DE3404434A1

DE3404434A1 - Verfahren zur herstellung von proteinen, die dem diphtherietoxin entsprechen

Info

Publication number: DE3404434A1
Application number: DE19843404434
Authority: DE
Inventors: Rino Quercegrossa Monteriggioni Siena Rappuoli
Original assignee: Sclavo SpA
Current assignee: Sclavo SpA
Priority date: 1983-02-08
Filing date: 1984-02-08
Publication date: 1984-10-25
Also published as: JPS6034918A; LU85197A1; FR2540516B1; DE3404434C2; US4925792A; CA1212642A; FR2540516A1; JPH0789950B2; ES529698A0; NL192208B; NL8400365A; CH660375A5; ES8505408A1; NL192208C

Description

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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins, welches dem Diphtherietoxin entspricht, indem ein Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium diphtheriae mit zwei mutierenden Phagen, die das dem Diphtherietoxin entsprechende Protein kodieren, in einer nicht hintereinanderliegenden Form in ihren Chromosomen, in einem flüssigen Nährmedium mit einer Eisenionenkonzentration von 0,05 bis 0,5 μg/ml bei einer Temperatur von 3O⁰C bis 40⁰C in einer neutralen Züchtungsumgebung unter aeroben Bedingungen gezüchtet wird.

Das Diphtherietoxin ist ein Protein, das auf eukaryotische Zellen extrem toxisch wirkt.

Ein solches Toxin besitzt zwei Untereinheiten, viz.: das B-Fragment, das in der Lage ist, an die Rezeptoren gebunden zu werden, die auf der Membran der eukaryotischen Zelle vorhanden sind, und das Α-Fragment, das toxisch wirkt und nach seinem Eindringen in die Zellen die Proteinsynthese derselben hemmt.

Das Diphtherietoxin wird von einem Gen kodiert, dessen Primärstruktur kürzlich aufgeklärt wurde [c. Ratti, R. Rappuoli, E.G. Giannini, Nucleic Acid Research, IJL # 6589, 6595, (1983)] und welches in der DNS (Desoxyribonucleinsäure, intern. DNA = deoxyribonucleic acid) einiger verwandter Bakteriophagen (ß,y,c*? ) enthalten ist, die Corynebacterium diphtheriae infizieren können (J.J. Costa et al., J. Bacteriol., 148, 124-130 (1981); V. Freeman, J. Bacteriol. Βλ_, 675-688 (1951)).

Nach der Infektion des Bakteriums können diese Phagen es entweder auflösen und somit töten, oder sie werden in das bakterielle

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Chromosom integriert, verbleiben in der Ruhephase und werden zusammen mit dem bakteriellen Chromosom repliziert.

Die DNS des integrierten Phagen wird zusammen mit dem bakteriellen Chromosom auf die Tochterzellen übertragen, die damit ebenfalls das proteinkodierende Gen tragen.

Zur Zeit wird das Diphtherietoxin durch Züchtung des PW_ß-Stammes gewonnen und nach Entgiftung mit Formol zur Herstellung des antidiphtherisehen Impfstoffes verwendet.

Kürzlich wurden von üchida et al. (Nature New Biol., 233, 8-11, (197 3)) Mutanten des Phagen ß durch Behandlung mit Nitrosoguanidin erhalten.

Solche mutierenden Phagen, die in das bakterielle Chromosom des Mikroorganismus Corynebacterium diphtheriae integriert sind, kodieren die Synthese von Proteinen, die dem Diphtherietoxin entsprechen, wovon sie sich durch ihre Struktur und/oder durch ihre Funktion in bezug auf die Gegenwart eines oder mehrerer Mutationen, eingefügt in dem Strukturgen des Toxins, unterscheiden.

Die oben erwähnten Proteine wurden Cross-Reacting Materials (CRM) genannt, weil sie eine immunologische Kreuzreaktion mit dem Diphtherietoxin zeigten.

Von den verschiedenen mutierenden Phagen, die isoliert wurden, wurden diejenigen die die Proteine CRM 176, CRM 197, CRM 228 und CRM 45 kodierten, näher untersucht. (Uchida et al.,Biol. ehem.., 218, 3838-3844 (1973)).

Insbesondere ist das CRM 45 ein Protein mit einem A-Fragment, ähnlich in Struktur und Funktion mit denen des Diphtherietoxins und einem B-Fragment, dem ein Teilstück fehlt, das das Protein an die Rezeptoren binden kann, die sich an der Oberfläche der eukaryotischen Zellen befinden.

