KR101444184B1 - 송이버섯에서 분리된 라카아제 코딩 유전자 - Google Patents

Abstract

본원 발명은 국내 자생 송이버섯(Tricholoma matsutake)에서 유래된 신규한 라카아제 유전자 및 라카아제에 대한 것이다. 본 발명의 라카아제 유전자 및 이를 통해 생산된 라카아제는 화장품산업, 양조산업 및 의료용 산업의 소재로 응용될 수 있다.

Description

송이버섯에서 분리된 라카아제 코딩 유전자 {LACCASE CODING GENE ISOLATED FROM TRICHOLOMA MATSUTAKE}

본원 발명은 송이버섯(Tricholoma matsutake)에서 유래된 신규 단백질 효소 및 이를 코딩하는 유전자에 대한 것이다. 더욱 상세하게는 송이버섯에서 유래된 라카아제(laccase)와 상기 효소를 코딩하는 유전자에 대한 것이다.

본 발명은 송이버섯(Tricholoma matsutake)에서 유래된 라카아제, 이의 유전자 염기서열 및 상기 효소를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

라카아제는 다양한 기질에 대해 촉매반응을 나타내는 특성과 관련하여, 다양한 범주의 난분해성 화합물을 분해하는 것으로 알려져 있다. 펄프공업에서의 펄프의 탈색 및 염색 공업에서 폐염료의 분해에 이용된다. 또한 오염된 환경을 재생 복원하는 생물학적교정(bioremediation) 산업과 관련하여 연구 가능성이 대단히 크다. 이에 라카아제에 관한 연구는 이들 유용 유전자의 고 발현을 통한 고생산은 물론 사용용도에 적합하도록 유전적인 엔지니어링을 통한 효율의 극대화 방법 등 여러 가지 분야에서 연구가 활발히 진행되고 있다.

그러나, 종래의 연구 보고들에서 송이버섯의 라카아제 유전자에 관한 연구는 전혀 보고된 바 없다. 본 발명자들은 상기의 내용에 착안하여 소나무 뿌리와 상호 작용하는 외생 균근균인 송이버섯(Tricholoma matsutake)으로부터 기존의 라카아제 와는 다른 신규한 단백질 효소 및 이를 코딩하는 유전자를 제공하고자 한다.

본원 발명의 목적은 소나무 뿌리에서 외생 균근을 형성하여 생육하는 송이버섯(Tricholoma matsutake)에서 신규한 라카아제(laccase)를 코딩하는 유전자의 염기서열을 밝히는 것이다. 또한 본원 발명의 목적은 상기 신규의 유전자로부터 향상된 기능을 갖는 라카아제를 얻는 것을 목적으로 한다.

본원 발명은 상기 기술과제를 해결하기 위해 안출된 것으로서 본원 발명은 서열번호 1의 유전자 서열을 갖는 라카아제 코딩 유전자 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 라카아제를 제공한다. 상기 유전자 및 효소는 송이버섯(Tricholoma matsutake)에서 유래된 것을 특징으로 한다.

본 발명은 국내 자생의 최고품질의 송이버섯으로부터 라카아제 유전자를 분리하고 유전자를 분리하고, 라카아제 코딩 유전자를 클로닝하였다. 본 연구에서 증폭한 송이균 유래의 라카아제 유전자의 염기서열을 기존에 보고된 다양한 종류의 라카아제 유전자와 비교해 보면, 기존에 보고된 효소들과 구별되는 송이버섯 유래의 특이한 라카아제임이 확인되었다. 본 발명의 라카아제 유전자를 이용하여 생산된 라카아제는 화장품산업, 양조산업 및 의료용 산업의 소재로 직접 응용 가능하다.

도 1a 및 도 1b는 타 미생물의 라카아제 아미노산 서열들과 송이버섯의 라카아제 아미노산 서열을 다중정렬한 것이다.

본원 발명은 송이버섯(Tricholoma matsutake)에서 유래된 라카아제 코딩 유전자 서열 및 이의 아마노산 서열을 제공한다.

