KR940003689B1 - 충치예방제의 제조방법 - Google Patents

충치예방제의 제조방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

충치예방제의 제조방법
제1도는 불용성 글루칸의 구조식.
제2도는 대장균의 세포질내에 존재하는 pYEJ 001 플라스미드의 유전자지도.
제3도는 스트렙토코쿠스 산기스의 세포질내에 존재하는 pGB 301 플라스미드의 유전자지도.
제4도는 스트렙토코쿠스 산기스의 플라스미드 pGB 301(9.8kb)과 대장균의 플라스미드 pUC 9(2.8kb)를 각기 HaeⅢ과 SmaⅠ로 절단하고 T4 리가제에 의해서 결합시켜 수득된 셔틀 벡터 pMN 1의 제조를 도시.
제5도는 pYEJ 001에 클로닝시킨 α-1, 3 글루카나제 유전자의 전사방향(합성 프로모터에서 개시되는 cm r유전자와는 역방향)을 도시.
제6a도는 pMN 2의 제조를 도시.
제6b도는 pMN 3의 제조를 도시.
본 발명은 충치의 예방에 사용되는 충치예방제의 제조방법에 관한 것이다.
충치의 원인균인 스트렙토코쿠스 무탄스(streptococcus mutans)는 이 균이 생성시키는 불용성 글루칸(또는 무탄이라고도 한다)(제1도 참조)에 의해서 치아의 표면에 부착하고, 이 균이 구강내에 존재하는 슈크로즈를 분해시켜 생성되는 유기산의 작용에 의해서 치아 에나멜질을 용해시킴으로써 충치가 생기는 것으로 판명되어 있다.
따라서 충치를 예방하기 위해서는 상기한 불용성 글루칸을 분해시켜 충치균의 치아에의 부착을 방지하면 된다. 종래에는 충치균과 불용성 글루칸의 복합체인 치구(dental plaque)는 치아를 치솔질함으로써 기계적으로 제거해 왔다.
또한 최근에는 불용성 글루칸을 분해하는 효소인 α-1,6 글루카나제(정식명은 α-1,6 글루칸 6-글루카노하이드롤라제로서, 일반적으로 덱스트라나제라 한다) 또는 α-1,3-글루카나제(정식명은 α-1,3 글루칸 3-글루카노하이드롤라제로서, 일반적으로 무타나제라 한다)를 치마제에 혼입시켜, 상기한 치구를 화학적으로 용해 및 제거하는 치마제가 제안되었다(예를 들어 일본국 특개소 57-165312호, 특개소 50-58243호).
치솔질로 치구를 기계적으로 제거하는 종래의 방법에서는, 치솔이 닿지 않는 곳에치구가 남는 결점이 있고, 또한 불용성 글루칸을 분해시키는 효소를 혼입한 치마제를 사용해도 치솔질 후에 물로 씻을 때 치마제 성분이 거의 유출해버리므로, 충치의 예방효과를 기대할 수 없었다.
본 발명은 상술한 점에 비추어 이루어진 것으로, 상기한 α-1,3 글루카나제, α-1,6-글루카나제, 또는 이들 효소 둘다를 생성하는 세균중의 유전자를 클로닝시켜 구강내 상재하는 세균의 세포내에 도입시켜 형질 발현시키고, 이 형질발현시킨 구강내 상재세균을 구강중에 투여함으로써, 불용성 글루칸을 분해시키는 일정 농도의 α-1,3 글루카나제, α-1,6-글루카나제, 또는 이들 효소 둘다가 항상 구강내에 분비되도록 하여 충치를 예방하는 것을 목적으로 한다.
[실시예]
본 발명에 다른 충치 예방제 및 이의 제조방법에 관하여, 그 한 실시예로서 α-1, 3 글루카나제 유전자를 클로닝시켜 구강내의 상재 세균에 도입시켜 형질발현시키는 방법에 대하여 이하에 상세히 설명한다.
[참고예 1a (α-1,3-글루카나제를 생성시키는 균의 분리)]
A. 충치균 스트렙토코쿠스 무탄스 OMZ 176주의 불용성 글루칸을 유일한 탄소원으로 한 최소배지에 본 발명자가 거주하는 지역에서 얻은 토양시료를 가하여 28℃의 온도에서 3일간 배양한다. 불용성 글루칸의 제조방법은 예비수(Ebisu)의 방법(참조 : 대판대학 치학잡지, 제21권, 제1호, 1976)에 따른다.
이어서 상기 배지에서 배양된 각종 세균을 12회 계대 배양시키고 이들 세균을 농축한 후, 상기 배지와 동일조성의 최소배지에 0.2% 불용성 글루칸을 가하여 형성시킨 한천평판에 상기한 농축세균을 도포하여 배양시켜 콜로니를 형성한다. 30℃의 온도에서 수일간 배양하면, 불용성 글루칸을 분해시키는 균이 콜로니 주위에 투명한 용해대(halo)를 형성시킨다. 불용성 글루칸 분해효소를 생성시키는 균을 분리하기 위한 배지계대용의 액체 최소배지로서,
(NH4)2SO40.1%
MgSO4ㆍ7H2O 0.0005%
FeCl2ㆍ6H2O 0.0005%
불용성 글루칸 0.03%
을 인산 완충액으로 pH 7.0으로 조정하여 멸균한다.
