne calculée par la méthode enzymatique (unité: Md).
Les plasmides de l'invention décrits ci-
dessus sont extraits respectivement des Actinomycetes suivants: p SF 588: Streptomyces albofaciens SF 588 p SF 619: p SF 689: p SF 765: p SF 701-1 (FERM-P N 5267 (ler Novembre 1979), maintenant transformé en FERM-BP N 122 ( 27 Avril 1982) Streptomyces hygroscopicus SF 619 (FERM-P N 5269 (ler Novembre 1979), maintenant transformé en FERM-BP N 123 ( 27 Avril 1982) Streptomyces platensis SF 689 (FERM-P N 5002 ( 25 Mai 1979), maintenant transformé en FERM-BP N 121 ( 27 Avril 1982)) Streptomyces fradiae SF 765 (FERM-P N 5270 (ler Novembre 1979), maintenant transformé en FER 4-BP N 124 ( 27 Avril 1982)) : Streptomyces griseochromogens SF 701 (FERM-P N 5000 ( 25 Mai 1979), maintenant
transformé en FERM-BP No 120 ( 27 Avril 1982)).
Les propriétés microbiennes de Streptomyces platensis SF 689 et de Streptomyces griseochromogens SF 701 ont été décrites en détail dans les publications de brevets japonais 6878/70 et 6076/70 Les propriétés
des autres souches sont décrites ci-après.
Streptomyces albofaciens SF 588 Cette souche a été extraite d'un échantillon
de sol en Inde.
I Caractéristiques morphologiques La formation de mycélium aérien est généra- lement peu importante, mais on observe une bonne sporulation sur de la gélose de saccharose-nitrate et de la gélose d'amidon, etc La ramification est monopodique et on n'observe pas de verticilles La chaîne de spores est en spirale (plus précisément, en spirale compacte) On n'observe pas de sclerotium
ni de sporangium.
Au microscope électronique, la structure superficielle de la spore est régulière Les spores ont une forme approximativement ovale-cylindrique et une taille de 0,4 0,6 x 0,6 1,0 micron En général, 10 spores ou plus sont liées pour former
une chaîne.
II Caractéristiques de culture sur divers milieux de culture Les caractéristiques de culture sur divers milieux de culture à 280 C pendant 14-21 jours sont
indiquées dans le tableau suivant.
Les étalons de couleur indiqués entre crochets dans le tableau correspondent à la classification du "Color Harmony-Manual" (produit par la "Container
Corporation of America).
TABLEAU 2
Milieu Croissance et Mycelium Pigment couleur inverse aérien soluble ic et faible
Gélose de saccharose-
nitrate
Gélose de glucose-
asparagine Mince et faible, incolore Moyenne, brune
Gélose de glycérol-
asparagine Faible-moyenne, incolore-jaune clair
Très peu dé-
veloppé, blanc Gélose d'amidon Moyenne, jaune grisâtre Gélose d'avoine Moyenne-importante, jaune grisatre Absent Absent ou légèrement jaune Gélose de levure-malt Importante, jaune brun&tre clair
Très peu dé-
velopp , blanc Blanc Absent Absent Absent Absent Oa Blanc Absent Absent / Ln o 1 n. vo. (D TABLEAU 2 (suite) Gélose de tyrosine Moyenne, jaune clair Gélose nutritive Moyenne-développée, froissée, jaune grisâtre Peu développê blanc Absent Absent Absent réà Ln 1 C> VJI o c* III Propriétés physiologiques: ( 1) Gamme de températures pour la croissance: la croissance s'observe dans une gamme de températures de 15 à 45 C et on observe une croissance satisfaisante
à 25-40 C.
( 2) Liquéfaction de la gélatine: positive
(culture à 20 C pendant 21 jours).
( 3) Hydrolyse de l'amidon: positive (culture
à 28 C pendant 14 jours).
( 4) Réduction du nitrate: positive (culture
à 28 C pendant 14 jours).
( 5) Peptonisation du lait écrémé: positive
( 28 C, 37 C).
( 6) Coagulation du lait écrémé: négative
( 28 C, 37 C).
( 7) Formation de pigment mélanoide: négative.
( 8) Antibiotiques produits: Oxytétracycline.
IV Utilisation de s-sources de carbone (sur milieu de gélose dce Pridham et de Gottlieb): ( 1) Utilisation D-glucose, D-fructose,
D-mannitol, i-inositol et raffinose.
( 2) Utilisation douteuse L-arabinose et L-rhamnose. ( 3) Pas d'utilisation D-xylose et
saccharose.
V Composition de la paroi,cellulaire: Une analyse par une méthode de Becker (voir Appl Microbiol 13, 236 ( 1965)), montre que l'acide diaminopilémique présent dans les constituants de
la paroi cellulaire est l'isomère LL.
Par conséquent, les caractéristiques micro-
biennes de la souche SF 588 se résument de la manière suivante: la chaîne de spores est en spirale et
la structure superficielle des spores est régulière.
Le mycélium aérien est blanc et la couleur inverse est un blanc-grisatrebrun On n'observe pas de couleur particulière En ce qui concerne les pigments solubles, on observe une couleur jaune pale sur la gélose d'avoine, mais il ne se forme pas de pigments solubles dans d'autres milieux de cultures La paroi
cellulaire contient de l'acide LL-diaminopimélique.
