WO2017010833A1 - 신규 알파-1,3-글루카나제 - Google Patents

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WO2017010833A1
WO2017010833A1 PCT/KR2016/007703 KR2016007703W WO2017010833A1 WO 2017010833 A1 WO2017010833 A1 WO 2017010833A1 KR 2016007703 W KR2016007703 W KR 2016007703W WO 2017010833 A1 WO2017010833 A1 WO 2017010833A1
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glucanase
alpha
recombinant
gene
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PCT/KR2016/007703
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반재구
김의중
양택호
이동범
김은영
이혜림
강정현
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주식회사 제노포커스
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A61K8/66—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01084—Glucan 1,3-alpha-glucosidase (3.2.1.84), i.e. mutanase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/80—Process related aspects concerning the preparation of the cosmetic composition or the storage or application thereof
    • A61K2800/86—Products or compounds obtained by genetic engineering

Definitions

  • the present invention relates to novel alpha-1,3-glucanase, and more particularly, novel alpha-1,3-glucanase derived from Trichoderma harzianum, which A gene encoding, a recombinant vector and a recombinant microorganism containing the gene, and a method for producing alpha-1,3-glucanase using the recombinant microorganism.
  • Streptococcus mutans are microorganisms that play an important role in plaque formation in the oral cavity and are most importantly associated with caries formation.
  • the microorganism has the ability to break down sugar to synthesize insoluble glucan in matrix outside the cell.
  • Glucan thus formed is a glycopolymer in which ⁇ -1,6 bond and ⁇ -1,3 bond are present at the same time.
  • the glucan is highly adhesive and water-insoluble, forming a biofilm on the tooth surface and preventing the adhesion of Streptococcus mutans.
  • Organic acids produced by Streptococcus mutans and the like in such biofilms cause tooth decay by causing demineralization on enamel layers or tissues of teeth.
  • the biofilm formed is known to play a major role in the development and progression of periodontitis.
  • Glucan is classified into three types. Dextran with alpha-1,6-glucose bonds only, water soluble glucan with alpha-1,6-glucose bonds as primary bonds, and water-insoluble glucan with alpha-1,3-glucose bonds as primary bonds, ie mutans ( mutan). (Rolla et al., 1985). The mutans produced by Streptococcus mutans bacteria account for 85-90% of alpha-1,3-glucose bonds, with the remainder alpha-1,6-glucose bonds.
  • Destranase breaks down the alpha-1,6-glucose bonds of plaque.
  • Fungi originate Penicillium, Paecilomyces, Aspergillus, Fusarium, Spicaria, Verticillium, Helminthosporium Genes are known from the bacteria, such as Chatomium, etc., and bacteria are derived from Lactobacillus, Streptococcus, Cellvibrio, Cytophaga, Brevibacterium, Many genes are known from Pseudomonas, Corynebacterium, Arthrobacter, Flavobacterium and the like.
  • Triclosan may temporarily reduce Streptococcus mutans bacteria, but destranase enzyme alone is expected to lack plaque resolution.
  • Alpha-1,3-glucanase is an enzyme that breaks down alpha-1,3-glucose bonds of plaques, called mutanases. Enzymes that degrade alpha-1,3-glucose bonds include Trichoderma sp. (Hasegawa et al., J. Biol. Chem., 244: 5460-5470, 1969), Streptomyces (Takehara et al., J Bacteriol., 145: 729-735,1981), Cladosporium resinae (Hare et al. Carbohydr Res., 58: 415-432, 1977), Pseudomonas sp.) (US Patent No. 4,438,093), Flavoacterium sp.
  • the present inventors have made a diligent effort to develop enzymes excellent in the biofilm degradation effect of bacteria, confirming that the new alpha-1,3-glucanase derived from the tricoderma hachiium GF101 strain shows a high biofilm degradation effect, The invention was completed.
  • An object of the present invention is to provide a novel alpha-1,3-glucanase excellent in the biofilm degradation effect of bacteria.
  • Another object of the present invention is to provide a gene encoding the novel alpha-1,3-glucanase and a recombinant vector containing the gene.
  • Still another object of the present invention is to provide a recombinant microorganism into which the gene or the recombinant vector is introduced, and a method for preparing alpha-1,3-glucanase using the recombinant microorganism.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for decomposing a biofilm produced by Streptococcus strain using the alpha-1,3-glucanase.
  • the present invention provides an alpha-1,3-glucanase having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the present invention also provides a gene encoding the alpha-1,3-glucanase and a recombinant vector comprising the gene.
  • the present invention also provides a recombinant microorganism into which the gene or the recombinant vector is introduced.
  • the present invention also comprises the steps of (a) culturing the recombinant microorganism to produce alpha-1,3-glucanase; And (b) provides a method for producing alpha-1,3-glucanase comprising the step of obtaining the resulting alpha-1,3-glucanase.
  • the present invention also provides a method for decomposing a biofilm using alpha-1,3-glucanase.
  • the present invention also provides an oral hygiene product containing the alpha-1,3-glucanase.
