SU1720493A3 - Способ получени штамма SтRертососсUS SaNGUIS, способного секретировать @ -1,3-глюкан-3-глюканогидролазу - Google Patents

Способ получени штамма SтRертососсUS SaNGUIS, способного секретировать @ -1,3-глюкан-3-глюканогидролазу Download PDF

Info

Publication number
SU1720493A3
SU1720493A3 SU864027298A SU4027298A SU1720493A3 SU 1720493 A3 SU1720493 A3 SU 1720493A3 SU 864027298 A SU864027298 A SU 864027298A SU 4027298 A SU4027298 A SU 4027298A SU 1720493 A3 SU1720493 A3 SU 1720493A3
Authority
SU
USSR - Soviet Union
Prior art keywords
glucanase
plasmid
glucan
gene
dna
Prior art date
Application number
SU864027298A
Other languages
English (en)
Inventor
Мацусиро Аизо
Original Assignee
Аизо Мацусиро (JP)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Аизо Мацусиро (JP) filed Critical Аизо Мацусиро (JP)
Application granted granted Critical
Publication of SU1720493A3 publication Critical patent/SU1720493A3/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q11/00—Preparations for care of the teeth, of the oral cavity or of dentures; Dentifrices, e.g. toothpastes; Mouth rinses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D249/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092—Streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/99—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from microorganisms other than algae or fungi, e.g. protozoa or bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/743—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Agrobacterium; Rhizobium; Bradyrhizobium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/86—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in cyclic amides, e.g. penicillinase (3.5.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01011—Dextranase (3.2.1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01084—Glucan 1,3-alpha-glucosidase (3.2.1.84), i.e. mutanase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии и фармакологии и касаетс  способов получени  препаратов дл  стоматологии. Разработан способ получени  штамма Streptococcus sanguis, продуцирующего а- 1,3-глюкан-З-глюканогидролазу, заключающийс  в том, что из ДНК Bacillus circulans BC-8/Ferm ВР-733 выдел ют EcoRI-EcoRI фрагмент размером 3 т.п.о., клонируют его в плазмиду pYEIOOL затем в векторах pGB301, pMN2, pMN1, pMN3. Полученными плазмидами, содержащими ген ог-1,3-глю- кан-3-глюканогидролазы, трансформируют клетки Streptococcus sanguis.