한천평판용 고형 배지로서는, 상기 최소배지에 불용성 글루칸 0.2%를 가한 것에 한천 1.2%를 첨가하여 멸균한 것을 사용한다.
B. 이 결과, 주위에 투명한 용해대(halo)를 형성시킨 콜로니중에서 하기한 4종의 세균이 발견되었다.
(1) 바실루스 서쿨란스(Bacillus circulans)BC-8(기탁기관 : 한국 종균협회 ; 기탁일 : 1986년 7월 21일 ; 수탁번호 : KFCC-10234) ; (2) 코리네 박테리움(Corynebacterium)종 ; 및 (3), (4) 슈도모나스(Pseudomonas)종, 이들을 순수배양하여 조사한 바, (1)은 상기 용해대(halo)의 형성이 가장 현저하고, (2)가 두번째로 현저하고, (3) 및 (4)는 미약한 것으로 확인되었다.
따라서, 불용성 글루칸을 분해시키는 균중 (1)이 가장 강력한 것으로 간주되므로 이 균(이하 BC-8균이라 한다)의 분해효소를 조사하기로 정했다. 이 BC-8균은 바실루스 서쿨란스에 속하기 때문에 바실루스 서쿨란스 BC-8이라 명명했다.
이 BC-8균을 트립티카제 소이 브로쓰(Trypticase soy broth) 배지〔디프코(Difco)사 제조〕에서 30℃의 온도로 배양하면, 불용성 글루칸을 첨가한 경우에만 유도적으로 분해효소의 발생이 보였다.
[참고예 1b (α-1, 6 글루카나제를 생성시키는 균의 분리)]
상기 BC-8균을 수득한 지역과 같은 장소의 토양시료로부터, 상기 참고예 1a의 불용성 글루칸 대신에 시판용 덱스트란(화광순약제, 분자량=100,000 내지 200,000)을 가한 상기 참조예 1a와 동일한 액체 및 한천 고형 최소배지를 사용하여 덱스트라나제 생성균을 다수 분리시킬 수 있다.
이들 균을 블루(blue) 덱스트란 0.5%, 덱스트란 0.5%를 탄소원으로 하는 한천 고형 최소배지에 접종하여 조사하면, 콜로니 주위에 투명한 용해대를 형성시킨다. 이것에 따라서 이들 분리균은 덱스트라나제를 균체외로 분비하는 균으로 확인된다. 그중에서도 특히 현저한 용해대를 나타낸 것은 다음 네 개의 균주이다.
(1) 아트로박터종 CB-8(기탁기관 : 한국 종균협회 : 기탁일 ; 1986년 7월 21일 ; 수탁번호 KFCC-10235) 1주
(2) 방선균 악티노마이세스(Actinomyces)종 3주
이들중 (1)은 증식이 현저하여 취급하기 용이한 균이므로, 본 발명자는 이 균으로부터 덱스트라나제 유전자를 클로닝시키는 것으로 했다.
[참고예 2 불용성 글루칸 분해효소의 활성 측정]
불용성 글루칸 분해효소의 활성은, 초음파 처리하여 세분화시킨 불용성 글루칸의 현탁액을 기질로 사용하고, 상기한 BC-8균의 배양액을 원심분리하여 수득한 상청액 또는 이를 황산암모늄(75%)으로 포화하여 침전시키고 10배로 농축시킨 것을 효소액으로 사용하여 측정한다. 37℃에서 16시간 동안 0.1μM의 환원당을 생성시키는 효소활성을 1단위로 한다.
[참고예 3 불용성 글루칸 분해효소의 정제]
상기한 BC-8균을, 0.3% 불용성 글루칸을 함유하는 트립티카제 소이 브로쓰 배지(디프코사 제조) 500ml에서 온도 30℃로 3일간 배양시켜 원심분리시킨 상청액을 수득하고, 이를 황산암모늄(75%)으로 포화하여 염석시켜 수득한 침전을 50mM 인산 완충액(pH 7.0)에 용해시키고, 이 용액을 DE-52 셀룰로즈 컬럼에 첨가한다. 이 컬럼은 상기한 바와 같은 인산완충액에 0 내지 0.5M의 NaCl을 가하여 수득한 이온농도 구배로 용출시킨다.
이어서 상기 용출물의 활성피크를 세파덱스(Sephadex) G-150컬럼 크로마토그라피에 도입시킨다. SDS-겔 전기 영동은 분자량 68k dal.(달톤), 및 54k dal.의 두 개의 밴드를 나타낸다. 이들 밴드 중 68k dal.의 밴드는 α-1,3 글루카나제이고, 54k dal.의 밴드는 α-1,6 글루카나제의 활성을 나타내는 것으로 이는 후술한다.
C. 상기한 참고예 3에서와 같이 하여 정제한 68k dal.의 효소는, 퍼요오드산 또는 시판용 덱스트라나제로 처리하여 α-1,6 결합을 파괴시켜 α-1,3 결합만을 남긴 글루칸에 작용시켜도, 환원당을 생성시키는 활성을 갖고 있다.
