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Procédés de production de la 2'-a,airo-2'-dEeoxy-Icanamyc,ne avec un rendement accru. La présente invention concerne des procèdes pour produire
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avec des rendements accrus la '-am.zio-2'-àésoxy-.canacnyc.ra qui est. un antibiotique. Plus spécialement aile'se rapporte à des procédés de production de la 2-amino'-2-deso;Ky-it<:anMycine par fermentation et à des procédés pour recueillir et purifier ce composé.
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La 2'-amino-2'-désoxy-ltsunanycine est efficace pour iru1i... ber la croissance des bactéries tiraln-positives, Gram-nat3vvs et aoldo-r6sistantes, comme Staphylococcus, 9seuàomùnax, S1l11onl:l1a;
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Shiolla. et Mycobacterium do mGLi,G que pour 1nh1'Oer' la c.:ro1:.;sa.nce
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do bactéries pathogènes qui aux antibiotiques et agents
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cllil1jiothrE\peut1q,uos de synthèse connus. La 2'-alUino..2'...dso.xy" kanamycine a une toxicité sxtrncuont faible et en particulier 4zN peu (l'effets secondaires sur le système auditif niais x un etfet thérapeutique utile sur les infections provoquées chez 'hoa:ae les aminaux par les bactéries Gl'am-positives, Gra nécatives et acido-r6sistantes.
La 2amino-2'-dësoxy-kanaNycine répond à la formule
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globale:
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Cl8"370' et à la oxwu7.a de structure:
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'tuàa de la production industrielle de la kanaMyoine A par formentation a toutefois indique que les souches ordinaires naturelles de Streptoutyces lsanawyc;et.cus, utilisées pour la production de la kanaisycine A à l'échelle industrielle pe>'1lot%en% d'habàtude la fOI'tllation d'une 1>ùpottunte quuut1t de ltal1aycice A déuix le milieu de culture,mais d'uno quantité beaucoup moindre de 2-aMino-2-dsoxy-kanaMycine.
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D'autres examens ont indiqua qu'il est possible d'amélio-
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eor beaucoup la production et l'accumulation de 2'.-aLina-'-dsorkanaliycine dans le milieu de culture et d'isoler ce composé avec
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un meilleur rendement soit en cultivant les anuhet, o'dinairâr ao Streptomyces kanainycotîcuo de la manière habituelle,unis en parésenco d'un aminoelucose ou d'un composé glucoziçilque ue 1'ûld..noglucose combiné avec de la dé:3ostl'eptUlliina, soit en cultivant certains nouveaux mutants do Streptomyces kanamyceticus de la manière classique dans un milieu de culture ordinaire tel qu'il
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est utilisé d'habituàe pour la culture ces actinomycotes de types connus.
Suivant un premier aspect, l'invention a pur objet un
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procédé de production de la 2'-amino-Z'-désoxy -kanany c.ne avec un rendement accru, suivant lequel on cultive une souche de
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Streptomyces kanamyceticus en milieu aérobie dans un Milieu de culture habituel qui contient un hyurate de carbone et un aliment azoté en présence d'au moins un additif choisi parmi les aminoglucoses et leurs composés glucosidiques combinés avec la désoxy-
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streptamine, jusqu'à ce que la 2'-am.no-2j-désoy-kdnarvycine s'accumule en quantité sensible dans le milieu de culture, puis on isole la 2'-arnino-2'-désoxy-kanacr.ycir:te du milieu de culture.
Comme exemples des aminoglucoses qu'on peut utiliser dans le procédé faisant le premier objet de 1,'invention, il convient ,
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de citer la D-glucosamine, le 3-amino-3-dsoa.y-n-d.ucosc, le 6...amino-6-déso.xy-D-glucoso et le 2,6-ûi-césox.y-2,,-uiaâülnG-Uglucose. Par composés glucosidiques ae ll&min0elUCose combinés avec la désaxystreptan:3ne, on ontond des composés Clans lesquels l'Eom1noalucoso est combiné avec la ctéso).,-yst'cpte,.n.lne UUl1S un rapport de 1 mole pour 1 mole, ou bien des complexe;; de ces composés olucosidiques associes a W1C autre molécule Uo glucose ou des Ì.l/1in061ucoses.
Des exemples appropriés OOS composés glucosediques de 11 aIúinoelucose combinés avec la d4soyyztr*l)taLiric- sont notaient la paromamine (ou l-(2-D-a;lucosa.nyl)-a-üi:snstnesp,. tamine), le désoÀ'Ystreptaine-O-karlosEúf.1nio.e" la néamine (ou ,-{2d(-di-désoxy-,b-diaâuino;lucosyl)-r.-désor.rstrc:pt :;,inc, 1>,
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biotique zak-1001 (composé de 6-amino-6-o.6so.xy..D-Glucosa, do désoxysti,opt'viàno et do glucose; et l'untibiotiquo DK-1003 (composa 0 6-azn.no-6-dcsox,yy-L7 Llucose et de désoxystroptauiine). (Les antibiotiques NK-l001 et NK-ldO,3 ci-dessus sont des coMposes nouveaux faisant l'objet des demandes de brevets japonais n 40145/67 et 40146/67 (correspondant aux demandes de brevets anglais n
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28147/68 et 28148/68,caime précisé ci-âpres).
Dans ce procédé constituant le premier objet de l'inven-
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tion, l'additif précité choisi parmi Ilawinoglucose et les composés glucosidiques de 0'aninoglucose combinés avec la désoxystreptamine, peut être ajouté au milieu de culture avant la mise en culture du stl'eptowyces, mais cet additif peut être introduit aussi dans le milieu pendant la culture, d'une manière classique cette fin. La proportion d'additif dans le milieu de culture
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n'est pas critique et peut être de OeO5 à 1,0 en poids, mais est de préférence de 0,1 à 0,5% en poids,sur la base du poids du
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milieu de culture.
On a découvert que la quantité de 2'-amino-2a.. ddsoxy-kanmuycine produite et accumulée dans le milieu do culture atteint son Maximum après écoulement de 3 à 7 jours,après le début de la mise en culture.
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Los souches ordinaires de streptomyces kanamyceticus qu'on utilise actuellement pour la production industrielle de la
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kanaMycine A ont l'aptitude de produire davantage de 2'-amino 2'-désoxy..ltunamycine par culture dans le milieu habituel et en arwcnco des aminollucoses et do leurs dérives dciso;.ystreptam:1.niQUèS pl'ûcits,!llais au contraire) comme on l'a découvert, certains npu, Vt.H1.U;'' mutants de Xtrcptouyces kanatuycoticus dérivant cL'une souche .naturelle typique 0-4-1 de Streptomyces kan/llJ/ycet.1cus peuvent prouuiro davimtade de 2-aMinù-2-dësoxy-kanaiiiycine même par culture dans le Milieu habituel et en l'absence des azainoz;
lucoses ot te 0 dÛSI?;.:ystl'epttililiniques d':minobl,ucoses précités, Cos nouveaux mutants qui ont, par nature, la capacité
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de produire davantage la 2e-.wino-2e-ddsoxy-.M cïne s'obtiennent
Partir de la souche naturelle connue 0-4-1 de Streptomyces kana-
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yeeticus sous l'effet d'un agent provoquant la mutation, à savoir la moutarde azotée ou le rayonnement ultraviolet et par triage spécial ultérieur des mycéliums ou des spores qui survivent.
Ces nouveaux mutants qui ont naturellement l'aptitude
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de produire davantage de 2'-arnino-2'-désoxy-kananycine sont au nombre de quatre qui ont reçu au laboratoire des indices A-4-6, 3AG, 18-8 et 19-2 respectivement. Ces nouveaux mutants ont on commun la propriété d'utiliser le xylose dans une mesure faible ou nulle alors que les souches de départ ont au contraire une plus grande aptitude à l'utilisation du xylose.
La variation ou la mutation du Streptomyces kanamyceticus est un phénomène qui n'est pas inattendu parce que cette propriété est fréquente chez les actinomycètes. Par conséquent, lorsqu'une souche quelconque connue de Streptomyces kanamyceticus est traitée au moyen d'un agent connu pour provoquer des mutations comme la moutarde azotée, on peut s'attendre à obtenir, outre les mutants A-4-6,, 3AG, 18-8 et 19-2 ci-dessus, encore d'autres mutants qui
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n'ont pas la propriété de produire davantage de 2'-anino-2'-désoxyCanawr cine.
Suivant le deuxième de ses aspects, llinventon a donc pour objet un procède de production de la 2'-amino-2'-désoxy-kanc:u:..ycine avec un rende- ment accru suivant lequel on cultive un mutant de Streptomyces kanamyceticus qui a naturellement l'aptitude à produire davantage
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de 2'-amino-2'-désoxy-kanamycineen milieu aérobie dans un milieu de culture habituel contenant les sources de carbone et d'azote habituelles jusqu'à, accumulation de la 2'-amino-2'-désoxy-kanatny- cine en quantité sensible dans le milieu de culture, après quoi on isole l'antibiotique du milieu de culture.
Suivant ce second aspect, l'invention a également pour
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objet un procédé de production de la 2'-éudno-2'-désoxy-kanamycine
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avec un rendement accru suivant lequel on ciel le mutant A-4-6, 3AG, 18-8 ou 19-2 du Streptomyces kanamyceticus en milieu aérobie dans un milieu de culture habituel contenant des hydrates de car- bone et des substances nutritivos azotées,jusque accumulation de la 2'-amino-2'-désoxy-kanamycine en quantité sensible dans le milieu de culture, puis on isole cet antibiotique du milieu de culture.
Dans les deux procédés constituant le premier et le second aspect de J'invention on peut réaliser la mise en culture de la manière habituelle suivant les procédés classiques pour les actinomycètes. Les milieux de culture contenant los éléments nutritifs classiques pour les actinomycètes permettent la production do la 2'-amino-2'-désoxy-kanamycine. Ainsi, le milieu de culture peut contenir des sources de carbone, comme de l'amidon, du saccharose, du maltose, du glucose, du glycérol etc, et des sources d'azote, comme de.la farine de soya, des protéines végétalas solubles, de la liqueur de macération de mais, de la peptone, de l'extrait de viande, des nitrates et des sels d'ammonium.
Le milieu de culture peut contenir également d'autres sels inorganiques appropriés, comme NaCl, MgSO4 et, si nécessaire, une substance favorisant la croissance de Streptomyces kanamyceticus.
Pour la production de la 2'-amino-2'-désoxy-kanamycine, il est possible de réaliser la culture sur milieu solide mais, pour la production de grandes quantités, il. est préférable que la culture se fasse en milieu liquide dans des conditions aérobies.
Pour la production de l'antibiotique à grande échelle, il est de loin préférable de recourir à la culture immergée avec aération profonde. Il est possible de recourir à la culture avec secousses ou à la culture avec agitation et aération en milieu liquide. La température de culture est d'habitude de 25 à 35 C mais une tempé- rature préférée est de 28 C environ.
On a découvert que la quantité de 2'-amino-2'-désoxy-kanamycine qui s'accumule dans le milieu de
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culture atteint son maximum au terme de 3 à 7 jours après le début de la mise en culture.