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Das Ergebnis ist, daß CRM 45 trotz seines in vitro aktiven Α-Fragments keine in vivo Aktivität besitzt, weil es nicht in die Zellen eindringen kann.

Umgekehrt besitzt das B-Fragment, unverändert, die hydrophobe Struktur, die nötig ist, um das Α-Fragment in das Zellinnere zu verlagern.

Wegen dieser Eigenschaften, Anwesenheit des aktiven A-Fragments und im B-Fragment Anwesenheit der zur Verlagerung des A-Fragments ins Zellinnere notwendigen Struktur und Fehlen der Region, die zum Erkennen der Rezeptoren auf den Zellmembranen notwendig ist, wurde die Verwendung von CRM 45 zum Aufbau von Hybridtoxinen ins Auge gefaßt. Tatsächlich konnte durch Ersetzen der fehlenden Region durch Substanzen wie: Antikörper, monoklonale Antikörper, Hormone oder andere biologisch wirksame Substanzen, die in der Lage sind, spezifische Moleküle auf den Oberflächen einiger Zellen, wie z.B. Bindungsstellen, zu erkennen, ein Hybridtoxin gewonnen werden, das in der Lage war, selektiv nur wenige Zellarten zu töten.

Solche Hybridtoxine könnten in der Pharmakologie Anwendung finden und besonders bei der Behandlung einiger Tumorarten (P. Bacha et al., J. Biol. Chem., 2!5_8, 1565-1570, (1983)).

Das CRM 197 Protein besitzt das gleiche Molekulargewicht wie das Diphtherietoxin und besteht aus einem B-Fragment, identisch in Struktur und Funktion mit denen des Toxins, und einem A-Fragment, das nicht toxisch ist und sich vom originalen Fragment durch eine Aminosäure unterscheidet. Das atoxische CRM 197 ist immunologisch nicht vom Diphtherietoxin zu unterscheiden und kann somit als Alternative zu dem derzeit zur Impfstoffproduktion verwendeten Diphtherietoxoid herangezogen werden.

Tatsächlich reicht eine vorsichtige Behandlung des CRM 197 mit Formol aus, um genügend hohe diphtherischo Antikörporspiegel bei

Meerschweinchen zu erzielen (M.Porro et al·., J. Infect Dis., 142, 5 (1980) ) .

Bislang wurden jedoch weitergehende Entwicklungen von Substanzen, die sich von den mit dem Diphtherietoxin verwandten Proteinen ableiten lassen und die nach der Methode von Uchida gewonnen wurden, aufgrund von geringen Ausbeuten bei der Züchtung solcher Proteine zurückgestellt.

Infolgedessen ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Schaffung eines Herstellungsverfahrens für Proteine, die dem Diphtherietoxin entsprechen, das den Schritt der Kultivierung in einem flüssigen Nährmedium mit einer Eisenionenkonzentration von 0,05 |ig/ml bis 0,5 μg/ml bei einer Temperatur von 3O⁰C bis 4O⁰C in einer neutralen Kulturumgebung und unter aeroben Kulturbedingungen eines Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium diphtheriae mit zwei mutierenden Phagen, die für das dem Diphtherietoxin entsprechende Protein kodieren und in nicht hintereinander liegender Form in ihren Chromosomen integriert sind.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von CRM 45 mit Ausbeuten von 50 Lf/ml bis 200 Lf/ml und von CRM 197 mit Ausbeuten von 30 Lf/ml bis 60 Lf/ml mittels Anzucht des Stammes C7 (ß45) M_g mit zwei ß45 mutierenden Phagen in einer nicht hintereinanderliegenden Form in ihren Chromosomen integriert, und mittels Anzucht des Stammes C7 (ß197) M₁ mit (zwei) ß197 Phagen in nicht hintereinanderliegender Form in ihren Chromosomen integriert.

