ES2283412T3 - La mananasa del cafe. - Google Patents
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Abstract
El proceso para el tratamiento de las semillas de café, en el que se utiliza la proteína de acuerdo con el ID. de SEC. Nº:2.
Description
La mananasa del café.
La presente invención está relacionada con la
utilización fragmentos de DNA del café que codifican al menos una
enzima que está involucrada en la hidrólisis de polisacáridos que
consisten al menos en moléculas de manano simples o ramificadas
unidas entre ellas a través de un enlace
\beta(1\rightarrow4).
Los polisacáridos que contienen manosa
frecuentemente se encuentran en la pared celular de las plantas
superiores, en particular en las plantas leguminosas, y se considera
que son un depósito de carbohidratos en las semi-
llas.
llas.
En varias plantas, se ha encontrado que la
actividad endo-\beta-mananasa se
detecta principalmente en el endospermo de las semillas que
experimentan la germinación (Bewley, Trends Plant Sci 2,
464-469, 1997).
En la semilla del café, se encuentran
concretamente galactomananos. Estos representan aproximadamente el
24% del peso seco de la simiente (Bradbury y Halliday, J Agric Food
Chem 38, 389-392, 1990). Estos polisacáridos
consisten en una cadena lineal de residuos manosilo que están unidos
entre ellos a través de enlaces de tipo
\beta(1\rightarrow4) y a los que se unen monómeros de
residuos \alpha-galactosilo. También es conocido
que la enzima denominada
endo-\beta-mananasa (E.C 3.2.1.78)
es una hidrolasa que degrada los polímeros de
(1\rightarrow4)-\beta-manano,
facilitando así la salida de las radículas durante la germinación y
liberando pequeños oligosacáridos que entonces se utilizan como
fuente de energía para el crecimiento de la plántula.
En los procesos industriales, durante el
tratamiento del café, las moléculas de manano y sus derivados
constituyen una porción considerable de los sedimentos insolubles.
Además, la fracción de estas moléculas que se disuelve durante la
primera extracción (aproximadamente el 50%) también tiene una baja
solubilidad, y por lo tanto es responsable de la mayoría de
precipitaciones secundarias que aparecen durante los pasos
subsiguientes. En la patente PE 0676145A, se demuestra que es
posible hidrolizar los galactomananos del café utilizando una
mananasa inmovilizada extraída de Aspergillus niger.
La solicitud de PE Nº 98203742.6, en sí misma,
propone la utilización de fragmentos del DNA del café que codifican
al menos una endo-\beta-mananasa
que está involucrada en la hidrólisis de polisacáridos que consisten
al menos en moléculas de manano simples o ramificadas unidas entre
ellas a través de un enlace \beta(1\rightarrow4).
La WO 99/24588 está relacionada con la
preparación de un DNA de la
endo-\beta-mananasa de diferentes
frutos, lo que incluye el tomate, melón, melocotón, pepino y
nectarina o una semilla para el control de la maduración. El cDNA se
utiliza para la preparación de una secuencia antisentido útil para
el bloqueo de la expresión de la
endo-\beta-mananasa en el fruto
para retrasar la maduración.
Giorgini et al. (Bras. Fisiol. Veg.
8(1) (1996), 43-49) muestran que la actividad
de la enzima endo-\beta-mananasa
se correlaciona con el crecimiento de los cotiledones de las
semillas del café. La actividad de la enzima puede modularse
mediante la adición de diferentes promotores del crecimiento.
La PE 0 676 145 se centra en un proceso para el
hidrolizado de los galactomananos presentes en un extracto líquido
mediante la \beta-mananasa de Aspergillus
niger sobre un soporte.
Sin embargo, parece ventajoso el proporcionar
los métodos para el tratamiento de las semillas del café.
La presente invención está relacionada con un
proceso para el tratamiento de las semillas del café, en el que se
utiliza una proteína de acuerdo con el ID. de SEC. Nº:2.
La presente invención también está relacionada
con el proceso de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende los
pasos de
- sobreexpresar un DNA con el ID. de SEC. Nº:1
en un microorganismo, un hongo o en una célula vegetal no
diferenciada,
- purificar la enzima,
- tratar los sedimentos de las semillas de café
con la enzima para aumentar el rendimiento de la extracción o tratar
la solución de café con la enzima para reducir la sedimentación
debida a los mananos que gelifican.
Otro aspecto de la invención está relacionado
con un fragmento de DNA derivado del café que codifica al menos una
enzima involucrada en la hidrólisis de polisacáridos que consisten
al menos en moléculas de manano puras o ramificadas que están unidas
entre ellas a través de un enlace \beta(1\rightarrow4),
cuyo fragmento de DNA tienen la secuencia de ácido nucleico ID. de
SEC. Nº:1 o la de ácido nucleico de los nucleótidos 62 a 1312 de la
secuencia de ácido nucleico de ID. de SEC. Nº:1.
La presente invención también está relacionada
con un vector recombinante que comprende un fragmento de DNA de
acuerdo con 3.
Otro aspecto de la presente invención está
relacionado con una proteína derivada de las semillas del café, que
está codificada por un gen del café y está involucrada en la
hidrólisis de polisacáridos que consisten al menos en moléculas de
manano puras o ramificadas que están unidas entre ellas a través de
un enlace \beta(1\rightarrow4), y que tiene la secuencia
de aminoácidos de ID. de SEC. Nº:2.