또한 상기 효소에 α-1,6 결합으로 이루어지는 시판용 덱스트란을 도입시키면 환원당이 거의 생성되지 않는다.
또한 이 효소반응중 환원당의 생성이 글루코스 모노사카라이드 (헥소키나제로 정량)의 생성에 선행하므로, 상기 효소는 α-1,3 결합을 절단하는 엔도형 글루카나제로 확인되었다.
따라서 이 효소를 엔도형 α-1,3 글루카나제로 결정했다. 이 효소의 정식명은 “α-1,3 글루칸 3-글루카노하이드롤라제”이다.
유사하게 54k dal.의 효소는 α-1,6 결합을 특이적으로 절단하는 것으로 확인되었다.
이상 기술한 바로부터, BC-8균은 α-1,3 글루카나제와 α-1,6 글루카나제 둘다의 효소를 함께 갖는 균이라 할 수 있다.
종래, 불용성 글루칸의 제거에는, α-1,3 글루카나제(무타나제)와 α-1,6 글루카나제(덱스트라나제)의 상승작용이 유효한 것으로 입증되었다. 또한 불용성 글루칸의 결합은 α-1,3 결합으로 주로 이루어져 있으므로, 그 효소적 분해에는 α-1,3 글루카나제가 주로 담당하고 α-1,6 글루카나제의 상승작용으로 분해가 촉진되는 것으로 명백해지고 있다. 따라서 불용성 글루칸 제거의 목적상, α-1,3 글루카나제 및 α-1,6 글루카나제 유전자 둘다를 모두 클로닝시켜 이들을 한개의 플라스미드 상에서 결합시키는 것이 바람직하다.
이하에서는 상기 BC-8균을 사용한 α-1,3 글루카나제 유전자의 클로닝에 대한 실시예를 기술한다.
D. (α-1,3 글루카나제 유전자의 클로닝)
상기한 BC-8균을 트립티카제 소이 브로쓰(디프코사 제조) 배지에서 배양시켜 DNA를 추출한다〔(제이. 마마 ; J. Marmur, J. Mol. Bio1., Vol. 3, pp. 208, 1961)의 마마법을 약간 수정하여 실시〕. 이 DNA를 CsCl-EtBr 평형밀도 구배원심법에 의해서 원심분리한 바, 플라스미드 DNA의 존재는 확인되지 않고 염색체 DNA의 단일밴드만이 분리정제되었다.
이렇게 하여 정제한 DNA를 투석시킨 후 제한효소 Eco R1로 절단한다.
한편 발현 벡터(expression vector) pYEJ 001 플라스미드(제2도 참조)(시판되고 있고, Pharmacia P-L Biochemicals사의 “분자생물학 카탈로그”, pp. 27, 1983에 기재되어 있음)를 갖는 대장균 HB101균을 L-배지(L-broth) 300ml에서 배양하고 추출한 상기 pYEJ 001 플라스미드 DNA도 동일한 제한효소 Eco R1로 절단한다. 상기한 L-배지는 하기한 조성을 갖는다.
펩톤 10g
이스트 추출물 5g
글루코즈 1g
NaCl 5g
H2O 1000ml(pH 7.2로 조정)
이렇게 하여 수득된 Eco R1로 절단한 BC-8균의 DNA와 pYEJ 001 플라스미드 DNA를 각기 1μg씩 함유시키고, 여기에 1효소단위로 되도록 DNA의 재조합효소 T4 리가제를 첨가하여 4℃에서 12시간 효소반응시킨다.
따라서 2종의 DNA가 조합된 재조합 플라스미드 DNA가 수득되고, 이 재조합 플라스미드 DNA를 트리스-EDTA 용액(10mM 트리스-HCl pH 7.5, 1mM EDTA)에 투석시킨다.
이어서 대장균 K 12주 HB 101을 수용균으로 사용하여 상기 재조합 플라스미드 DNA에 의해서 형질절환을 수행한다.
E. 이하에 상기한 유전자 클로닝시킨 균을 선택하는 방법에 대하여 상세히 기술한다.
제2도에 나타낸 바대로, 발현 벡터 pYEJ 001 플라스미드의 Cm r유전자내의 Eco R1부위(site)에, 특정 유전자를 함유하는 DNA 단편을 삽입하면 균은 Cm감수성으로 될 것이다. 또한 이 유전자의 상류에 존재하는 합성 프로모터의 기능에 의해서, 정방향에 들어선 유전자의 강력한 발현이 일어날 것이다.
따라서 암피실린을 함유하는 한천평판을 사용하여 상기한 재조합 pYEJ 001 플라스미드를 수용한 대장균의 배양물로 콜로니를 만들고, 각 콜로니를 클로람페니콜(Cm)을 함유하는 L-한천평판에 멸균 스틱(stick)을 사용하여 옮기면, Cm감수성을 나타내는 대장균의 배양물은 Eco R1 부위에 몇몇 DNA 단편이 삽입된 것이므로, 이들중에서 α-1,3 글루카나제 유전자가 삽입된 것을 찾을 수 있다. L-한천평판은 1.5%의 한천을 함유하는 상기 L-배지이다.