D'après les propriétés microbiennes décrites ci-dessus, la souche SF 588 appartient au genre Streptomyces et plus précisément, elle est semblable au Streptomyces albofaciens Lorsque l'on compare le Streptomyces albofaciens correspondant à la
description de 'ISP (International Streptomyces
Project) (voir le International Journal of Systematic Bacteriology 18: 287-288 ( 1968)) et la souche SF 588, bien qu'ils utilisent différemment le L-arabinose,
ils sont très semblables en ce qui concerne les carac-
téristiques morphologiques et les propriétés de
culture En outre, la souche SF 588 produit de l'oxy-
tétracycline, alors que l'on sait que le Streptomyces
albofaciens en produit également (voir M J Thiruma-
lachar et o: Hindustan Antibiot Bull 3: 61-63 ( 1960)) Par consécruent, ils sont très semblables
en ce qui concerne les antibiotiques produits.
Il est par conséquent raisonnable de considérer que la souche SF 588 appartient à l'espèce Streptomyces albofaciens, car ils sont très semblables en ce qui concerne leurs propriétés essentielles, bien qu'ils présentent certaines différences de détail La souche SF 588 a donc été dénommée Streptomyces albofaciens
SF 588 par la présente Demanderesse.
Streptomyces hygroscopicus SF 619: Cette souche a été extraite du sol d'un bosquet de bambous à Dakaoka City, Préfecture
d'Okayama, Japon.
I Caractéristiques morphologiques: La formation d'un mycélium aérien est abondante sur la gélose d'amidon et sur la gélose de levure de malt, etc et la formation de spores est importante La ramification est monopodique et on n'observe pas de verticilles La chaîne de spores est en spirale (plus précisément en spirale compacte) Au cours de la période finale de la culture (culture d'une durée de 14-20 jours) des zones noires humides (zones dites "hygroscopiques") apparaissent sur le mycélium aérien On n'observe
pas de sclérotium ni de sporangium.
Au microscope électronique, la structure superficielle de la spore est régulière Les spores ont généralement une forme ovale et une taille de 0, 5-0,8 x 0,7-1,0 micron En général, 10 spores
ou plus sont reliées pour former une chaîne.
II Caractéristiques de culture sur divers milieux de cultures: Les caractéristiques de cultures sur divers milieux de cultures à 28 C pendant 14-21 jours sont
indiques dans le tableau suivant.
Les étalons de couleurs indiqués entre parenthèses dans le tableaucorrespondent à la classification du "Color Harmony Manual" produit par la "Container
Corporation of America").
L'apparition des zones hygroscopiques s'observe en particulier sur la gélose d'amidon, la
gélose d'avoine et la gélose de levure-malt.
TABLEAU 3
Milieu Croissance et Mycélium Pigment couleur inverse aérien soluble
Gélose de saccharose-
nitrate
Gélose de glucose-
asparagine
Gélose de glycérol-
asparagine Gélose d'amidon Gélose d'avoine Gélose de levure-malt Gélose de tyrosine Gélose nutritive Faible, incolore
Faible, incolore-
jaune clair
Faible, incolore-
jaune clair Importante, jaune grisâtre Moyenne-importante jaune grisâtre nuance d'une couleur olive Importante, brun clair Faible, jaune clair Faible, jaune clair Peu développé gris brûnatre
Très peu dé-
veloppé, blanc Peu développé, blanc Abondant, gris brunatre ( 2 fe) Abondant, gris
brunâtre ( 2 fe-
3 ig) Abondant, gris
brunâtre ( 2 fe-
2 ge) Peu développé blanc Peu développé blanc Absent Absent Absent Absent Absent Absent Absent Absent o tn O> 1 VI' Co ro III Propriétés physiologiques: ( 1) Gamme de températures pour la croissance: la croissance s'observe dans une gamme de températures de 15-40 OC, et on observe une croissance satisfaisante
à 26-37 C.
( 2) Liquéfaction de la gélatine: positive
(culture à 20 C pendant 14 jours).
( 3) Hydrolyse de l'amidon: positive (culture
à 280 C pendant 14 jours).
( 4) Réduction du nitrate: négative (culture
à 28 C pendant 14 jours).
( 5) Peptinisation du lait écrémé: positive
( 28 C, 37 C).
( 6) Coagulation du lait écrémé: négative
( 28 C, 37 C).
( 7) Formation de pigments mélanoides: négative.
( 8) Antibiotique produit: Paromomycine.
IV Utilisation des sources de carbone (sur gélose de Pridham-et Gottlieb) : ( 1) Utilisation D-glucose, D-fructose,
D-mannitol, i-inositol, raffinose et D-cylose.
( 2) Pas d'utilisation L-arabinose,
L-rhamnose et saccharose.
V Composition de la paroi cellulaire: Une analyse par une méthode de Becker (voir Appl Microbiol 13:236 ( 1965)), montre eue l'acide diaminopimélique présent dans les constituants de
la paroi cellulaire est l'isomère LL.
Par conséquent, les caractéristiques micro-
biennes de la souche SF 619 se résument de la manière suivante: la chaîne de spores est en spirale et la structure superficielle des spores est régulière Le mycélium aérien est gris brunâtre et des zones hygroscopiques apparaissent au cours de la période
finale de la culture La couleur inverse est un jaune clair-
jaune grisâtre et on n'observe pas de couleurs particulières Aucun pigment soluble n'est formé dans les divers milieux de culture utilisés La
paroi cellulaire contient de l'acide LL-diamino-
pimélique. D'après les propriétés microbiennes décrites ci-dessus, la souche SF 619 appartient au genre des
Streptomyces, parmi lesquels le Streptomyces hygros-
copicus semble être le plus proche En particulier, on observe dans la souche SF 619 les caractéristiques essentielles du Streptomyces hygroscopiques comme ( 1) l'apparition d'une zone hygroscopique, ( 2) la formation d'un mycélium aérien gris brunâtre, ( 3) une chaîne de spores en spirale et ( 4) l'absence de
formation de pigments de mélanine.