La presente invención también está relacionada
con una célula vegetal que comprende, a través de un vector
recombinante, un fragmento de DNA de acuerdo con la presente
invención.
La presente invención también está relacionada
con una planta o semilla que consiste de células vegetales de
acuerdo con la presente invención.
La presente invención está relacionada con un
microorganismo que comprende, integrado en su genoma o mediante un
plásmido que puede replicarse, un fragmento de DNA de acuerdo con la
presente invención.
La Figura 1 representa un alineamiento de
proteínas de las
endo-\beta-mananasas de
Aspergillus aculeatus, Trichoderma reesei y Lycopersicon
esculentum (tomate) con la mananasa A (Marraccini y Rogers, Nº
PE 98203742.6) y la mananasa del café de acuerdo con la presente
invención (mananasa B).
La Figura 2 representa un esquema que hace
posible posicionar los oligonucleótidos sintéticos utilizados para
la amplificación de la proteína ManB madura que incluye un grupo de
colas de HIS en su extremo carboxiterminal
(C-ter).
La Figura 3 representa un mapa del plásmido
pDP580.
La Figura 4 representa un mapa del plásmido
pDP588.
La Figura 5 representa el análisis mediante
electroforesis en gel SDS-PAGE de la expresión de la
proteína ManB en E. coli, tras inducirla con la adición de
IPTG.
La Figura 6 representa un mapa del plásmido
pNFF296.
La Figura 7 representa un mapa del plásmido
pCY316.
El término "secuencia homóloga" pretende
significar cualquier secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos
con una función idéntica, que se diferencia de las secuencias de
acuerdo con la invención sólo por la sustitución, deleción o adición
de un pequeño número de bases de ácido nucleico o de aminoácidos,
por ejemplo de 1 a 500 pares de bases (pb) o de 1 a 150
aminoácidos.
En este contexto, dos secuencias de DNA que, a
causa de la degeneración del código genético, codifican el mismo
polipéptido se considerará que son particularmente homólogas. De
forma similar, dos proteínas funcionales que son reconocidas por el
mismo anticuerpo, siempre que la proporción entre los valores de
intensidad de reconocimiento de las dos proteínas por el anticuerpo
no sea superior a 100, por ejemplo, se considerará que son
homólogas.
También se considerará una secuencia homóloga
aquella secuencia con más de un 70% de homología con las secuencias
de acuerdo con la invención, en particular con más de un 80% o 90%.
En este último caso, la homología se determina mediante la
proporción entre el número de bases o de aminoácidos de una
secuencia homóloga que son idénticos a aquellos de la secuencia de
acuerdo con la invención, y el número total de bases o de
aminoácidos de dicha secuencia de acuerdo con la invención.
El término "fragmento que hibrida" pretende
significar cualquier fragmento capaz de hibridar con los fragmentos
de acuerdo con la invención mediante el método de Southern Blot
(Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1989, capítulos 9.31 a
9.58). Preferiblemente, la hibridación se realiza bajo condiciones
astringentes de tal modo que se evitan las hibridaciones
inespecíficas o relativamente inestables.
Finalmente, el término "fragmento" o
"fragmento de DNA" debe entenderse como un DNA de doble cadena
de origen cromosómico que puede sintetizarse, multiplicarse in
vitro por ejemplo mediante el conocido método denominado
"reacción en cadena de la polimerasa", o multiplicarse in
vivo en una bacteria de tipo Escherichia coli, por
ejemplo.
En el resto de la descripción, los Nº de ID. de
SEC. de las secuencias se refieren a las secuencias que se
proporcionan más adelante en el listado de secuencias. Los
oligonucleótidos sintéticos de ID. de SEC. Nº:6 a ID. de SEC. Nº:25
mencionados en la descripción y que se proporcionan más adelante en
el listado de secuencias han sido suministrados por Eurogentec (Parc
Scientifique du Sart Tilman [Parque científico de Sart
Tilman]-4102 Seraing-Bélgica).
Ha sido posible demostrar que toda o parte de la
secuencia de ID. de SEC. Nº:1. posibilita, de forma subsiguiente a
una transformación, la hidrólisis de polisacáridos que consisten al
menos en moléculas de manano puras o ramificadas que están unidas
entre ellas a través de un enlace \beta(1\rightarrow4),
en una célula huésped, como una célula vegetal o un
microorganismo.
La presente invención está relacionada con
cualquier fragmento de DNA con la secuencia de ácido nucleico de ID.
de SEC. Nº:1. Esta secuencia de ácido nucleico que codifica al menos
una enzima que está involucrada en la hidrólisis de polisacáridos
que consisten al menos en moléculas de manano puras o ramificadas
que están unidas entre ellas a través de un enlace
\beta(1\rightarrow4).
La enzima es preferiblemente una
endo-\beta-mananasa con la
secuencia de aminoácidos de ID. de SEC. Nº:2.
La invención está relacionada con el fragmento
de DNA delimitado por los nucleótidos de 62 a 1312 de la secuencia
de ácido nucleico de ID. de SEC. Nº:1.
La presente invención también está relacionada
con las nuevas enzimas codificadas por los genes de la secuencia de
ID. de SEC. Nº:1, en particular las secuencias que son homólogas a
éstos. Así, es posible concebir su utilización para modificar o
degradar tales polisacáridos in vitro, por ejemplo. Para
ello, es preferible purificar al menos una de estas enzimas,
mediante la sobreexpresión de su gen en una bacteria y su
aislamiento de forma convencional, mediante precipitación y/o
cromatografía del medio de cultivo, por ejemplo.
