KR101377071B1 - 송이버섯에서 분리된 베타 글루카나아제 코딩 유전자 및 베타 글루칸 합성 효소 코딩 유전자 - Google Patents

Abstract

본원 발명은 국내 자생 송이버섯(Tricholoma matsutake)에서 유래된 신규한 β-글루카나아제 코딩 유전자 및 β-글루카나아제에 대한 것이다. 또한, 송이버섯에서 유래된 β-글루칸 합성 효소 코딩 유전자 및 β-글루칸 합성 효소에 대한 것이다. 본 발명의 β-글루카나아제, β-글루칸 합성 효소 유전자 및 이를 통해 생산된 β-글루카나아제, β-글루칸 합성 효소는 화장품산업, 양조산업 및 의료용 산업의 소재로 응용될 수 있다.

Description

송이버섯에서 분리된 베타 글루카나아제 코딩 유전자 및 베타 글루칸 합성 효소 코딩 유전자 {BETA GLUCANASE AND BETA GLUCAN SYNTHEASE GENE ISOLATED FROM TRICHOLOMA MATSUTAKE}

본원 발명은 송이버섯(Tricholoma matsutake)에서 유래된 신규 단백질 효소 및 이를 코딩하는 유전자에 대한 것이다. 더욱 상세하게는 송이버섯에서 유래된 β-글루카나아제 및 β-글루칸 합성 효소와 이들 효소를 코딩하는 유전자에 대한 것이다.

본 발명은 송이버섯 (Tricholoma matsutake)에서 유래된 β-글루카나아제 및 β-글루칸 합성 효소, 이의 유전자 염기서열 및 상기 효소를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

β-글루카나아제 및 β-글루칸 합성 효소는 항진균성 약리물질인 카스포펀진(caspofungin)과 같은 물질로 이용되며 생물공학적인 면에서도 중요한 역할을 하는 효소 중의 하나이다. β-글루카나아제는 다당체를 D-글루코오스로 분해하여 맥아 형성과 같은 주조, 그리고 D-글루코오스의 산업적 생산에 광범위하게 이용되고 있으며, 특히 β-글루카나아제는 분해하여 얻은 당을 이용하여 에탄올을 생성할 수 있어 산업적으로 활용할 수 있는 잠재력이 크다.

이러한 β-글루카나아제와 β-글루칸 합성 효소에 관한 연구는 이들 유용 유전자의 고 발현을 통한 고생산은 물론 사용 용도에 적합하도록 유전적인 엔지니어링(genetic engineering)을 통한 효율의 극대화 방법 등 여러 가지 분야에서 응용가능성이 매우 크다고 할 수 있다.

그러나, 상기한 연구 보고들에서 송이버섯의 β-글루칸에 대한 유전자 수준에 대한 연구는 전혀 보고된 바 없다. 본 발명자들은 상기의 내용에 착안하여 소나무 뿌리와 상호 작용하는 외생 균근균인 송이버섯(Tricholoma matsutake)으로부터 기존의 β-글루칸 합성 효소 및 β-글루카나아제와는 다른 신규한 단백질 및 이를 코딩하는 유전자를 제공하고자 한다.

본원 발명의 목적은 소나무 뿌리에서 외생 균근을 형성하여 생육하는 송이버섯(Tricholoma matsutake)에서 신규한 β-글루칸 합성 효소 및 β-글루카나아제를 코딩하는 유전자의 염기서열을 밝히는 것이다. 또한 본원 발명의 목적은 상기 신규의 유전자로부터 향상된 기능을 갖는 β-글루칸 합성 효소 및 β-글루카나아제를 얻는 것을 목적으로 한다.

본원 발명은 상기 기술과제를 해결하기 위해 안출된 것으로서 본원 발명은 서열번호 1의 유전자 서열을 갖는 β-글루카나아제 코딩 유전자 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 β-글루카나아제를 제공한다. 상기 유전자 및 효소는 송이버섯(Tricholoma matsutake)에서 유래된 것을 특징으로 한다.

또한 본원 발명은 서열번호 3의 유전자 서열을 갖는 β-글루칸 합성 효소 코딩 유전자 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 β-글루칸 합성 효소를 제공한다. 상기 유전자 및 효소는 상기 유전자 및 효소는 송이버섯(Tricholoma matsutake)에서 유래된 것을 특징으로 한다.