그러나 대장균은 그람-음성균이므로 상기한 BC-8균처럼 효소를 균체외로 분비하는 것을 기대할 수 없고, 실제로 수천개의 콜로니를 불용성 글루칸을 함유하는 평판에 옮겨 조사한 결과, α-1,3 글루카나제를 분비하는 형질전환체는 하나도 발견되지 않았다.
그러나 상기 Cm-감수성(Cm s)으로 된 대장균 배양물을 불용성 글루칸을 탄소원으로 한 합성배지에 접종한 바, 증식하는 것이 발견되었다. 이 경우, 수용균의 HB 101이 Thr, Leu 및 Pro와 같은 아미노산을 요구하는 균이므로, 카사미노산(casamino acid)을 소량 첨가한 최소배지로서, 초음파처리에 의해서 파쇄하여 균체내에 쉽게 투입시킨 불용성 글루칸 0.2%를 함유하는 배지를 사용한다.
따라서 상기 형질전환체는 α-1,3 글루카나제 유전자를 수용했기 때문에, 그 생성물인 α-1,3 글루카나제를 균체외로 분비할 수 없지만 불용성 글루칸을 탄소원으로 분해이용하는 능력은 있는 것으로 추측된다.
이어서 이 형질전환체를 조금 더 큰 배지(1ℓ)에서 배양시키고 플라스미드 DNA를 추출하여 Eco R1로 절단한다. 삽입되어 있는 DNA를 겔 전기영동으로 조사한 결과 약 3.0kb(킬로 베이스)의 단편을 함유한 것으로 판명되었다.
이 크기는 상기한 참고예 3에서 판명된 α-1,3 글루카나제 단백질의 분자량 68k dal.에 근거하여 계산된 유전자의 크기를 커버하는데 충분하다고 여겨진다.
이 3.0kb의 DNA 단편중에 α-1,3 글루카나제 유전자가 존재하는 것을 증명하기 위해서 하기 실험을 수행한다.
(1) 대장균 HB 101
(2) pYEJ 001을 갖는 HB 101균
(3) 3.0kb의 DNA 단편을 받아들인 pYEJ 001을 갖는 HB 101균
상기한 3종류의 균을 각기 30ml씩의 0.2% 불용성 글루칸을 함유하는 최소배지에 배양하여, 참고예 2에서와 같이 α-1,3 글루카나제의 활성을 정량한다. 기대된 바와 같이 (3)의 균에서만 상기 효소의 활성이 확인되었다.
이는 BC-8균의 α-1,3 글루카나제 유전자가 성공적으로 대장균의 pYEJ 001 플라스미드에 클로닝된 것을 나타낸다.
F. 상기한 바대로, 대장균에서 BC-8균의 α-1,3 글루카나제 유전자의 형질발현이 보이므로 이 유전자를 그대로 구강내 상재 세균내의 적당한 플라스미드와 교체시켜 거기서 형질발현시키면, 초기의 목적을 달성할 수 있다.
그런데 구강내 상재세균중에서, 스트렙토코쿠스 산기스(Streptococcus sanguis) 및 스트렙토코쿠스 살리바리우스(Streptococcus salivarius)는 가장 무해한 박테리아이고, 특히 균에 접종시킨 스트렙토코쿠스 산기스는 그 접종부위에 2년반 이상이나 정착하고 있다는 보고도 있다(참조 : M. Svanberg & G. Westergren, Archs oral Bio1., Vol.31, No.1, pp.1-4, 1986). 이들중 특히 스트렙토코쿠스 산기스 찰리스(Streptococcus Sanguis Challis) 주(NCTC 7868)는 형질절환에 의한 유전학적 연구가 비교적 진전된 재료이므로, 본 발명자들은 이 균주를 선택하여 그 벡터 플라스미드로서 pGB 301〔제3도 참조, Behnke et al, M.G.G. (Molecular and General Genetics), Vol.184, pp.115-120, 1981 ; American Society for Microbiology, Microbiology-1982″, pp.239-242, 1982〕를 이용했다.
G. (스트렙토코쿠스 산기스에 도입된 α-1,3 글루카나제 유전자의 형질발현)
(1) pGB 301을 사용하는 스트렙토코쿠스 산기스에 도입된 α-1,3 글루카나제 유전자의 형질발현.
제3도에 나타낸 바대로, 스트렙토코쿠스 사니스 찰리스 주의 세포질중에 존재하는 pGB 301 플라스미드 DNA는 Em r(에리쓰로마이신 내성)과 Cm r(클로람페니콜 내성)이라는 2개의 약제-내성 마커를 갖고, Cm r유전자내에 제한효소 Bst E Ⅱ 부위가 있다.
따라서 pGB 301 플라스미드 DNA를 Bst E Ⅱ의 제한효소로 절단하여 그 말단을 DNA 폴리머라제 Ⅰ로 플러쉬 엔드(flush end)시킨다.