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии и фармакологии и касаетс  способов получени  препаратов дл  стоматологии.
Разработан способ получени  штамма Streptococcus sanguis, экспрессирующего а-1,3-глюкан-3-глкжаногидролазу, заключающийс  в том, что из -ДНК Bacillus circulans BC-8/1-Ferm ВР-733 выдел ют EcoRI-EcoRI фрагмент размером 3 т.п.о., клонируют его в плазмиду pYEIOOl, затем в векторах pGB301, pMN2, pMNI, pMN3. Полученными плазмидами, содержащими ген а -1,3-г юкан-З-глюканогидролазы, трансформируют клетки Streptococcus sanguis.
Пример1.В пробу почвы, содержа щую выветрившийс  гранит, смешанный с торфом, и имеющую рН приблизительно 6, добавл ют стерилизованную и забуфериро ванную фосфатом (рН 7) минимальную среду, содержащую 0,1 мае. % (NtafeSO, 0,005 мае. % Mo., 0,0005 мас.% FeCte 6Н20 и 0,03 мас.% нерастворимого глюкана, полученного из кариогенного штамма бактерий Streptococcus mutans ОМ Z 176, который  вл етс  источником углерода, Пробы почвы инкубируют в среде в течение трех дней при 28°С.
Семейство бактерий, культивированных в этой среде, подвергают субкультивированию двенадцать раз и затем концентрируют. Получают плоские агары, содержащие 1,2 мас.% агара, в который добавл ют 0,2% нерастворимого глюкана и минимальную среду. На пластинки прививают концентрированную культуру бактерий и культивируют до образовани  колоний. Через несколько дней, в течение которых осуществл ют инкубирование при 30°С, бактерии, экспрессирующие активность глюканазы и разрушающие нерастворимый глюкан, идентифицируют при помощи образовани  прозрачных гало вокруг колоний.
Четыре колонии, которые образовывают наиболее заметное гало, депонированы
V|
ю о о со
00
в техническом исследовательском институте микробиологической промышленности, Япони , под номерами PERM BP-733 и PERM BP-995.
П р и ме р2. Дл  определени  активно- сти фермента глюканазы суспензию нерастворимого глюкана (пример 1) размельчают обработкой ультразвуком и используют в качестве субстрата. Культуру Bacillus circulars БС-8 {далее БС-8) инкубируют в соевом бульоне триптиказы при 30°С. Экспрессию фермента глюканазы инициируют добавлением нерастворимого глюкана. Пробы верхнего сло , содержащие фермент , получают центрифугированием и 10- кратной концентрацией культуральной среды. Либо верхний слой обрабатывают 75% сульфатом аммони  с тем, чтобы осуществить осаждение фермента. За единицу активности фермента принимают такое ко- личество, которое продуцирует0.1 мМ глюкозы в течение 16 ч при 37°С из субстрата нерастворимого глюкана.
П р и м е р 3. Культуры бактерий БС-8 инкубируют в 500 мл соевого бульона трип- тиказы, содержащем 0,3% нерастворимого глюкана, в течение трех дней при 30°С. Верхний слой культуры, полученный центрифугированием , обрабатывают 75%-ным раствором сульфата аммони  с тем, чтобы фермент перешел в осадок. Полученный осадок раствор ют в 50 мМ буферного раствора фосфата (рН 7,0) и нанос т на колонку из целлюлозы ДЕ-52. Фракции собирают элюированием 50 мМ раствором фосфатно- го буфера (рН 7) при увеличении концентрации NaCI от 0 до 0,5 М. Фракцию, имеющую пик активности, подвергают хроматографии на колонке Сефадекс 1-150. В результате электрофореза в геле обнаруживают две по- лосы, одна в 68 килодальтон(к Д) «друга  в 54 кД (молекул рные массы). Протеин в 68 кД идентифицирован как а-1,3-глюканаза, в то врем  как протеин в 54 кД идентифицирован как имеющий активность а-1,б-глю- канззы.
Протеин с молекул рной массой 68 кД подвергают очистке при помощи процедуры , описанной выше, и примен ют к глкжа- ну, химические св зи которого типа а-1,6 предварительно разрушают в результате обработки йодной кислотой или производимой промышленностью декстраназой, имеющей только а-1,3 химические св зи. Протеин с молекул рной массой 68 кД раз- рушает си-1,3 св зи и дает восстановительные сахара. Фермент с молекул рной массой 54 кД обладает активностью Глюканазы , характерной дл  а-1,6 св зи,и  вл етс , таким образом, а-1,6-глюкан-6«глюка- ногидролазой.