상기 유전자 서열 및 아미노산 서열을 확인하는 방법은 송이버섯 (Tricholoma matsutake)에서 토탈 RNA를 분리 및 정제하는 단계; 상기 RNA로 부터 cDNA를 얻는 단계; 및 상기 cDNA에서 라카아제 코딩 유전자를 선택적으로 클로닝하는 단계를 포함한다.

송이버섯(Tricholoma matsutake )은 소나무 뿌리에서 외생균근을 형성하여 생육하는 여러해살이 식용버섯의 하나로 담자균강 송이버섯목 송이버섯과 송이버섯속에 속한다. 갓은 초기에는 반구형이나 펼쳐져서 우산 모양이 되며 회갈색 또는 연한 흑갈색이고 지름은 대략 12cm 내지 15cm이다. 균습(菌褶)은 흰색이고 자루와 서로 연결되어 있는 것이 특징이다. 갓이 펼쳐지지 않았을 때는 피막이 덮여져 있고 펼쳐진 후에는 피막은 자루에 잔류하며 뚜렷하지 않은 균환(菌環)으로 된다. 균자류는 균산(菌傘) 중앙에 있고 직립하거나 약간 구부러져 있으며 길이는 대략 9cm 내지 18cm이다. 여름과 가을철에 소나무숲에서 자란다. 송이버섯은 살아있는 소나무 뿌리에 붙어서 생육하는 것으로 우리나라의 소나무가 있는 거의 모든 지역에 퍼져 있다. 주로 함경산맥, 낭림산맥, 마식령 산맥 및 태백산맥 줄기의 동해안쪽에 많이 자생하는 것으로 알려져 있다.

라카아제(laccase)는 구리이온을 함유하는 산화 효소(copper-containing oxidase enzyme)로서, 옻나무 수액 속에서 옻을 산화시키고 경화하는 효소로서 처음 발견되었다. 주로 고등식물과 균류에서 발견되어왔으며, 목재의 주성분인 리그닌의 생분해 반응을 촉매하는 효소로 연구되어왔다. 라카아제는 일반적으로 4개의 구리이온을 가지고 있으며, 이 부분이 반응의 활성부위로 작용한다고 알려져 있다. 산소를 전자수용체로 이용하는 페놀산화효소(phenoloxidase)로 작용하여, 모노- 또는 폴리페놀성 기질의 수산기 그룹(hydroxyl group)이나 방향족 아민을 직접적으로 산화한다. 산화 환원 매개체가 존재할 경우, 리그닌뿐만 아니라, 몇몇 방향족, 지방족 인공화합물을 분해하는 것으로 보고되었다.

본원 발명에서는 송이버섯의 토탈 RNA로부터 cDNA를 획득하고 라카아제를 코딩하는 유전자를 선택적으로 증폭할 수 있는 특이 프라이머를 이용하여 PCR을 통해 상기 효소들을 코딩하는 유전자를 클로닝 하는 방법을 사용하였다.

본원 발명의 일 실시예에 따르면 pGEM®-T Easy Vector와 같은 플라스미드 벡터에 RT-PCR 수행 후 얻어진 cDNA가 삽입된다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니며 T-Vector pMD20와 같은 다른 종류의 플라스미드 벡터를 사용하는 것도 가능하다. 또한, YAC, BAC, 코스미드 또는 박테리오파지 등을 cDNA의 삽입 벡터로 사용할 수 있다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 송이버섯에서 라카아제 코딩 유전자 확인

송이버섯의 토탈 RNA 분리 및 정제

대구인근 가창지역에서 채취한 송이버섯 자실체 약 1 g을 취하여 토탈 RNA를 분리하였다. 대구인근 가창지역에서 채취한 송이버섯 자실체로부터 토탈 RNA를 분리 하였다. 자실체 토탈 RNA는 QIAGEN 키트 (RNeasy Maxi 키트: cat#75162)를 사용하여 분리하였다. 자실체 조직 약 1g을 취하여 액체질소와 막자사발을 이용하여 마쇄하였다. 베타 머캅토에탄올을 첨가한 15㎖의 키트내의 RLT 완충액에 용해시키고, 호모지나이저로 분쇄하였다. 상기 시료 용액을 3,000g에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 분리하고, 여기에 15㎖의 70% EtOH을 첨가하여 잘 섞은 후, 3,000g에서 5분간 원심분리하여 토탈 RNA를 막에 부착시켰다. 두 차례의 세척 과정을 수행 후, 1.2ml의 RNase가 제거된 물을 첨가하여 토탈 RNA를 용출, 분리하였다.