Die vorliegende Erfindung beruht im wesentlichen auf der überraschenden Entdeckung, daß der Stamm Corynebacterium diphtheriae C7 (ATCC 27010) in seinem eigenen Chromosom zwei Haftstellen attB besitzt, an denen die Phagen-DNS integriert werden kann. Der lysogene Zyklus eines Phagen gemäß Campbell's Methode (Epitomes Adv. Genetics, 1_1_, 101-145, (1982)) ist in Fig. 1A dargestellt. Dabei wird die Spaltung der runden Phagen-DNS an

einem spezifischen Punkt, attP, und die Integration an einem ebenso spezifischen Punkt des bakteriellen Chromosoms, attB, die auch Haftstelle genannt wird, angenommen. Bislang wurde in allen bekannten Strukturen eine einzige attP Stelle und eine einzige attB Stelle gefunden.

Es wurde, jetzt ermittelt, daß der Stamm Corynebacterium diphtheriae C₇ (ATCC 27010) auf seinem Chromosom zwei Haftstellen, attB.. und

2, besitzt, an denen die Phagen-DNS integriert werden kann. Durch Anwendung des von der Anmelderin modifizierten TYE Kulturmediums konnten bei der Lyse dieses Bakteriums folgende lysogene Stämme isoliert werden:

Monolysogene, wenn der Phage nur einmal an der Stelle attB oder attB„ vorhanden ist, Zwillingslysogene (hintereinanderliegend), wenn zwei Phagen gleichzeitig an einer einzigen Stelle attB vorhanden sind, und nicht hintereinanderliegende Zwillingslysogene, wenn zwei Phagen gleichzeitig vorhanden sind, einer an attB. und der andere an attB₂ (Fig. 1B).

Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde Corynebacterium diphtheriae C₇ (ATCC 27010) mit einem mutierenden Phagen,der das dem Diphtherietoxin entsprechende Protein kodiert, durch Ausstreichen auf ein CY Kulturmedium infiziert.

Nach 48 Std. Wachstum bei einer Temperatur von 35⁰C wurden vom Phagen"lysierte Stellen beobachtet, die an ihrer Innenseite eine opaque Zone aufwiesen, die auf das Wachstum derjenigen Bakterien zurückzuführen ist, bei denen der Phage in das bakterielle Chromosom integriert wurde.

Die Stämme wurden steril entnommen und auf CY Medium ausgestrichen, um die einzelnen Kolonien zu isolieren, um sie anschließend mit dem "phage release assay" (Miller et al·., Virology, 29, 410-425, (1966)) auf Anwesenheit von lysogenen Phagen zu untersuchen.

Ein Screening auf Zwillingslysogene wurde aufgrund der Tatsache durchgeführt, daß die Lysogene, die zwei Paare des Phagen integriert hatten, auch zwei für das dem Diphtherietoxin entsprechende Protein kodierende Gene besitzen, so daß sie in der Lage sind, die doppelte Menge des genannten Proteins zu synthetisieren.

Es wurden Platten mit TYE Kulturmedium hergestellt, die jeweils 3, 4, 6, 8, 12 U/ml diphtheriesches Antitoxinserum enthielten, und jedes Lysogen wurde anschließend mittels Plattentransfer auf jede einzelne Serumkonzentration geprüft. Das Protein, so wie es durch die verschiedenen Lysogene durch Diffusion durch den Agar-Agar erzeugt wurde, wurde von dem im Medium vorhandenen Antikörper ausgefällt, somit einen Hof bildend, dessen Größe direkt proportional der von den einzelnen Kolonien gebildeten Menge CRM war.

Auf den Platten, bei denen die Antikörperkonzentration 3 U/ml betrug, bildeten alle Lysogene identische Höfe. Auf denjenigen Platten, die eine mittlere Antikörperkonzentration, 4-6 U/ml, enthielten, konnten Höfe von verschiedener Größe beobachtet werden: sehr kleine für die Monolysogene und größere für die Zwillingslysogene .

Bei den Platten mit einer Antikörperkonzentration von 8 bis 12 U/ml zeigten nur die Zwillingslysogene einen Präzipitationshof.

Fig. 2 zeigt die Fotografie einer TYE Platte mit einer Antikörperkonzentration von 6 U/ml. Hier kann man drei Höfe verschiedener Größen erkennen, die verschiedenen Lysogenen entsprechen: Monolysogene (kleiner Hof) , hintereinanderliegendes Zwillingslysogene (Hof A) und nicht hintereinanderliegendes Zwillingslysoqene (Hof B). Der Beweis, daß die Lysogene mit den größeren Höfen zwei Phagen in ihren entsprechenden Chromosomen integriert hatten, wurde durch Aufklärung der molekularen Struktur (Organisation) der Phagen mittels Reinigung der chromosomalen DNS nach üblichen

Methoden erbracht.