  • the present inventors developed a fungal cell wall degrading enzyme for transformation during the study of recombinant protein production using fungi.
  • Glucan degrading enzymes secreted from the Trichoderma hachinium GF101 strain include alpha-1,3-glucanase, beta-1,3-glucanase, exo-beta-1,4-glucanase, endo-beta-1, It was composed of 4-glucanase, beta-1,4glucosidase, kininase, and protease, and it was confirmed that a lot of alpha-1,3-glucanase was included.
  • the inventors confirmed that the N-terminal amino acid analysis showed that it was ASSADRLVFC, and 100% matched with trichoderma hachinium alpha-1,3-glucanase.
  • ASSADRLVFC ASSADRLVFC
  • a new alpha-1,3-glucanase sequence derived from Trichoderma hazinium was identified, and alpha-1,3-glucanase was prepared in Aspergillus Niger.
  • the present invention relates to alpha-1,3-glucanase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • alpha-1, 3-glucanase gene was isolated from the Trichoderma hachinium GF101 genome.
  • the separated alpha-1,3-glucanase was 98% and 99, respectively, from alpha-1,3-glucanase derived from trichoderma hazianum CECT2413, CCM-F340, CBS243.71. % And 99% homology.
  • Alpha-1,3-glucanase of the present invention has a signal peptide consisting of 24 amino acids (SEQ ID NO: 1, underline) in the N- terminal is secreted out of the cell, propeptide consisting of 13 amino acids (SEQ ID NO: 1; italic).
  • Alpha-1,3-glucanase, which has activity except signal peptide and propeptide, consists of 599 amino acids and has a molecular weight of 63.9 kD.
  • the present invention relates to a gene encoding alpha-1.3-glucanase.
  • the novel alpha-1,3-glucanase gDNA gene sequence is shown in SEQ ID NO: 3, and the gDNA total size including alpha-1,3-glucanase gene is 2069 bp and consists of three introns. (SEQ ID NO: 2; underline), cDNA gene sequence excluding introns is shown in SEQ ID NO: 3 and is 1908 bp, encoding 636 amino acids.
  • the present invention is a recombinant vector containing a gene encoding the alpha-1,3-glucanase and a recombinant microorganism into which the gene encoding the alpha-1,3-glucanase or the recombinant vector is introduced. It is about.
  • the recombinant microorganism may be selected from the group consisting of bacteria, fungi and yeasts.
  • a recombinant E. coli transformed with a gene encoding alpha-1,3-glucanase was prepared.
  • the fungus transformed with a gene encoding alpha-1,3-glucanase. Aspergillus Niger was prepared.
  • Aspergillus Niger transformant prepared in one embodiment of the present invention in the case of alpha-1,3-glucanase produced by the original protein molecular weight is 64.9kD size, but the glycosylation (Glysosylation) The size varied from 115 to 240 kD.
  • the term "vector” refers to a DNA preparation containing a DNA sequence operably linked to a suitable regulatory sequence capable of expressing the DNA in a suitable host.
  • the vector may be a plasmid, phage particles, or simply a potential genomic insert. Once transformed into the appropriate host, the vector can replicate and function independently of the host genome, or in some cases can be integrated into the genome itself. Since plasmids are the most commonly used form of current vectors, "plasmid” and “vector” are sometimes used interchangeably in the context of the present invention. However, the present invention includes other forms of vectors having functions equivalent to those known or known in the art. Typical expression vectors for mammalian cell culture expression are based on, for example, pRK5 (EP 307,247), pSV16B (WO 91/08291) and pVL1392 (Pharmingen).
  • expression control sequence refers to a DNA sequence essential for the expression of a coding sequence operably linked in a particular host organism.
  • Such regulatory sequences include promoters for performing transcription, any operator sequence for regulating such transcription, sequences encoding suitable mRNA ribosomal binding sites, and sequences that control the termination of transcription and translation.
  • suitable control sequences for prokaryotes include promoters, operator sequences, and ribosomal binding sites.
  • Eukaryotic cells include promoters, polyadenylation signals, and enhancers. The factor that most influences the amount of gene expression in the plasmid is the promoter.
  • an SR ⁇ promoter a promoter derived from cytomegalovirus, and the like are preferably used.
  • any of a wide variety of expression control sequences can be used in the vector.
  • useful expression control sequences include early and late promoters of SV40 or adenovirus, lac system, trp system, TAC or TRC system, T3 and T7 promoters, major operator and promoter regions of phage lambda, regulation of fd code protein Known to modulate expression of a region, a promoter for 3-phosphoglycerate kinase or other glycolysis enzymes, promoters of the phosphatase, promoter of the yeast alpha-crossing system and prokaryotic or eukaryotic cells or genes of their viruses Other sequences of construction and derivation and various combinations thereof.
  • the T7 RNA polymerase promoter ⁇ 10 is two. It can be usefully used to express protein NSP in E. coli.
  • Nucleic acids are "operably linked” when placed in a functional relationship with other nucleic acid sequences. This may be genes and regulatory sequence (s) linked in such a way as to allow gene expression when appropriate molecules (eg, transcriptional activating proteins) bind to regulatory sequence (s).