Además, también es sujeto de la presente
invención una proteína derivada de la semilla del café, que está
codificada por un gen del café y que está involucrada en la
hidrólisis de polisacáridos que consisten al menos en moléculas de
manano puras o ramificadas que están unidas entre ellas a través de
un enlace \beta(1\rightarrow4), y que presenta la
secuencia de aminoácidos de ID. de SEC. Nº:2.
Otro sujeto de la presente invención está
relacionado con el proceso de hidrólisis de polisacáridos que
consisten al menos en moléculas de manano puras o ramificadas que
están unidas entre ellas a través de un enlace
\beta(1\rightarrow4), en los que (1) un fragmento de DNA
que codifica las enzimas de acuerdo con la invención se clona en un
vector, y dicho vector también comprende una secuencia que permite
su replicación autónoma o integración en una célula huésped, (2) una
célula huésped se transforma con dicho vector, y luego (3) la célula
huésped transformada se cultiva bajo condiciones adecuadas para la
hidrólisis de tales polisacáridos.
La presente invención por lo tanto abre la
posibilidad de utilizar fragmentos de DNA de acuerdo con la
invención para modificar la producción de polisacáridos que
consisten al menos en moléculas de manano puras o ramificadas que
están unidas entre ellas a través de un enlace
\beta(1\rightarrow4) en una célula huésped, en particular
en una célula de la semilla del café. Así, es posible concebir la
expresión o sobreexpresión de DNA de acuerdo con la invención, en
una célula de la semilla del café, para producir tales polipéptidos
con los que se pretende modificar el aroma y la estructura de las
semillas del café, por ejemplo.
Finalmente, la presente invención también
proporciona nuevas enzimas involucradas en la hidrólisis de tales
polisacáridos. Estas enzimas pueden utilizarse de forma ventajosa
para sintetizar o modificar tales polisacáridos, in
vitro.
vitro.
La presente invención también está relacionada
con una célula vegetal que comprende, mediante un vector
recombinante, un fragmento de DNA con la secuencia de nucleótidos de
ID. de SEC. Nº:1, o un fragmento de DNA que comprende los
nucleótidos de 62 a 1312 de la secuencia de nucleótidos de ID. de
SEC. Nº:1.
La célula vegetal es preferiblemente una célula
de café.
La presente invención también está relacionada
con cualquier planta o cualquier semilla que consiste en células
vegetales que comprenden, mediante un vector recombinante, un
fragmento de DNA con la secuencia de nucleótidos de ID. de SEC.
Nº:1, o un fragmento de DNA que comprende los nucleótidos de 62 a
1312 de la secuencia de nucleótidos de ID. de SEC. Nº:1.
También es sujeto de la presente invención
cualquier microorganismo que comprenda, integrado en su genoma o
mediante un plásmido que puede replicarse, un fragmento de DNA de
acuerdo con la invención de forma que se exprese al menos una enzima
involucrada en la hidrólisis de polisacáridos que consisten al menos
en moléculas de manano puras o ramificadas que están unidas entre
ellas a través de un enlace \beta(1\rightarrow4).
Finalmente, la presente invención está
relacionada con un proceso para el tratamiento de las semillas de
café, en el que se utiliza la proteína de acuerdo con la invención.
En particular, es posible utilizar la proteína de acuerdo con la
invención para aumentar el porcentaje de sólidos extraídos durante
el tratamiento de las semillas de café. Así, utilizando la proteína
de acuerdo con la invención es posible aumentar el rendimiento de la
extracción reduciendo al mismo tiempo la cantidad de sedimento.
Tras la sobreexpresión del fragmento de DNA de
acuerdo con la invención en un microorganismo, en un hongo o en una
célula vegetal no diferenciada, los sedimentos pueden tratarse con
la enzima más o menos purificada, de forma que se aumenta el
rendimiento de la extracción.
Tras la sobreexpresión del fragmento de DNA de
acuerdo con la invención en un microorganismo, en un hongo o en una
célula vegetal no diferenciada, también es posible tratar la
solución de café, de forma que se reduce la sedimentación debida a
los mananos que gelifican.
La presente invención se describe en más detalle
más adelante, con la ayuda de una mayor descripción a continuación y
que se refiere a ejemplos de la producción de los fragmentos de DNA,
de los plásmidos recombinantes y de las bacterias transformadas de
acuerdo con la invención. No es necesario decir, sin embargo, que
estos ejemplos se proporcionan como una ilustración del sujeto de la
invención, para la cual no constituyen en modo alguno una
limitación. La manipulación del DNA, el clonaje y la transformación
de células bacterianas se realizaron, si no se dan
instrucciones de lo contrario, de acuerdo con los protocolos
descritos en el manual de Sambrook et al. mencionado
anteriormente. Los porcentajes se proporcionan en peso, a no ser que
se indique de otro modo.