한편, 상기 E항에서 α-1,3 글루카나제 유전자의 형질발현을 확인한 대장균의 세포질내 pYEJ 001 플라스미드 DNA를 추출하고, 3.0kb의 DNA 단편을 제한효소 Eco R1로 절단하여 그 말단을 DNA 폴리머라제 Ⅰ로 플러쉬엔드시킨다.
이어서 상기한 pGB 301 플라스미드 DNA와 α-1,3 글루카나제 유전자 DNA의 단편을 1μg : 1μg의 비율로 혼합시키고, T4 리가제 100단위에 의해서 플러쉬 말단끼리 결합시켜 재조합 플라스미드 DNA를 수득한다.
이렇게 하여 수득된 재조합 플라스미드 DNA에 있어서는, Cm r유전자가 분해되는 대신에 Cm r유전자의 하류에 있는 α-1,3 글루카나제 유전자는 전사되어 형질발현될 것이다.
실제로 스트렙토코쿠스 산기스 찰리스 주는 α-1,3 글루카나제 유전자 약 3.0kb 단편을 삽입함으로써 형질전환된다.
또한 상기 형질전환의 방법은 르 블랑 및 하셀의 방법〔Le Blanc & Hassell, J. of Bacteriol., 128(1), 347-355(1976)〕 및 마크리나 등의 방법〔Macrina et al., Infec. & Imm., 28(3), 692-699(1980)〕에 따라서 수행한다. 그 결과 상기한 α-1,3 글루카나제 유전자의 재조합으로 pGB 301 플라스미드를 수용한 스트렙토코쿠스 산기스 찰리스 균주는, 에리쓰로마이신(50μg/ml)을 함유하는 브레인 하트 인퓨전(Brain Heart Infusion, 이하 B.H.I.라 한다) 한천평판(디프코사 제조)상에서 콜로니를 만든다. 이들을 한개씩 콜로람페니콜(10μg/ml)을 함유하는 B.H.I. 한천평판에 옮겨 Cm s(클로람페니콜-감수성)으로 된 콜로니의 유무를 조사한다. Cm s로 된 스트렙토코쿠스 산기스 찰리스 균주의 대부분은, 도입된 pGB 301 플라스미드 DNA내에 α-1,3 글루카나제 유전자가 삽입되어 있을 것으로 기대된다.
실제로는 α-1,3 글루카나제 유전자 단편이 삽입되는 방향에도 2개가 있으므로, 그 유전자가 형질발현하는 것은 형질전환된 콜로니의 약 3분의 1이다. 즉 스트렙토코쿠스 산기스는 그람양성균임으로, 원래의 BC-8균과 마찬가지로 α-1,3 글루카나제를 생성시키는 경우에는, 균체외로 분비하는 것을 기대할 수 있다. 상기한 Cm s로 된 균의 콜로니에서 멸균 스틱을 사용하여 불용성 글루칸을 함유하는 B.H.I. 한천평판에 식균하여, 직접 α-1,3 글루카나제의 생성을 용해대의 유무에 따라서 조사한다.
이렇게 하여 초기의 목적인 구강내 상제세균인 스트렙토코쿠스 산기스의 세포 내에 유전자 조작에 의하여 클로닝시킨 α-1,3 글루카나제 유전자를 도입시켜 형질발현시킬 수 있다.
(2) pMN 1을 사용하는 스트렙토코쿠스 산기스에 도입시킨 α-1,3 글루카나제 유전자의 형질발현.
제3도에 나타낸 바대로, pGB 301은 Emr(에리쓰로마이신 내성)과 Cmr(클로람페니콜 내성)이라는 2개의 안정한 약제내성 마커를 갖는 그다지 크지 않은 플라스미드이다. 그러나 pGB 301을 그대로 사용하기에는 하기한 이유로부터 다소 개량할 여지가 있다 :
1. 스트렙토코쿠스 산기스의 세포에서 pGB 301의 카피(copy) 수(스트렙토코쿠스 산기스의 세포 1개당 플라스미드 DNA의 수)는 약 10으로 많지 않다.
2. 플라스미드를 조작할 경우에, 일반적으로 세균을 소량 배양하여 플라스미드의 크기 등을 간단히 체크할 수 있는 것이 바람직하지만, 상기 1의 이유에 따라서 이 플라스미드를 갖고 있는 스트렙토코쿠스 산기스〔pGB 301〕를 소량 배양하여 플라스미드의 크기 등을 간단히 체크하는 것은 어렵다. 또한 대량 배양하여 플라스미드 DNA를 얻기에는 복잡하고 장시간을 요함으로 매우 효율이 낮다.
그래서 pGB 301이 지닌 장점을 활용하면서 상기한 결점을 보충한다는 의미에서, pGB 301과 대장균의 플라스미드 pUC 9를 조합시켰다. pUC 9는 대장균의 플라스미드 중에서 가장 작고 또한 카피수가 많은 것 중의 하나로서 폴리클로닝 부위를 갖는다. pGB 301 DNA를 제한효소 HaeⅢ으로 절단하고(한 지점에서) 또한 pUC 9 DNA를 제한효소 SmaⅠ로 절단하여(한 지점에서), 어느 쪽도 양 말단이 평활 말단을 갖는 선상분자를 수득한다. 이어서 이 절단된 양쪽의 DNA를 T4 DNA 리가제로 결합시킨다. 이 경우 상기 제한효소 및 리가제는 하기 참고문헌에 기재되어 있는 효소를 사용하여 반응을 수행한다.