  • DNA for a pre-sequence or secretion leader is operably linked to DNA for a polypeptide when expressed as a shear protein that participates in the secretion of the polypeptide, and a promoter or enhancer
  • the ribosome binding site is operably linked to the coding sequence when affecting the transcription of the sequence, or the ribosomal binding site is operably linked to the coding sequence when affecting the transcription of the sequence; Or the ribosomal binding site is operably linked to a coding sequence when positioned to facilitate translation.
  • "operably linked" means that the linked DNA sequence is in contact, and in the case of a secretory leader, is in contact and present within the reading frame. However, enhancers do not need to touch. Linking of these sequences is performed by ligation (linking) at convenient restriction enzyme sites. If such sites do not exist, synthetic oligonucleotide adapters or linkers according to conventional methods are used.
  • expression vector generally refers to a fragment of DNA that is generally double stranded as a recombinant carrier into which fragments of heterologous DNA have been inserted.
  • heterologous DNA refers to heterologous DNA, which is DNA not naturally found in host cells.
  • the gene must be operably linked to transcriptional and translational expression control sequences that function in the selected expression host.
  • the expression control sequence and the gene of interest are included in one expression vector including both a fungal selection marker and a replication origin.
  • Host cells transformed or transfected with the expression vectors described above constitute another aspect of the present invention.
  • transformation means introducing DNA into a host so that the DNA is replicable as an extrachromosomal factor or by chromosomal integration.
  • transfection means that the expression vector is accepted by the host cell whether or not any coding sequence is actually expressed. It should be understood that not all vectors and expression control sequences function equally in expressing the DNA sequences of the present invention. Likewise not all hosts function equally for the same expression system. However, those skilled in the art can make appropriate choices among various vectors, expression control sequences and hosts without departing from the scope of the present invention without undue experimental burden.
  • the host in selecting a vector, the host must be considered, since the vector must be replicated in it.
  • the number of copies of the vector, the ability to control the number of copies, and the expression of other proteins encoded by the vector, such as antibiotic markers, must also be considered.
  • expression control sequences several factors must be considered. For example, the relative strength of the sequence, the controllability, and the compatibility with the DNA sequences of the present invention should be considered, particularly with regard to possible secondary structures.
  • Single cell hosts may be selected from a host for the selected vector, the toxicity of the product encoded by the DNA sequence of the invention, the secretory properties, the ability to accurately fold the protein, the culture and fermentation requirements, the product encoded by the DNA sequence of the invention from the host.
  • a binding method binding method
  • a panning method panning method
  • a film emulsion method film emulsion method
  • substantially pure in the definition of the present invention is meant that the polypeptides according to the invention and the DNA sequences encoding the polypeptides are substantially free of other proteins derived from bacteria.
  • Host cells for expressing recombinant proteins have been widely used prokaryotic cells such as Escherichia coli, Bacillus subtillis, etc., which are capable of liquid culture, easy to manipulate genetically, and whose genetic and physiological characteristics are well known.
  • prokaryotic cells such as Escherichia coli, Bacillus subtillis, etc.
  • yeast strains Piichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha
  • Filamentous fungi insect cells, plant cells, mammalian cells and higher organisms are used as host cells for recombinant protein production.
  • the present invention relates to a method for producing alpha-1,3-glucanase by culturing the recombinant microorganism.
  • the present invention comprises the steps of (a) culturing the recombinant microorganism to produce alpha-1,3-glucanase; And (b) relates to a method for producing alpha-1,3-glucanase comprising the step of obtaining the resulting alpha-1,3-glucanase.
  • recombinant alpha-1,3-glucanase was prepared using transformed recombinant A. niger, and the pASP (GenoFocus, Korea) vector is a separate inducer for protein expression. Recombinant protein is possible in a state in which cell growth and protein expression are separated by microbial culture alone without the need for addition.
  • Alpha-1,3-glucanase produced by the above method was confirmed by SDS-PAGE, the band having a size of 115-240kDa was confirmed (Fig. 1).
  • the present invention relates to a method for decomposing a biofilm using the alpha-1,3-glucanase.
  • the present invention relates to an oral hygiene product containing the alpha-1,3-glucanase.
  • the oral hygiene article may be a toothpaste or mouthwash.
  • Recombinant vectors and recombinant microorganisms were prepared using Trichoderma hachianium novel alpha-1,3-glucanase gene sequences.
  • Primers of SEQ ID NO: 4 MutF and SEQ ID NO: 5 MutR were prepared based on the nucleotide sequences of the alpha-1,3-glucanase gene of SEQ ID NO: 2.
  • Genomic gDNA of Trichoderma hachinium GF101 was used as a template, and PCR was performed using primers of MutF and MutR. After purification of the PCR product, using the restriction enzyme sequences StuI and NotI inserted into the respective primers, a vector named pASPGFMUT was prepared by inserting the same restriction enzyme site into the pASP (GenoFocus, Korea) vector. The vector was transformed into E. coli DH5 ⁇ strain.
  • PASPGFMUT plasmid DNA was prepared from the recombinant Escherichia coli prepared in Example 1.