Несмотр  на то, что химические св зи нерастворимого глюкана принадлежат главным образом а-1,3 семейству и что а-1,3- глюканаза играет главную роль в ферментной деградации нерастворимого глюкана, установлено, что комбинаци  а- 1,3-глюканазы и а-1,6-глюканазы дает си- нергетический эффект при деградации нерастворимых глюканов. Поэтому, чтобы удалить нерастворимый глюкан, предпочтительно клонирование обоих генов как а- 1,3-глюканазы, так и а-1,6-глюканазы, и св зывание их в одной плазмиде.
П р и м е р 4. Бактерии БС-8 культивируют в соевом бульоне триптиказы и ДНК экстрагируют . ДНК центрифугируют в градиенте плотности CSCI-EtBr. При этом присутствие ДНК плазмиды не вы влено. Далее единственную полосу хромосомной ДНК изолируют и подвергают очистке. ДНК диализуют и расщепл ют эндонуклеазой EcoRI.
Одновременно культуру E.coli ХБ 101, содержащую производимую промышленностью плазмиду PYEI001 , культивируют в 300 мл L-бульона (содержащего 10 г пептона , 5 г экстракта дрожжей, 1 г глюкозы, 5 г NaCI и 1000 мл Н20) с рН на уровне 7,2. ДНК плазмиды PYEI001 затем экстрагируют и обрабатывают ферментом EcoRI.
Один мг ДНК - фрагмента EcoRI БС-8 и один мг ДНК плазмиды PYEI001 лигиру- ют лигазой Т4, ДНК рекомбинантной плазмиды трансформируют в штамм ХБ 101 Е. coll K12.
П р и м е р 5. Известно, что встраивание ДНК-фрагмента в сайт EcoRI гена устойчивости к хлорамфениколу (Cmr) плазмиды PYEI001 делает бактерии чувствительными к хлорамфениколу.
Среди колоний культуры E.coli, которые были трансформированы рекомбинантной плазмидной PYEI001 , отбирают клоны, обладающие Cm-чувствительностью, которые далее идентифицируют на наличие гена а-1,3 глюканазы с правильной ориента: цией.
Так как бактери  ХБ 101 требует дл  роста треонин, лейцин и пролин, Cm-чувствительные (Cm1) колинии E.coli культивируют на синтетической минимальной среде, содержащей небольшое количество казаминокис- лот и 0,2% размельченного ультразвуком нерастворимого глюкана в качестве единственного источника углерода. Несмотр  на то, что не получено ни одного гало и предполагают , что трансформированные бактерии не
способны секретировать а-1,3-глюканазу, некоторые из колоний дают рост, это указывает на то, что они экспрессируюг продукт гена а-1,3-глюканазы и, таким образом, приобретают способность разрушать и ассимилировать нерастворимый глюкан в качестве источника углерода.
Те трансформированные культуры, которые дают рост на минимальной среде, культивируют и их ДНК экстрагируют, расщепл ют эндонуклеазой EcoRI, при помощи гелевого электрофореза получают ДНК- Фрагмент размером 3,0 т.п.о.
Культуры E.coli ХБ 101, бактерии ХБ 101, трансформированные плазмидой PYEI001 и бактерии ХБ 101, трансформированные плазмидой PYEI001, включающей вставку фрагмента ДНК в 3,0 т.п.о., культивируют . Верхний слой, полученный при центрифугировании лизированных клеток из трех типов культур, анализируют на активность глюканазы в соответствии с процедурой из примера 2. В результате установлено, что только бактерии, трансформированные плазмидой PYEI001, содержащей фрагмент в 3.U т.п.о., про вл ют активность глюканазы. Таким образом, это доказывает правильность вставки гена а- 1,3-глкжаназы бактерии БС-8 в плазмиду PYEIOOIE.coll.Кроме того, только клетки ХБ 101, трансформированные плазмидой PYEI001, включающей вставку в 3,0 т.п.о., способны выжить в канаминокислотах и нерастворимом глюкане.
Примерб. Штамм (№ СТС7868) бактерии Streptococcus sanguis Challis, который содержитс  во флоре ротовой полости, трансформируют геном, кодирующим экспрессию а-1,3-глюканазы. Среди различных бактерий S.sanguis и Streptococcus salivarius  вл ютс  наиболее безвредными, в частности штамм (№ СТС7868) Streptococcus sanguis Challis  вл етс  хорошим материалом дл  генетиков, трансформацию которого они относительно хорошо понимают. Плазмиду pGB301 используют в качестве вектора трансформации.