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La 2'-amino-2'-désoxy-kananycine qui s'est accumulée dans le milieu de culture pout en être isolée par l'un ou l'autre procédé classique faisant intervenir des résines échangcuses d'ions, par extraction à l'aide de solvants organiques et par précipitation à l'aide d'un agent habituel pour la purification des antibiotiques basiques hydrosolubles connus.
Pour la production industrielle do
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la 2'-arnino-2'-désoxy-kanamycine, il est préférable d'isoler le composé recherché par adsorption et élution d'une résine échangeuse d'ions, qui est de préférence une résine échangeuse de cations du type des acides carboxyliques ou par extraction à l'aide d'un solvant organique qui contient un véhicule convenable, tel que l'acide p-toluënesulfonique ou l'acide laurique.
Par exemple, on pout iso-
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ler la 2'-am.no--2'-désoxy-lcanari;ycine en séparant par filtration les solides, par exemple le mycéliunr du bouillon de fermentation contenant la 2'-amino-2'-dcso.y-kan:u>iycine, en adsorbant le filtrat sur de la résino Ainberlite ll:,,C-50 (résine échaneeuso d'ions de la Rohm & Haas CO, Etats-Unis d' Amériquo), en éluant la résine à l'ammoniaque aqueuse, en collectant et en concentrant les fractions actives, en soumettant la fraction concentrée il une séparation chromatographique sur Dowex 1 x 2 (résine échangeuse d'ions
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de la Dow Cheinical C , Etats-Unis d'ADl61'ique),puiscncollcctt:.,nt et en concentrant les fractions actives.
On soumet la fraction concentriée à nouveau à une séparation chrol!1 to;;raphiquc sur Aeibarlite CG-50, après quoi on exécute une élution avec gradient à l'aide d'eau et d'ammoniaque aqueuse. On peut obtenir une fraction uni-
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que contenant un composé actif, à savoir la 2'-awino-2'-dôsoxykro1D.I:vrcine. On lyophilise cette fraction et on recristalliso la poudre résultante dans un mélange eau: pour obtcnir la 2J-a1ll1n0-2'-désoxy-kanaJJvcinc en cristaux.
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On. peut obtenir la 2'-a.i:o-2-co" ana:ycir.e sous 14
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forme de cristaux aciculaires incolores qui Yonaent a 183-186 C, qui ont uno réaction basique et qui sont solubles dans l'eau, le méthanol aqueux, l'bthanol aqueux, l'ac6tone afiueusc, mais qui sont insolubles dans le méthanol absolu, (Il absolu, l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle, l'éther éthylique, le chloroforme et le benzène, qui donnent une réaction positive à la ninhy-
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drine: et aux réactifs d'Elson-Morgan et de Idiolisch,maïs une réac- tion négative aux réactifs de Sakaguchi, Tollens, Fehling, Millon ot Bénédicte une solution aqueuse à 1% de la substance ayant un
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pouvoir rotatoire L-a-7D 21 de plus 118 .
Un N-acétylato obtenu par acétylation de la 2'-amino-2'.-âésohy-kanaLrcine à l'aide d'un Mélange 'de méthanol et d'anhydride acétique répond à la formule globale C1SH32NO10.5(CkiCO).HZO, fond à 290-300 C avec décompo- sition et a un pouvoir rotatoire [[alpha]] 21 de plus 118 .
D
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L'effet antibactérien de la 2'--araino-2'-désoxy-kanarcine n'est pas détruit par la chaleur. Après qu'une solution de 2'-amino- 2'-àésoxy-kanauiycine dans l'acide chlorhydrique 6N a subi une dégra- dation par chauffage à 100 pendant 40 minutes, le pouvoir antibactérien contre Bacillus subtilis de la solution dégradée est encore do 60 à 80% du pouvoir de la solution initiale.
On applique la solution dégradée en une tache sur une feuille de papier-filtre Toyo n 50 de 40 cm x 40 cm et on la soumet au développement ascendant au moyen d'un solvant qui contient du butanol, de l'acide acé- tique et de l'eau (4 : 2 :1). Cette chromatographie sur papier montro qu'on obtient deux taches dont l'une donne une réaction posi-
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tiN'c à la ninl1ydl'lnc et que l'une des taches donna également une réaction positive au nitrate d-* argent a:.uaoniacal.
La 2'-a,uiuo-2'-désoy'-?caxxa..ucinc a un pouvoir antibactéri'.'n élové et utile contre los bactéries Gram-positives et Gramn0otivos et 1-iùo-i,ésistmites, ùe même que contre des bactéries ot souches r4sistaut à la l:ana:I'cine A et à d'autres antibiotiques et agents chiuiotliéré-poutiqués connus. La toxicité de la
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2'-amino-:'.-désa.cy-lcnna;ycin; est trôs faible ptl'!s'i'.4e "ev. - doso létale 50 est à peine de: 190 mg/kg chez la souris (en injection Intraveineuse).
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Le tableau I ci-après indique le spectre antibacturion do la 2'-amino-2'-dso.cy-lttuza"ycine.
T A 3 ia " ¯ Çl Z,
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<tb>
<tb> Micro-organismes <SEP> essayés <SEP> Concentration <SEP> minimum
<tb> pour <SEP> l'inhibition
<tb>
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¯ bzz¯ compl8to en ?G/ll1
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<tb>
<tb> Aerobactor <SEP> aerogenes <SEP> IAM <SEP> 1102 <SEP> 0,15
<tb> Alcaligenes <SEP> faecalis <SEP> 0,031
<tb>
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]3acillus agri 0,0?r3
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<tb>
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> ATCC <SEP> 6633 <SEP> oeo3g
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> PCI <SEP> 219 <SEP> 0,078
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> Type <SEP> 311D <SEP> 0,31
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> IAM <SEP> 1253 <SEP> 1,25
<tb>
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Klebsiella ptle umoniae 607 0, je
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<tb>
<tb> Lactobacillus <SEP> arabinosus <SEP> ATCC <SEP> 8014 <SEP> 1,56
<tb> Lactobacillus <SEP> fermenti <SEP> ATCC <SEP> 9338 <SEP> 0,15
<tb> Staphylococcus <SEP> albus <SEP> PCI <SEP> 1200A <SEP> 0,
039
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 209P <SEP> 0,31
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> Terashima <SEP> 0,015
<tb>
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Mycobacterium phlei no 56 0,62
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<tb>
<tb> Mycobacterium <SEP> phlei <SEP> Sekiguchi <SEP> 0,31
<tb> Mycobacterium <SEP> 607 <SEP> 0,78
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> 7,8
<tb>
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Pseudomonas aoruginosa I1 1007 0,1 Pseudomonas aeruginosa Takasalci 0,78 Pseudoinonas aeruginosa alasakuro 0,39
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<tb>
<tb> Salmonella <SEP> paratyphi <SEP> A <SEP> 0,62
<tb> Salmonella <SEP> paratyphi <SEP> B <SEP> 0,62
<tb> Salmonella <SEP> paratyphi <SEP> C <SEP> 1,25
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> PCI <SEP> 1001 <SEP> 0,31
<tb>
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T A B L Ë A 0 i (suite.
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Hicro-organismos essayés Concentration minimum
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<tb>
<tb> pour <SEP> l'inhibition
<tb> complète <SEP> en <SEP> g/ml
<tb>
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Sacclw,ro..1yces cerevisiae IAH 4626 500 SiiijeJ,la flexneri EW 10 2a o,039
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<tb>
<tb> Sreptococcus <SEP> faecalis <SEP> ATCC <SEP> 8043 <SEP> 15e6
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 209P
<tb>
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(réoîstant à la streptotiiycino) 2,5 Stap:ylococcus aureus 209P oe3l (résistant à l'\.h'ti.ll'O:llJrcine) 0,31 Eschorichia coli K-12 CS-2 Oe3l Escherichia coli K-12 Ci-2
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<tb>
<tb> (résistant <SEP> aux <SEP> antibiotiques) <SEP> 1,56
<tb>
Dans les dessins:
la Fig, Important en ordonnées l'absorbance A et en
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abscisses la longueur d'onde en mîllîinicrons,repr6sente le spectre d'absorption dans l'ultraviolet de la 2'-animo-2'-désoxy-lçanaluy- cine en solution dans de l'eau à une concentration de 1 mg/ml d'eau; la Fig. 2, portant en ordonnées la transmission en pour-
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cent et en abscisses le nombre d-lorides en em-l, représente le spectre d'absorption dans l'infrarouge de la 2e-amîtio-Ze-d6so>:y-kanwayoine dans le Nujol.
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Coinine on peut le déduire des Fig. 1 et 2, la 2'-amino-2'désoxy-katlavqrcine n'absorbe pas dans l'ultraviolet -de 220 à 340 :nillimicrons,mais préscnte des bandes d'absorption caractéristiques au nombre d'ondes ci-après: 3600, 3000, 1650' 1600, 1570, 1140;
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1110e 1095e 1090, 1060, 1035, 960e 900, 895e 880, 81.5a 815, 790, 780, 765,et 725/cm-1.
Pour exécuter le procédé constituant le premier aspect de l'invention, on peut utiliser une culture de la souche d'origine
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0-.-1 de Streptomyces kanamyceticus qui a été déposée dans la collection permanente de micro-organismes de l'1. T. C. C. à Washington, D.C. sous le n 21252. En outre, les cultures des mutants A-4-6,
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3AG, 18-8 et 19-2 de Streptomyces kanamyceticus qu'un peut utiliser dans le procède constituant le second aspect dE:! l'invention, ont été déposées également à l'A.T.C.C. sous les n 21260, 21259, 21261 et
21268 respectivement.
@ Comme on l'a indiqué ci-dessus, les mutants A-4-6, 3AG, 18-8 et 19-2 de Streptomyces kanamyceticus se distinguant par une aptitude faible sinon nulle à utiliser le xyloso,au contraire de la souche d'origine 0-4-1 qui utilise beaucoup de xylose.
Le mutant A-4-6 se distinguo, en outre, par le fait que sa croissance est nulle sur une plaque d'agar-agar de Czapek au saccharose ne contenant pas de désoxystreptamine, alors que la sou- che originale 0-4-1 peut y croître. Le mutant 3AG sa distingue par le fait qu'il forme des colonies beaucoup plus grandes que la sou- che 0-4-1 sur une plaque d'agar-agar de Czapek contenant du 3-amino- glucose. Les mutants 18-8 et 19-2 utilisés suivant l'invention, se distinguent par le fait qu'ils utilisent le dulcitol dans une Mesure' faible ou nulle alors quo la souche 0-4-1 originale peut utiliser beaucoup plus de dulcitol,
On produit ces mutants en appliquant la technique ci-après de mutation et de triage.
Les procédés appliqués pour chacun des mutants A-4-6, 3AG, 18-8 et 19-2 sont décrits plus en détail ci- après.
On obtient le mutant A-4-6 en traitant la souche 0-4-1 de Streptomyces kanamyceticus de la manière suivante : on apporte par inoculation la souche typique de Streptomyces kanamyceticus ci-dessus sur la surface d'une plaque inclinée d'agar-agar de Czapek au saccharose et on met la culture en incubation à 28 C pour une durée do 7 jours. Au moyen d'une boucle de platine, on prélève un fragment de la culture et on l'introduit dans loir un milieu liquide contenant Il*; de liqueur de macération de mais et 0,25% de levure séchée à un pH de 7,0, aans un tube à essai de 70 ml.