  • the expression vector pASPGFMUT was introduced into Aspergillus Niger and transformed. (Tilburn et al., Gene., 26: 205-221, 1983).
  • Transformation was carried out by treating the mycelium cultured in liquid phase culture for 15 hours in YPD (Yest extract 1%, peptone 2%, Dextran 2%) medium to prepare a protoplast (Sigma L1412) to prepare pASPGFMUT DNA Inserted into the dielectric.
  • YPD Yest extract 1%, peptone 2%, Dextran 2%) medium
  • pASPGFMUT DNA Inserted into the dielectric pASPGFMUT DNA Inserted into the dielectric.
  • subcultures were selected in YPD agar medium containing 100 g / ml of hygromycin B (Hygromycin B).
  • Recombinant microorganisms resistant to hygromycin B among the recombinant microorganisms of Example 2 were first inoculated on the same agar medium. After 4 days, evenly disperse the recombinant microorganism spores in agar complete medium, and incubate for 5-6 days at 30 ° C. until the spores are evenly formed.
  • Aspirate spores were harvested at 1X10 ⁇ 6 cells / ml with 0.1% Tween 80 from the culture dish incubated for 5 days, and 1 ml of this dilution was inoculated into 50 ml of liquid production medium (Glucose 5% soybean meal 2% CSL1%). After inoculation, incubate at 28 ° C., 200 rpm for 4 days or more in a shaker. The cells were centrifuged at 10,000 g for 10 minutes to remove the cells and the recovered culture supernatants were subjected to protein electrophoresis (SDS-PAGE).
  • alpha-1,3-glucanase molecular weight was 64.9 kD size, but the glycosylation (Glysosylation) was confirmed that the actual size is varied to 115-240 kD.
  • Analysis using the O-link glycosylation analysis program http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/), results of 316, 317 446, 452, 455, 460, 461, 465, 466, 470, 471, 472, 473, 477, 482, 483, 484, 487, 488, 492, 493, 497, 499, 500, 501, 508, 509, 510, 558, 562 .
  • the lyophilized powder After incubating the recombinant transformants for 151 hours, the lyophilized powder showed 105.4 U / g alpha-1, 3-glucanase activity.
  • Mutant isolated by culturing Streptococcus mutans is used to quantify the production of free reducing sugars. 10 mg of mutan is placed in a tube and 0.9 ml of 0.1 M phosphate buffer is added to allow the mutan to be evenly dispersed. The solution containing the mutans was left at 37 ° C. for about 5 minutes. In Example 3, 0.1 ml of the fermentation broth or lyophilized powder was dissolved in 1 g of 9 ml of water, and 0.1 ml of enzyme solution was added to make a total of 1 ml. The reaction solution was reacted at 37 ° C. for 30 minutes. The reaction was left in boiling water for 3 minutes to inactivate the enzyme.
  • the activity of the enzyme is the amount of enzyme that produces 1 ⁇ ole of free reducing sugar per minute.
  • novel alpha-1,3-glucanase according to the present invention can effectively decompose mutan, which is a component of microbial biofilm, and can be used in oral care products and medical fields.

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Abstract

본 발명은 신규 알파-1,3-글루카나제(α-1,3-glucanase)에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 트리코더마 하찌아늄(Trichoderma harzianum)유래의 신규 알파-1,3-글루카나제, 이를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물을 이용한 알파-1,3-글루카나제의 제조방법 관한 것이다. 본 발명에 따른 신규 알파-1,3-글루카나아제는 미생물의 바이오필름의 성분인 뮤탄을 효과적으로 분해할 수 있어, 구강 위생용품 및 의료분야에 사용될 수 있다.

Description

신규 알파-1,3-글루카나제
본 발명은 신규 알파-1,3-글루카나제(α-1,3-glucanase)에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 트리코더마 하찌아늄(Trichoderma harzianum)유래의 신규 알파-1,3-글루카나제, 이를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물을 이용한 알파-1,3-글루카나제의 제조방법에 관한 것이다.
스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)는 구강 내에서 플라그 형성에 중요한 역할을 하는 미생물로 충치 형성과 가장 중요하게 연관되어 있는 것으로 알려져 있다. 상기 미생물은 설탕을 분해하여 세포 외부의 메트릭스(matrix)에 불용성 글루칸(glucan)을 합성하는 능력을 가지고 있다. 이렇게 형성된 글루칸은 α-1,6 결합과 α-1,3 결합이 동시에 존재하는 당중합체로서, 점착성이 높고 비수용성이어서 치아 표면에 바이오필름(biofilm)을 형성하고, 스트렙토코커스 뮤탄스의 부착을 용이하게 하며, 각종 세균들을 응집시킨다. 이러한 바이오필름내에서 스트렙토코커스 뮤탄스 등이 생산하는 유기산은 치아의 에나멜(enamel) 층이나 조직 등에 데나멜리제이션(demineralization)을 일으켜 충치를 발생시킨다. 형성된 바이오필름은 치주염의 발생과 진행에 있어서도 주요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
플라그는 포도당의 중합체인 글루칸과 과당의 중합체인 프럭탄(fructan)으로 구분된다. 글루칸은 3종류로 분류된다. 알파-1,6-글루코스 결합만 있는 덱스트란 (dextran), 알파-1,6-글루코스 결합이 주된 결합인 수용성 글루칸, 알파-1,3-글루코스 결합이 주된 결합인 비수용성 글루칸, 즉 뮤탄(mutan)으로 구분된다. (Rolla et al., 1985). 스트렙토코커스 뮤탄스 균에 의해서 생성되는 뮤탄은 알파-1,3-글루코스 결합이 85-90%를 차지하며 나머지가 알파-1,6-글루코스 결합이다.