ДНК плаэмиды pGB301, котора  содержитс  в цитоплазме штамма S.sanguis Challis, содержит два маркера устойчивости к лекарственным препаратам, Emr (к эритромицину ) и Стг(к хлорамфениколу) с единственным сайтом Bst Е II внутри гена Cmr. ДНК плазмиды pGB301 гидролизу ют ферментом сечени  Bst E II, а концы затупл ют при помощи ДНК-полимеразы I.
В то же самое врем  плазмиду PYEI001 содержащую фрагмент в 3,0т.п.о., кодирующий экспрессию гена #-1,3-г юканазы, обрабатывают эндонуклеазой EcoRI и концы фрагмента в 3,0 т.п.о. превращают в тупые ДНК - полимеразой I. ДНК-фрагмент плазмиды pGB301 и ДНК-фрагмент гена а-1,3- 5 глюканазы лигируют с использованием 100 ед. лигазы Т4 с целью восстановлени  плазмиды .
Штамм S.sanguis Challis трансформируют лигазной смесью, культивируют на пло0 ских агарах выт жки  дра головного мозга (B.H.I), содержащей эритромицин (50 мг/мл). Каждую из этих колоний перенос т на плоский агар B.H.I., содержащий хло- рамфеникол (10 мг/мл) с тем, чтобы
5 установить наличие Cms (чувствительных к хлорамфениколу) колоний.
Даже дл  тех штаммов S. sanguis Challls, которые обладают чувствительностью к хло- рамфениколу, фенотипна  экспресси 
0 вставленного гена а-1,3-глюканззы отмечена только в одной трети трансформированных колоний. Это вызвано тем, что фрагмент гена может быть вставлен с двум  различными ориентаци ми. Экспрессию
5 генного продукта анализируют при помощи переноса колоний Ст8-бактерий на плоские агары с В.Н.1., содержащие нерастворимый глюкан. Ввиду того, что S.sanguis  вл етс  грамположительной бактерией, возможно
0 она будет секретировать любую а-1,3-глю- каназу, которую она синтезирует. Экспрессию и секретирование глюканазы определ ют наличием гало на пластинках с агаром. Таким образом, ген а -1,3-глюкана5 зы правильно введен в клетки S.sanguis бактерии , котора  в общем случае присутствует в ротовой полости, и фенотипна  экспресси  этого гена может быть осуществлена в этом хоз ине.
0 Пример. Плазмида pGB301 имеет два стабильных маркера устойчивости к эритромицину и хлорамфениколу и имеет несколько ограничений дл  ее эффективного применени . Число копий плазмиды
5 pGB301 в клетке S.sanguis примерно равно дес ти. Как результат небольшого числа копий весьма неэффективно культивировать небольшие количества S.sanguis, содержащие плазмиду pGB301, и выполн ть про0 стые анализы размера плазмиды или выращивать большие количества трансформированных S. sanguis и получать ДНК плазмиды .
Дл  устранени  этих ограничений плаз5 миды pGB301 и рИС9 рассекают по сайтам Sma I, что позвол ет получить линейные молекулы , имеющие тупые концы с обеих сторон . ДНК-фрагменты лигируют и трансформируют в штамм IM 103 E.coli (PI).
Колонии, которые идентифицируют как содержащие маркер (ас и имеющие плазми- ды размером 12 т.п.о., отбирают, а плазмиду обозначают рМ № 1.
Эту плазмиду используют в качестве вектора - переносчика дл  трансформации культуры S.sanguls в соответствии с описанием , приведенным выше, надел   трансформированную культуру стойкостью к ампициллину, а также стойкостью к хлорам- фениколу и эритромицину.
Ген СЕ-1,3- глюканазы должен быть вставлен в правильном направлении относительно синтетического промотора, который предшествует участку от В к А. В этой конфигурации можно ожидать энергичную экспрессию и получить большое количество синтезированной а-1,3- глюканазы. Так как ни один из таких штаммов не был изолирован , то сигнальный пептид генного продукта а-1,3-глюканазы бактерии БС-8 не был отсечен сигнальной пептидазой E.cotf. Кроме того, если продуцирование а-1,3-глюкана- зы при регулировании мощным синтетическим промотором  вл етс  чрезмерным, бактери -хоз ин, накапливающа  а-1,3- глюканазу в клетке, погибает.
В тех случа х, когда ген сс-1,3-глюкана- зы вставлен в обратном направлении, т.е. от А к В, имеет место транскрипци  гена а-1,3-глюканазы бактерии БС-8 под действием регул рного промотора. Така  транскрипци  снижаетс  до весьма низкого уровн  за счет сильного конкурирующего эффекта транскрипции, котора  регулирует- с  синтетическим промотором. Этот факт также подтверждаетс  экспериментом, в котором ген а-1,3-глюканазы вставл ют при неиндуктивных услови х в направлении вниз от сильных промоторов таких, как про- мотор триптофан (Ptrp) или промотор лактоза (Plac) культуры E.coll. В этих случа х были получены продукты генов, вставленных как в правильном, так и обратном направлени х . Гены, вставленные в правильном направ- лении, дают значительно более энергичное продуцирование а-1,3-глюканазы.