En conséquence, il est raisonnable de considérer que la souche SF 619 appartient à l'espèce Streptomyces hygroscopicus La souche SF 619 a donc été dénommée Streptomyces hygroscopicus SF 619 par la présente
Demanderesse-
Streptomyces fradiae SF 765 Cette souche a été extraite d'un échantillon
de sol de Minamiitabashi, Tokyo, Japon.
I Caractéristiques morphologiques: La formation du mycélium aérien est abondante sur la gélose d'amidon, la gélose d'avoine et la gélose de tyrosine, etc et la formation de spores est importante La ramification est monopodique, et on n'observe pas de verticilles Les chaînes de spores présentent diverses formes, parmi lesquelles des formes droites, ondulées, en boucles, en crochets, en spirales primitives et en vraies spirales On
n'observe pas de sclerotium ni de sporangium.
Au microscope électronique, la structure superficielle des spores est régulière Les spores ont généralement une forme ovale, cylindrique et une taille de 0,6-0,9 x 0,8-1,4 micron Les chaînes de spores sont généralement courtes, et contiennent
quelquefois moins de 10 spores.
II Caractéristiques de culture sur divers milieux de culture': Les caractéristiques de culture sur divers milieux à 28 C pendant 14-21 jours sont indiquées
dans le tableau suivant.
Les étalons de couleurs indiqués entre parenthèses correspondent à la classification du "Color Harmony Manual" (produit par la Container Corporation of America).
TABLEAU 4
Milieu Croissance et Mycélium Pigment couleur inverse aérien soluble
Gélose de saccharose-
nitrate Faible, incolore Peu développé rose clair ( 5 ca)
Gélose de glucose-
asparagine Très faible, incolore
Gélose de glycérol-
asparagine Gélose d'amidon Gélose d'avoine Gélose de levure-malt Gélose de tyrosine Gélose nutritive Faible, incolore Importante, jaune grisâtreorange grisâtre Importante, jaune grisâtre Moyenne-importante jaune brunâtre Moyenne, jaune grisâtre clair Moyenne, jaune clair Rose clair ( 5 ca) Abondant, rose
grisâtre ( 5 ec-
gc) Abondant, rose clair-beige ( 4 ec-5 gc) Gris rosatre ( 5 gc) Abondant, brun rosatre ( 5 gc) Peu développé, rose clair ( 5 ca) Absent Absent Absent Absent Absent Absent Absent Absent Absent IO 1 WJ N Ln O 1 o' N Us) III Propriétés physiologiques: ( 1) Gamme de températures pour la croissance: la croissance s'observe dans une gamme de températures de 1540 C, et on observe une croissance satisfaisante
à 26-32 C.
( 2) Liquéfaction de la gélatine: positive
(culture à 20 C pendant 21 jours).
( 3) Hydrolyse de l'amidon: positive (culture
à 28 C pendant 14 Jours).
( 4) Réduction du nitrate: positive (culture
à 28 C pendant 14 jours).
( 5) Peptonisation du lait écrémé: positive
(culture à 28 C pendant 14 jours).
( 6) Coagulation du lait écrémé: négative
( 28 C, 37 C).
( 7) Formation de pigments mélanoides: négative.
( 8) Antibiotique produit: néomycine.
IV Utilisation des sources de carbone (sur une gélose de Pridham et Gottlieb): ( 1) Utilisation D-glucose, D-fructose,
D-xylose et L-arabinose.
( 2) Pas d'utilisation D-mannitol,
i-inositol, L-rhamnose, raffinose et saccharose.
V Composition de la paroi cellulaire: Une analyse par une méthode de Becker (voir Appl Microbiol 13:236 ( 1965)) montre que l'acide diamonipimélique présent dans les constituants de
la paroi cellulaire est l'isomère LL.
Par conséquent, les caractéristiques micro-
biennes de la souche SF 765 se résument de la manière suivante: la chaîne de spores présente diverses formes allant de formes droites à des formes spirales, et la structure superficielle des spores est régulière Le mycélium aérien est de couleur rose grisatre-rose brunâtre, et la couleur inverse est jaune grisâtre-jaune brunâtre Aucun pigment soluble ne se forme dans les divers milieux de cultures utilisés La paroi cellulaire contient de l'acide LL-diaminopimélique. D'après les propriétés microbiennes décrites ci-dessus, la souche SF 765 appartient au genre des Streptomyces, parmi lesquels le Strentomyces fradiae semble être le plus proche Lorsqu'on compare le Streptomyces fradiae décrit dans 1 'ISP (International Streptomyces Project) (voir International Journal of Systematic Bacteriology 18:118-120 ( 1968)) et la souche SF 765, on remarque qu'elles sont toutes deux très semblables en ce qui concerne la totalité des caractéristiques morphologiques, les propriétés
de culture et l'utilisation des sources de carbone.
En outre, comme le Streptomyces fradiae et la souche SF 765 produisent tous deux de la néomycine, ils sont très semblables en ce qui concerne la production
d'antibiotique.