데스트라나제는 플라그의 알파-1,6-글루코스 결합을 분해한다. 곰팡이 유래로는 페니실리움(Penicillium), 폐실로마이세스(Paecilomyces), 아스퍼질러스(Aspergillus), 푸사리움(Fusarium), 스피카리아(Spicaria), 버티실리움(Verticillium), 헬민소포리움(Helminthosporium), 채토미움 (Chaetomium), 등에서 유전자 알려져 있으며, 박테리아 유래로는 락토바실러스(Lactobacillus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 셀비브리오(Cellvibrio), 시토파가(Cytophaga), 브래비박테리움(Brevibacterium), 수도모나스(Pseudomonas), 코리네박테리움(Corynebacterium), 아소박터(Arthrobacter), 플라보박테리움(Flavobacterium) 등에서 많은 유전자가 알려져 있다.
국외에서는 일본 효소전문회사인 아마노 (Amano)사에서 패니실로마이세스 리라시누스(Paecilomyces lilacinus) 유래 데스트라나제 제품을 출시했다. 주로 사탕수수로부터 설탕 제조 공정시 오염균에 의해서 생성되는 데스트란 제거용도로 판매되며, 일부 구강제품에 사용되기도 한다.
일본 리온(Lion)의 클리니니카(Clinica Lion) 제품도 트리크로산(triclosan)이 함유된 데스트라나제를 사용하고 있다. 트리크로산에 의해 스트렙토코커스 뮤탄스 균을 일시적으로 줄여 줄 수는 있으나 데스트라나제 효소만으로는 플라그 분해능이 부족할 것이라 예상된다.
국내에서는 김치유산균 유래 신규 데스트라나제가 개발된바 있으며, 데스트라나제와 글로코스 옥시다제(glucose oxidase)를 사용하는 치약이 출시된 바 있으나, 데스트라나제에 의한 바이오필름(biofilm) 분해 효과가 미약하여 성공하지 못하였다.
알파-1,3-글루카나제는 플라그의 알파-1,3-글루코스 결합을 분해하는 효소로 뮤타나아제(Mutanase)라 불린다. 알파-1,3-글루코스 결합을 분해하는 효소는 트리코더마 종 (Trichoderma sp.) (Hasegawa et al., J. Biol. Chem., 244: 5460-5470, 1969), 스트렙토마이세스(Streptomyces) (Takehara et al., J Bacteriol., 145:729-735,1981), 클라도스포리움 레시내(Cladosporium resinae) (Hare et al. Carbohydr Res.,58:415-432, 1977), 수도모나스 종 (Pseudomonas sp.) (미국등록특허 제4,438,093호), 플라보박테리움 종(Flavobacterium sp.) (일본등록특허 제77038113호), 바실러스 써큘란스(Bacillus circulanse) (일본등록특허 63301788), 아스퍼질러스 종(Aspergillus sp.) 등에서 보고되었다. 하지만, 구강내 뮤탄의 분해능에 대해서 연구는 초기 단계이다. 해외에서 알파-1,3-글루카나제가 개발된 바가 있었으나, 뮤탄 분해 활성이 떨어져서 상용화되지 못하였다. 최근 일본에서 바실러스 써큘란스 유래 알파-1,3-글루카나제가 개발되어 GSK(GlaxoSmithKline)사에 공급되어 바이오텐(Biotene) 가글제와 치약제품에 적용되고 있다. 하지만, 효소가 제품으로는 출시된 바가 없다.
이에, 본 발명자들은 세균의 바이오필름 분해효과가 우수한 효소를 개발하고자 예의노력한 결과, 트리코더마 하찌아늄 GF101 균주 유래의 신규 알파-1,3-글루카나제가 높은 바이오필름 분해효과를 나타내는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 세균의 바이오필름 분해효과가 우수한 신규 알파-1,3-글루카나제를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 신규 알파-1,3-글루카나제를 코딩하는 유전자 및 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자 또는 재조합 벡터가 도입된 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 이용한 알파-1,3-글루카나제의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 알파-1,3-글루카나제를 이용하여 스트렙토코코스 속 균주에 의해 생성된 바이오필름을 분해시키는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 알파-1,3-글루카나아제를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 알파-1,3-글루카나아제를 코딩하는 유전자 및 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터가 도입된 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 알파-1,3-글루카나아제를 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 알파-1,3-글루카나아제를 수득하는 단계를 포함하는 알파-1,3-글루카나아제의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 알파-1,3-글루카나아제를 이용한 바이오필름의 분해방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 알파-1,3-글루카나아제를 함유하는 구강위생용품을 제공한다.