Fig. 1B zeigt, daß man durch Spaltung der Phagen DNS an den Punkten A und B mit Hilfe eines Restriktionsenzyms, ein AB-Fragment erhält, während die Anwendung des gleichen Enzyms bei dem Monolysogen zwei Fragmente, A und B, beide mit einem Teilstück des bakteriellen Chromosoms versehen, vier Fragmente bei dem nicht hintereinanderliegenden ZwillingsIysogen und drei bei dem hintereinanderliegenden Zwillingslysogen ergeben sollte.

Tatsächlich stimmen die nach der Southern blot Methode (J. Mol. Biol., 9j3, 503-517, (1975)) durchgeführten Analysen unter Ver-

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wendung von ßBam 4 Fragment, mit der mit P markierten attP-Stelle, wie in Fig. 3 dargestellt, in beidem, Anzahl und Position der Bänder, genau mit dem überein, was von der Anmelderin aufgrund der Analyse von Fig. 1B vorausgesagt wurde.

Fig. 3 zeigt, daß die Phagen-DNS nur ein Band (A) ergibt, die des Monolysogens 2 Bänder (B), die des nicht hintereinanderliegenden Zwillingslysogens vier Bänder (C) und die des hintereinanderliegenden Zwillingslysogens drei Bänder zeigt, von denen eines zusammen mit dem der Phagen-DNS gewandert ist (D).

Die Stabilität der Zwillingslysogene wurde kontrolliert, indem man von alten Kulturen (5 Tage alt) Einzelkolonien entnahm, sie auf CY Medium ausstrich und mit Hilfe der Hof-Methode auf Anwesenheit von ein oder zwei Phagen untersuchte. Die Analyse hatte folgende Ergebnisse: die hintereinanderliegenden Zwillingslysogene waren aufgrund ihrer Neigung, einen Phagen zu verlieren und in Monolysogene überzugehen, wenig stabil. Von 250 untersuchten Kolonien wurden etwa 180 zu Monolysogenen, während die Zwillingslysogene des nicht hintereinanderliegenden Typs extrem stabil waren: bei 450 untersuchten Kolonien wurde kein Monolysogen gefunden.

Erfindungsgemäß wurde der Stamm C₇ mit dem ß45 mutierenden Phagen,

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der das CRM 45 Protein kodiert, infiziert und mit dem ß197 Phagen zur Kodierung von CRM 197. Folgende lysogene Stämme wurden isoliert: C₇ (ß45)M₃ und C_ (ß197)M₅ (Monolysogene), C₇ (84S)M₁₁ und C₇ (ß197)Mg (hintereinanderliegende Zwillingslysogene) und C₇ (ß45)Mg und C₇ (ß197)M-, (nicht hintereinanderliegende Zwillingslysogene). Die Stämme C₇ (ß45)M_o und C₇ (ß197)M^ wurden bei der American Type Culture Collection Accession hinterlegt und wurden mit den Bezeichnungen ATCC-39526 und ATCC-39255 versehen.

Die verschiedenen lysogenen Stämme wurden auf die Produktion von CRM 45 und CRM 197 untersucht, indem man sie unter aeroben Bedingungen, in einem flüssigen Nährmedium mit einer Eisenionenkonzentration von 0,05 ug/ml bis 0,5 ug/ml, vorzugsweise 0,1 bei einer Temperatur von 30⁰C bis 40⁰C, vorzugsweise von 35⁰C bis 37⁰C und einem neutralen pH-Wert während eines Zeitraumes züchtete, der nötig war, bis eine bedeutende Menge der Proteine im Nährmedium enthalten war.

Das Protein wurde anschließend gewonnen und mittels irgendwelchen üblichen, dem Fachmann bekannten Methoden gereinigt.

Verwendete Kulturmedien:

TYE Medium zur Herstellung des Präzipitationshofes.

Das folgende Medium wurde modifiziert in bezug auf die Standardausführung von Pappenheimer (Inf. Imm. , IjJ₁, 203-209, (1977)) und besitzt folgende Zusammensetzung: Tryptose: 10 g; Hefeextrakt: 5 g; NaCl: 5 g; KH₂PO₄: 5 g; Wasser: 1 Liter. Der pH-Wert wurde auf 7,4 eingestellt und vor dem Autoklavieren wurden dem Kulturmedium 2 ml CaCl₉ (50 %) zugesetzt. Wenn sich der Niederschlag abgesetzt hat, wird 2 ml/1 einer Lösung II und 1 ml/1 einer Lösung III und 12 ml/1 eines guten Agar-Agar zugefügt.