I 1 est par conséquent raisonnable de considérer que la souche SF 765 appartient à l'espèce Streptomyces fradiae La souche SF 765 a donc été dénommée
Streptomyces fradiae SF 765 par la présente Demanderesse.
L'extraction des plasmides de l'invention à partir d'Actinomycètes et leur purification sont effectuées selon le procédé décrit dans "Journal
of Antibiotics", vol 33, pages 118-121 ( 1980)).
Cependant, la concentration de la glycine dans le cas de l'incubation d'Actinomycètes est respectivement de 2,0 %, de 0,5 %, de 0,5 %, de 0,5 % et de 0,5 % pour le Streptomyces albofaciens SF 588, le Streptomyces hygroscopicus SF 619, le Streptomyces platensis SF 689, le Streptomyces fradiae SF 765 et le Streptomyces
griseochromogens SF 701.
La masse moléculaire des plasmides purifiés est déterminée par préparation d'un échantillon selon la méthode de Davis et col (Methods in Enzymology; vol 21, pages 413-428 ( 1971), Academic Press, New York et Londres), réalisation d'une photomicro- graphie électronique de molécules d'ADN circulaires ouvertes, mesure de leur longueur au moyen d'un curvimètre, et calcul avec un taux de conversion
de 1 pm = 2 x 106 daltons.
Les enzymes de restriction utilisés pour le traitement et l'analyse des fragments obtenus sont Eco RI, Hind III, Bam HI, Pst I, Bg XII et Sa LI (produits par Miles Lab Co) Sst I et Xba I (produits par Bethesda Res Lab Inc) et Stu I (produit par la Wako Pure Chemical Ltd) et sont disponibles sur
le marché.
Pour effectuer la digestion par les enzymes de restriction, l'ADN a été traité par un excès d'au moins 3 fois la quantité d'enzymes de restriction dans les conditions conformes aux directives du fournisseur. En outre, dans le cas o l'on traite le plasmide par deux enzymes de restriction ou davantage, si la composition des solutions réactionnelles est
la même, les réactions s'effectuent simultanément.
Si la composition des solutions réactionnelles est différente, on effectue tout d'abord la réaction dans des conditions de faible salinité puis on augmente la concentration en sel pour atteindre des conditions réactionnelles optimales et on ajoute les autres enzymes pour effectuer la réaction Plus précisément, une fois le traitement par la première enzyme achevé, on inactive l'enzyme par chauffage à 600 C pendant minutes Après refroidissement, on élimine les protéines par un procédé SDS au phénol suivi d'une dialyse On ajuste ensuite le p H de la composition réactionnelle et on effectue le traitement par la seconde enzyme, puis le traitement par la troisième enzyme On effectue une analyse par électrophorèse sur gel d'agarose selon la méthode décrite dans "Method in Molecular Biology", vol 7, 87 ( 1974). Comme décrit ci-dessus, les plasmides de l'invention ont une faible masse moléculaire et comportent au moins un site de coupure pour une enzyme de restriction spécifique, et leurs extraction et purification s'effectuent facilement On notera par conséquent qu'ils sont utilisables comme vecteurs
pour la technologie de recombinaison-de l'ADN.
On peut produire l'ADN de plasmides recombinants par des procédés connus A titre d'exemple, le p SF 701-1 est coupé par Eco Ri ou Xba I pour donner un ADN linéaire D'autre part, d'autres molécules d'ADN non vecteurs peuvent être coupés par la même enzyme Lorsque l'on mélange la molécule d'ADN linéaire obtenue à l'ADN non vecteur, les extrémités des chaînes s'apparient On ajoute ensuite de la polynucléotide ligase qui a pour effet de combiner les deux types de molécules par des liaisons covalentes en donnant
une molécule d'ADN circulaire.
En utilisant le plasmide recombinant obtenu, on peut effectuer un clonage de l'ADN non vecteur
par transformation d'une cellule hôte appropriée.
A titre d'exemple, la méthode de transformation des Actinomycètes et de clonage d'un gène de résistance à la néomycine provenant de Streptomyces fradiae, ont été décrits dans Nature, 274, 398-400 ( 1978) et Nature 286, 525-529 ( 1980), etc. En outre, les plasmides de l'invention, à l'exception du p SF 588 sont capables de produire des plasmides de plus petite taille, plus faciles d'utilisation du fait qu'ils présentent un ensemble de sites de coupure par des enzymes de restriction En outre, il est possible de préparer des vecteurs navettes (plasmides capables d'être amplifiés par n'importe quel hôte) comme par exemple, des vecteurs navettes constitués de plasmides de l'invention et du vecteur d'Escherichia Coli, p BR 322 ou du vecteur de Bacillus subtilis p VB 110 etc. Les exemples et les exemples de référence non limitatifs suivants sont donnés à titre d'illustration de l'invention Sauf indication contraire, tous les pourcentages sont des pourcentages en poids par
volume (pds/v).
EXEMPLE 1.
Extraction du plasmide p SF 588 du Streptomyces
albofaciens et purification.
On inocule des cellules de Streptomyces albofaciens SF 588 cultivées sur plan incliné ou lyophilisées dans 20 ml d'un milieu MYG ( 1 % d'extrait de malt (produit par la Difco Labs), 0,4 % d'extrait de levure (produite par la Difco Labs) et 2 % de glucose, p H 7,0), et on les fait incuber à 28 C pendant deux jours en agitant à 120 tours/min On inocule ensuite 2 ml de la culture d'ensemencement dans 80 ml d'un milieu MYG frais contenant 2 % de glycine et on les fait incuber à 28 C pendant deux jours en agitant à 120 tours/min Apres incubation, on recueille les mycelia et on les lave 2 fois avec un tampon à 20 m M de Tris HCL contenant 0,14 M de chlorure de sodium (p H 8,0) On met en suspension les mycelia obtenus dans 5 ml d'un tampon de saccharose TE ( 0,1 M de Tris HCL, 0,02 M d'EDTA et 25 % de
saccharose, p H 8,0), par gramme de mycelia mouillés.