Las semillas de la variedad Coffea
arabica var. caturra 2308 se recogieron en su etapa madura, se
despulparon y se secaron durante tres días a temperatura ambiente. A
continuación, se eliminó la piel apergaminada de las semillas y
éstas se secaron y luego se esterilizaron para ser germinadas en un
cultivo in vitro. Para ello, éstas se sitúan en Rovral (al
0,12% v/v) durante 1 hora, se enjuagan con agua estéril, se sumergen
durante 1 hora en una solución de hipoclorito cálcico (al 6% p/v) a
los que se han añadido unas gotas de emulsificante Teepol, y luego
se enjuagan 4 veces con agua estéril antes de cultivarse en tubos de
ensayo sobre un medio de agar-agua. La germinación
ocurre a 25°C en presencia de luz. El momento en el que las semillas
se sitúan en el lecho de agar se considera el día tras el lavado
cero (DTL = 0).
Los grupos de semillas se recogen entonces en
diferentes momentos de la germinación (DTL 7, 14, 21, 28), y luego
se sumergen en nitrógeno líquido. A continuación, el polvo se
homogeniza, con una proporción de 1 g por cada 5 ml, en un tampón de
extracción (fosfato-citrato 200/l00 mM, pH 5,0,
meta-bisulfito 10 mM, Na_{2}S_{2}O_{5}, EDTA 5
mM y una tableta/ 50 ml de inhibidor de proteasas "completo"
[Nº Cat. 1 836 145, Roche Diagnostics GmbH, Sandhofer Strasse 116,
Mannheim, Alemania] 1 tableta/50 ml), durante 20 min. a 4°C.
Entonces el homogeneizado se centrifuga a 12000 g durante 20 min. a
4°C, y el sobrenadante se recoge y se centrifuga una segunda vez.
Entonces el sobrenadante, que corresponde al extracto enzimático
crudo, se reparte en alícuotas y se congela a -80°C.
La actividad enzimática de la
endo-\beta-mananasa se analizó de
acuerdo con el siguiente método. Un extracto enzimático crudo de 400
\mul se añade a 1,6 ml de tampón de reacción (NaCl 100 mM, acetato
sódico 200 mM, pH 5,0) que contiene sustrato insoluble
AZCL-galactomanano (Nº cat. I-AZGMA,
Megazyme International Ireland Ltd., Bray Business Park, Bray Co.,
Wicklow, Irlanda) en una cantidad final del 1% p/v. La reacción se
inicia al añadir el extracto, y tiene lugar a 37°C en agitación.
Para calcular la pendiente inicial de la reacción, se recoge una
alícuota de 400 \mul de medio cada 15 min. durante 1 h, se
calientan a 100º durante 5 min. y luego se centrifugan a
12000\cdotg durante 2 min. La densidad óptica del sobrenadante se
mide a 590 nm y la actividad específica se expresa en UA (unidades
de absorción óptica), min^{-1}.mg proteína-^{1},
tras analizar la concentración de proteína en cada extracto mediante
el método de Bradford (Bradford, Anal. Biochem. 72,
248-254, 1976). Por lo tanto, se detectó que la
actividad es virtualmente cero durante los primeros 14 días tras el
lavado (DTL), y subsiguientemente aumenta de forma gradual hasta un
pico máximo alrededor de los 28 DTL. Tras 28 DTL, la actividad
descendió lentamente.
De acuerdo con los resultados descritos
anteriormente, se continúa la estrategia de purificación utilizando
16 ml de un extracto crudo de enzima de 28-DTL con
una actividad de alrededor de 0,2 AU.min^{-1}.mg
proteína-^{1} x 10-^{2}, un
contenido total de proteína de aproximadamente 48 mg y una actividad
total de 9,6 AU.min-^{1} x
10-^{2}.
Inicialmente, el extracto crudo enzimático se
fraccionó mediante una precipitación con sulfato amónico a 4°C. El
sulfato amónico se añade lentamente en agitación hasta que se
obtienen un nivel de saturación del 35%, y entonces la solución se
centrifuga a 12.000 g y a 4°C durante 20 min. El botón así obtenido
se recoge en un mínimo (1 ml) de tampón de extracción (véase
anteriormente). En este extracto, la concentración de proteína es de
aproximadamente 10 mg.ml-^{1}. La actividad
específica de la
endo-\beta-mananasa es de 0,9
AU.min^{-1}.mg-^{1} x 10-^{2},
que corresponde a un enriquecimiento de 4 veces de la enzima
respecto del extracto crudo y una recuperación de 10 AU.min^{-1}
de la actividad total, es decir el 100%.
La muestra descrita anteriormente se separa
entonces en una columna de interacción hidrofóbica (Hiload HR 16/10
de fenilsefarosa de alto rendimiento, Amersham Pharmacia Biotech UK
Ltd, Amersham place, Little Chalfont, Buckinghamshire, HP7 9NA,
Inglaterra). La columna se preequilibró con un tampón de equilibrado
(fosfato sódico 50 mM, sulfato amónico 400 mM, pH 7,0). Entonces se
inyectó la muestra (1 ml) en la columna, que luego se lavó con 5
volúmenes de columna de tampón de equilibrado. Se aplicó un
gradiente de 0 a 99,5% de agua en 0,5 volúmenes de columna, seguido
de otro de 99,5 a 100% en 5 volúmenes de columna. La actividad se
concentró principalmente en tres fracciones, que se utilizaron para
continuar con la purificación. El rendimiento de purificación de
este paso está alrededor del 80% respecto al paso previo. La
actividad específica es de 27AU.min^{-1} .mg^{-1}, es decir un
enriquecimiento de aproximadamente 137 veces respecto al extracto
crudo. La actividad total recuperada es de aproximadamente 9
AU.min^{-1} x 10^{-2}, es decir un 90% de la actividad
inicial.