토탈 RNA 로부터 cDNA 획득

상기 실시예 1에서 얻은 토탈 RNA로 부터 올리고텍스(oligotex) mRNA 정제키트 (QIAGEN)를 사용하여 mRNA를 분리하고, dT17을 함유한 올리고머를 프라이머로 사용하여 RT-PCR 방법으로 cDNA를 합성하였다. 상기 RT-PCR 조건은 95℃ 2분 1사이클, 95℃ 30초, 55℃ 1분, 72℃ 2분, 35 사이클이었다.

이렇게 합성된 cDNA는 XL PCR 키트 (PerkinElmer)를 사용하여 합성된 DNA 삽입체의 5' 말단과 3' 말단의 올리고머를 함유한 PCR 반응을 수행하여 소량 증폭시켰다. 상기에서 얻어진 PCR 산물을 SfiI의 효소로 처리한 후 아가로스젤 전기영동을 하여 1.3 kb 이상의 cDNA 단편을 분리한 후 DraIII 효소로 처리한 pCNS-D2 벡터에 연결시킨 후 전기침공법(electroporation)에 의해 대장균 Top10F' (Invitrogen) 균주에 형질전환시켰다.

cDNA 염기서열의 결정 및 데이터 분석

상기에서 제작한 cDNA를 앰피실린 (100ug/ml)이 함유된 LB 한천배지에 도말하여 다수의 cDNA 클론을 배양하였다. 여기에서 얻어진 클론들의 염기서열을 분석하기 위하여 MWG 96well 플라스미드 프렙 시스템으로 플라스미드 DNA를 분리하고, 자동화염기서열 결정기인 ABI 3700으로 염기서열분석을 수행하였다. 결정된 DNA 데이터의 유사성 검색은 NCBI의 BLASTN과 BLASTX를 사용하여 수행하였다.

라카아제 코딩 유전자 클로닝 및 염기서열 분석

라카아제 코딩 유전자를 클로닝 하기 위해 다음의 프라이머를 이용하여 PCR 을 수행하였다. PCR 조건은 다음과 같았다 : 95℃ 2분 1사이클, 95℃ 30초, 55℃ 1분, 72℃ 2분, 35사이클의 조건.

정방향 프라이머: 5' ATGGTAAAACTACTCCATCTCTTGTGG 3'

역방향 프라이머: 5' TCAGGGCTGGTCCAGTGTCGAGGA 3'

다음으로, 상기 PCR을 통해 얻어진 라카아제 코딩 유전자 단편을 pGEM®-T Easy Vector(Promega)에 삽입하고 이를 이용하여 Escherichia coli DH5α를 형질전환 하였다. 상기 형질 전환된 E.coli 를 LB 배지(1.0% Bcto-trypton, 0.5% Bacto-yeast extract, 1.0% NaCl), 37℃에서 배양하였다. 삽입된 벡터를 가진 E. coli 를 선별하기 위해 LB 배지에 앰피실린(50㎍/㎖ ), 0.1mM IPTG, X-Gal (50㎍/㎖)을 첨가하였다.

상기 클로닝을 통해 얻어진 라카아제 코딩 유전자의 염기 서열을 확인한 결과 서열목록 1과 같았다.

타 미생물과 송이버섯의 라카아제의 아미노산 서열들의 다중정렬 ( multiple - alignment )

상기 실시예 4에서 얻은 유전자 염기서열을 통해 라카아제의 아미노산 서열(서열번호 2)를 확인하였다. 또한 타 미생물과 송이버섯의 라카아제의 아미노산 서열들을 Clustal X 프로그램을 이용하여 다중정렬(multiple-alignment)하였다. 타 미생물의 라카아제 아미노산 서열들과 송이버섯의 라카아제의 아미노산 서열의 다중정렬 결과를 도 1a 내지 도 1b에 도시하였다.