도 1은 재조합 알파-1,3-글루카나제 유전자가 형질전환된 아스퍼질러스 나이거에서 생산된 재조합 알파-1,3-글루카나제의 단백질 발현 양상을 배양 시간 별로 SDS-PAGE로 확인한 결과이다 (M: 단백질 사이즈 마커(Bio-rad:161-0317, 200:Myosine(미오신), 116:beta-galactosidase(베타 갈랄토시다제, 96:serum albumine(시럽 알부민), 66:Ovalvumine(오발부민), 45:, 31:carbonic anhydrase(카보닉 언하이드라제).
발명의 상세한 설명 및 구체적인 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명자들은 곰팡이를 이용한 재조합 단백질 생산 연구를 진행하던 중, 형질전환을 위한 곰팡이 세포벽 분해효소를 개발하였다. 곰팡이 세포벽의 주요 성분인 글루칸 분해 효소 생산 균주를 다수 스크리닝하여, 이 중에서 효소 분비 활성이 비교적 높은 트리코더마 종(Trichoderma sp.) 균주를 확보하고 있었다. (Trichoderma sp. GF01). rRNA 분석 결과 GF101 균주는 트리코더마 하찌아늄으로 판명되었다. 트리코더마 하찌아늄 GF101 균주에서 분비되는 글루칸 분해 효소는 알파-1,3-글루카나제, 베타-1,3-글루카나제, 엑소-베타-1,4-글루카나제, 엔도-베타-1,4-글루카나제, 베타-1,4글루코시다제, 키니나제, 프로테아제로 구성되어 있으며 이중 알파-1,3-글루카나제가 많이 포함되어 있음을 확인하였다.
본 발명자들은 N-터미널 아미노산 분석결과 ASSADRLVFC임을 확인하였고, 트리코더마 하찌아늄 알파-1,3-글루카나제와 100% 일치 하였다. 실시예에서 트리코더마 하찌아늄 유래의신규한 알파-1,3-글루카나제 염기서열을 확인하고, 알파-1,3-글루카나제를 아스퍼질러스 나이거에서 제조하였다.
따라서, 일 관점에서 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 알파-1,3-글루카나아제에 관한 것이다.
본 발명에서는 트리코더마 하찌아늄 GF101 게놈(Genome)으로부터 신규 알파-1,3-글루카나제 유전자를 분리하였다. 상기 분리한 알파-1,3-글루카나제는 기존에 알려진 트리코더마 하찌아늄 (T. harzianum) CECT2413, CCM-F340, CBS243.71 유래의 알파-1,3-글루카나제 와 각각 98%, 99%, 99% 상동성을 보였다.
본 발명의 알파-1,3-글루카나제는 N-터미널에 24개 아미노산으로 구성된 시그날펩타이드(서열번호 1; 언더라인)를 가지고 있어 세포 밖으로 분비되며, 13개 아미노산으로 구성된 프로펩타이드(서열번호 1; 이탤릭체)를 가지고 있다. 시그날펩타이드와 프로펩타이드를 제외한 활성을 가지는 알파-1,3-글루카나제는 599개 아미노산으로 이루어져있고, 분자량은 63.9kD 이다.
다른 관점에서, 본 발명은 알파-1.3-글루카나아제를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.
상기 신규 알파-1,3-글루카나제 gDNA 유전자 염기서열은 서열번호 3에 나타내었으며, 알파-1,3-글루카나제 유전자가 포함된 gDNA 전체크기는 2069 bp이고, 3개의 인트론으로 구성되며(서열번호 2; 언더라인), 인트론을 제외한 cDNA 유전자 염기서열은 서열번호 3에 나타내었으며 1908bp이고, 636개 아미노산을 암호화 한다.
Figure PCTKR2016007703-appb-T000001
Figure PCTKR2016007703-appb-I000001
Figure PCTKR2016007703-appb-I000002
다른 관점에서, 본 발명은 상기 알파-1,3-글루카나제를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 알파-1,3-글루카나제를 코딩하는 유전자 또는 상기 재조합 벡터가 도입된 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서는 알파-1,3-글루카나제를 코딩하는 유전자로 형질전환된 재조합 대장균을 제조하였으며, 다른 양태에서는 알파-1,3-글루카나제를 코딩하는 유전자로 형질전환된 곰팡이 아스퍼질러스 나이저를 제조하였다.
본 발명에 일 양태에서 제조된 아스퍼질러스 나이저 형질전환체는 가 생산하는 알파-1,3-글루카나제의 경우는, 원래의 단백질 분자량은 64.9kD 크기이나 글라이코실레이션(Glysosylation)되어 실제 크기는 115-240 kD로 다양함을 확인하였다
본 발명에서 용어 "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터 (vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다. 포유동물 세포 배양물 발현을 위한 전형적인 발현 벡터는 예를 들면 pRK5 (EP 307,247호), pSV16B (WO 91/08291호) 및 pVL1392 (Pharmingen)을 기초로 한다.