본 발명은 국내 자생의 최고품질의 송이버섯으로부터 β-글루카나아제, β-글루칸 합성 효소 유전자를 분리하고, β-글루카나아제, β-글루칸 합성 효소 유전자를 클로닝하였다. 본 연구에서 증폭한 송이균 유래의 β-글루카나아제, β-글루칸 합성 효소 유전자의 염기서열을 기존에 보고된 다양한 종류의 β-글루카나아제, β-글루칸 합성 효소 유전자와 비교해 보면, 기존에 보고된 효소들과 구별되는 송이버섯 유래의 특이한 β-글루카나아제, β-글루칸 합성 효소임이 확인되었다. 본 발명의 β-글루카나아제, β-글루칸 합성 효소 유전자를 이용하여 생산된 β-글루카나아제, β-글루칸 합성 효소는 화장품산업, 양조산업 및 의료용 산업의 소재로 직접 응용 가능하다.

도 1 및 도 2는 타 미생물의 β-글루카나아제의 아미노산 서열들과 송이버섯의 β-글루카나아제의 아미노산 서열을 다중정렬한 것이다.
도 3은 타 미생물의 β-글루칸 합성 효소의 아미노산 서열들과 송이버섯의 β-글루칸 합성 효소의 아미노산 서열을 다중정렬한 것이다.

본원 발명은 송이버섯(Tricholoma matsutake)에서 유래된 β-글루카나아제 코딩 유전자 서열 및 이의 아미노산 서열을 제공한다. 또한 본원 발명은 송이버섯(Tricholoma matsutake)에서 유래된 β-글루칸 합성 효소 코딩 유전자 서열 및 이의 아미노산 서열을 제공한다.

상기 유전자 서열 및 아미노산 서열을 확인하는 방법은 송이버섯 (Tricholoma matsutake)에서 토탈 RNA를 분리 및 정제하는 단계; 상기 RNA로 부터 cDNA를 얻는 단계; 및 상기 cDNA에서 β-글루카나아제 및 β-글루칸 합성 효소 코딩 유전자를 선택적으로 클로닝하는 단계를 포함한다.

송이버섯(Tricholoma matsutake )은 소나무 뿌리에서 외생균근을 형성하여 생육하는 여러해살이 식용버섯의 하나로 담자균강 송이버섯목 송이버섯과 송이버섯속에 속한다. 갓은 초기에는 반구형이나 펼쳐져서 우산 모양이 되며 회갈색 또는 연한 흑갈색이고 지름은 대략 12cm 내지 15cm이다. 균습(菌褶)은 흰색이고 자루와 서로 연결되어 있는 것이 특징이다. 갓이 펼쳐지지 않았을 때는 피막이 덮여져 있고 펼쳐진 후에는 피막은 자루에 잔류하며 뚜렷하지 않은 균환(菌環)으로 된다. 균자류는 균산(菌傘) 중앙에 있고 직립하거나 약간 구부러져 있으며 길이는 대략 9cm 내지 18cm이다. 여름과 가을철에 소나무숲에서 자란다. 송이버섯은 살아있는 소나무 뿌리에 붙어서 생육하는 것으로 우리나라의 소나무가 있는 거의 모든 지역에 퍼져 있다. 주로 함경산맥, 낭림산맥, 마식령 산맥 및 태백산맥 줄기의 동해안쪽에 많이 자생하는 것으로 알려져 있다.

β-글루칸은 식물의 셀룰로오스, 곡물의 왕겨, 효모와 버섯 그리고 곰팡이의 세포벽의 구성 성분이다. β-글루칸은 D-글루코오스가 글루코시드 결합으로 연결되어 있는 형태로 존재한다. 또한 β-글루칸은 분자적 질량, 용해성, 점성, 3차원적 외형에 따라 다양한 분류로 구분되어진다.

β-글루카나아제는 β-글루칸 분해 효소로 작용하는 양식에 따라 엑소-β-글루카나아제와 엔도-β-글루카나아제로 나누어진다. 엔도-β-글루카나아제는 β-글루칸 사슬 안쪽에서 규칙성 없이 절단하여, 초기부터 다당류는 급속히 저분자화 되어 D-글로코오스 단당류로 변한다. 엑소-β-글루카나아제는 β-글루칸을 사슬 말단에서부터 순차적으로 D-글루코오스를 합성시키는 효소이다. β-글루카나아제에는 β-(1,3), β-(1,4), β-(1,6)결합을 가수분해하는 형태로 나누어져서 각 자의 결합을 분해한다.