On y ajoute 0,1 ml de R Nase (produite par la Sigma Co,
et préparée par dissolution de 5 mg/ml dans une solu-
tion à 0,85 % de chlorure de sodium et traitement à 80 C pendant 15 min) et 0,1 ml de lysozyme à mg/ml (produit par la Sigma Co) et on effectue la réaction à 37 C pendant environ 1 heure On refroidit le mélange réactionnel à O C, on ajoute 6 ml d'eau stérilisée et 0,25 ml de dodécylsulfate de sodium à 5 % et on mélange soigneusement le mélange dans un bain de glace pendant 5 min pour effectuer une lyse complète On ajoute ensuite 3,1 ml d'une solution aqueuse de chlorure de sodium (SM) et on
laisse reposer le mélange à 0-4 C pendant une nuit.
On obtient un lysat limpide par centrifugation à 10.000 g pendant 60 min A ce lysat, on ajoute du polyethylene glycol 1000 de façon à obtenir une concentration finale de 10 % Apres avoir maintenu le lysat à O C pendant 4 heures, on le soumet à une centrifugation à 10 000 g pendant 10 min pour obtenir un précipité On dissout le précipité obtenu dans un tampon de sarcosyl-TE ( 10 m M de Tris HCL, m M d'EDTA et 0,4 % de lauroyl sarcosinate de sodium, p H 8,0) et on ajuste la quantité totale à 4,76 ml avec la même solution tampon A la solution obtenue, on ajoute 5 g de chlorure de cesium qui s'y dissout et on ajoute 0,5 ml d'une solution de bromure d'éthidium à 4,7 mg/ml Le mélange est introduit dans un tube pour centrifugation constitué de nitrocellulose, et on effectue la séparation par
centrifugation avec gradient de densité du Cs Cl-
bromure d'éthidium, à 20 C pendant 40 heures ou
davantage, à 36 000 tours/min sur une ultracentri-
fugeuse Beckman modèle L 2-75 B dans un rotor à angle fixe 75 Ti On expose le tube de centrifugation à une irradiation par des ultraviolets à 365 nmet on prélève un ruban d'ADN de plasmide sous forme
*d'une fraction de plasmide.
De plus, apres avoir éliminé le bromure d'éthidium par extraction par du n-butanol, on dialyse l'ADN du plasmide avec le tampon TE ( 10 m M de Tris HCL et 1 m M d'EDTA, p H 8,0) La purification de l'échantillon après dialyse est effectuée par centrifugation avec gradient de densité du saccharose neutre à 5-20 % Plus précisément, en utilisant un tampon TEN contenant du bromure d'éthidium ( 10 m M d'une solution tampon de Tris HCL, 20 m M d'EDTA, m M de chlorure de sodium et 1 pg/ml de bromure d'éthidium, p H 8,0), on superpose un mélange de 0,5 ml de l'échantillon et 0,05 ml de bromure d'éthidium ( 5 mg/ml) sur un gradient de densité linéaire de saccharose à 5-20 %, et on effectue une séparation par centrifugation à 4 C pendant 3 heures, à 40 000 tours/min sur une ultracentrifugeuse Beckman modèle L 2-75 B dans un rotor SW 40 On expose ce tube de centrifugation à de l'ultraviolet à
365 nm et on prélève un ruban de plasmide fluorescent.
Après élimination du bromure d'éthidium par extraction par du n-butanol, on dialyse l'ADN du plasmide p SF 588 au moyen d'une solution tampon TE, ce qui donne un
plasmide purifie.
Pour déterminer la masse moléculaire, on utilise tout d'abord une méthode de microscopie
électronique qui consiste à effectuer une photo-
micrographie électronique de molécules d'ADN circulaires ouvertes selon la méthode de Davis et col (décrite plus haut), à mesurer la longueur de leur périphérie au moyen d'un curvimètre et à effectuer un calcul en utilisant comme taux de conversion: 1 pm = 2 x 106
daltons.
La détermination de la masse moléculaire par la méthode enzymatique a été effectuée en utilisant un procédé d'électrophorèse sur agarose après avoir soumis le plasmide à un traitement par une enzyme de restriction Plus précisément, on calcule la masse moléculaire d'un fragment linéaire d'ADN obtenu
par digestion du plasmide par une enzyme de restric-
tion, en mesurant une mobilité relative par rapport aux produits de la digestion par Hind III de l'ADN du phage à ou aux produits de la digestion par Hind III de l'ADN du SV 40, par la méthode de l'électro- phorèse sur agarose Au cas o l'on a plusieurs fragments, on calcule la somme des résultats Les
masses moléculaires sont indiquées dans le tableau 1.
Des cartes des enzymes de restriction sont élaborées de la façon suivante: on fait réagir 0,5 1 pg de l'ADN du plasmide avec 9 types d'enzymes de restriction (Bg ZII, Eco RI, Rind III, Bam HI, Sst I, Sa ZI, Pst I, Xba I et Stu I) à raison de 5 unités de chacuned'elles dans des conditions de réaction optimales pour chacune des enzymes de restriction, à 370 C, pendant 2 heures On ajoute une solution d'arrêt de la réaction ( 5 % de dodécylsulfate de sodium, à 25 % de glycérol et 0,025 % de bleu-de
bromophénol)'à raison de 1/10 du mélange réactionnel.