Таким образом, чтобы эффективно продуцировать глюканазу, часть сигнального пептида секреции должна быть модифици- рована таким образом, чтобы сигнальный пептид можно было легко удалить от фермента глюканазы, а ген а-1,3-глюканазы должен быть вставлен в правильном на
правлении вниз от сильного промотора.
Примере. / -Лактамаза - продукт гена устойчивости к ампициллину (Am1), подвергаетс  эффективной экспрессии в культуре E.coll, а также в культур
5 0 5
0 5 9 5
0
5
S.sanguls.pMN1 гидролизуют эндонуклеа- зой BstEl, а полученные концы превращают в тупые. Одновременно, плазмиду PYEI001 гидролизуют эндонуклеазой EcoRI с тем, чтобы удалить фрагмент гена глюканазы в 3,0т.п.о., а затем полученные концы превращают в тупые. Этот фрагмент затем лигиру- ,ют фрагментом pMN1.
Фрагмент гена, содержащий промотор и сигнальный пептид секреции / -лактама- зы, отсекают от плазмиды pGH54 и вставл ют в сайт Nurl внутри ДНК, кодирующей ген а-1,3-глюканазы на рММ1, в которую был вставлен этот ген.
Как было установлено, сайт Nurl находитс  в области гена глюканазы, кодирующего амино-конец полипептида фермента. Дл  завершени  этой конструкции используют синтетический линкер, служащий дл  соединени  ДНК, кодирующей сигнальный пептид /J-лактамазы на фрагменте pGH54, с остатком гена глюканазы (от 3 до сайта Nurl) и снова получают ДНК (от 5 до сайта Nurl), кодирующую амино-конец этого фермента .
П р и м е р 9. Фрагмент гена, содержащий промотор и сигнальный пептид секреции дл  стрептокиназы, клонируют в Streptococcus equlclmllls и определ ют его основную последовательность. Эта генетическа  последовательность кодирует секрецию стрептокиназы клетками S. equiclmllis, а также E.coli. Плазмиду pMN3 получают в результате синтеза ДНК-последовательности , соответствующей промотору и сигнальному пептиду этого фермента гена глюканазы на участке от 5 до сайта Nurl, и лигировани  синтезированной ДНК-последовательности в сайте Nurl в плазмиде pHN1, которую предварительно обрабатывают с тем, чтобы включить ген, кодирующий протеин а-1,3-глюканазы.
Культуры штамма IM103 E.coll и S.sanguis могут быть трансформированы в соответствии с процедурами, описанными вфие, при помощи плазмид pMN2 и pMN3. Трансформированные клетки будут содержать значительное количество а -1,3;глюка- назы и клетки S.sanguls будут секретировать фермент.
Таким образом устанавливаетс  фено- типна  экспресси  гена а-1,3-глюканазы в культуре S.sanguls. Вставка гена глюканазы в правильном направлении относительно промотора и замена сигнального пептида пептидом, который функционирует в клетках S.sanguis,  вл ютс  важными свойствами дл  экспрессии и секретировани  больших количеств а-1,3-глюканазы.
К бактери м, отличным от S.sanguis, которые  вл ютс  естественными по отношению к ротовой полости и могут быть использованы в соответствии с изобретением , относ тс  другие виды Streptococcus, например Streptococcus sallvarlus. Можно ввести ген в эти бактерии при помощи процедур , аналогичных описанным дл  трансформации S.sanguis.
Препарации, предотвращающие кариес зубов, содержат бактерию, аборигенную относительно ротовой полости. Ген а-1,3- глюканазы и ген а -1,6-глюканазы или тот и другой продуцируют ферменты, которые разрушают нерастворимый глюкан, выраба- тываемый кариогенными бактери ми, который служит причиной кариеса зубов. В соответствии с этим предмет изобретени  может быть установлен на зубах при помощи какого-либо средства таким образом, чтобы экспресси  и секреци  ферментов
глюканазы путем непрерывного воздействи  разрушала нерастворимый глюкан, синтезированный кариогенными бактери ми в ротовой полости.