<110> KB Univ. <120> laccase <130> KB laccase <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1566 <212> DNA <213> Tricholoma matsutake <400> 1 atggtaaaac tactccatct cttgtggttc tctgcgtcct tgctctggcg ttccactgat 60 gccgcgatcg gacccgttgg cgatttggtt atccgtaatg cggtgatcag tcctgatggc 120 tttgatagat cagctgtgct tcctggaggt acatttccgg gtcccgtgat tcgaggcaac 180 aaaggagatc ggttccagat taatgttgtt gatcatttga cggacgctac gatgttgcgc 240 agtacaagta ttcactggca tgggattctt cagcagaaac aatcatcttg ggctgatggt 300 gcagcgttca tcacacaatg ccctattgct gcgggcgatt cgttcctata taattttcgg 360 acggcagacc aagctggcac tttttggtat cactctcatt tatctacaca atactgcgat 420 ggacttcgag gtgctttcat catttatgat cccgatgatc cgcataagaa tctatacgac 480 attgatgatg agtcgaccgt gattacactg gcggattggt accatgttcc tgcacgtgaa 540 gcgcccagaa tcccgcaatc gcaagcgacc ctaatcaatg gcaaaggccg atatctcaac 600 ggtccggcgg tccctctctc tgtaataaac gtgcagcagg gcaagcggta tcggttccgc 660 attatcgcca tgtcatgcga tcccagcttt gcgttttcta tcgatggtca caacttgacc 720 atcatcgaag ccgatggtga aaatactgct ccatgggttg ttgattctgt tcaggtctat 780 gccggacaac gatactcagc tttgcttgtg gctaaccaac caattggaaa ttactggatg 840 cgcgcagatc ctgattcgcg aggcttgcct ggcttcgatg gtggacgcaa ttctgctatc 900 ttgcgatacg ctggtgcacc agatgctgat ccgacaactg cacagacacc aaatgtccgc 960 ccgctcgtgg agacagattt gcatgctcta acggaccctg ctgcgcctgg cagaccggtc 1020 gtagggggcg cggatatggt tctaacattg aatctgaact tcgatttcaa aacctttact 1080 ttctccatca atggtgtgtc gtttaaacca ccgactacgc cggttctcct tcagatcctg 1140 agcggcgcaa agtcggctca agatttactt ccttctggaa gtctctacgc tctgccgccc 1200 aacaaggtca ttgagatcaa catacctggt cttccgtcct cattaggtgg tccccatccc 1260 ttccatcttc acggtcactc tttctctgtg atacgaagtg cgaacagtac ggcatataac 1320 tttgcaaacc ccgtccgccg tgatacagtc agtactggac tccacggctc caacacaact 1380 atccgcttcg tcactgataa tcctggacct tggttcttgc attgtcacat tgactggcac 1440 cttgatattg gcatgagtgt tgtcatggtc gaagatttcg gtgacattgc agcgaaagac 1500 ccagtgcctg atgcttggca gggtctctgt ccacgatatg attcctcgac actggaccag 1560 ccctga 1566 <210> 2 <211> 521 <212> PRT <213> Tricholoma matsutake <400> 2 Met Val Lys Leu Leu His Leu Leu Trp Phe Ser Ala Ser Leu Leu Trp 1 5 10 15 Arg Ser Thr Asp Ala Ala Ile Gly Pro Val Gly Asp Leu Val Ile Arg 20 25 30 Asn Ala Val Ile Ser Pro Asp Gly Phe Asp Arg Ser Ala Val Leu Pro 35 40 45 Gly Gly Thr Phe Pro Gly Pro Val Ile Arg Gly Asn Lys Gly Asp Arg 50 55 60 Phe Gln Ile Asn Val Val Asp His Leu Thr Asp Ala Thr Met Leu Arg 65 