Après avoir effectué le traitement à 650 C pendant min, on refroidit rapidement le mélange On effectue ensuite une analyse par électrophorèse sur gel d'agarose Plus précisément, on effectue une électrophorèse dans une solution tampon d'acide borique Tris ( 89 mm de solution tampon Tris, 2,5 m M d'EDTA et 89 m M d'acide borique) en utilisant un gel à 0,8 % d'agarose On colore ensuite le gel en le trempant dans 1 pg/ml d'une solution de bromure
d'éthidium On expose le gel obtenu à de l'ultra-
violet à 365 nm et on effectue une photographie des bandes fluorescentes On compte les bandes pour déterminer le nombre de sites de coupure de chaque enzyme de restriction de chacun des plasmides En outre, on calcule la masse moléculaire de chaque fragment par le procédé connu, et on évalue le nombre de sites de coupure Au cas o le plasmide présente plusieurs sites de coupure par des enzymes de restriction, on construit la carte des enzymes de restriction en mesurant la distance relative entre les sites de coupure par les enzymes de restriction par un procédé connu (figure 1).
EXEMPLE 2.
La séparation et la purification d'un plasmide du Streptomyces hygrcscoI:F 619 sont effectuées par le même moda e opératoire que dans l'exemple 1 excepté que Ilon a fait passer la concentration en glycine du milieu à 0,5 % de façon à obtenir un plasmide
p SF 619 purifié.
La mesure de la masse moléculaire et l'établis-
sement de la carte des enzymes de restriction ont été réalisés par le même mode opératoire que dans l'exemple 1 Les résultats sont indiqués dans le
tableau 1 et la figure 2.
EXEMPLE 3.
On effectue la séparation et la purification d'un plasmide du Streptomyces platensis SF 689 par le même mode opératoire que dans l'exemple 1, excepté que l'on a fait passer la concentration en glycine du milieu à 0,5 pour obtenir un plasmide p SF 689 purifié.
La mesure de la masse moléculaire et l'établis-
sement de la carte des enzymes de restriction ont été réalisés par le même mode opératoire que dans l'exemple 1 Les résultats sont indiqués dans le
tableau 1 et la figure 3.
EXEMPLE 4.
On effectue la séparation d'un plasmide du Streptomyces fradiae SF 765 et sa purification par le même mode opératoire que dans l'exemple 1, excepté que l'on fait passer la concentration en glycine du
milieu à 0,5 %, ce qui donne un plasmide p SF 765 purifié.
La mesure de la masse moléculaire et l'établis-
sement de la carte des enzymes de restriction sont réalisés par le-même mode opératoire que dans l'exemple 1 Les résultats sont indiqués dans le tableau 1 et la figure 4.
EXEMPLE 5.
Comme une cellule de Streptomyces griseachromo-
gens SF 701 comprend deux plasmides ayant chacun une masse moléculaire différente, la préparation est effectuée de la même manière que dans l'exemple 1 (excepté que la concentration en glycine du milieu est de 0,5 %) par centrifugation avec gradient de densité du Cs Cl-bromure d'éthidium, puis séparation par centrifugation avec gradient de densité du saccharose neutre de 5-20 % On expose le tube de centrifugation à un rayonnement ultraviolet à 365 nm et on obtient un plasmide p SF 701-1 ayant une masse moléculaire plus faible et apparaissant à la partie
supérieure du tube de centrifugation Après élimina-
tion du bromure d'éthidium par extraction par du n-butanol, on dialyse l'ADN du plasmide à l'aide d'une solution tampon TE, ce qui donne un plasmide
p SF 701-1 purifié.
La mesure de la masse moléculaire et l'établis-
sement de la carte des enzymes de restriction sont réalisés par le même mode opératoire que dans l'exemple 1 Les résultats sont indiqués dans le
tableau 1 et la figure 5.
EXEMPLE DE REFERENCE 1.
Séparation de la souche Les souches Streptomyces albofaciens SF 588, Streptomyces hygroscopicus SF 619 et Streptomyces fradiae SF 765 ont été isolées respectivement d'un échantillon de sol en Inde, d'un échantillon de sol d'un bosquet de bambous à Kasaoka City, Préfecture d'Okayama et d'un échantillon de sol de Minamiitabashi
à Tokyo par le procédé suivant.
On met en suspension 4 g d'un échantillon de sol dans 40 ml d'eau stérilisée (en utilisant un flacon conique de 100 ml) Après l'avoir agité pendant 10 min, sur un agitateur rotatif, on le laisse reposer pendant 15 min pour faire précipiter les particules de sol irrégulières et lourdes On prélève 4 ml du liquide surnageant (boueux) et on le dilue 10 fois avec de l'eau stérilisée On dépose 0,5 ml de la solution diluée sur une assiette de Pétri et on y ajoute 20 ml d'une gélose pour séparation qui a été stérilisée et chauffée à 45-500 C Après avoir mélangé la solution de sol diluée et la gélose de façon à les rendre aussi homogènes que possible, on laisse reposer le mélange pour que la gélose se solidifie On fait incuber cette assiette de Pétri à 280 C pendant 10 jours On inocule une colonie de la souche choisie se développant sur la gélose, sur un plan incliné de gélose de levure-amidon ( 0,2 % d'extrait d'enzyme, 1 % d'amidon soluble et 2,0 % de
gélose, p H 7,0).