On exécute la culture avec agitation à 28 C pendant 24 heures
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dans un appareil à mouvement de va-et-vient réalisant 350 cycles par Minute sur une amplitude de 2 cm. On isolo le mycélium on croissance en centrifugeant le bouillon de culture pendant 10 minutes sous une accélération de 2000 g et en rejetant le liquide surnageant. On lave le gâteau de mycélium à deux reprises avec des quantités égales de solution de sérum physiologique à 0,9%, puis on mot le mycélium humide en suspension dans une solution de sérum physiologique à 0,9% jusque un volume de 5 ml, puis on y ajoute 4 ml d'une solution contenant du Na2HPO4 0,25 molaire,
après quoi on ajoute au mélange 1 ml d'une solution à 500 mg/ml de moutarde azotée, après quoi on laisse reposer le mélange pendant la minu- tes. Ensuite, on prélevé 1 ml du mélange et on l'ajoute à 9 ml d'une solution de neutralisation contenant 0,2% de glycine et 0,17% do NaHCO3, après quoi on laisse reposer le mélange à la température ambianto pendant environ 1 heure.
Par centrifugation, on isole le mycélium qu'on rince et qu'on transplante alors en entier dans la ml de liqueur de macération de mais.dans un tube à essai de 70 ml. On exécute une culture par agitation à 28 C pendant 24 heures de la façon indiquée ci-dessus. On rince le produit de culture deux fois, on le dilue et on l'introduit par inoculation sur une plaque d'agar-agar de Czapek au saccharose contenant en outre 100 mg/ml de désoxystreptamine. On exécute l'incubation à 28 C pendant 10 jours pour obtenir des colonies.
On prélève une certaine quantité de mycélium de chaque colonie qu'on utilise pour ensemencer 10 ml de liqueur de macération de mais dans des tubes à essai de 70 ml. On exécute à nouveau la culture par agitation à 28 C pendant 24 heures, connue ci.. dessus. On rince les cultures résultantes deux fois, puis ou les dilue et on .Les utilise pour inoculer des plaques d'agar-agar de Czapek au saccharose et des plaques d'agar-agar de Czapek au saccharose con- tenant de plus 100 mg/ ml ae désoxystreptamine. On exécute l'incu- bation à 28 C pondant 7 jours pour obtenir des colonies.
On isole'
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une soucho ne croissant pas sur la première plaque mais uniquement sur la seconde et on l'appelle ci-après le mutant A-4-6 de
Streptomyces kanamyceticus. Ce mutant qui consomme de la désoxy- stroptamine n une abondance d'environ unc colonie contre 100.
On produit le mutant 3AG on traitant la Douche originale 0-4-1 de la manière suivante: on applique par inoculation uno cul- ture do la souche typique 0-4-1 de Streptomyces kanamyceticus à la surface d'une plaque d'agar-agar de Czapek au saccharose incli- née et on la soumet à l'incubation pendant 7 jours à 28 C. Au moyen d'une boucle de platine on prélève un pou de la culture et on transplante cette quantité dans 10 ml d'un milieu liquide conte- nant 1% de liqueur de macération de mais et 0,25% de levure séchée à un pH de 7,0 dans un tube à essai de 70 ml.
On exécute la culture par agitation à 28 C pendant 24 heures dans un agita- teur à mouvement de va-et-vient assurant 350 cycles par minute avec une amplitude de 2 cm. On lave la culture deux fois avec une solution physiologique salée, puis on la traite avec une solution de 50 mg/ml de moutarde azotée. Au moyen de mycélium de la souche ainsi traitée, on inocule le milieu de Czapek contenant 3% de 3aminoglucose au lieu de 3% de saccharose èt on exécute la culture par agitation à 28 C pendant 24 heures comme ci-dessus.
On sépara de la culture par centrifugation le mycélium en croissance qu'on utilise pour inoculer un milieu à la liqueur de macération de mais, pour améliorer la croissance. On exécute la culture par agitation à nouveau à 28 C pendant 24 heures comme ci-dessus. On lave alors la culture et on homogénéise la suspension résultantes puis on la dilue et on l'utilise pour inoculer des plaques d'agar-agar ae Czapek au 3-aminoglucose qu'on soumet alors à l'incubation à 28 C pendant 14 jours pour obtenir des colonies. On obtient ainsi des colonies de petite dimension, de moyenne dimension et de grande dimension.
On ne recueille le mycélium que des Colonies do grande dimension. et on l'utilise pour inoculer de la liqueur de macération de mais.
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Cn cx:;uLe ? a culture il nouveau à 2S'-'C pendant i!./. nwu.':; :'-"I' '4I..;tút... tJ..v:1, C0..::.1C 1;.,Ü:11.1"'; ci-dessus. Apres lavaùe, on homogénéise la vN;p;w 7:icn, on là dilue et on Inutilisé pour inoculer des plaques Gi'a,;;,;t,t2'^:."L:I' de C'.'.v:jC:i. au 3-nmlnoglucose qu'on soumet a. une nouv;1.lù incubation ia 28 C pendant 14 jours,pour obtenir o nouveau ".5 colonids. un obtient ainsi une souche donnant uniquement des tol.on3.es do grande dimension qu>on recueille et qu?on appelle ciur0s le'Mutant 3,au de Streptouyces kanamyceticus.
On obtient les mutants 18-8 et 19-2 on traitant la souche o: i..e 0-4-1 de la manière suivante: au moyen ci'une culture de la souche originale -4-1 de Streptooyces kanafayceticus, on inocule la surface d'une plaque inclinùe d'agar-agar de Czapok à l':;iàon et on la soumet à l'incubation à 28 C pendant 7 jours.
Au Noycn d'une boucle de platine, on prélevé un peu de la culture et on met cette quantité en suspension dans 1 ml d'e au stérilises.
Apros trituration, on transplante le produit dans une polie contenant de l'agur-a3ar de Czapek à l'amidon et on oxécute l'incuba tion à 2â C pendant 10 jours.
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Apres l'incubation,' on dépose la coupelle sous une lampe
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à rayonnement ultraviolet (lampe de stérilisation de 19 watts de la Toshiba C > 'Ja90n) et on exécute l'irradiation dans l'ultraviolet pendant 10 tninutes en maintenant la coupelle à 30 cra de la ' lampe. Apr0s ce traitement provoquant la wutation, on racle 10 n:yceliun l0e 1& surface de 1?agar-aJar et on le mot en suspension dans 10 ml d'eau stérilisée. On homogénéise la suspeii-ion, puis on Inappliqué sur de 1>x1li,-agar de Csapek au duleitol et à l'af.:lidon (c'est-b.-dire de ..'slür -s3 jylr de Czapck contenant O,l/ d'anidon ot 3/J do 4ulcitol), puis on exécute l'incubation à 23 C pendant 7 jours.
On ne recueille le uyceliuu que aes colonies de petite dimension ayant grandi faiblement sur J,.'arc"lax' On utilise alors ce Ktyceliun pour inoculer les plaques inclinées d'acar-aur de CZQe à 1'a:hidon qu'on soumet à l'incubation à
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28QO pensait 7 jours. Toutes les colonies croissent convcnalliment sur les plaques d'aJ3x'-a;o.r inclinées de Csapck à 1" a::dçlcn.
Au moyen (Puna boucle de lutine on suparc le :;;c<J1ium uo chaque plaque inclinée et on Inutilisé pour inoculer une plaquu incllnue d'aÛar-a;ar contenant Ctes sels minéraux ct nu dut ci toi (1 de dulc1 tol, 01264,3 de sulfate d'xaniniu<>1, 0.. 5Ó5,.; d"l'(,lroGl1ophosphate I.lipotaDs1que, 0, Z:3S,; do ctihyurosophosphato Monopotasulque, 0,1; de sulfate ae magnàsiluz hepta:y'dratb, 0,0006/1'/'" ue sulfate cuivriquo pent,ai1yai'até, 010007';1/ de chlorure (..ú W...'1;MÙ:W t6tl'al1.Ydl'até, 0,00011,,, da sulfate ferriquc hcpt:.ù1Yurat6, o,Oü015 de sulfate de zinc heptal.'draé et 1..5", d' a;ar-ars pH 7,0).
On exécute 1"incubtltlon à 28 C pendant 14 jours pour obtenir un nombre prépondérant de souches crois.:m't de la manière normale ainsi que deux souches à peine qui ne croissent pas sensibleinent.
Ces deux souches,qui m.urr.irnt croîtru sur l'a;axwa'ar de Czrpr:lt à 1"a±lidon"ma1s non sur l'aax-aar contenant des sels Minéraux: et du dulcitol,ont Inaptitude de produire do la 2'-aràino-2?d6soxy-kro1cinc avec une efSicacit accrue et ces deux souches sont appelées ci-après mutants 1.3-8 et 19-2 de Stl'0;)tO[,j'ces kanaryceticus respectivement.
Les mutants :3G, A-4-6" 18-8 et 19-2 de 8trûtoLVC0 kanamyceticus qu'on utilise suivant linvnticn ont 1.,n; caractur1stiqucs suivantes: Les uiutants 3ÂGy A-4-6, 18-3 et 1-2 sont Morphologiquement semblables les wis aux autres ou fait que le f.l/C01:Lu,;
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aérien donne des ratifications,Mais non d'une finesse comparable
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et ne donne d'habituùe pas de spirales et \J vxi.l.ca ut uu ;< = .t que nés spores sont i'o:':.s i.'. l'cxtl'v;;,itJ du .'.(..'t..l. ;: aérien et ont d'habi tUQe une forme ovale ou cylindrique avec une larjeur u,1.: 1,0 à 115 micron en G4CJi ü.;., 1;. surfacu ces spores étant .7....:i:'st.
Toutefois, ces diverses souches s'jnt discernables 1;:m un'-s es autres en ce qui concerne les conditions do croissance sur les
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Milieux C1C culture, los C:.11?t:::r physiologiques et 1' pÉiÉé<io à
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1utilisation aos sources ùe carbone. Les conditions de criL5Si.1l'lCO, les effets l)i1Y;:zi'Jlo.Lque:.; et les a;>ìt<i;1<v ii l'uiilixation dos IOU:r.'-':C:; de curbone de ceu mutants ue d i ; v : e j) ' 4U ' .,: jl ,:, u l'.:ú,L1.UMycoti'jus t=ont :r0:;Uús dû..n::: les tableu.ux II, III et IV ci-aprus.
De plun) 1s>s x:iza't::e ncr: entr'c la souche typique 0-1r-1 da Streptor;yccs k:.ma:V'c0ticus et les mutants 1\"'/1'-6, :31.0, 18-8 et 19-2 qui en. dérivent sont resucées dans le tableau IV ci-après en ce qui concerne les conditions de croissance, les effets physiologiques et l'aptitude à l'utilisation des sources de carbone.