Claims (1)

  1. Формула изобретени  Способ получени  штамма Streptococcus sanguls, способного секрети- ровать «-1.3-глюкан-З-глюканогидролазу, заключающийс  в том, что осуществл ют выделение E.coRI фрагмента ДНК Bacillus clrculans BC-8/PERM ВР-733 размером 3,0 кв, клонирование выдел емого фрагмента ДНК в плазмиду PYEI001, конструирование вектора, содержащего ген а-1,3-глюкан-3- глюканогидролазы, субклонирование ДНК фрагмента, клонированного в PYEI001 в вектор pGB3C1 или pMN1, или pMN2, или pMN3 с последующей трансформацией полученной рекомбинантной ДНК бактерий Streptococcus anguis.
SU864027298A 1985-03-20 1986-03-20 Способ получени штамма SтRертососсUS SaNGUIS, способного секретировать @ -1,3-глюкан-3-глюканогидролазу SU1720493A3 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP5744385 1985-03-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SU1720493A3 true SU1720493A3 (ru) 1992-03-15

Family

ID=13055798

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SU864027298A SU1720493A3 (ru) 1985-03-20 1986-03-20 Способ получени штамма SтRертососсUS SaNGUIS, способного секретировать @ -1,3-глюкан-3-глюканогидролазу

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP0195672B1 (ru)
JP (1) JPS6225A (ru)
KR (1) KR940003689B1 (ru)
AU (1) AU592328B2 (ru)
CA (1) CA1321962C (ru)
DE (1) DE3681946D1 (ru)
SU (1) SU1720493A3 (ru)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63185381A (ja) * 1987-01-27 1988-07-30 Aizo Matsushiro デキストラナ−ゼの製造方法
EP0311469A3 (en) * 1987-09-02 1990-05-30 Plant Genetic Systems N.V. Transformed lactic acid bacteria
US4810733A (en) * 1987-10-19 1989-03-07 Toyo Ink Mfg Co., Ltd Color concentrates
JPH02157228A (ja) * 1988-12-12 1990-06-18 Hitachi Ltd 微生物及びその利用方法
JPH0687776B2 (ja) * 1990-02-20 1994-11-09 愛三 松代 新規形質転換株およびその製造方法
JPH054927A (ja) * 1991-06-28 1993-01-14 Aizo Matsushiro 乳酸菌含有組成物及びその製造方法
IT1270123B (it) * 1994-10-05 1997-04-28 Dompe Spa Composizioni farmaceutiche contenenti microorganismi ingegnerizzati e loro uso per terapia
JP2000505649A (ja) * 1996-02-09 2000-05-16 ノボ ノルディスク バイオテック，インコーポレイティド ムタナーゼ活性を有するポリペプチド及びそれをコードする核酸
ES2174248T3 (es) 1996-04-16 2002-11-01 Novozymes As Composiciones para la eliminacion de una placa dental.
GB2327345B (en) 1997-07-18 1999-06-23 Finnfeeds Int Ltd Use of an enzyme for manufacturing an agent for controlling bacterial infection
US6080849A (en) 1997-09-10 2000-06-27 Vion Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified tumor-targeted bacteria with reduced virulence
WO1999013053A1 (en) 1997-09-10 1999-03-18 Vion Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified tumor-targeted bacteria with reduced virulence
US6962696B1 (en) 1999-10-04 2005-11-08 Vion Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for tumor-targeted delivery of effector molecules
US20090324547A1 (en) * 2006-01-04 2009-12-31 Wikstroem Maude Probiotic Oral Health Promoting Product
MX343566B (es) 2010-08-31 2016-11-09 Centro Superior De Investig En Salud Publica (Csisp) * Composiciones y probioticos/prebioticos anticaries.
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
AU2022224569A1 (en) * 2021-02-17 2023-09-07 Colgate-Palmolive Company Prebiotic oral care compositions and methods