Las tres fracciones descritas anteriormente se
mezclaron y se concentraron y el tampón se cambió utilizando tubos
Ultrafree (Millipore, Bedford, MA, USA, centrifugación a 4 000 g
máximo). El volumen recuperado es de 1 ml. Esta muestra se inyectó
en una columna de intercambio aniónico Resource Q (Amersbam
Pharmacia Biotech Inglaterra) preequilibrada con un tampón de
Tris/HCl 20 mM, pH 8,0. La elución se llevó a cabo con un gradiente
lineal de NaCl entre 0 y 1 M en 20 volúmenes de columna. La
actividad total recuperada está presente exclusivamente en dos
fracciones. El rendimiento de la purificación de este paso es del
58% respecto al paso anterior. La actividad específica es de 167
AU.min-^{1} .mg^{-1}, es decir, un
enriquecimiento de aproximadamente 836 veces respecto al extracto
bruto. La actividad total de recuperación es de 0,9 AU.min^{-1},
es decir, aproximadamente un 9% de la actividad inicial.
Las dos fracciones recuperadas de la columna de
intercambio aniónico se concentraron a 100 \mul mediante
centrifugación a 4000 g utilizando los tubos Ultrafree (Millipore
Co, 80 Ashby Road, Bedford, MA, USA). Esta muestra se inyectó en una
columna Superdex 75 HR 10/30 (Amersham Pharmacia Biotech,
Inglaterra) preequilibrada con un tampón de fosfato sódico 50 mM,
NaCl 150 mM, pH 7,0. Las proteínas se eluyeron con el mismo tampón,
con una tasa de flujo de 0,3 ml.min^{-1}. Se preparó una curva de
calibración para la columna bajo las mismas condiciones utilizando
estándares de peso molecular. La actividad
endo-\beta-mananasa se distribuyó
en dos fracciones, correspondientes a un peso molecular de entre 40
y 55 kDa. El rendimiento de la purificación de este paso final es
del 48%. La actividad específica es de aproximadamente 1400
AU.min^{-1}.mg^{-1} es decir, un enriquecimiento de
aproximadamente 7000 veces respecto al extracto bruto. La actividad
total es de 0,45 AU.min^{-1}., es decir el 4,5% de la actividad
inicial.
Las fracciones descritas anteriormente con
actividad enzimática a la salida de la columna se analizaron durante
la purificación mediante electroforesis bidimensional. Para realizar
este paso, se mezclaron las fracciones y se concentraron hasta 20
\mul mediante centrifugación en los tubos Ultrafree (Millipore,
USA) como se ha descrito antes. A este volumen se añadieron 105
\mul del tampón de rehidratación (urea 8 M, CHAPS 3% p/v,
anfolinas 0,8% v/v, DTT 1% p/v), y se rehidrató una tira no lineal
de gel de 7 cm (pH 3,0 a 10,0) (Immobiline Dry Strip, Amersham
Pharmacia Biotech, Inglaterra) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Las proteínas se separaron entonces como una función de
su punto isoeléctrico (pI) utilizando, por ejemplo, el sistema
IPGphore (Amersham Pharmacia Biotech, Inglaterra), empleando un
número total de 14000 volt-horas.
Tras la separación de las proteínas en función
de su pI, éstas se separaron entonces en una segunda dimensión de
acuerdo a sus pesos moleculares. Esta separación se llevó a cabo de
acuerdo con las recomendaciones de Hochstrasser et al. (Anal.
Biochem, 173, 412-423, 1989) y de Gorg et
al. (Electrophoresis, 8, 122-124, 1987).
Así, la tira de gel de la primera dimensión se equilibró en una
primera solución, (urea 6 M, glicerol 30% v/v, SDS 2% p/v, PTT 2%,
Tris-HCl 50 mM, pH 8,0) durante 5 min., y luego se
equilibró en una segunda solución (urea 6 M, glicerol 30% v/v, SDS
2% p/v, yodoacetamida 2,5% p/v, Tris-HCl 50 mM, pH
8,0) durante 10 min. La tira de gel se cargó entonces en un gel de
acrilamida en gradiente a una concentración del
10-20% (dimensiones 1,0 x 10 x 0,75 cm) en un único
pocillo, y se cubrió con una solución de agarosa (agarosa 1% p/v,
SDS 0,5% p/v, trazas de azul de bromofenol) precalentada a 90°C y
mantenida a 40°C. El gel se montó en un sistema de electroforesis
vertical y se sometió a un voltaje de 170 V durante 2 h. Tras la
migración, las proteínas se tiñeron con plata de acuerdo con el
método de Bjellqvist et al. (Electrophoresis, 14,
1357-1365, 1993). El perfil de la mezcla de las tres
fracciones finales obtenidas de esta manera muestran la presencia de
un grupo único de proteínas que consiste de una línea de 5 proteínas
con el mismo peso molecular aproximado de 42 kDa, pero con pequeñas
diferencias en el pI, entre 5,5 y 6. Esta estimación de pI se
confirma por el hecho de que la actividad
endo-\beta-mananasa se eluyó a
partir de una columna de cromatoenfoque (mono P HR 5/5 - Amersham
Pharmacia Biotech, Inglaterra) a un pH de 5,7 (resultados no
mostrados) y también mediante la estimación del pI teórico (5,8) de
la proteína madura (ver a continuación).