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T A B L E 1-. U II
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Conditions de croissance sur différents milieux de cultiu-e des mutants de Strept#::;rces kanar.vceticv.s (observation après 1. jours d'incrbatîon à une température de 28 C)
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llîlie-1 de culture Observations Mutant A-±-6 Mutant 3AG 1,lutant 18-8 hîutznt 19-2 1:ùcr-agar de c#ape3:
Croissance Croissance uniforue Croissance uniforme Croissance uniforme C-oi-sace 1X.'1.5..au saccharose - coloration jaune coloration jaune coloration jaune l rnc coJ.oa tio!1. faible profond profond j a-g=+ fonce Zyc01i1X1 aérien Néant' Néant Ileant î ",-' a P5.jtùc>iit solûDl e Jaune faible Jaune faible Jaune Jaune faible Revers Coloration jaune Coloration jaune ----- -----
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<tb> grisâtre <SEP> faible <SEP> grisâtre
<tb>
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J . . " Croissance Croissance très Croissance uniforme Croissance uniforme Croissame uniV , iaéàiocre ...., coloration .......... foi,r;c glyccrol médiocre incolore coloration sris coloration Gr15 1 O!':::C ccioraion jaunâtre jaunâtre brun elir liaiit Col l'yccliun acricn Néant Néant Néant Co'ratio:: j?,is oi'.'e vif soluble i-i C" ...
PiC'-i6nt soluble Ncant Néant Néant Coorrti'ibrun
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<tb> jaunâtre <SEP> faible
<tb>
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Revers ----- Coloration srisâtre Coloratic.njauriG ColorL.Gnbrun
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<tb> faible <SEP> grisâtre <SEP> faible; <SEP> jaunâtre
<tb>
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T J. B E 1. U II (suite 1)
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COZ1.!'O""<'" e ''''-'--01r''C:--.''''*"I>è l:-r" d'1f")..(.-:;t<- '-:-11i±"\'''''. ,.C: C1J1.t:..')C (2'" '"i1t..."'t'-'" (';( C;"".'t: J. ''''''.' "l,.
( o. ¯:>....1.."":-:- =17 gir ....- ..J:. gwi s à ' µrr, 1 1,> 1 ï 1 - . J ¯. <;..:........: 1. a 1;'t Ul...:..-... \\....'1.... = nr"J<:f-,)7""'"'f ,--. U-'q :":"111"."':'5 11. '01-1-t"c.:: Ú' .L"'''''f\1".''=-' -; -: C1" '"t l,}""';p i'C' ""'\.. 1'.("'.'I"('l. (,t-'" -:..'O("- ""'1o...'.........-......-'.,J- .10.. -....,. v ,-,,-..., ---.....,t¯v- "'"- ¯.¯-¯¯ '-1' ."J."'-.- -¯v¯- ...... ¯\... '-'.! .- - - . - - - ¯
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Milieu de cciture Observations Mutant ù#-(-6 l-uta!1t 31G ::l.ltt:.:d.. ; 1.'... -.... r -.r ¯:,ai:F::
I.,-o ¯Lk . :c,, ¯ . .., J.[,2¯!'-::..<::r à Croissance Colorc:.tion D:'1ffi CO 03.'C:vlCxn J2'LL Coloration jl1<lk '.UZ 6I'a.', e C j;,i;iz<> i>aspii,a=5¯ize et jlî:?vI''E3 a jaune jzi1#iàtre profond profond vif
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<tb> au <SEP> glucose <SEP> profond <SEP> à <SEP> brun
<tb>
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(?=W¯ ; =-¯s:" ) l.t,. céli 121 aérien Néant i;W-.l:c Coloration j::u==e l:(:r: t
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<tb> faible
<tb> Pilent <SEP> soluble <SEP> néant. <SEP> néant <SEP> Néant <SEP> Néant
<tb> Revers <SEP> Coloration <SEP> gris <SEP> Coloration <SEP> brun <SEP> ----jaurâtre <SEP> faible
<tb>
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J-[;<:r-<:1[;&1' k Croissance Coloration j2.U:.r18 Coloration jalJ21e Coloration jclule Coloration ja\:.!'.:
1'<:,;p2.ré:.Gine et profond à jaune proforid à jaune pr-of#1d fonce
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<tb> au <SEP> glucose
<tb> (Uschinsky)
<tb> Mycélium <SEP> aérien <SEP> Néant <SEP> Néant <SEP> Néant <SEP> Néant
<tb> Pigment <SEP> soluble <SEP> Néant <SEP> Néant <SEP> Néant <SEP> Néant
<tb> Revers <SEP> Coloration <SEP> jaune <SEP> Coloration <SEP> jaune' <SEP> ----- <SEP> ----
<tb> à <SEP> jaune <SEP> faible <SEP> à <SEP> jaune <SEP> faible
<tb>
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T A B L E A U II (suite 2)'
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Conditions ce C O? S Sf..eCE' s'Ur Q1¯ ÎG'¯'G:l S Bilieux de c-LTitrre des suants de 5ti'epto=jccs }:C:,!1:.::,.-cct:.C;.s CDSC'ilYWGIi après 1 jours Cî?12?Cl.iZJc:
.'OI'? à une température de 28 C)
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Milieu de culture Observations Mutant fi-!-6 Huant 3J.G 1.iutant lô-8 Mutant 19-2
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<tb> Agar-agar <SEP> au <SEP> Croissance <SEP> Coloration <SEP> jaune <SEP> Coloration <SEP> blanc <SEP> à <SEP> Coloration <SEP> blanc <SEP> à <SEP> Coloration <SEP> blanc <SEP> à
<tb> malate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> faible <SEP> à <SEP> jaune <SEP> jaune <SEP> faible <SEP> .jaune <SEP> très <SEP> faible <SEP> jaune <SEP> très <SEP> faible
<tb>
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î<h+c+liIna aérien. liéa>it Néant Néant Néant Pit;::Hmt sol1Jble Coloration légére- Néant néant Néant
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<tb> ment <SEP> jaune
<tb> Revers <SEP> ----- <SEP> Coloration <SEP> blanc <SEP> Coloration <SEP> blanc <SEP> -----
<tb>
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],c-r:..r-t-C<1l' [.U Croiss:rce Colorrtionbrun Co1or<:
.tio!1 brUl"i à Bonne croissance Boncze c=*1<sin-e rllz.Lc <ic: calciun ' jaimâtre brun jaunâtre coloration jaune coloration jaune et au slycérol 1.iôrcélîim aérien Néant Néant Néant Néant Pilent soluble Jaune Jaune Jaune Ja1.U-;C îé:.ible
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<tb> Revers <SEP> Coloration <SEP> jaune <SEP> Coloration <SEP> brun <SEP> ----faible
<tb>
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J,[;<:.1'-::'(;<:.1' au lice Coloration nulle Coloration nulle Coloration nulle C ol a=+ a t i ccx nulle bouillon a jaune crisatre a jà"m>e srisatre jaune grisâtre jaie gi,isi:t;>e
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<tb> Mycélium <SEP> aérien <SEP> Néant <SEP> Néant <SEP> Néant <SEP> Néant
<tb> Pigment <SEP> soluble <SEP> Néant <SEP> Néant <SEP> Néant <SEP> Néant
<tb>
<tb>
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,1 L D J, S L i3 ï 1=.>?#Ûe 5 - - - - - - - - - -
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, ; ;...-." ¯ " =.¯ ;j. i=,=. dirf.-..:.:;
r¯g) j13.;=.= ±é =1;' 13'È'c :, : 1."à"lzt¯ti de Strc-:.to-.yecG 1.lé:iiì.jcr"ï15-CU.S ('.'.:t '.:. : <:':. i;j>,"Î " 1/; jc"...;>r G'±é#c1-,iti<;#i .... i:.¯:.' ':r:' '..¯...' ae 2o'C./ cr:s ;':<,l:;:.:j' cet:.c'c'.S
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r. -... 'w .- t . : ' " i >-. (..:: (¯:''':;¯fC':1.. autant I;-,ce-6 rlut?..t'-t3LG ."tl4e:?"t1 G v ;":1.xt.c:.'.r!.t 19-2 .." -.... -..... '* - . - - ------- .... ¯ .. ¯ ¯ . - ß G'¯:...¯.i.r.G ' Cï'CJ'! .c.SF3:Ce l, '\ "r1 - "''11;:.- Croissance Zr ..¯'È'r fs:'ç 31i Croissance GLr E:- CTG? S3E..=:CE G ..'rc- :'''',--.''. ' ...¯¯...¯. r id e colo:.ti#l ri .fe, colo!'é.ti#'l Dcnt riùée, colo- u:!-.'.?¯i. rQ COiO:<:."' " 'Dlit.irt à e.là2'tE.' faible bl:.nc à jaune faible ration b2.anc à tien blanc a ,l-, 4l:;rlf:
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<tb> jaune <SEP> faible <SEP> faible
<tb>
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::yccli aérien l:E:e.I'v t6<;=Jt Néant Néant PiL-.-rit soluble Ncant Néant Néant Néant 1..': :'-' ;:' . ;.<;2- Croissance Coloration jaune à Coloration ja-tr-.e Coloration jaune Coloration jccne ¯ ",^C:::...C I!¯¯-. et brun ja-unâtre brun jaunâtre faible à jaune f3ible 2 jaune 1, l'(:z.:l:v1 ljr c 61 ij, aérien Néant néant Néant Néant
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<tb> Pilent <SEP> soluble <SEP> Néant <SEP> Néant <SEP> Néant <SEP> Néant
<tb>
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Revers ----- ----- Coloration jaune Coloration jaune
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<tb> faible <SEP> faible
<tb>
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Po: 1::8 de terre Croissance Bonne croissance Croissance riaée.
Croissance riàée, Croissance riàée, élevée, coloration surface gra-.iiilcv,,:,e, surface granuleuse surface ±r21nÙeTICJ
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<tb> ocre <SEP> coloration <SEP> brun <SEP> coloration <SEP> brun <SEP> coloration <SEP> brun
<tb> jaunâtre <SEP> faible <SEP> jaunâtre <SEP> faible <SEP> jaunâtre <SEP> faible
<tb>
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I¯'CÉ 3.1i7!.i aérien Coloration blanche Coloration léj/#c- Coloration légère- Néant sent blanche Ment "1" blanche .... : Do,\; D-c...C.. - ...Cl..."G Iéaat PiG:,e::-lt =oi##71e Néant Néant Néant Néant ...... 0 ¯. ¯- ¯¯¯¯¯¯.Jt#tt.-#Jt-.
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T A B L E A U II (suite 4)
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Cor.di tions de croissance SUl' C:.. i CI'Gili:S nilieux de Ctùt1:.l'e des mutants de StrCI}t#:.yCC:5 }:é:,;r.:ycE:tic1:.s CLZri.'.=li..'!G2? après 1,'y jours Ci?i??Ctitl'i0¯'1. à une té:#péiatlwe de 2BoC)
EMI21.2
Milieu iic culture Observations ïulltêi2l' A-.t-6 Hutant 3AG Ilutant lS-8 .autant 19-2
EMI21.3
<tb> Carotte <SEP> Croissance <SEP> Croissance <SEP> ridée, <SEP> Croissance <SEP> ridée, <SEP> Croissance <SEP> ridée, <SEP> Croissance <SEP> médiocre
<tb> moindre <SEP> que <SEP> sur <SEP> moindre <SEP> que <SEP> sur <SEP> moindre <SEP> que <SEP> sur
<tb> de <SEP> terre, <SEP> pomme <SEP> de <SEP> terre, <SEP> pomme <SEP> de <SEP> terre,
<tb> surface <SEP> granuleuse <SEP> surface <SEP> granuleuse <SEP> surface <SEP> granuleuse
<tb> Mycélium <SEP> aérien <SEP> Néant <SEP> Néant <SEP> Coloration <SEP> légère- <SEP> Néant
<tb> ment <SEP> blanche
<tb> Pigment <SEP> soluble <SEP> Néant <SEP> Néant <SEP> néant <SEP> Néant
<tb> CroiEsnce <SEP> à <SEP> 37 C <SEP> Pas <SEP> de <SEP> croissance <SEP> Pas <SEP> de <SEP> croissance <SEP> ----- <SEP> -----
<tb>
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Srrü su sans de Croissance - Croissance de colo- Croissance de colo- Croissance de colo- C3'û:îûSF.'¯CE de colcLocffler ration gris à CrÉi.G' ration gris à crene ration gris à CI'E:. ration r..?.'t b..