Schließlich wird antidiphtherisches Pferdeblutserum in den Konzentrationen 4, 6, 8 oder 12 U/ml zugefügt, je nach erwartetem

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Präzipitationshof.

CY Medium zur Herstellung von CRM Proteinen.

Hefeextrakt: 20 g> Casaminoacids: 10 g, 1%-Tryptophan: 5 ml, KH₂PO₄: 5 g, Wasser: 1 Liter (pH-Wert 7,4) werden aufgekocht und über Whatmanfilter filtriert, wenn es noch kocht. Es werden 2 ml der Lösung II und 1 ml der Lösung III zugefügt, dann wird das Reaktionsgemisch autoklaviert. Vor Gebrauch werden 3 ml einer Maltose-CaC^-Lösung pro 100 ml Medium zugegeben.

Lösung II:

MgSO₄.7H₂O: 22,5 g, Alanin: 115 mg, Nicotinsäure: 115 mg. Es werden dann 1 ml Wasser und konzentrierte HCl zugefügt, um die Bestandteile zu lösen. Danach werden 7,5 mg Pimelinsäure, 5 ml 1%-CuSO₄.5H₂O, 4 ml 1%-ZnSO₄·5H₂O, 1 ,5 ml 1%-MnCl₂.4H₂O und 3 ml konz. HCl und Wasser ad 100 ml zugefügt.

Lösung III:

L-Cystin: 20 g, konz. HCl: 20 ml, Wasser ad 100 ml.

Maltose-CaCl₂ Lösung:

Maltose: 50 g, 2 ml 50%-CaCl₂, 1 g KH₃PO₄ und Wasser ad 100 ml. Der pH-Wert wird auf 7,4 eingestellt und die Lösung wird durch ein Whatman 40 Papier gefiltert und anschließend autoklaviert.

Beschreibung der Zeichnungen:

Fig. 1A: Lyse nach Campbell'.

Die Phagen-DNS wird an einer bestimmten Stelle, attP, aufgespalten und an einer ebenso bestimmten Stelle, attB, in das bakterielle Chromosom integriert.

Fig. 1B: Lyse bei Corynebacterium diphtheriae C₇ (ATCC 27010). Die Phagen DNS wird an der Haftstelle attP aufgespalten und kann an zwei Bindungsstellen, attB. und attB-, die auf dem bakteriellen Chromosom vorhanden sind, in-

tegriert werden. Daraus ergeben sich: Monolysogene, hintereinanderliegende Zwillingslysogene und nicht hintereinanderliegende Zwillingslysogene.

Fig. 2; Platte mit TYE Medium, enthaltend (angereichert mit) 6 U/ml antidiphtherisches Serum. Es können 3 Präzipitationshöfe unterschieden werden, nämlich: sehr kleine Höfe (Monolysogene), mittelgroße Höfe A (hintereinanderliegende Zwillingslysogene) und große Höfe B (nicht hintereinanderliegende Zwillingslysogene).

Fig. 3: Analyse der DNS der Lysogene nach der Southern blot Methode. Die DNS wurde mit BamH^ aufgelöst bzw. aufgeschlossen und die Teilstücke wurden auf Agarose-Gel (1,3 %) getrennt, danach auf Nitrocellulose übertragen,

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wonach sie mit dem ßBam 4 Fragment, welches die P markierte attP Stelle enthielt, hybridisiert wurden. Das ßBam 4 Fragment entspricht dem AB Fragment aus Fig. 1B. Es können ein einzelnes AB Fragment in der Phagen-DNS (A), zwei AB Fragmente in dem Monolysogen (B), vier Fragmente in dem nicht hintereinanderliegenden Zwillingslysogen (C) und drei Fragmente in dem hintereinanderliegenden Zwillingslysogen (D) gesehen werden.

Fig. 4: Herstellung von CRM 197 mit dem Monolysogen Stamm C₇ (ß197)Mt-i Symbol OJ dem hintereinaderliegenden Zwillingslysogen Stamm C₇ (ß197) M_g: Symbol V; dem nicht hintereinanderliegenden Zwillingslysogen Stamm C₇ (6197JM₁ : Symbol: P .