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57165312A (en) * 1981-04-03 1982-10-12 Handai Biseibutsubiyou Kenkyukai Production of oral composition
FR2529569B1 (fr) * 1982-07-02 1985-07-05 Pasteur Institut Microorganismes, notamment e. coli, transformes par une sequence d'adn originaire de c. thermocellum, compositions a activite cellulolytique issues de ces micro-organismes et procede pour les obtenir

Also Published As

Publication number Publication date
KR940003689B1 (ko) 1994-04-27
AU5493786A (en) 1986-09-25
DE3681946D1 (de) 1991-11-21
EP0195672A3 (en) 1988-07-06
EP0195672A2 (en) 1986-09-24
JPS6225A (ja) 1987-01-06
KR860007377A (ko) 1986-10-10
AU592328B2 (en) 1990-01-11
CA1321962C (en) 1993-09-07
EP0195672B1 (en) 1991-10-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SU1720493A3 (ru) Способ получени штамма SтRертососсUS SaNGUIS, способного секретировать @ -1,3-глюкан-3-глюканогидролазу
HU205386B (en) Process for expressing cloned lysostaphin gene and for producing dna fragment containing the gene, expression vector and transformed host cell
JPH07278195A (ja) 組み換えｇ−ｃｓｆ
EP0459385B1 (de) Maltopentaose produzierende Amylasen
DE3390105C2 (ru)
DE60206885T2 (de) Agarase und gen dafür
JPH10500565A (ja) ｏｓｍＢ プロモータで制御される発現プラスミド
JPH05219942A (ja) 細菌クロストリジウム・ヒストリチカムの変異株、その製造法及びその用途
US5290916A (en) Purified glucanase enzymes
JPH07170984A (ja) 新規アミノ酸配列及び該アミノ酸配列をコード するｄｎａを保有する発現ベクターを 組み込んだバチルス・ブレビスを用いる 有用物質の製造法
EP0400569B1 (en) Method for preparing a vaccine from Streptococcus mutans for dental caries and vaccinal compositions for dental caries used as nasal drops
EP0469523B1 (de) Klonierung und Überexpression von Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase aus Leuconostoc dextranicus
KR100457879B1 (ko) 비피도박테리움 유래 신규 플라스미드, 이를 이용한 재조합 발현 벡터 및 형질전환 방법
DE60034318T2 (de) A-agarase und verfahren zur herstellung derselben
EP1169461B1 (de) Verwendung von pankreatischer Procarboxypeptidase B zur Herstellung von Insulin
EP0524604B1 (de) Gentechnologisches Verfahren zur Herstellung von S-(+)-2,2-Dimethylcyclopropancarboxamid mittels Mikroorganismen
DE3538433A1 (de) Dna-fragment mit dem cyclodextrin-glycosyl-transferase-strukturgen, expressionsvektor, mikroorganismen zur expression und herstellungsverfahren
RU2143492C1 (ru) Рекомбинантная плазмида, кодирующая гибридный белок - предшественник инсулина человека (варианты), штамм бактерий e.coli - продуцент гибридного белка - предшественника инсулина человека (варианты), способ получения инсулина человека
Tsai et al. The primary structure of fulvocin C from Myxococcus fulvus
US20030148497A1 (en) Bacteriolytic complex, method for producing said complex and strain for carrying out said method
JP3089287B2 (ja) う蝕ワクチンの製造法
KR20040072545A (ko) 비피도박테리움 롱검 ｍｇ1 유래 신규 플라스미드를함유하는 셔틀벡터
CH688653A5 (de) Verfahren zur herstellung rekombinanter streptokinase
DE4204476A1 (de) Cyclodextrinase-gene und verfahren zur herstellung von cyclodextrinase
NO864206L (no) Derivat av interleukin-2, dets fremstilling og anvendelse.