C-3Ei:"t .trcéliu:n aérien néant Néant Néant l141;;=t Pi;:e:2t soluble Néant Néant Néant Néant Croissance a 37 C Semblable à la Semblable à l.a è#à>1 òle àl.a -----croissance à 28 C croissance à 2ôOC croissance ±>. 2;J C 001.11" Cr'O.J..':C:S'l"C C"O'Íc'c-"' ,""c 2'W.É'.E.', i.l'G:i.: ^TtCcV ri;jE.E roissincl- C..éC:.
E.. :.,-!.' coloration jaune coloration jaune coloration jaune co}o:':'é. ';:;.1.C1:;. ;Îi:ir.T'
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<tb> Mycélium <SEP> aérien <SEP> Néant <SEP> Néant <SEP> Néant <SEP> Néant
<tb> Pigment <SEP> soluble <SEP> Néant <SEP> Néant <SEP> Néant <SEP> Néant
<tb>
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--------------------- -, - --- -------- ¯"¯¯M- , . -.---¯. ---- ''''...r-
<Desc/Clms Page number 22>
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'1.' 13 le ;, j U -1-I (suite 5)
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Coitl';-:'.s ..;c craisi=#.3=.tù sr;'-' E.?¯ï 1 i''¯'E::7 è.$ niH.ou;-: ;fl,# c;:11:>:=* des i;iiii,tzi,s do Sl.;>r;j<;¯ ;,c.¯i: CZ:C.'= ': î.l. ' '."¯' ....,r):"'....e- 1/. jours tl'ii#c;1;z,1±<,n à un* 1.(""-'(,,.,:,..1..1''''(''. de "j.........t, '-#.--
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Milieu d S C uù tià' e OEJ S C 1 ia 1 à. O13 Hutant A--4,- 6 iÉl ité.iit 3 X.
G II-Lmjit. 1± -S Jl 1 it. ; i = t ± j -2 LE.it ëcrcnë Croissr-nee Pas de croissance Pas de croissance Crois-sance en é=rin"té,ii CY'V,i.l'i't,1?,iàe en 8r;<1/é;U 1#JCé?.iC& aérien ----- ----- &nt i141:ià, PS-g%(.13i SolïblÈ ----- !én1t lï611ilt
<Desc/Clms Page number 23>
TABLEAU III Effet physiologique du mutant de Streptomyces kanamyceticus (observation après incubation de 14 jours à 28 C)
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<tb> Effets <SEP> physiologiques <SEP> Mutant <SEP> A-4-6 <SEP> Mutant <SEP> 3AG <SEP> Mutant <SEP> 18-8 <SEP> Mutant <SEP> 19-2
<tb> Réduction <SEP> du <SEP> nitrate <SEP> Positive <SEP> Positive <SEP> Positive <SEP> Positive
<tb> Hydrolyse <SEP> à <SEP> l'amidon <SEP> Positive <SEP> Positive <SEP> Positive <SEP> Positive
<tb> Formation <SEP> de <SEP> sulfure <SEP> Négative <SEP> Négative <SEP> Négative <SEP> Négative
<tb> d'hydrogène
<tb> Formation <SEP> de <SEP> tyrosinase <SEP> Négative <SEP> Négative <SEP> Négative <SEP> Négative
<tb> Liquéfaction <SEP> de <SEP> la <SEP> gélatine <SEP> Fortement <SEP> liquéfiée <SEP> Liquéfiée <SEP> Liquéfiée <SEP> Liquéfiée
<tb> (à <SEP> 15 C <SEP> perdant <SEP> 14 <SEP> jours)
<tb> Solubilisation <SEP> du <SEP> sérum <SEP> au <SEP> Non <SEP> observée <SEP> Non <SEP> observée <SEP> Non <SEP> observée <SEP> Non <SEP> observée
<tb> sang <SEP> de <SEP> Loeffler <SEP> (à <SEP> 28 C <SEP> et
<tb> 37 C <SEP> pendant <SEP> 14 <SEP> jours)
<tb> Milieu <SEP> au <SEP> lait <SEP> écrémé <SEP> Pas <SEP> de <SEP> coagulation, <SEP> Pas <SEP> de <SEP> coagulation, <SEP> Pas <SEP> de <SEP> coagulation, <SEP> Pas <SEP> de <SEP> coagulation
<tb> peptonisation <SEP> peptonisation <SEP> peptonisation <SEP> lente <SEP> peptonisation <SEP> lent,
<tb> rapide <SEP> rapide
<tb>
<Desc/Clms Page number 24>
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2 1-. J3 -.-k.JG\ JI-LY.
EMI24.2
D-i ."'!..':lf" ::"S .:?:::-=:: 1 à";!: tjr;i::,.1.l-:? 0-1..-1 et les 1:11t!1t.S dB St:trJtf)w,rces 1'>;-x-=r."i;iaus
EMI24.3
i's:3r'é :..".='s,±y::5 Souche O-±-1 t7 3 :u !i ; #I'.L r¯-.ir-r3 '' Mutant 3AG iéutz¯nt 18-3 autant 19-2 6'.ZGJ¯C¯ ;¯¯ Plaque .a' 4fGi ¯x-4G3 de CzàPeÉ T 1 i' - -H- + 4t,A S..CCil.06 Plaque ='*ra=-*ca=- C:e' Cza?ek '' -iw la dcso.:-yEtr&pt:ii:e Plaque d'agar-e&r de Czapek - -F---I- au 3's.i.:'1.r0 utL .'.-e Plaque d'agar-agar deCzapek ... i-i-i- ++ ' wi- - ¯i
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<tb> au <SEP> dulcitol
<tb>
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P13T e de 'terre Croissance ridêe Bonne croissance Croissance Croissance r3.C.E, Croissance ridée, surface ßa2tei:
.5e, élevée, colora- ridée, s'ur- surface granule'c.- surface granucoloration lêgereSteiit tion ocre face granu- se, coloration Icuse, colorabrune leuse, colo- brun jaunâtre tien. brun jau- -raùion brun faible natre faible
EMI24.6
<tb> jaunâtre
<tb> ------ <SEP> faible <SEP>
<tb>
EMI24.7
Effet ;sio3 oic;e
EMI24.8
<tb> Liquéfaction <SEP> de <SEP> la <SEP> gélatine <SEP> +
<tb>
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Hilieu au lait écréme Peptonisation lente Peptonisation Peptonisation Peptonisation Pepé"or-îsa4-i-on r4p ce rapide lente lente
<Desc/Clms Page number 25>
T A B L E A U IV (suite)
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¯¯¯¯¯¯¯Diiférezces ez%g=e la souche t-.:!pi¯O-4-1 et les, mutants de Stre..pt:l1Ls ks1:?:.::
rr¯eticus
EMI25.2
<tb> Observations <SEP> Souche <SEP> 0-4-1 <SEP> typique <SEP> Mutant <SEP> A-4-6 <SEP> Mutant <SEP> 3AG <SEP> Mutant <SEP> 18-8 <SEP> Mutant <SEP> 19-2
<tb> Utilisation <SEP> des <SEP> sources
<tb> de <SEP> carbone
<tb> Saccharose <SEP> +++ <SEP> # <SEP> ++ <SEP> + <SEP> +
<tb> Xylose <SEP> ++ <SEP> - <SEP> - <SEP> # <SEP> #
<tb> Acétate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> ++ <SEP> - <SEP> # <SEP> +++ <SEP> +
<tb> Citrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> +++ <SEP> + <SEP> ++ <SEP> + <SEP> +
<tb> Suçcinate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> + <SEP> # <SEP> ++ <SEP> + <SEP> +
<tb>
EMI25.3
Dulcitol +++ ++ +++ # #
<Desc/Clms Page number 26>
Les antibiotiques NK-1001 et NK-1003 quon peut utiliser comme additif dans le procédé constituant le premier aspect,
de l'invention décrit ci-dessus sont de nouveaux antibiotiques qui peuvent être obtenus par culture d'une souche de Streptomyces kanamy- ceticus dans un milieu contenant un additif spécial.
L'antibiotique NK-1001 est une nouvelle substance qui est efficace pour inhiber la croissance de bactéries Gram-positives et Gram-négatives comme Bacillus subtilis, Lacto-bacillus fermenti et Shigella dysenteriae, qui est basique et soluble dans l'eau, le méthanol aqueux et l'éthanol aqueux, mais insoluble dans le méthanol absolu, l'éthanol absolu, l'acétate d'éthyle, l'acétate do butyle et le benzène, qui donne une réaction positive à la ninhydrine et avec les réactifs d'Elson-Morgan et Molisch, mais une réaction négative avec les réactifs de Sakaguchi, Tollens, Fehling, Millon et Benedict, qui contient du carbone de l'hydrogène, de l'oxygène et de l'azote,mais ne contient pas de soufre, d'halogènesni de cendres,
qui répond à la formule globale C18H35N3O12.H2O et qui forzne des cristaux aciculaires incolores se décomposant à 238-242 C, qui accuse en solution aqueuse un pouvoir rotatoire [[alpha]]D21 de plus 132 , qui n'absorbe pas dans l'ultraviolet de 220 à 340 millimicrons comme le montre la Fig. 3 portant en ordonnées l'absorbance A, en abscisses la longueur d'onde et qui présente des bandes d'absorption caractéristiques dans le Nujol dans la région infrarouge comme le montre la Fig.
4 portant en ordonnées la transmission en pour-cent et en abscisses le nombre d'ondes. L'antibiotique NK-1001 hydrolysé par chauffage en solution dans l'acide chlorhydrique 6N pendant 40 minutes à 100 C perd son activité antibactérienne. La solution d'hydrolyse résultante est appliquée sous la forme d'une tache sur un ruban (40 cm x 2 cm) de papier-filtre Toyo n 50, puis développée en sons descendant au moyen d'un mélange butanol-pyridino-acide acétique-eau (6 : . : 1 : 3).
Le chromatogramme sur papier résultant montre la
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formation de trois taches, à savoir l'une qui donne des réactions positives à la ninhydrine et au nitrate d'argent ammoniacal, l'autre qui donne une réaction positive à la ninhydrine uniquement et la troisième qui donne une réaction positive au nitrate d'argent ammoniacal. De la comparaison avec des étalons, on peut en déduire que ces trois taches correspondent à la désoxy streptamine, au 6-amino-6-désoxy-D-glucose et au D-glucose, respectivement.