Hae Ⅲ : Middleton et al., J. Virol., Vol.10, pp.42-50, 1972 ; Roberts et al., J.Mol., Biol., Vol.91, pp.121-123, 1975
Sma Ⅰ : Endow & Roberts, J.Mol.Biol., Vol.112, pp.521-529, 1977 ; Mc.Parland et al., J.Virol., Vol.19, pp.1006-1011, 1976
T4 DNA 리가제 : Weiss et al., J.Biol.Chem., Vol.243, pp.4543-4555, 1968 ; Panet et al., Biochemistry, Vol.12, pp.5045-5050, 1973 ; Wilson & Murray, J.Mol.Biol., Vol.132, pp.471-491, 1979 ; Murray et al., J.Mol.Biol., Vol.132, pp.493-505
리게이션시킨(ligated) DNA에서 대장균 JM 103(P1)-을 형질전환시키고, 재조합 플라스미드를 갖는 세포를 적당한 표지판(참조 : Messing et al., Proc.Nat.Acad. Sci.U.S.A., Vol.74, pp.3642, 1977 ; Messing et al., Gene, Vol.19, pp.276, 1982) 상에서 청색 콜로니 중의 백색 콜로니로서 검출한다. 이들 콜로니로 부터 검출한 플라스미드 DNA를 조사하여 제4도와 같은 배열을 갖는 것을 pMN 1이라 지칭한 후, 이를 α-1,3 글루카나제 유전자의 클로닝 벡터로서 사용한다.
pMN 1의 특성은 다음과 같다 :
1. 분자의 크기는 예상대로 12kb이고, 이는 pGB 301(9.8kb)과 pUC 9(2.8kb)의 합계크기에 상당한다.
2. 이는 대장균에서도, 스트렙토코쿠스 산기스에서도 증식할 수 있는 셔틀 벡터(shuttle vector)이다.
3. Emr과 Cmr이외에 Amr(암피실린 내성 유전자)을 갖고, 이들 형질 모두가 대장균에서도 스트렙토코쿠스 산기스에서도 발현된다.
상기한 2와 3의 특성은 pMN 1 DNA를 스트렙토코쿠스 산기스의 세포에 도입시켜 형질전환시키는 실험의 결과 명백해졌다. 형질전환의 방법은 르블랑과 하셀〔(J.of Baeteriol.), 128(1), 347-355(1976)〕, 및 마크리나 등〔(Infec. & Imm.), 28(3), 692-699(1980)〕의 방법에 따라 수행한다.
상기 E항에서, pYEJ 001 플라스미드의 합성 프로모터의 하류에 α-1,3 글루카나제 유전자를 클로닝시킨 것은 기술했다. 그러나 그 활성이 기대한 만큼 강하게 발현되지 않았으므로, α-1,3 글루카나제 유전자가 합성 프로모터에 대하여 정방향에 삽입되어 있는가의 여부가 의심스러웠다. 그래서 다음에 α-1,3 글루카나제 유전자의 삽입 방향을 결정하는 실험을 수행한다.
제5도에 나타낸 바대로, α-1,3 글루카나제 유전자는 대장균의 RNA 폴리머라제로 시험관내 전사시킨바 A→B의 방향으로 판명되었고, 제한효소 PVUⅡ 부위와의 절단거리관계로부터 역방향으로 결론지어졌다. 또한 3kb의 단편을 pYEJ 001의 Eco R1 부위에 클로닝시킨 것을 20주 이상 수득할 수 있지만, 이것도 모두 역방향으로 클로닝된 것이다.
그러면 이러한 결과는 무엇을 의미하는가에 대하여 고찰해본다. 만일 유전자가 정방향에 삽입되어 있다면, 강력한 형질발현이 일어나고 α-1,3 글루카나제를 대량으로 생성시키는 것이 기대된다. 또한 실제로 이러한 주가 전혀 분리될 수 없는 것을 보면 BC-8균의 α-1,3 글루카나제의 시그날 펩타이드는 대장균의 시그날 펩티다제에 의해서 절단되지 않고, 따라서 강력한 합성 프로모터하에서 그 생성이 과도해지면 균체 내에 축적된 숙주균을 사멸시키는 것으로 여겨진다.
역방향으로 삽입된 경우에는, BC-8균의 α-1,3 글루카나제 유전자의 본래의 프로모터에 의해서 전사가 이루어지지만, 그 수준은 강력한 합성 프로모터로부터의 전사에 의해서 상쇄되어 매우 미약한 것으로 간주된다. 또한 대장균의 트립토판 프로모터(Ptrp) 또는 락토즈 프로모터(Plac)와 같은 유도 시스템의 강력한 프로모터의 하류에서 비유도조건하에 1,3 글루카나제 유전자를 삽입한 경우에는, 정역 양쪽 방향으로 삽입된 유전자가 수득되고, 정방향에 삽입된 유전자가 α-1,3 글루카나제를 상당히 많이 생성시켰다.