"발현 조절 서열 (expression control sequence)"이라는 표현은 특정한 숙주생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다.
그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.
본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열 중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다. T7 RNA 폴리메라아제 프로모터 Φ10은 이. 콜라이(E. coli)에서 단백질 NSP를 발현시키는데 유용하게 사용될 수 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결 (operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나, 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는것을 의미한다. 그러나, 인핸서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
본 명세서에 사용된 용어 "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 곰팡이 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다.
상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다.
본원 명세서에 사용된 용어 "형질감염"은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다. 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다.
예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현 클로닝에 의해 NSP 단백질의 cDNA를 클로닝 하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름에멀션법(film emulsion 법)등이 적용될 수 있다.
본 발명의 정의상 "실질적으로 순수한"이란 본 발명에 따른 폴리펩타이드 및 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열이 박테리아로부터 유래된 다른 단백질을 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다.
재조합 단백질을 발현하기 위한 숙주세포는 액체 배양이 가능하고 유전자 조작이 용이하고 유전학적, 생리적 특징이 잘 밝혀져 있는 대장균 (Escherichia coli), 고초균 (Bacillus subtillis) 등과 같은 원핵세포가 널리 이용되어 왔다. 그러나, 단백질의 번역 후 수식 (post-translational modification), 분비과정 및 활성형의 3차원 구조, 단백질의 활성상태의 문제점들을 해결하기 위해 최근 단세포 진핵세포인 효모 계열 (Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha등), 사상성 진균류 (filamentous fungi), 곤충세포 (insect cells), 식물세포, 포유동물세포 (mammalian cells) 등 고등생물에 이르기까지 재조합 단백질 생산의 숙주세포로 활용하고 있다. 실시예에서 예시된 아스퍼질러스 나이가 뿐만 아니라 다른 숙주세포를 이용하는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 용이하게 적용가능하다. 또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 재조합 미생물을 배양하여 알파-1,3-글루카나제를 생성시키는 제조방법에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 알파-1,3-글루카나아제를 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 알파-1,3-글루카나아제를 수득하는 단계를 포함하는 알파-1,3-글루카나아제의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에서는 형질전환된 재조합 A. niger를 이용하여 재조합 알파-1,3-글루카나제를 제조하였으며, 상기 pASP(GenoFocus사, 한국) 벡터는 단백질 발현을 위해 별도의 유도제(Inducer) 첨가가 필요 없이 미생물 배양만으로 세포성장과 단백질 발현이 분리된 상태로 재조합 단백질이 가능하다.
상기 방법으로 생산된 알파-1,3-글루카나제는 SDS-PAGE로 확인결과 115-240kDa의 크기를 가지는 밴드가 확인되었다 (도 1).
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 알파-1,3-글루카나아제를 이용한 바이오필름의 분해방법에 관한 것이다.
본 발명의 일양태에서는 아스퍼질러스 나이저 유래 효소를 스트렙토코커스 뮤탄스에 의해 생산된 뮤탄에 처리하였을 때, 뮤탄 분해에 의하여 환원당이 형성된는 것을 확인하였다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 알파-1,3-글루카나아제를 함유하는 구강위생용품에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 구강위생용품은 치약 또는 구강세척제일 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 트리코더마 유래 신규 알파-1,3-글루카나제의 클로닝
트리코더마 하찌아늄 신규 알파-1,3-글루카나제 유전자 염기서열을 이용하여 재조합 벡터 및 재조합 미생물을 제조하였다. 서열번호 2의 알파-1,3-글루카나제 유전자의 염기서열을 토대로 하기와 같은 서열번호 4 MutF와 서열번호 5 MutR의 프라미어(primer)를 제작하였다.
서열번호 4 MutF: atataggcctatgttgggcgttttccgccgcctc
서열번호 5 MutR: atatgcggccgcctagcagtattgacatgccgttgg
트리코더마 하찌아늄 GF101의 게놈 gDNA를 주형으로 하고, MutF와 MutR의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 산물을 정제 후, 각각의 프라이머에 삽입한 제한효소 서열 StuI과 NotI을 이용하여, pASP(GenoFocus사, 한국) 벡터에 동일 제한효소 부위에 삽입하여 pASPGFMUT로 명명한 벡터를 제조하였고, 상기 제조된 벡터를 대장균 DH5α 균주에 형질전환 시켰다.
실시예 2: 알파-1,3-글루카나제 유전자를 함유한 재조합 벡터 및 재조합 미생물의 제조
실시예 1에서 제작된 재조합 대장균에서 pASPGFMUT 플라스미드 DNA를 제조하였다. 발현벡터 pASPGFMUT를 아스퍼질러스 나이거에 도입하여 형질전환하였다. (Tilburn et al., Gene., 26:205-221, 1983).