Las proteínas purificadas de esta manera se
analizaron mediante microsecuenciación de los aminoácidos. Para
realizar este paso, se transfirieron a una membrana de PVDF
("Problot", Perkin Elmer Applied Biosystems Division, 850
Lincoln Center Drive, Foster City, CA 94404, USA) utilizando, por
ejemplo, una cubeta de transferencia Trans-Blot
(Bio-Rad, 2000 Alfred Drive, Hercules, California
94547, USA). Así, tras la separación de la segunda dimensión, el gel
se recuperó y se agitó en una solución de transferencia (metanol al
10% v/v, NaOH-CAPS 10 mM, pH 11,0) durante 10 min.
Durante este tiempo, se humedecieron dos soportes de espuma, dos
piezas de papel Whatman y una membrana de
PCDF-Problot (Perkin Elmer Applied Biosystem, USA)
en la misma solución. El gel, la membrana y los soportes se montaron
en el sistema Trans-Blot de acuerdo con las
instrucciones del fabricante (Bio-Rad, USA), y la
transferencia se llevó a cabo bajo una corriente de 100 V durante
una hora a una temperatura de 4°C. Al final de la transferencia, las
proteínas transferidas a la membrana se revelaron con una tinción
ligera de azul de Coomassie de acuerdo con las instrucciones del
fabricante de la membrana problot. Las diferentes proteínas se
recortan de la membrana, se mezclan y se secuencian juntas. La
secuenciación N-terminal de las proteínas
purificadas y de los péptidos internos se lleva a cabo con un
secuenciador automático Beckmann (Beckmann Instruments Inc., 250
Harbor Boulevard Box 3100, Fullerton, California, 92634 USA) de
acuerdo con los métodos descritos en Teixeira et al.
(Electrophoresis, 18, 156-162,1997).
Se obtuvieron tres secuencias mediante este
método; una secuencia N-terminal de 22 aminoácidos,
llamada ID. de SEC. Nº:3, y otras dos correspondientes a péptidos
internos independientes, obtenidos mediante digestión con tripsina,
de 10 y 17 aminoácidos, respectivamente, descritos en las secuencias
ID. de SEC. Nº:4 y 5.
Ninguna de las secuencias obtenidas presentan
ambigüedades y muestran que las tres proteínas, que se acaban de
describir, son isoenzimas de la
endo-\beta-mananasa que comparten
una secuencia que es idéntica en las regiones analizadas. Las
secuencias ID. de SEC. Nº:3, 4 y 5.corresponden respectivamente a
los residuos 41 a 62, 99 a 108 y 265 a 281 de la secuencia ID. de
SEC. Nº:2.
Las semillas de café (Coffea arabica var.
caturra 2308) se recogieron en el estadío maduro y germinaron in
vitro tal como se ha descrito antes.
Los RNA totales de las semillas se extraen tras
22 días de germinación (DTL 22). Para realizar esto, la semilla se
sumerge rápidamente en nitrógeno líquido y el polvo obtenido se
resuspende en 8 ml de tampón a pH 8,0 que contiene Tris HCl 100 mM,
SDS al 0,1% p/v y \beta-mercaptoetanol al 0,5%
v/v, se homogeneizó con un volumen de fenol saturado con Tris HCl
100 mM, pH 8,0, y luego se centrifugó a 12000 g durante 10 min. a
4ºC, hasta extraer la fase acuosa, que se centrifugó (i) una vez con
un volumen equivalente de fenol, (ii) dos veces con un volumen
equivalente de fenol:cloroformo (1:1) y (iii) dos veces con un
volumen equivalente de cloroformo (Rogers et al., Plant
Physiol. Biochem. 37, 261-272, 1999).
Los ácidos nucleicos totales se precipitaron
durante 1 h a -20°C mediante la adición a la fase acuosa de 1/10 del
volumen de acetato sódico 3 M, pH 5,2, y 2,5 volúmenes de
etanol.
La mezcla resultante se centrifugó entonces a
12000 g durante 30 min. a 4°C, y el botón se recogió en 10 ml de
H_{2}O, antes de reprecipitar los ácidos nucleicos en presencia de
LiCl (final 2 M) y de etanol (2,5 volúmenes).
Tras la centrifugación, el botón de los RNA
totales se recogió en 1 ml de H_{2}O, y se digirió durante 1 h a
37°C con DNAsa RQ1 (Promega Corporation, 2800 Woods Hollow Road,
Madison, Wisconsin 53711 USA) para eliminar cualquier resto de DNA,
y después el RNA total se desproteinizó tratándolo con fenol y
cloroformo, antes de precipitarlo en presencia de acetato sódico tal
como se ha descrito antes.
El RNA total se recogió en 500 \mul de
H_{2}O, y se cuantificó mediante ensayo espectrofotométrico a 260
nm. La calidad se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa
en presencia de formaldehído.
Para realizar este paso, los RNA mensajeros
(mRNA) poli A+ se purificaron a partir de 500 \mug de RNA total
utilizando el sistema de purificación Oligotex-dT
(Qiagen INC., 9600 De Soto Avenue, Chatsworth, California, 91311
USA), y después se evaluó la cantidad de RNA mensajero utilizando el
equipo de DNA Dipstick (InVitrogen BC. De Schelp 12, 9351 NV Leek,
Holanda).