On utilise une gélose de séparation ayant la composition suivante extrait d'enzyme: 0,05 % amidon soluble: 0,25 % gélose: 2,0 % eau du robinet: pour compléter (p H 7,0 avant stérilisation).
EXEMPLE DE REFERENCE 2.
Culture du Streptomyces albofaciens SF 588 et séparation de l'oxytétracycline ( 1) Culture: On inocule une boucle de la souche Streptomyces albofaciens SF 588 (FERM-P N O 5267) ayant subi une croissance suffisante sur une gélose de saccharose nitrate dans un tube à essai contenant 10 ml du milieu de culture d'ensemencement suivant, et on la fait incuber à 280 C pendant 20 heures, en agitant au moyen d'un agitateur de tubes. Milieu de culture d'ensemencement Amidon soluble: 2,0 % polypeptone: 1,0 % extrait de viande: 0,3 %
K 2 HPO 4: 0,05 %
eau du robinet: pour compléter (p H 7) On inocule 1 mi de culture dans 5 flacons de Sakaguchi contenant chacun 100 ml du milieu de culture décrit ci-dessus, et on le fait incuber à 280 C pendant 20 heures en agitant au moyen d'un agitateur réciproque Cette culture a été utilisée comme seconde culture d'ensemencement La seconde culture d'ensemencement a été transférée dans un fermentateur de 50 litres contenant 35 litres du milieu de production suivant, et on la fait incuber
à 350 C pendant 5 heures en agitant avec aération.
Milieu de production: Amidon soluble: 2,0 % poudre de soja: 2,5 % germe de blé: 1,0 % Na Cl: 0,25 % eau du robinet: pour compléter (p H 7,0 avant stérilisation ajusté avec du Na OH) Après avoir réalisé la culture, on la filtre,
pour obtenir 20 litres d'un filtrat.
( 2) Extraction de l'oxytétracycline-: On ajuste à 4 le p H de 20 1 du filtrat de culture avec du HC 1 6 N, et on y ajoute 100 g de charbon actif puis on agite De cette manière, l'oxytétracycline présente dans le filtrat de culture est absorbé par le charbon actif Apres avoir agité pendant 30 minutes, on recueille le charbon actif par filtrage et on le lave avec 3 1 d'eau On mélange le charbon actif à 10 1 d'une solution aqueuse à 50 % d'acétone et on ajuste le p H à 9 avec du Na OH 5 N
en agitant Après avoir agité pendant 40 min sup-
plémentaires, on le filtre, ce qui donne 9 1 de filtrat On le condense sous vide pour éliminer l'acétone. On fait passer 4,7 1 de la solution aqueuse obtenue dans une colonne garnie de 500 ml d'une résine échangeuse de cations: Amberlite CG-50 (type H+) (produite par la Rohm and Haas CO, USA) pour absorber l'oxytétracycline sur la résine Après avoir lavé la résine avec 1 litre d'eau, on effectue une élution avec une solution aqueuse à 50 % d'acétone pour obtenir des fractions de 500 ml On étudie l'activité de chacune de ces fractions par la méthode du disque de papier en utilisant le Staphylococcus aureus 209 p comme microbe d'essai On recueille les fractions à haute activité (N 1 4) ( 2 litres) et on les condense à environ 100 ml sous vide Après avoir ajusté le p H de la solution condensée obtenue à 8 avec du Na OH 5 N, on laisse reposer la solution à
5 C pour précipiter des cristaux d'oxytétracycline.
On sépare les cristaux par filtrage et on les recris-
tallise (par dissolution dans du HCL 1 N, élimination des impuretés et ajustement du p H à 8), ce qui donne mg de cristaux d'oxytétracycline sous forme
d'aiguilles.
EXEMPLE DE REFERENCE 3.
Culture du Streptomyces hygroscopicus SF 619 et séparation de la paromomycine I. ( 1) Culture: On inocule une quantité correspondant à une cuillère de platine de la souche Streptomyces hygroscopicus SF 619 (FERMP N 5269) ayant subi une croissance suffisante sur une gélose de levureamidon ( 0,2 % d'extrait d'enzyme, 1,0 % d'amidon soluble, et 2,0 % de gélose, p H 7) dans des tubes à essai ( 5 tubes) contenant chacun 10 ml du milieu d'ensemencement suivant, et on la fait incuber à 28 C pendant 24 heures en l'agitant au moyen d'un
agitateur de tubes.
Milieu d'ensemencement glucose: 2,0 % polypeptone: 1,0 % extrait de viande: 0,3 % Na Cl: 0,05 % eau du robinet: pour compléter (p H 7) On inocule 0,8 ml de la culture d'ensemencement dans des flacons de Sakaguchi ( 50 flacons) contenant chacun 80 ml du milieu de production suivant, et on fait incuber à 28 C pendant 4 jours en agitant au
moyen d'un agitateur réciproque.
Milieu de production: amidon soluble:2,0 % saccharose:2,0 % poudre de soja:3,0 % germe de blé:2,0 % Na Cl:0,25 % eau du robinet: pour compléter (p H 7,0 ajusté avec Na OH avant stérilisation) Après incubation, on filtre pour obtenir 3 1
d'un filtrat.