형질전환은 YPD(Yest extract 1%, peptone 2%, Dextran 2%)배지에서 15시간 액상 배양한 균사체에 세포벽분해 효소(Sigma L1412)를 처리하여 프로토플라스트(protoplast)를 제조한 후 pASPGFMUT DNA를 유전체에 삽입하였다. 재조합미생물을 선별하기 위하여, 하이그로마시신(Hygromycin B)이 100ug/ml로 첨가된 YPD 아가 배지에서 선별하여 계대 배양하였다.
실시예 3: 재조합미생물의 플라스크 배양
실시예 2의 재조합 미생물 중에서 하이그로마이신 B에 내성을 가지는 재조합미생물들을 동일한 아가배지에 점 접종하여 1차 계대를 한다. 4일 후 아가완전 배지에 재조합미생물 포자를 골고루 분산시킨 후 30℃에서 포자가 골고루 형성될때까지 5-6일간 배양한다.
5일간 배양한 배양접시로부터 0.1% 트윈(Tween) 80으로 무성포자를 1X10^6 cell/ml 로 수확하여 이 희석액 1ml를 액상 생산배지(Glucose 5% soybean meal 2% CSL1%) 50ml 에 접종한다. 접종후 진탕배양기에서 28℃, 200rpm, 4일 이상 배양한다. 배양액을 10,000 g에서 10분간 원심분리하여 균체를 제거하고 회수한 배양 상등액을 단백질 전기영동(SDS-PAGE)을 수행하였다.
전기영동 분석 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 알파-1,3-글루카나제 분자량은 64.9 kD 크기이나 글라이코실레이션(Glysosylation)되어 실제 크기는 115-240 kD로 다양함을 확인하였다. O-링크(link) 글라이코실레이젼 분석프로그램(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)을 이용하여 분석한 결과 316, 317 446, 452, 455, 460, 461, 465, 466, 470, 471, 472, 473, 477, 482, 483, 484, 487, 488, 492, 493, 497, 499, 500, 501, 508, 509, 510, 558, 562 위치에 존재하고 있다.
균체를 파쇄하지 않고 균체만 제거하고 상등액을 전기영동한 결과와 같이 알파-1,3-글루카나제가 시그날펩타이드에 의해 아스퍼질러스 나이거 외부로 분비됨을 확인할 수 있었다. 분비된 액상 발효액은 33.6U/ml 활성을 보였다. 액상 발효액은 5% 트래할로스(trehalose)를 첨가하여 동결건조하여 파우더로 제작하였다.
재조합 형질전환체를 151시간 배양한 후, 동결건조한 파우더는 105.4U/g 알파-1,3-글루카나제 활성을 보였다.
실시예 4: 알파-1,3-글루카나제 효소의 활성 측정
스트렙토코커스 뮤탄스를 배양하여 분리한 뮤탄을 이용하여 유리 환원당의 생성을 정량한다. 뮤탄 10 mg을 튜브에 담고, 0.1 M 포스페이트 완충용액 0.9 ml을 첨가하여 뮤탄이 고르게 분산되도록 한다. 뮤탄이 담겨있는 용액을 37℃에서 5분 정도 놓아두었다. 실시예 3에서 발효액상 0.1ml 또는 동결건조한 파우더를 물 9ml에 1g에 녹여 효소액 0.1ml을 첨가하여 총 1 ml이 되도록 하고, 이 반응액을 37℃에서 30분간 반응시킨다. 효소를 불활성화시키기 위해 반응액을 끓는 물에서 3분 정도 놓아두었다.
반응이 끝난 뮤탄을 분리하기 위해 12,000RPM에서 10분간 윈심분리한다. 앞의 과정에서 분리된 상층액 0.5ml을 취하여 그대로 또는 적정하게 희석하여 반응 중에 생성된 유리 환원당을 Somogyi-Nelson method로 정량한다. 효소의 활성은 1분당 1umole의 유리 환원당을 생성시키는 효소의 양으로 한다.
본 발명에 따른 신규 알파-1,3-글루카나아제는 미생물의 바이오필름의 성분인 뮤탄을 효과적으로 분해할 수 있어, 구강 위생용품 및 의료분야에 사용될 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (12)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 알파-1,3-글루카나아제.
  2. 제1항에 있어서, 트리코더마 하찌아눔 유래인 것을 특징으로 하는 알파-1, 3-글루카나아제.
  3. 제1항의 알파-1.3-글루카나아제를 코딩하는 유전자.
  4. 제3항에 있어서, 서열번호 2의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 유전자.
  5. 제3항에 있어서 서열번호 3의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 유전자.
  6. 제3항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  7. 제3항의 유전자 또는 제6항의 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물.
  8. 제7항에 있어서, 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  9. 다음 단계를 포함하는 알파-1,3-글루카나아제의 제조방법:
    (a) 제7항의 재조합 미생물을 배양하여 알파-1,3-글루카나아제를 생성시키는 단계; 및
    (b) 상기 생성된 알파-1,3-글루카나아제를 수득하는 단계.
  10. 제1항의 알파-1,3-글루카나아제를 이용한 바이오필름의 분해방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 바이오필름은 스트렙토코코스 속 균주에 의해 생성된 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항의 알파-1,3-글루카나아제를 유효성분으로 함유하는 구강위생용품.
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