Pour cette raison et connaissant le poids moléculaire de l'antibioti- que NK-1001, on peut considérer que l'antibiotiquo NK-1001 est un nouveau composé consistant en une molécule de désoxy streptamine, une moléculé de 6-amino-6-désoxy-D-glucose et une molécule de D-glucoso. L'antibiotique NK-1001 ost sensiblement non toxique puisque sa dose létale 50 en administration intraveineuse chez la souris est de 3050 mg/kg.
On peut produire l'antibiotique NK-1001 en cultivant la souche typique ci-dessus 0-4-1 de Streptomyces kanamyceticus dans des conditions aérobies dans un milieu de culture contenant un hydrate de carbone et un aliment azoté, de môme qu'une certaine quantité de streptidine, jusqu'à ce que l'antibiotique NK-1101 s'accumule dans le milieu, puis en isolant l'antibiotique de la culture. La technique pour produire l'antibiotique NK-1001 par fermentation et la nature des sources de carbone et d'azote peuvent être semblables aux techniques et aux sources convenant pour la production de la 2'-amino-2'-désoxy-kanamycine, comme décrit cidessus. Il est donc possible d'appliquer la culture par agitation et la culture en cuve. La température de culture peut être de 25 à 35 C et est de préférence d'environ 28 C.
La quantité do streptidine ajoutée au milieu de culture n'est pas critique mais elle est économiquement de 0,05 à 1,0% et de préférence de 0,1 à 0,5% du poids du milieu. La streptidine peut être ajoutée au début de la mise en culture ou au cours de l'opération même.
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L'isolement et la purification ae l'antibiotique NK-1001 peuvent être exécutés connue pour la 2'-amino-2'-désoxy-kanamycine, comme décrit ci-dessus.
L'antibiotique NK-1003 qui peut être utilisé comme addi- tif comme l'antibiotique NK-1001 est aussi une nouvelle substance antibactérienne efficace contre les bactéries Gram-positives, Gram-négatives et acido-résistantes comme Bacillus subtilis, Lactobacillus fermenti, Shigella dysenteriae et ainsi de suite.
L'antibiotique NK-1003 est une substance qui est efficace pour inhiber la croissance dos bactéries Gram-positives, Gram-négatives et acido-résistantes, qui est basique et soluble dans l'eau, le méthanol aqueux et l'éthanol aqueux mais insoluble dans le métha- nol absolu, l'éthanol absolu, l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle et le benzène, qui donne une réaction positive à la ninhy- drino et aux réactifs d'Elson-Morgan et de Molisch, une réaction négative aux réactifs de Salcaguchi, Tollens, F'ehling, Millon et Benedict, qui contient du carbone, de l'hydrogène, de l'oxygène et de l'azote mais qui ne contient pas de soufre, d'halogènes ni de cendres, qui répond à la formule globale C12H25N3O7,
qui forme des cristaux aciculaires incolores se décomposant à 202-205 C,qui accuse en solution aqueuse à 1% un pouvoir rotatoire [[alpha]]D21 de plus 95 , qui n'absorbe pas dans l'ultraviolet de 220 à 340 milli- microns comma le montre la Fig. 5 portant en ordonnées l'absorbance A et en abscisses la longueur d'onde et qui présente des bandes d'absorption caractéristiques dans le Nujol dans la région infra.. rouge conune le montre la Fig. 6 portant en ordonnées la trans- mission en % et en abscisses le nombre d'ondes. L'antibiotique Ni\-1003 hydrolyse par chauffage pendant 40 minutes à 100 C en solu- tion dans l'acide chlorhydrique 'ON perd son pouvoir antibactérien.
On applique la solution d'hydrolyse résultante sous la forme d'une tache sur un ruban (40 cm x 2 cm) de papier filtre Toyo n 50, puis on la développe en sens descendant au moyen d'un mélange
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butanol-pyridine-acide acétique-eau (6 : 4 : 1 : 3@. Le chroma- togramme sur papier résultant montre qu'il se forme deux taches dont l'une donne une réaction positive à la ninhydrine et 1-'autre donne une réaction positive également au nitrate d'argent ammonia- cal. Par comparaison avec .des étalons, on peut établir quo les deux taches correspondent à la désoxystreptamine et à la 6-D-Cluco- .samine,respectivement. Pour cette raison et connaissant le poids moléculaire du composé, on peut en déduire que l'antibiotique .
NK-1003 est un composé consistant en une molécule do désoxystrep- tamine et en une Molécule de 6-D-glucosamine. L'antibiotique NK-1003 est sensiblement non toxique puisque sa dose létale 50 en administration intraveineuse chez la souris est de 1550 mg/kg.
On peut produire l'antibiotique NK-1003 en cultivant une souche de Streptomyces kanamyceticus dans un Milieu de culture qui contient un hydrate de carbone et un allient azoté, de même qu'une certaine quantité d'antibiotique NK-1001 dans des conditions aérobies jusqu'à ce que l'antibiotique NK-1003 s'accumule dans la culture, puis en isolant l'antibiotique de la culture. La produc- tion par fermentation de l'antibiotique NK-1003 de même que les sources de carbone et d'azote convenant à cette- fin sont les mêmes que celles convenant pour la production de la 2'-amino-2'-désoxy- kanamycine. Il est préférable de recourir à la culture on immersion profonde avec aération. La température de culture peut être de 25 à 30 C mais est de préférence de 28 C environ.
La quantité d'antibiotique NK 1001 ajoutée au milieu de culture n'est pas cri- tique,mais peut être de 0,05 à 1,0% et de préférence de 0,1 à 0,5% du poids du milieu. L'antibiotique NK-1001 peut être ajouté soit au début de la culture, soit pendant l'opération.
L'isolement et la purification de l'antibiotique NK-1003 peuvent être exécutés comme pour la 2'-amino-2'-désoxy- kanamycine, comme décrit ci-dossus.
Dans les dessins:
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la Fig. 3 représente le spectre d'absorption dans l'ultraviolet de l'antibiotique NK-1001 en solution dans de l'eau à 1 mg/ml d'eau, la Fig. 4 représente le spectre d'absorption dans l'infra-
EMI30.1
roue de 11uitibiotîque Nit-1001 dans le lqujol; la Fig. 5 repr6sente le spectre d'absorption dans l'ultraviolet de l'antibiotique NK-1003 en solution dans de l'eau à 1 mg/ml d'eau, la Fig, 6 représente le spectre d'absorption dans l'in- frarougo de l'antibiotique NK-1003 dans le Nujol.
Les spectres antibactériens des antibiotiques NK-1001 et NK-1003 qu'on peut utiliser comme additif dans le procède faisant le premier aspect de l'invention sont résumés dans le tableau V ci-après.
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TABLEAU V
EMI31.1
Concentration. minîzun olrr 1 inh:l.b i tien en lf\.p:/;n1 I-licro-orsanisse essayé Antibiotique IIK-1001 Antibiotique IX-1003 µr¯atiîs;xe essajYé ±-ntïoiotique i-1 ooi Jmtïbioiique î±K-? 1,erobacter aerogenes IIà.b 1102 31 2 15 6 A1ca1iEenes faecalis ¯¯¯¯ 3 g Bacillus abri 7,8 . 20 Bacillus STJbtilis ATCC 6633 6,,25 3,125 Candida albicans >500 >500 Diplococcus :emior:ise Type 311D 500 250 Escher.cr¯3.a, coli 1;.1.: 1253 ' 125 125 K1ebsicll .p:eu.orur¯e 607 31,2 31,2 1,actoba,ci13.us fc:rr.(>!1ti ATCC 9338 3,9 3,9 Sta1ih.lococcus àiD1% PCI 1200A 15,,6 7,,8 StGjîi'z"IOCOç;C1iS Z1Wet;S 209P . 62,5 62,5 S tï:1!ilr OCGCCh:' 41:2'F.'1i$ .'E'rc : :l0 Ii: 2 6,25 3 125 I ; ca:c¯ctcr i.i.:. p111(>1 ::S 15,6 25 ;
CO;:K.C.(( ri 1.'" 6U7 62,5 50 Salmonella '.i..i a.ij'r1F21, A 62,5 62,5 Sa:c.,l lut.<:'a FC'1 1001 00 250 S,.¯cC'¯a.re::, ct' CF2'e:'iS:.Lc' 11-':.: ±626 >500 >500 ShiGell<:, fi f.'-.3:C2";.. ?Il 10 2a ,6,25 3 125 8trevt.ocGCCUS lG:iO't'',¯C'.iS D-90 500 bzz
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Le procédé constituant le premier ospect de l'invention est illustré avec référence aux exemples 1 à 8 ci-après.
EMI32.1
1.?; ;;II',[;L; On inocule un milieu de culture liquide (15 litres)
EMI32.2
contenant 3,0il d'amidon, 2,,01 de maltose, 2, sjé de farina de soya, 1,2% do nitrate de sodium et 0,5% de chlorure de sodium au moyen do la souche typique 0-4-1 de Streptomyces kanamyceticus et on exécute l'incubation à 28 C avec aération et agitation.
Apres 22 heures d'incubation, 'on introduit 50 g de 3-amino- glucose dans le milieu de culture et on poursuit l'incubation.
EMI32.3
La quantité de 2'ino--2'-désoy-kana:;c.rre produite dans le milieu do culture atteint son maximum au terme de 150 heures.
On filtre alors le milieu de culture liquide et on traite le
EMI32.4
filtrat au moyen de 4 litros d" Amber11 te IRC-50 (forme ammoniaque).
On ùluc les antibiotiques adsorbés sur la rûs1ne au rnoyen d'auuno- niaquu aqueuse 0,5N. On recueille les fractions actives et on les concentre en un sirop. Un dissout le sirop dans 500 ml d'eau, puis on décolore la solution par traitement à l'aide de 6 g de charbon actif. On filtre la solution pour éliminer le charbon actif et on soumet le filtrat à une élution chromatographique au Moyen de 600 !!il do Dowex 1 x 2 (forme OU)'. On élue les fractions
EMI32.5
contenant de la 2'-aaino-2'-désoxy-kttnarnycino en premier lieu avant d'isoler de la kanamycine A.
On collecte les fractions à concen- tration élevée en puis on les concentre et on les lyophilise pour obtenir 2,2 g d'une poudre de brute. On dissout cette poudre brute (2,2 ) dans 50 ml d'eau et on traite la solution au moyen
EMI32.6
Û'A.l3h:llßto CG--50 (fol'mc auJ.:1lonique). On élue la résine chromato- ;ra.:ucucr,mtzt au moyen d'a.aonialua aqueuse 0,11'1 à 0,5N et on \11uo on 1)1'0::11131' lieu la petite quantité de kananycine A présente iuultanu::nt. On élue ensuite séparéaent la 2'-wimo-2'-dôsoxy- .wll'..Iycinc en une fraction unique qu'on concentre et qu'on lyo-
<Desc/Clms Page number 33>
philise pour obtenir une poudre brute.
Par recristallisation do la
EMI33.1
poudra dans un molango d'eau et de diwôt8yLiormamido, on obtient 11 do 2'-atrnirto-2'-désoty-ltartarclrxa sous lu l'orme do cristaux aciculaires incolores, L'analyse élémentaire indique que Io produit contient /.2,,62Î; de carbone, 7,52; d'iydroune et l230;J d'azote (valeurs trouvées), On détermine le poids moléculaire du produit qui est de 435.