( 2) Séparation de la paromomycine I: On fait passer 3 litres du filtrat de culture (p H 7,6) dans une colonne garnie de 300 ml d'une résine échangeuse de cations: Amberlite IRC-50 (type NH 4 +) (produite par la US Rohm and Haas Co) pour adsorber
la paromomycine du filtrat de culture sur la résine.
Apres avoir lavé la résine avec 1,5 1 d'eau, on effectue une élution avec du NH 40 H 0,5 N, ce qui donne des fractions de 150 ml On évalue l'activité de chacune des fractions par la méthode du disque de papier en utilisant le Bacillus subtilis ATCC 6633 comme microbe d'essai On recueille les fractions activés (fractions N 2 et 3) ( 300 ml) et on les condense sous vide jusqu'à 30 ml On fait passer la solution condensée obtenue dans une colonne contenant ml de la résine échangeuse de cations Amberlite CG-50 (type NH 4 +) (produite par la U S Rohm and Haas Co.) et on la lave avec 150 ml d'eau On lave ensuite la résine avec 300 ml de NH 40 H 0,15 N et on l'élue avec du NH 4 OH 0,3 N. On recueille les fractions actives ( 60 ml) et on les condense à sec sous vide, ce qui donne
mg d'une poudre brute de paromomycine (pureté 75 %).
On dissout la poudre brute obtenue dans une petite quantité d'eau et on la chromatographie avec de l'eau sur une colonne de résine échangeuse d'anions Dowex 1 x 2 (type OH) (produite par la U S Dow Chemical Co.) ( 25 ml) On recueille les fractions actives et on les condense à sec sous vide, ce qui permet d'isoler 63 mg de base libre de paromomycine I sous
forme d'une poudre blanche.
EXEMPLE DE REFERENCE 4.
Culture de la souche Streptomvces fradiae SF 765 et séparation de la néomycine: ( 1) Culture:
On inocule 2 3 boucles de la souche Strepto-
myces fradiae SF 765 (FERM-P N 5270) ayant subi une croissance suffisante sur une gélose de levure-amidon ( 0,2 % d'extrait d'enzyme, 1, 0 % d'amidon soluble et 2,0 % de gélose, p H 7) dans des flacons de Sakaguchi (huit flacons) contenant chacun 100 ml du milieu d'ensemencement suivant, et on la fait incuber à 28 C pendant 20 heures en agitant au moyen d'un agitateur réciproque On utilise la culture obtenue
comme culture d'ensemencement.
Milieu d'ensemencement: Amidon soluble: 2,0 % polypeptone: 1,0 % extrait de viande: 0,3 %
K 2 HPO 4: 0,05 %
Eau du robinet: pour compléter (p H 7) On transfère 400 ml de la culture d'ensemencement dans des fermentateurs stérilisés de 30 litres (deux dispositifs) contenant 20 litres du milieu de production suivant, et on les fait incuber à 28 C
pendant 69 heures en agitant et en aérant.
Milieu de production: Amidon soluble:2,0 % poudre de soja:2,5 % germe de blé:1,5 % Ca CO 3:0,3 % eau du robinet:pour compléter (p H 7,0 ajusté avec du Na OH avant stérilisation) Après incubation, on filtre, ce qui donne 27
litres d'un filtrat.
( 2) Séparation de la néomycine (mélange de B et C): On fait passer 27 litres du filtrat de culture (p H 8,0) dans une colonne contenant 2,5 litres d'une résine échangeuse de cations Amberlite IRC-50 (type NH 4) (produite par la U S Rohm and Haas Co) pour adsorber sur la résine la néomycine contenue dans
le filtrat de culture.
Après avoir lavé la résine avec 12,5 litres
d'eau, on l'élue pour obtenir des fractions de 1 litre.
On étudie l'activité de chaque fraction par la méthode du disque de papier en utilisant le Bacillus subtilïs ATCC 6633 comme microbe d'essai On condense les fractions actives (fractions N O 2 4) jusqu'à 150 ml sous vide On fait ensuite passer la solution condensée obtenue dans une colonne contenant 200 ml d'Amberlite CG-50 (type NH 4) (produite par la U S Rohm and Haas Co) Après lavage avec 1 litre d'eau puis 1 litre de NH 4 OH 0,1 N, on effectue une élution avec du NH 4 OH 0,3 N On condense les fractions actives à sec sous vides, ce qui donne 880 mg d'une poudre brute de néomycine On-dissout la poudre brute obtenue dans une petite quantité d'eau, et on la chromatographie avec de l'eau sur une colonne de 80 ml de Dowex 1 x 2 (type OH) (produite par la U S Dow Chemical Co) On condense les fractions actives à sec sous vide et on isole 340 mg de la base libre de néomycine
(mélange de B et C) sous forme d'une poudre blanche.
f

Claims (2)

REVENDICATIONS
1 Plasmides de pureté élevée dérivés d'Actinomycêtes, caractérisés en ce qu'ils ont au moins un site de coupure de-restriction pour une enzyme de restriction spécifique et une masse moléculaire inférieure à 1,0 x 107.
2 Plasmide selon la revendication 1, carac-
térisé en 3. térisé en
4.
térisé en 5. térisé en 6. térisé en ce qu'il Plasmide ce qu'il Plasmide ce qu'il Plasmide ce qu'il Plasmide ce qu'il
s'agit du p SF 588.
selon la revendication
s'agit du p SF 765.
selon la revendication
s'agit du p SF 701-1.
selon la revendication
s'agit du p SF 619.
selon la revendication
s'agit du p SF 689.
1, carac-
1, carac-
1, carac-
1, carac-
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