β-글루칸 합성 효소는 앞서 언급한 β-글루카나아제와 정반대의 역할을 수행하는 효소로서 분해된 D-글루코오스를 셀룰로오스나 β-글루칸으로 합성하여 식물의 외벽이나, 효모와 버섯 곰팡이의 외벽을 형성하게 된다. 그리고 이 효소는 작용 양식에 따라 β-(1,3), β-(1,4), β-(1,6)의 형태로 나뉘어져 작용한다.

β-글루칸 합성 효소가 결여되면 식물의 세포벽을 구성하지 못하게 되어 산화적 스트레스(oxidative stress), 삼투압(osmotic pressure) 등 여러 외부환경에 대한 적응력을 약화시켜 결국에는 그 생명이 유지되지 못한다. 또한 β-글루칸 합성 효소는 글루코실트랜스퍼라아제(glucosyltransferase)로써 곰팡이에서 β-글루칸의 전달에 연관되어 있으며, 항진균성 약리물질인 카스포펀진(caspofungin)과 같은 물질로 이용되기도 한다. 한편, β-글루카나아제는 D-글루코오스의 생산 및 분해하여 얻은 당을 이용하여 에탄올을 생산하는데 사용될 수 있다.

본원 발명에서는 송이버섯의 토탈 RNA로부터 cDNA를 획득하고 β-글루칸 합성 효소 및 β-글루카나아제 효소들을 코딩하는 유전자를 선택적으로 증폭할 수 있는 특이 프라이머를 이용하여 PCR을 통해 상기 효소들을 코딩하는 유전자를 클로닝 하는 방법을 사용하였다.

본원 발명의 일 실시예에 따르면 pGEM®-T Easy Vector와 같은 플라스미드 벡터에 RT-PCR 수행 후 얻어진 cDNA가 삽입된다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니며 T-Vector pMD20와 같은 다른 종류의 플라스미드 벡터를 사용하는 것도 가능하다. 또한, YAC, BAC, 코스미드 또는 박테리오파지 등을 cDNA의 삽입 벡터로 사용할 수 있다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 송이버섯에서 β- 글루카나아제 및 β- 글루칸 합성 효소 코딩 유전자 확인

송이버섯의 토탈 RNA 분리 및 정제

대구인근 가창지역에서 채취한 송이버섯 자실체 약 1 g을 취하여 토탈 RNA를 분리하였다. 대구인근 가창지역에서 채취한 송이버섯 자실체로부터 total RNA를 분리 하였다. 자실체 토탈 RNA는 QIAGEN 키트 (RNeasy Maxi 키트: cat#75162)를 사용하여 분리하였다. 자실체 조직 약 1g을 취하여 액체질소와 막자사발을 이용하여 마쇄하였다. 베타 머캅토에탄올을 첨가한 15㎖의 키트내의 RLT 완충액에 용해시키고, 호모지나이저로 분쇄하였다. 상기 시료 용액을 3,000g에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 분리하고, 여기에 15㎖의 70% EtOH을 첨가하여 잘 섞은 후, 3,000g에서 5분간 원심분리하여 total RNA를 막에 부착시켰다. 두 차례의 세척 과정을 수행 후, 1.2ml의 RNase가 제거된 물을 첨가하여 토탈 RNA를 용출, 분리하였다.

토탈 RNA 로부터 cDNA 획득

상기 실시예 1에서 얻은 토탈 RNA로 부터 올리고텍스(oligotex) mRNA 정제키트 (QIAGEN)를 사용하여 mRNA를 분리하고, dT17을 함유한 올리고머를 프라이머로 사용하여 RT-PCR 방법으로 cDNA를 합성하였다. 상기 RT-PCR 조건은 95℃ 2분 1사이클, 95℃ 30초, 55℃ 1분, 72℃ 2분, 35 사이클이었다.

이렇게 합성된 cDNA는 XL PCR 키트 (PerkinElmer)를 사용하여 합성된 DNA 삽입체의 5' 말단과 3' 말단의 올리고머를 함유한 PCR 반응을 수행하여 소량 증폭시켰다. 상기에서 얻어진 PCR 산물을 SfiI의 효소로 처리한 후 아가로스젤 전기영동을 하여 1.3 kb 이상의 cDNA 단편을 분리한 후 DraIII 효소로 처리한 pCNS-D2 벡터에 연결시킨 후 전기침공법(electroporation)에 의해 대장균 Top10F' (Invitrogen) 균주에 형질전환시켰다.

cDNA 염기서열의 결정 및 데이터 분석

상기에서 제작한 cDNA를 앰피실린 (100ug/ml)이 함유된 LB 한천배지에 도말하여 다수의 cDNA 클론을 배양하였다. 여기에서 얻어진 클론들의 염기서열을 분석하기 위하여 MWG 96well 플라스미드 프렙 시스템으로 플라스미드 DNA를 분리하고, 자동화염기서열 결정기인 ABI 3700으로 염기서열분석을 수행하였다. 결정된 DNA 데이터의 유사성 검색은 NCBI의 BLASTN과 BLASTX를 사용하여 수행하였다.