EMI33.2
:XFJU...k..::.
On inocule un milieu de culture liquide (15 litres) do la même composition que dans l'exemple 1 au moyen de la même
EMI33.3
souche de Streptomyces ltunaroyccticus quo dans l'exemple 1, ;xi on exécute l'incubation à 280C avec agitation et aération. Aprt3c 22 heures d"incubation, on introduit 50 g do 6-awinoglucosc dans le milieu de culture et on poursuit l'incubation, La quantité de 2'-amino-2'-désoxy-kanaxvcine s'accumulant dans le "11Ui'}U de culture atteint son maximum au terme de 145 heures après le début de l'incubation.
On traite alors le milieu de culture liquide et on purifie la poudre brute comme dans l'exemple 1 pour obtenir 1,0 g
EMI33.4
de 2-amino-2''-désoxy-kanamycine cristalline.
EXE{P.LE ,.3 t
On inocule un milieu de culture liquide (15 litres) contenant 3,0% d'amidon, 2,5ï d'amidon de mais, 1,2% de nitrate de sodium et 0,35% de chlorure de sodium au moyen de la même souche
EMI33.5
de StreptoiiVces kanamyceticus que dans l'exemple 1, puis --n exé- cute l'incubation à 28 C avec aération et agitation. Aprs 20 heures d'incubation, on ajoute au milieu de culture, 30 g de l'antibiotique NK-1001 et on poursuit l'incubation. La production
EMI33.6
de 2''-amino-2'-désoxy-kanam/cine atteint son maximum au terme de 140 heures d'incubation.
On traite alors le milieu de culture liquide et on purifie la
EMI33.7
poudre- brute comme dans l'exemple 1 pour obtenir Ze5 g de 2''*amino-
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2'-désoxy-kanamycine cristalline.
On inocula un milieu de culture liquide (15 litres) de la même composition que dans l'exemple 3 au moyen de la même souche
EMI34.1
de Stroptonycos kananyocticus que cello de l'exemple 1, puis on exécute l'incubation à 28 C avec aération et agitation. Apres 20 heures d'incubation, on ajoute au milieu de culture 30 g
EMI34.2
ae l'a.ntibiotiquo xK-1003 et on poursuit l'incubation. La quantité de 2'''-amino-2'-dësoxy'-kanaMyoine s'accur.1ulant dans le milieu de culture atteint un maximum au terme de 140 heures d'incubation.
On traite alors le milieu de culture et on purifie la poudre brute comme dans l'exemple 1 pour obtenir 1,5 g de
EMI34.3
2's.r:;3...o-2'-dêsolr-ltariarrdcine . crista:lline.
#:'ÍPTJE it.:':r
On inocule un milieu de culture liquide (15 litres) ayant la même composition que dans l'exemple 3 au moyen de la
EMI34.4
même souche de Streptomyces kanalilyceticus que dans l'exemple 1, puis on exécute l'incubation à 28 C avec aération et agitation.
Aprs 20 heures d'incubation, on ajoute 45 g de néamine au milieu de culture et on poursuit l'incubation. La quantité de
EMI34.5
2'-amino-2'-désQxy-kanamycine s'accumulant dans le milleu de culture atteint un maximum au terme de 140 heures d'incubation.
On traite alors le milieu de culture et on purifie la poudre brute comme dans l'exemple 1 pour obtenir 1,2 g de 2'-amino-
EMI34.6
2'-.dLSOxy-itanu::ycine cristalline.
EXEMPLE 6. -
On stérilise un milieu de culture liquide (15 litres)
EMI34.7
contenant 3,0 d'a.nidon, ,,,5 de farjne de soyn, 1,2% de nitrate de sodium et 0,35% de chlorure de sodium, puis on le refroidit et on le mélange avec une solution stérilisée et refroidie de 30 g de l'antibiotique NK-1001 dans de l'eau. On inocule le mélange
EMI34.8
résultant au luuyen de la même souche de Streptomyces kananyceticus
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EMI35.1
que dans liexempl.3 1 et on exécute l'incubation à 28C avec aération c3t agitation. La quantité de '-ara.no-'-c:éso3-kanu:nyc.nc a;4Qcutnulant dans le milJeu de culture atteint un maximum après 140 heures d' incubation.
EMI35.2
On traite le milieu de culture et on purifie la poudre
EMI35.3
brute comme dans l'exemple 1 pour obtenir environ 2,2 g de 2 '-amino-2'-désoxy-kanamyaInc cr1 p.tall1ne.
EMI35.4
EXEMPLE 7,.-
EMI35.5
On cultive du Streptoieces kanawycoticus en présence do l'antibiotique NI%'-1001 comme dans .'exe:nole 3. On filtre le m1l1eu de culture résultant et on ajuste le plI du i';iltrt7t (14 13tres) à 10 par addi ti on d'hylroxyde de sod1um. On ,,,ou,net le filtrat alors à une extraction au moyen de Oy25 volume do n-butanol contenant 2 g de benzaldsl1yàe par gral1l;llC doantibiotiquos bp-siqueslirdro,solubles que contient le filtrat. On sépare lpax-
EMI35.6
trait n-butanolique par mélange avec 0,1 volume ci'eau.
En ajustant
EMI35.7
le pH du mélange à 2,0 par addition d'acide sulfurique et auitation,
EMI35.8
on transfère les antibiotiques basiques hydrosolubles dans la phase aqueuse, On décolore la solution résultante dos antibioti-
EMI35.9
ques dans de 2'eau au moyen de charbon actif et on la soulnet à la chromatographie sur de la résine Dowex 1 x 2 (forite OH) et à la chromatographie sur de la résine Amberli te CG-50 (f orn! a::da0-
EMI35.10
nique) comme dans l'exemple 1. On obtient une poudre brute qu'on
EMI35.11
recristalliso dans de 1.'eau et du diwétllfo!1auiQe pour obtx.nir 1,1 g de 2'-ar:1ino-2'-d6soXy-kanamycino sous la l'orao de cristaux
EMI35.12
aciculaires incolores.
EMI35.13
RX&PLË ¯8..¯-Co!MaraiGon), Dans cet exemple" on exécute une série dressais pour démontrer l'effet imprévisiblo et avantageux de 7.'Wc:uition ùes aniinoglucoses et de leurs aérivés déso.;.:ystrcptu.-:ini'luC:$ sur la formation de la 2'-aaina-'-âéso:y-k.na.^;cinr: CW."1 la Pl';:I:;;tI'1J forte de réalisation do leinvention, la copar(.1.ison étant établie
<Desc/Clms Page number 36>
avec des témoins ne contenant pus les additifs.
Pour cos essais, on cultive la soucho typique 0-4-1 do Streptomyces kanamyceticus à 28 C pendant 150 heures comme dans l'exemple 1 1 dans des cuves de fermentation identiques contenant des milieux do culture de la même composition. A différents Moments aprbs le début do la mise en culture, comme indiqué ci-après, on ajoute divers aminoglucoses et leurs composés désoxystreptaminiques aux milieux de culture. Apres avoir poursuivi la culture pendant 150 heures, on traita les bouillons comme dans l'exemple 1 pour obtenir de la 2'-amino-2'-désoxy-kanamycine et de la kanamycine A dans toute la mesure du possible. Les quantités des produits obtenus et les détails concernant les essais sont précises dans le tableau VI.
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EMI37.1
B Z E .i U VI
EMI37.2
<tb> Essai <SEP> Additif <SEP> Quantité <SEP> Houent <SEP> de <SEP> Teneur <SEP> en <SEP> Production <SEP> de <SEP> Teneur <SEP> en <SEP> Production <SEP> de
<tb>
EMI37.3
1: 't d'additif' l'addition 2'-<::.ro::ino-2'- .ésm:;'{- 2'-amino-2'-désoigi- kanancine A #.nB.ILfcine A
EMI37.4
<tb> (g) <SEP> après <SEP> le <SEP> kanamycine <SEP> kanarycine <SEP> (mg/ml) <SEP> (g)
<tb> début <SEP> de <SEP> la <SEP> (mg/ml) <SEP> (g)
<tb> mise <SEP> en
<tb> culture
<tb> (heure)
<tb> 1 <SEP> , <SEP> néant <SEP> --- <SEP> -- <SEP> 26 <SEP> 0,12 <SEP> 2790 <SEP> 26,8
<tb>
EMI37.5
2 3-Arsino- 50 22 240 1,10 V180 12,7
EMI37.6
<tb> glucose
<tb> 3 <SEP> 6-Amino- <SEP> 50 <SEP> 22 <SEP> 225 <SEP> 1, <SEP> 00 <SEP> 1730 <SEP> 15,2
<tb> glucose
<tb> 4 <SEP> Antibiotique <SEP> 30 <SEP> 20 <SEP> 575 <SEP> 2,50 <SEP> 1240 <SEP> Il,
2
<tb> NK-1001
<tb> 5 <SEP> idem <SEP> 30 <SEP> 0 <SEP> 480 <SEP> 2,20 <SEP> 1450 <SEP> 13,6
<tb> 6 <SEP> Antibiotique <SEP> 30 <SEP> 20 <SEP> 345 <SEP> 1,50 <SEP> 17.00 <SEP> 16,0
<tb> NK-1003
<tb> 7 <SEP> Néamine <SEP> 45 <SEP> 20 <SEP> 260 <SEP> 1,20 <SEP> 1390 <SEP> 12,8
<tb>
<Desc/Clms Page number 38>
Comme il ressort des résultats du tableau V, l'addition
EMI38.1
des 1inoGlucoscs et de leurs dérivés àésoxystreptammiques au mill .,,'..1 de culture conduit à une amélioration remarquable de la production de la 2'-aràino-2'-désoxy-kanazycine, ce qui indique que la quantité de 2e-amino-2e-désoxy-Aaneunycine produite et accu- mulée dans le milieu de culture augmente beaucoup lorsqu'on applique le procède constituant le premier aspect de l'invention.
Le procédé constituant le second aspect de l'invention est .illustre avec référence aux exemples 9 à 13,
EMI38.2
E.::Ó:-fPrJ 9.-:: On inocule un milieu de culture liquide (15 litres) contenant 3 0; de maltose, 2,0;'& d'amidon, 3,O;b de farine de soya, 1,0% de nitrate de sodium et 0,5% de chlorure do sodium au moyen du mutant A-4-6 de Streptomyces kanamyceticus, puis on exécute l'incubation à 28 C avec aération et agitation. La quan-
EMI38.3
due 2'-aminu-2'-déso.xy-kanamycine accumulée dans le mU:!" e1.t de culture atteint un maximum au terme de 6 jours après le début de l'incubation.
On filtre le milieu de culture pour obtenir 14 litres de filtrat qu'on traite au moyen de 4 litres de résine Amberlite
EMI38.4
IRC-50 (forme aiùiaon1lue), On élue la résine ensuite au moyen dam- moniaque aqueuse 0,5N. On recueille los fractions actives et on lesconcentre en un sirop qu'on dissout dans 500 ml d'eau. On décolore la solution par traitement au moyen de 6 g de charbon actif, Or. filtro la solution pour séparer le charbon et on soumet le filtr at à uno élution chromatographique sur 600 ml de Dowex 1 x 2
EMI38.5
(forme 011). On élue la 2'-amino-2'-àésoxy-kanaiycine avant de séparer la iianaiiveine A.