La síntesis de DNA complementario (cDNA),
necesario para construir las bibliotecas, se llevó a cabo de acuerdo
con las recomendaciones proporcionadas con el equipo ``Riboclone
cDNA synthesis system M-MLV (H-) (Promega, USA), con
la excepción del paso de ligación del enlazante EcoRI. Esto
hace posible clonar estos cDNA directamente en la única diana
SrfI del vector pPCR-Script Amp SK(+)
(Stratagene, 11011; North Torrey Pines Road, La Jolla, California
92037, USA). La eficacia de esta reacción de síntesis de cDNA se
monitoriza añadiendo alfa-(^{32}P)-dCTP durante la
síntesis de las dos cadenas de DNA.
Tras su migración en un gel de agarosa alcalino
(Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1989), se estimó que la
longitud de los cDNA recién sintetizados estaba en un rango de entre
0,2 y más de 4,3 kb. Las cuantificaciones, utilizando el equipo DNA
SS Dipstick (InVitrogen, Holanda), mostraron que se sintetizan
aproximadamente 100 ng de cDNA a partir de 1 \mug de mRNA.
Los cDNA ligados al vector
pPCR-Script Amp SK(+) (Stratagene, USA) se
utilizaron para transformar la cepa de Escherichia coli
(E. coli) XL2-Blue MRF' (Stratagene, USA).
Las bacterias que contenían vectores recombinantes se seleccionaron
en placas con medio LB (Luria-Bertani) que contiene
100 \mug.ml^{-1} de ampicilina, y en presencia de IPTG y de
X-Gal (Sambrook et al., 1989). Los plásmidos
de esta biblioteca de cDNA se extraen entonces tras un cultivo de
toda la noche, que corresponde a una mezcla de transformantes, en
presencia de 25 ml de medio LB que contiene 100 \mug.ml^{-1} de
ampicilina, y utilizando el equipo "QiaFilter Plasmid MidiKit"
(Qiagen INC., USA).
Esta biblioteca de cDNA de semillas de
germinación se probó mediante PCR utilizando oligonucleótidos
sintéticos deducidos del resultado de la secuenciación
N-terminal e interna de la mananasa purificada.
Se utilizaron los oligonucleótidos sintéticos
degenerados MAN 202, con la secuencia de ácidos nucleicos de ID. de
SEC. Nº:6, y MAN 203, que posee la secuencia de ácidos nucleicos de
ID. de SEC. Nº:7. El oligonucleótido sintético MAN 202 corresponde a
los aminoácidos de 9 a 14 (GTEFVM) de la secuencia
N-terminal (ID. de SEC. Nº:3) de la mananasa
purificada. El oligonucleótido sintético MAN 203 corresponde a la
secuencia complementaria que codifica los aminoácidos WAFSDG
localizados en la posición de 2 a 7 del péptido interno de la
mananasa purificada, correspondiente a la secuencia de ID. de SEC.
Nº:4.
La reacción de PCR se llevó a cabo en presencia
de 10 ng de plásmido a partir de la biblioteca de cDNA, en un
volumen final de 50 \mul que contenía KCl 50 mM,
Tris-HCl 10 mM, pH 8,8, MgCl_{2} 1,5 mM, gelatina
0,1 mg.ml^{-1}, 0,2 mM de cada dNTP, 0,25 \muM de cada
oligonucleótido (MAN 202 y 203) y 3 unidades de polimerasa de DNA
Taq (Stratagene, USA). Se utilizó el aparato de PCR
Robocycler 96 (Stratagene, USA) equipado con una tapa
calefactada, y las reacciones se incubaron durante 35 ciclos
(94°C - 1 min., 45°C - 1 min. 30 s, 72°C - 2 min.) seguido de una
extensión final a 72°C durante 7 min. Al final de esta reacción, se
obtuvo un único producto de PCR de aproximadamente 170 pb de
longitud, que se ligó directamente en el vector
pGEMT-easy, de acuerdo con las recomendaciones del
fabricante (Promega, USA). La ligación se utilizó entonces para
transformar la cepa de E. coli XL2-Blue MRF'
(Stratagene, USA). Las bacterias que contenían vectores
recombinantes se seleccionaron en placas de medio LB que contenían
100 mg.ml^{-1} de ampicilina, y en presencia de IPTG y de
X-Gal (Sambrook et al., 1989).
Al final de la transformación, se aisló un clon
que contenía el fragmento de 170 pb del cDNA clonado en la diana
SfrI del vector pPCR-Script Amp SK(+)
(Stratagene, USA). Este producto de PCR se secuenció entonces de
acuerdo con el protocolo del "equipo de secuenciación T7"
(Amersham Pharmacia Biotech, Inglaterra), en presencia de
alfa(^{35}S)-dATP. El análisis de esta secuencia mostró que se localiza entre los nucleótidos 206 y 375 de la secuencia de ID. de SEC. Nº:1 y está flanqueada, en sus extremos 5' y 3', por las secuencias correspondientes a los oligonucleótidos MAN 202 y 203. De este análisis, se deduce que este producto de PCR corresponde a un fragmento de cDNA que codifica de forma efectiva la endo-\beta-mananasa del café que se purificó y se secuenció como se ha definido antes. También se debe notar que este cDNA es diferente del que se clonó en el laboratorio (EP Nº 98203742.6), que sugiere la existencia de una familia de múltiples genes que codifican la endo-\beta-mananasa del café.
alfa(^{35}S)-dATP. El análisis de esta secuencia mostró que se localiza entre los nucleótidos 206 y 375 de la secuencia de ID. de SEC. Nº:1 y está flanqueada, en sus extremos 5' y 3', por las secuencias correspondientes a los oligonucleótidos MAN 202 y 203. De este análisis, se deduce que este producto de PCR corresponde a un fragmento de cDNA que codifica de forma efectiva la endo-\beta-mananasa del café que se purificó y se secuenció como se ha definido antes. También se debe notar que este cDNA es diferente del que se clonó en el laboratorio (EP Nº 98203742.6), que sugiere la existencia de una familia de múltiples genes que codifican la endo-\beta-mananasa del café.