결론적으로, α-1,3 글루카나제를 효율적으로 생성시키기 위해서는, 그 시그날 펩타이드 부분이 대장균과 스트렙토코쿠스 산기스로 절단될 수 있을 정도의 DNA 수준으로 배열함과 동시에, 프로모터에 대하여 α-1,3 글루카나제 유전자를 정방향으로 삽입해야 한다.
상술한 바의 방법에서 유효하다고 생각되는 2개의 시그날 펩타이드를 α-1,3 글루카나제의 상부에 가하는 실험을 시도한다.
(1) 상기 F항에 기술한 바대로, Amr의 생성물인 β-락타마제는 대장균에서도 스트렙토코쿠스 산기스에서도 유효하게 발현되므로, 그 시그날 펩타이드에 대응하는 DNA 서열에 α-1,3 글루카나제 유전자의 시그날 펩타이드보다 뒤의 DNA 서열을 결합시키면 좋다. 구체적으로는, 오가이 등(1985년 2월 4일, 동경에서 개최된 「일본 분자 생물학회」의 회합에서 발표)에 의해서 개변된 pGH 54의 시그날 펩타이드에 상당하는 DNA 서열과 α-1,3 글루카나제의 시그날 펩타이드보다 뒤의 DNA 서열을, DNA 합성장치(일본 제온(주) (도꾜도 소재)제의 DNA 합성기 A-Ⅱ의 기종명 Zeon Genet A-Ⅱ)로 인공적으로 합성한 DNA 서열과 함께 결합시켜 pMN 2(제6a도 참조)를 제조한다.
(2) 스트렙토키나제(streptokinase) 유전자를 스트렙토코쿠스 에퀴시밀리스(Streptococcus equicimilis)로부터 클로닝시켜 그 염기서열을 결정한다(참조 : Malke & Ferretti, Proc. Nat.Acad.Sci. U.S.A., Vol.81, pp.3557-3561, 1984 ; Malke et al., Gene, Vol.34, pp.357-362, 1985). 이 효소는 스트렙토코쿠스 산기스와 같은 속에 속하는 스트렙토코쿠스 에퀴시밀리스에서는 물론이고 대장균에서도 균체외로 분비되는 것이 판명되었으므로, 이 효소의 시그날 펩타이드에 상당하는 DNA 서열을 DNA 합성장치로 합성하고 여기에 α-1,3 글루카나제의 시그날 펩타이드보다 하류의 DNA 서열을 결합시킴으로써 pMN 3(제6b도 참조)을 수득한다.
pMN 2와 pMN 3 플라스미드에 의해서 형질전환된 대장균 JM 103을 Emr및 Cmr로서 수득한다. 이들 형질전환된 세포는 이의 페리플라즘(periplasm)에 상당량의 α-1,3 글루카나제를 축적하고 있는 것으로 확인되었다.
이어서 pMN 2와 pMN 3 플라스미드에 의해서 스트렙토코쿠스 산기스 주를 형질전환시키는 실험을 수행한다. 어느 경우에도 Emr및 Cmr로서 수득한 형질전환체의 콜로니를 각기 불용성 글루칸을 첨가한 B.H.I. 한천평판에 식균하여 바로 조사한 바, 용해대가 관찰되고 α-1,3 글루카나제가 대량으로 생성되고 있는 것이 판명되었다.
이렇게 하여 초기의 목적이었던 구강내 상재세균인 스트렙토코쿠스 산기스의 세포에서 α-1,3 글루카나제 유전자를 형질발현시키는데 성공했다. 상술한 바대로, 프로모터에 대하여 글루카나제 유전자를 정방향으로 결합시키는 것, 스트렙토코쿠스 산기스의 세포에서 기능하는 시그날 펩타이드로 교체하는 것 등이 성공의 비결이라고 여겨진다.
이상에서 α-1,3 글루카나제 유전자를 클로닝시켜 구강내 상재세균에 도입시켜 형질발현시키는 방법에 대하여 기술했지만, 상기 B항에 기술한 바대로, 바실루스 서쿨란스 BC-8균은 α-1,3 글루카나제와 함께 α-1,6 글루카나제를 생성시키는 균이다. 따라서 α-1,6 글루카나제 유전자를, 상기 실시예에 나타낸 것과 같은 유전자 조작에 의해서 콜로닝시켜 스트렙토코쿠스 산기스의 세포에 도입시켜 형질발현시키는 것도 가능하다.