On collecte les fractions à concentration élevée en 2'-D.wino-2'-dú:; iV'-kanúLiJ,Ycine" puis on les concentre et on les lyophilise pour obtenir 3,2 g d'une poudre brute. On dissout cette poudre brute dans 50 ml d'eau et on traite la solution au moyen de résine Amberlite CG-50 (forme ammonique) pour adsorber
<Desc/Clms Page number 39>
EMI39.1
les antibiotiques. On. souuct la résine à une 61utlon chroatocraphique au moyen d'ar:lr:lOn1aqllc aqueuse 0,1" à 0, 5. On élue cl'u.ùoz'ù une petite qua:ztité de loa1ixTycine ;, présente silllultallÙ,lOnt, puis on élue la 2'-arnino-2'-désoxy-kan.^.rcine en une seule fraction.
On concentre cette fraction unique et on la lyophilise pour obtenir une poudre brute de Par recris-
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tallisation de cette poudre dans l'oau et le ciaétir,yi:'orna..^ido9 on obtient 1,9 g de sous la forme de cristaux aciculaires incolores.
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r F.rP .10-
On inocule un milieu de culture liquiao (15 litres) de la même composition que dans l'exemple 9 au moyen du mutant 3AG
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de Streptomyces kanaitqceticus, puis on exécute 1)incubation à 280C avec aération et agitation. La quantité de 2'-ur:.no-2'-dsoyl<:ana.u1Yc1.'1e seaccumulant dans le milieu de culture atteint un maxi- mum au terme de 6 jours après le début de l'incubation.
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On traite le milieu de culture ColuLio dans l'exenrle 9 pour obtenir 1,2 g de 2'-aruino-2'-désoxy-kanarcycine cristalline.
EXEMPLE 11. -
On inocule un milieu de culture liquide (15 litres) ayant la même composition que dans l'exemple 9 au moyen du mutant
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18-8 de Streptomyces kanaàoyceticus, puis on exécute l'incubation à 280C avec agitation et aération. La quantité de 2)-amino-2.1desoxy-kanacrycine s'accuarulant dans le L,ilieu de culture atteint son maximum au tere de 7 jours après le u0but de l'Lcuuation.
On traite le bouillon de culture co;>1;e clans l'e::e:3ple 9 pour obtenir environ 2,2 g de 2'-a:aino-?'-déso:;-kana;;clne cris- talline.
SIMPLE 12.-
On répète le procédé de l'exemple 9 au moyen du mutant
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19-2 de Str eptorayces kayiaUceticus. On obtient un résultat analogue à celui atteint dans leexemple 9. On obtient 3,15 g de 2' -a::ano-
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2'--1Gsoxy-k::mûn,ycin sous forme cristalline.
:;";:u'F 13,.- (Comparai son!
Dans cet exemple, on exécute une série drossais pour Montrer l'effet avantageux et imprévisible de l'utilisation des mutants A-4-6, 3AG, 18-8 et 19-2 qui ont une aptitude propre à
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produire de la 2-aMino-2-dûsoxy"kanatnyeinc pour la production do la 2'-ar>ino-2'-àdso>ty-;ianuitycine suivalit 10 procède consti- tuant lo second aspect de L'invention, la comparaison étant établie par mise en culture de la souche typique 0-4-1 de Streptomyces
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lçill1.D.:VY ce ticu s.
Pour les essais, on exécute les cultures de la souche originale 0-4-1 et des mutants A-4-6, 3AG, 18-8 et 19-2 de
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St1'81)tol:yces kal1D.h1Ycoticus à 28 C pendant 150 heures chaîne dans l'exeixple 9,d;"ns des cuves de fermentation identiques contenant un r1:lj\1u de culture de la mené composition, Au terme de la culture, on dose la 2--.nlno-21-d6soxy-kanamycJne et la kanamycine A dans les milieux de culture. Les résultats des essais sont résumés dans le tableou VII ci-après.
TABLEAU U VII
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Essai Souchos utilisées Teneur en 2'-unino.- Teneur en kanamycine A N 2'-dcsoxy-kanamycine (m;/.) ¯ ¯ (m.G/ l:l1)
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<tb>
<tb> 1 <SEP> Souche <SEP> originale <SEP> 26 <SEP> 2790
<tb> 0--1
<tb>
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rlutatit A-l-6 430 1970 3 ,îutant .3AG 285 1785 4 1,iutzJit 1()-S 520 1900
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<tb>
<tb> 5 <SEP> Mutant <SEP> 19-2 <SEP> 700 <SEP> @ <SEP> 1690
<tb>
On traite chacun des milieux do culture d'un volume de
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15 litres cü:..1a dans l'exe,uple 9 pour en isoler autant que possible 1;; 2-sino-2''-dusoy-Xanainycine et la kana:::ycine A.
Les quantités 0:.r produi-cs obtenus sont inaiquécs dans le tableau VIII.
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T A B L E A U VIII
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Essai Souches utilisées Proùuct.on :o Production de N 2'-xnLao-2-iiJ5oxj- j(.na.:.y c.1.no bzz ¯ ¯ kaua:J1ycinc (g) (t;) 1 Souche Oriflinale 0..12 z6,5
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<tb>
<tb> 0-4-1
<tb>
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Mutant AIr..6 1..90 19,0
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<tb>
<tb> 3 <SEP> autant <SEP> 3AG <SEP> 1,20 <SEP> 15,8
<tb> 4 <SEP> Mutant <SEP> 18-8 <SEP> 2,20 <SEP> 17,6
<tb> 5 <SEP> Mutant <SEP> 19-2 <SEP> 3,15 <SEP> 16,1
<tb>
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,...........,...............,-..11
Il ressort des résultats au tableau VIII que les mutants A-4-6, 3AG,. 18-8 et 19-2 ont naturellement 1 aptitude à produire
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de la 2'-amino-2'-àéso>iy-kanai'aycine en quantité beaucoup plus importante que la souche or:
1g'....nale A-4-1 de Strcptouyccs kill1a.;:ycoticus.
Les exemples 14 et 15 ci-après illustrent la préparation de l'antibiotique NK-1001 et de l'antibiotique NK-1003 qu'on peut utiliser comme additif pour l'exécution du procédé constituant le premier aspect de l'invention.
EXEMPLE 14.-
On inocule un milieu de culture liquide (15 litres)
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contenant 2,0;: d'amidon, 30 de c,altose, 3,0,:' de farine de soya., 1,0, de nitrate de sodium, et 0,5j de chlorure de sodium au moyen de la souche typique 0-4-1 oe Streptorjyccs K<=i1argrecticus et on exécute l'incubation à 28 C avec agitation et aération. Apres 80 heures d'incUbation, on ajoute 30 1 de streptiuinc au milieu et on poui-muit l'iricubation pendant encore 80 heures. La quantité d'antibiotique i'lK-1001 s'accumulât dans le r.d11ou atteint son maximum au tcri-'io de cotte durée d'incubation.
'On filtre le millou 3e culture 1lnuide pour obtenir 14 litiges ce filtrat qu'on additionne de . litres de résine An;berlite IRC-50 (foi-rae ammonique) pour adsorber les antibiotiques sur l'chlrlûGilf d'ions. On élue la résine au moyen d'ammoniaque aqueuse 0,5N, puis
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on combine les fractions actives de l'éluat et on les concentre.
On dissout le concentre dans 100 ml d'eau et on agite le mélange avec1 g de charbon actif pendant 30 Minutes. par filtration, on obtint une solution décolorée qu'on additionne de 2 litres de
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rusine AMberllto CG-50 (forcit?: aiMuonique), On élue la résine port....'1.t los antibiotiques adsorbés à laide d'une solution aqueuse o.,i 1 a U,3â. On isole une fraction unique d'antibiotique i-.00. en premier lieu avLut la séparation de la kanataycine A.
On concentre la fraction unique d'antibiotique NK-lOOl et on la lyophilise pour obtenir une poudre blanche brute de l'antibiotique ;:K -1001 (28 J g)
On dissout cette poudre brute dans 12 ml d'eau et on ajoute 50 .,il de méthanol par fractions pour, faire déposer les cristaux dans la solution, Apres filtration et séchage;, on obtient 17,4 g de l'antibiotique NK-1001 sous la forme de cristaux aciculaires blancs.
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L' a.naly se elcrnentaire du produit indique qu'il contient l1,2(lJ de carbone, 7;09;J d'hyclroe;0ne et 8,95, d'azote (valeurs trouvées ) mais pas de soufre, d'halogènes et de cendres. Le poids moléculaire produit mesure suivant la technique des tensions de vapeur est de 492.
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r?C ,:tt'L31 i On inocule un ;ni 13 eu de culture liquide (15 litres) contenant 20 d)aj,tidon 3,0-; de maltose, 3,0,v de farine de soya,, 1,0; de nitrate de sodium et Oe5,, de chlorure de sodium au moyen de la souche typique 0-4-1 de Streptoeiyces kUl1atJy ceticus et on exécute 1.'inculi'L.Uil , 28 C avec aération et agitation.
Apres 20 heures d'incubation, on ajoute 25 6 de l'antibiotique NK-1001 obtenu dans l'QXCIl11J1C 1. à ce mà lieu et on poursuit l'incubation sous agitation et 1±ral;ion, Apres 6 jours d'incubation, la quantité o.' r..ntibiotiq1.w Nîi-1003 a4cuß:ule dans la culture atteint son maximum.
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On filtre le milieu de culture pour obtenir 14 litres
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d'un filtrat qu'on traita au Koycn de 4 litres de i'6xàne Aborlito Iiic-50 (forme aJ:1l1loniquc) pour adsorber les antibiotiques xur la résine. On élue la résine alors avec ci(-, la!.'j.i0ni!.quo aqueuse 0,sil et on combine les fractions actives diluât qu'on concentre. On
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dissout le concentre dans 100 Lil d'eau et on 1'aiite avec 1 g do charbon actif.
On filtre la solution décolorée rusultantc et on la traite au Moyen de 2 litres Ue résine Ailberl3.te CG-0 (forure a.,.,u.0nique). On lave la résine portant les antibiotiques adoI'b6s avec de l'eau, puis on l'élue avec de l'a:uon.1qua aqueuse 0,3X pour sdparer la fraction de kanatycine A en premier lieu et ensuite une fraction unique de l'antibiotique NK-1003. On concentre cette fraction unique de l'antibiotique NK-1003 et on la lyophilise pour obtenir 11,3 g de cet antibiotique NK-1003 sous la forme d'une poudre brute. Par recristallisation, de la poudre dans de 1'eau et
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du méthanol, puis séchage, on obtient 7,5 g de l' ;;.ntib:1,otlque NK-1003 sous la forme de cristaux aciculaires blancs.
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Une analyse élbiaentaire'uu produit indique qu'il contient ,.,,2; de carbone, 7 ,81 dhydrocne et l;"11; d'azote (valeurs trouvées). Le poids moléculaire du produit ,4tcrninL par la techni- que des tensions de vapeur est de 305 (le produit contient une molécule de méthanol de cristallisation).