70 75 80 Ser Thr Ser Ile His Trp His Gly Ile Leu Gln Gln Lys Gln Ser Ser 85 90 95 Trp Ala Asp Gly Ala Ala Phe Ile Thr Gln Cys Pro Ile Ala Ala Gly 100 105 110 Asp Ser Phe Leu Tyr Asn Phe Arg Thr Ala Asp Gln Ala Gly Thr Phe 115 120 125 Trp Tyr His Ser His Leu Ser Thr Gln Tyr Cys Asp Gly Leu Arg Gly 130 135 140 Ala Phe Ile Ile Tyr Asp Pro Asp Asp Pro His Lys Asn Leu Tyr Asp 145 150 155 160 Ile Asp Asp Glu Ser Thr Val Ile Thr Leu Ala Asp Trp Tyr His Val 165 170 175 Pro Ala Arg Glu Ala Pro Arg Ile Pro Gln Ser Gln Ala Thr Leu Ile 180 185 190 Asn Gly Lys Gly Arg Tyr Leu Asn Gly Pro Ala Val Pro Leu Ser Val 195 200 205 Ile Asn Val Gln Gln Gly Lys Arg Tyr Arg Phe Arg Ile Ile Ala Met 210 215 220 Ser Cys Asp Pro Ser Phe Ala Phe Ser Ile Asp Gly His Asn Leu Thr 225 230 235 240 Ile Ile Glu Ala Asp Gly Glu Asn Thr Ala Pro Trp Val Val Asp Ser 245 250 255 Val Gln Val Tyr Ala Gly Gln Arg Tyr Ser Ala Leu Leu Val Ala Asn 260 265 270 Gln Pro Ile Gly Asn Tyr Trp Met Arg Ala Asp Pro Asp Ser Arg Gly 275 280 285 Leu Pro Gly Phe Asp Gly Gly Arg Asn Ser Ala Ile Leu Arg Tyr Ala 290 295 300 Gly Ala Pro Asp Ala Asp Pro Thr Thr Ala Gln Thr Pro Asn Val Arg 305 310 315 320 Pro Leu Val Glu Thr Asp Leu His Ala Leu Thr Asp Pro Ala Ala Pro 325 330 335 Gly Arg Pro Val Val Gly Gly Ala Asp Met Val Leu Thr Leu Asn Leu 340 345 350 Asn Phe Asp Phe Lys Thr Phe Thr Phe Ser Ile Asn Gly Val Ser Phe 355 360 365 Lys Pro Pro Thr Thr Pro Val Leu Leu Gln Ile Leu Ser Gly Ala Lys 370 375 380 Ser Ala Gln Asp Leu Leu Pro Ser Gly Ser Leu Tyr Ala Leu Pro Pro 385 390 395 400 Asn Lys Val Ile Glu Ile Asn Ile Pro Gly Leu Pro Ser Ser Leu Gly 405 410 415 Gly Pro His Pro Phe His Leu His Gly His Ser Phe Ser Val Ile Arg 420 425 430 Ser Ala Asn Ser Thr Ala Tyr Asn Phe Ala Asn Pro Val Arg Arg Asp 435 440 445 Thr Val Ser Thr Gly Leu His Gly Ser Asn Thr Thr Ile Arg Phe Val 450 455 460 Thr Asp Asn Pro Gly Pro Trp Phe Leu His Cys His Ile Asp Trp His 465 470 475 480 Leu Asp Ile Gly Met Ser Val Val Met Val Glu Asp Phe Gly Asp Ile 485 490 495 Ala Ala Lys Asp Pro Val Pro Asp Ala Trp Gln Gly Leu Cys Pro Arg 500 505 510 Tyr Asp Ser Ser Thr Leu Asp Gln Pro 515 520

Claims (4)

1. 서열번호 1의 유전자 서열을 갖는 라카아제 코딩 유전자.
2. 제1항에 있어서
   상기 유전자는 송이버섯(Tricholoma matsutake)에서 유래된 것을 특징으로 하는 것인, 유전자.
3. 서열번호 2의 아마노산 서열을 갖는 라카아제.
4. 제3항에 있어서
   상기 라카아제는 송이버섯(Tricholoma matsutake)에서 유래된 것을 특징으로 하는 것인, 라카아제.
   
   

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