Die kleinen ausgemalten Rechtecke ■ zeigen die optische Dichte der Kultur.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung ohne sie einzuschränken.

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Beispiel 1:

T25 ml-Kolben mit je 10 ml CY Medium wurden vorbereitet und 15 Min. bei 120⁰C sterilisiert. Die Kolben wurden mit einer Platinöse voll folgender lysogener Stämme beimpft: C- (ß197)M₅, C₇ (ß197)M₈, und C₇ (8197JM₁, die zuvor 24 Std. bei 35°C auf CY-Platten angezüchtet worden waren. Die so beimpften Kolben wurden bei 35°C über Nacht gezüchtet.

0,1 ml jeder einzelnen Kultur werden auf 125 ml Erlenmeyer-Kolben überimpft, von denen jeder 10 ml enteisentes CY Medium enthält, das mit 0,1 μg/ml Fe angereichert wurde, und die Erlenmeyer-Kolgen wurden auf einer rotierenden Schüttelmaschine mit 240 Upm für 45 Std. bei 35⁰C inkubiert.

In zweistündigen Abständen wurden Proben entnommen und die optische Dichte sowie der Gehalt an CRM 197 im Überstand bestimmt. Die optische Dichte wurde in einem Perkin-Elmer Mod. 35 Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 590 nm (Lichtweg 1 cm) gemessen und das CRM 197 wurde mit der "rocket" immunoelektrophoretischen Methode (Murfy et al., J. Clin. Microbiol. , 1_, 91-96 (1978)) und/oder Ausflockung (G. Ramon, CR. Soc. Biol. , 86, 661-671, (1922)) bestimmt. Mit dem Ausdruck Lf/ml ist die Einheit der Ausflockung, wie sie von G. Ramon im CR. Soc. Biol. (Paris), 86_, 661-671 (1922) berichtet wurde, gemeint.

Die gewonnenen Ergebnisse wurden in Fig. 4 veranschaulicht. Es ist ersichtlich, daß die Produktion des CRM 197 nicht beginnt, bevor die optische Dichte (O.D.) der Kultur einen Wert von 4,5-5 O.D. erreicht hat, was dem Ende der logarithmischen Wachstumsphase entspricht. Wenn das Ende der letzteren Phase beginnt, beginnt auch eine massive Produktion des CRM 197. Sie hält bis zum Beginn der stationären Phase (etwa 20 Std.) an, wenn die größte optische Dichte und die größte Menge CRM 197 beobachtet werden.

Nach der 24ten Wachstumsstunde wird ein Rückgang der CRM 197 Pro-

duktion von 25 % nach 30 Std. beobachtet, und nach 45 Std. ist der Rückgang 75 %. Der Verlauf der Produktionskurve von CRM 197 ist praktisch derselbe für die verschiedenen Lysogene, wobei die Produktion für die Monolysogene 2 0 Lf/ml beträgt, für die hintereinanderliegenden Zwillingslysogene 30 Lf/ml und für die nicht hintereinanderliegenden Zwillingslysogene 60 Lf/ml. Nach demselben Verfahren wie im Beispiel 1 beschrieben wurden auch die Inocula für C₇ (ß45)M₃, C₇ (645JM₁₁ und C₇ (ß45)M₈ hergestellt.

0,1 ml einer jeden Kultur wurden in 125 ml Kolben überimpft, die je 10 ml. enteisentes CY Medium, angereichert mit 0,1 ug/ml Fe enthielten. Die Kolben wurden 36 Std. lang bei einer Temperatur von 35⁰C auf einer rotierenden Schüttelmaschine (2 40 üpm) inkubiert. Proben wurden nach 20 Std. und 30 Std. entnommen, ebenso beim Beginn der Fermentation. Sie wurden nach den gleichen Vorschriften analysiert, wie im Beispiel 1 zur Bestimmung der optischen Dichte und der Produktion von CRM 45, das an den überstand abgegeben wurde, angegeben ist.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle widergegeben:

Tabelle 1

Lysogener Optische Dichte CRM 45 ug/ml

Stamm 20 Std. 30 Std. 20 Std. 30 Std.

C₇(ß45)M₃ 4,5 9,7 16 31,5

C₇(ß45)M_l1 4,5 9,8 22 42

C₇(ß45)Mg 4,7 10 40 70

Die obigen Ergebnisse zeigen, daß die größte CRM 45 Produktion nach 30 Std. Kultivierung erreicht wird und daß sie praktisch gleich groß ist für die Monolysogene und die hintereinanderliegenden Zwillingslysogene, während sie fast doppelt so groß ist für die nicht hintereinanderliegenden Zwillingslysogene.