또한 상기 실시예에서 사용한 바실루스 서쿨란스 BC-8균 외에, α-1, 3 글루카나제를 생성시키는 균, 예를 들어 슈도모나스(Pseudomonas) SK-01(미공연균기 제 4273호 : FERM P-No.4273)의 α-1,3-글루카나제 유전자 또는 α-1,6 글루카나제를 생성시키는 균, 예를 들어 아트로박터종 CB-8(기탁기관 : 한국 종균협회 ; 기탁일 : 1986년 7월 21일 ; 수탁번호 ; KFCC-10235), 코리네박테리움 AK-01(미공연균기 제2505호 : FERM P-No.2505), 플라보박테리움(Flavobacterium) BK-01∼06(미공연균기 제1194호 또는 제1285호∼제1288호 : FERM P-No.1194 또는 FERM P-No. 1285∼1288), 파에실로마이세스(Paecilomyces) TCI-No.9001(미공연균기 제6602호 : FERM P-No.6602) 및 페니실리움 페니쿨로숨(Penicillium Pheniculosum) IAM-7013(미공연균기 제1290호 : FERM P-No.1290)의 α-1,6 글루카나제 유전자를 상기 실시예에 나타낸 방법과 거의 같은 유전자 조작에 의해서 클로닝시켜, 그 유전자를 스트렙토코쿠스 산기스의 세포내에 도입시켜 형질발현시킬 수 있다.
또한 상기 E항에 기술한 바대로, 불용성 글루칸의 제거에는 α-1,3 글루카나제와 α-1,6 글루카나제의 상승작용이 특히 유효하다. 따라서 하나의 플라스미드 상에서 하나의 강력한 프로모터(예를 들어 β-락타마제 또는 스트렙토키나제 유전자의 프로모터)의 하류에, α-1,3 글루카나제 유전자와 α-1,6 글루카나제 유전자를 연속적으로 결합시킨 플라스미드를 제조하여, 이것을 스트렙토코쿠스 산기스에 도입시키면 동시에 효소 둘다를 생성시키므로, 가장 유효하게 불용성 글루칸을 제거할 수 있다.
구강내 상재세균에는 전술한 바와 같이 스트렙토코쿠스 산기스 이외에도 스트렙토코쿠스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) 등의 연쇄구균이 존재하므로, 이들에도 스트렙토코쿠스 산기스를 형질전환시킨 방법과 기본적으로 같은 조작에 의해서 이 유전자를 도입시켜 발현시킬 수 있다.
이상 설명한 대로, 본 발명의 충치예방제는, 충치의 원인균인 충치균이 생성시킨 불용성 글루칸을 분해하는 효소를 생성시키는 α-1,3 글루카나제 유전자, α-1,3 글루카나제 유전자 또는 양쪽의 유전자 모두를 도입시켜 형질전환시킨 구강내 상재세균을 함유하므로, 여러 수단에 의해서 본 발명에 따른 충치예방제를 구강내의 치아에 부착시키면, 구강내에 충치균이 생성시킨 불용성 글루칸을 분해하는 효소를 항상 생성시킬 수 있고, 그 결과 충치를 확실히 장기간에 걸쳐 예방할 수 있는 효과를 발휘한다.

Claims (5)

  1. 충치균에 의해 생성되는 불용성 글루칸의 분해효소인 α-1,3 글루칸 3-글루카노하이드롤라제, α-1,6 글루칸 6-글루카노하이드롤라제, 또는 이들 효소 둘다를 생성하는 세균을 배양하고 ; 상기 세균으로 부터 α-1,3 글루칸 3-글루카노하이드롤라제, α-1,6 글루칸 6-글루카노하이드롤라제, 또는 이들 둘다의 유전자 DNA를 추출하여 대장균의 플라스미드 DNA와 재조합시키고 ; 상기 재조합 플라스미드 DNA를 대장균에 도입시켜 형질발현 시킨 후, 상기한 α-1,3 글루칸 3-글루카노하이드롤라제, α-1,6 글루칸 6-글루카노하이드롤라제, 또는 이들 둘다의 유전자 DNA의 존재를 확인하고 ; 그 후 상기 재조합 플라스미드 DNA 중의 α-1,3 글루칸 3-글루카노하이드롤라제, α-1,6 글루칸 6-글루카노하이드롤라제, 또는 이들 둘다의 유전자 DNA를, 구강내 상재세균으로 부터 추출한 플라스미드 DNA에 재조합시킴으로써 구강내 상재세균에 도입시키고 형질발현시킴을 특징으로 하여, 충치예방제를 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, α-1,3 글루칸 3-글루카노하이드롤라제, α-1,6 글루칸 6-글루카노하이드롤라제 또는 이들 둘다의 유전자 DNA를 바실루스 서쿨란스(Bacillus circulans) BC-8균(기탁기관 : 한국 종균협회 ; 기탁일 : 1986년 7월 21일 ; 수탁번호 : KFCC-10234)으로부터 추출하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, α-1,3 글루칸 3-글루카노하이드롤라제 유전자 DNA를 슈도모나스(Pseudomonas) SK-01균으로부터 추출하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, α-1,6 글루칸 6-글루카노하이드롤라제 유전자 DNA를 아트로박터(Arthrobacter)종 CB-8(기탁기관 : 한국 종균협회 ; 기탁일 : 1986년 7월 21일 ; 수탁번호 : KFCC-10235)으로부터 추출하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, α-1,6 글루칸 6-글루카노하이드롤라제 유전자 DNA를 코리네박테리움 AK-01균으로부터 추출하는 방법.
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