β- 글루카나아제 및 β- 글루칸 합성 효소 코딩 유전자 클로닝 및 염기서열 분석

각각의 유전자를 클로닝 하기 위해 다음의 프라이머를 이용하여 PCR 을 수행하였다. PCR 조건은 다음과 같았다 : 95℃ 2분 1사이클, 95℃ 30초, 55℃ 1분, 72℃ 2분, 35사이클의 조건.

β- 글루카나아제

정방향 프라이머: 5' ATGGAAGACCGCCCTATATCCAAT 3'

역방향 프라이머: 5' CTACGATGTTGTTGTTGCTAATGATG 3'

β- 글루칸 합성 효소

정방향 프라이머: 5' ATGCCAGCGACTGTGCCAACGA 3'

역방향 프라이머: 5' TCAACAAGTAGTTCTGGGGGCGAAA 3'

다음으로, 상기 PCR을 통해 얻어진 β-글루카나아제 및 β-글루칸 합성 효소 코딩 유전자 단편을 pGEM®-T Easy Vector(Promega)에 삽입하고 이를 이용하여 Escherichia coli DH5α를 형질전환 하였다. 상기 형질 전환된 E.coli 를 LB 배지(1.0% Bcto-trypton, 0.5% Bacto-yeast extract, 1.0% NaCl), 37℃에서 배양하였다. 삽입된 벡터를 가진 E. coli 를 선별하기 위해 LB 배지에 앰피실린(50㎍/㎖ ), 0.1mM IPTG, X-Gal (50㎍/㎖)을 첨가하였다.

상기 클로닝을 통해 얻어진 β-글루카나아제 유전자 염기 서열을 확인한 결과 서열목록 1과 같았으며, β-글루칸 유전자 염기서열은 서열목록 3과 같았다.

타 미생물과 송이버섯의 β- 글루카나아제 및 β- 글루칸 합성 효소의 아미노산 서열들의 다중정렬 ( multiple - alignment )

상기 실시예 4에서 얻은 유전자 염기서열을 통해 β-글루카나아제 아미노산 서열(서열번호 2) 및 β-글루칸 합성 효소 아미노산 서열(서열번호 4)를 확인하였다. 또한 타 미생물과 송이버섯의 β-글루카나아제 및 β-글루칸 합성 효소의 아미노산 서열들을 Clustal X 프로그램을 이용하여 다중정렬(multiple-alignment) 하였다. 타 미생물의 β-글루카나아제의 아미노산 서열들과 송이버섯의 β-글루카나아제의 아미노산 서열을 다중정렬 결과를 도 1 및 2에 도시하였다. 타 미생물의 β-글루칸 합성 효소의 아미노산 서열들과 송이버섯의 β-글루칸 합성 효소의 아미노산 서열을 다중정렬한 결과는 도 3에 도시하였다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (8)

1. 서열번호 1의 유전자 서열을 갖는 β-글루카나아제 코딩 유전자.
2. 제1항에 있어서
   상기 β-글루카나아제 유전자는 송이버섯(Tricholoma matsutake)에서 유래된 것을 특징으로 하는 것인, 유전자.
3. 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 β-글루카나아제.
4. 제3항에 있어서
   상기 β-글루카나아제는 송이버섯(Tricholoma matsutake)에서 유래된 것을 특징으로 하는 것인, β-글루카나아제.
5. 서열번호 3의 유전자 서열을 갖는 β-글루칸 합성 효소 코딩 유전자.
6. 제5항에 있어서
   상기 β-글루칸 합성 효소 코딩 유전자는 송이버섯(Tricholoma matsutake)에서 유래된 것을 특징으로 하는 것인, 유전자.
7. 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 β-글루칸 합성 효소.
8. 제7항에 있어서
   상기 β-글루칸 합성 효소는 송이버섯(Tricholoma matsutake)에서 유래된 것을 특징으로 하는 것인, β-글루칸 합성 효소.
   
   
   

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