Beispiel 2:

Eine Vorkultur des Lysogens C- (ß45)Mg wurde wie im Beispiel 1 beschrieben hergestellt; 2 ml dieser Vorkultur wurden auf zwei 2000 ml Erlenmeyer-Kolben überimpft, die je 500 ml enteisentes CY Medium/ angereichert mit 0/1 μg/ml Fe enthielten. Es wurde für 24 Std. bei 35°C unter Rühren (240 Upm) angezüchtet.

1000 ml der erhaltenen Lysogenkultur wurden in 40 1 eines CY-Kulturmediums mit einer Fe -Ionenkonzentration von 0,1 μg/ml überimpft, die in einem 50 1 Topf-Fermenter enthalten waren; es wurde bei 37°C, einem Luftdurchfluß von 15 l/Min, vom Boden aufsteigend und unter ständigem Rühren mit 600 Upm. und Aufrechterhaltung des pH-Wertes der Kulturbrühe durch 20 % Glukoselösung oder 4n NaOH bei 6,5 bis 7,5 während 40 Std. gezüchtet. Nach 30 Std. Fermentation betrug die CRM 45 Menge 200 Lf/ml. Die entstandene Kulturbrühe wurde in einer "continuous-flow" Zentrifuge abzentrifugiert und das Protein aus dem Überstand durch Präzipitation mit einem Ammoniumsulfat bei einem Sättigungsgrad von 75 % gewonnen.

Der so erhaltene Extrakt (Aufschlämmung) wurde zentrifugiert und das Sediment wurde nach dem Waschen mit einem Phosphatpuffer pH 7,5 über einer Säule, die mit einem Ionenaustauscherharz (Dimethylammoniumäthy!cellulose) beladen war, gereinigt.

Das Protein wurde durch Eluieren der Säule mit einem Natriumchlorid-Gradienten in einer Ausbeute von 80 % gewonnen.

-Ab-

- Leerseite -

Claims

Dr. FV Zumstefn "sen. - Dr. E. Assmann Dipl.-Ing. F. Klingseisen - Dr. F. Zumstein jun.

PATENTANWÄLTE

ZUGELASSENE VERTRETER BEIM EUROPÄISCHEN PATENTAMT REPRESENTATIVES BEFORE THE EUROPEAN PATENT OFFICE

Case 1561/1867

SCLAVQ S.p.Α., Siena / Italien

Verfahren zur Herstellung von Proteinen, die dem Diphtherietoxin entsprechen

PATENTANSPRÜCHE

\ .1 Verfahren zur Herstellung eines dem Diphtherietoxin entsprechenden Proteins, gekennzeichnet durch die Kultivierung eines zur Gattung Corynebacterium diphtheriae gehörenden Mikroorganismus mit zwei mutierenden Phagen, die das dem Diphtherietoxin entsprechende Protein kodieren und in einer nicht hintereinanderliegenden Form an den beiden Haftstellen des bakteriellen Chromosoms integriert sind, in einem flüssigen Nährmedium mit einer Eisenionenkonzentration von 0,05 ug/ml bis 0,5 ug/ml, bei einer Temperatur von 30⁰C bis 40⁰C, bei einem neutralen pH-Wert und unter aeroben Bedingungen.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das dem Diphtherietoxin entsprechende Protein das CRM 45 Protein ist.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß

der Mikroorganismus der Stamm C₇ (ß45)M_o ATCC-39526 mit zwei

/ O

ß45 mutierenden Phagen,in einer nicht hintereinanderliegenden Form in ihren Chromosomen integriert, ist.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das dem Diphtherietoxin entsprechende Protein das CRM 197 Protein ist.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus der Stamm C₇ (ß197)M.j ATCC-39255 mit zwei ß197 mutierenden Phagen_/ in einer nicht hintereinanderliegenden Form in ihren Chromosomen integriert, ist.
6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein festes Nährmedium mit einer antidiphtherischen Serumskonzentration von 4 bis 12 U/ml zur Isolierung des Mikroorganismus verwendet wird.
7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Eisenionenkonzentration im flüssigen Nährmedium 0,1 μg/ml ist.