Para poder aislar el cDNA completo de la
endo-\beta-mananasa del café, se
llevaron a cabo una serie de reacciones de PCR, utilizando esta vez
oligonucleótidos sintéticos que son específicos y deducidos de la
secuencia del producto de PCR de 170 pb previamente clonada. Para
esto, se utilizaron los oligonucleótidos MAN 214, con la secuencia
de ácidos nucleico de ID. de SEC. Nº:8, y MAN 215, con la secuencia
de ácido nucleico de ID. de SEC. Nº:9. Los oligonucleótidos
sintéticos MAN 214 y 215 corresponden, respectivamente, a los
nucleótidos de 307 a 325 y de 307 a 290 de la secuencia con ID. de
SEC. Nº:1 y están posicionados de 5' a 3' en esta misma
secuencia.
Estas reacciones de PCR utilizan 10 ng de la
biblioteca de cDNA cribada anteriormente, los oligonucleótidos MAN
214 y 215, y los oligonucleótidos universales T3 y T7 específicos
para el vector de clonaje pPCR-Script Amp SK(+)
(Stratagene, USA), que corresponden a las secuencias de ID. de SEC.
Nº:10 y 11, respectivamente. Estos cebadores se localizan a
aproximadamente 100 pb de la diana de clonaje SfrI del vector
pPCR-Script Amp SK(+), a cada lado. Las reacciones
de PCR se incubaron, de acuerdo con las condiciones descritas
anteriormente, con los siguientes parámetros: 40 ciclos de
amplificación (94°C - 1 min., 50°C - 1 min. 30 s, 72°C - 3 min.)
seguidos de una extensión final a 72°C durante 7 min.
Tras la migración de los productos de PCR sobre
gel de agarosa, se observó la presencia de un fragmento de DNA de
aproximadamente 400 pb amplificado durante la reacción de MAN
215-T3 y de un fragmento de DNA de aproximadamente
1,2 Kb amplificado durante la reacción de MAN
214-T7. Estos fragmentos se clonaron
independientemente en el vector pGEMT-easy (Promega,
USA), y después se secuenciaron en ambas cadenas (Eurogentec Bel
s.a.- Parc Scientifique du Sart Tilman [Parque Científico de Sart
Tilman] - 4102 Seraing-Bélgica). El análisis de las
secuencias de ácido nucleico muestra que el producto amplificado de
PCR mediante los oligonucleótidos MAN 215-T3
comprende los primeros 307 nucleótidos de la secuencia de ID de SEC.
Nº:1, mientras que el producto de PCR amplificado mediante los
oligonucleótidos MAN 214-T7 comprende las últimas
1180 bases de la secuencia de ID. de SEC. Nº:1., y también una cola
de 26 residuos poli A+ que no se muestra en la secuencia de ID.
de
SEC. Nº:1.
SEC. Nº:1.
Para poder aislar el cDNA de longitud completa
de la mananasa del café correspondiente a la secuencia ID. de SEC.
Nº:1, se llevó a cabo una reacción de PCR utilizando 20 ng de la
biblioteca de DNA de plásmidos y los oligonucleótidos sintéticos MAN
300 y 301. Estos cebadores corresponden, respectivamente a las
secuencias de ID. de SEC. Nº:12 y 13, y están localizadas en los
extremos 5' y 3' respectivamente, de la secuencia de ID. de SEC.
Nº:1. Se decidió que el cebador MAN 301 estuviera localizado justo
antes de la cola poli A+ presente en el fragmento de PCR amplificado
con los oligonucleótidos MAN 214-T7. Esta reacción
de PCR se llevó a cabo en un volumen final de 50 \mul que contiene
10 ng de plásmido de la biblioteca de cDNA (DTL = 22), KCl 10 mM,
(NH_{4})_{2}SO_{4} 6 mM, Tris-HCl 20
mM, pH 8, Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 2 mM, 0,2
mM de cada dNTP, BSA 10 \mug/ml, 0,25 \muM de cada
oligonucleótido y 3 unidades de polimerasa de DNA Pfu
(Stratagene, USA). La reacción se incubó durante 45 ciclos (94°C - 1
min., 45°C - 1 min. 30 s, 72°C 3 min.) y seguido por una extensión
final a 72°C durante 7 min.
Al final de esta reacción, se amplificó un
fragmento único de aproximadamente 1500 pb, que se clonó en el
vector pPCR Script Amp SK(+), y después se secuenció en ambas
cadenas. Su secuencia corresponde a la secuencia de ID. de SEC.
Nº:1. Por comparación con los bancos de datos, se deduce que este
cDNA está completo y que efectivamente codifica una
endo-\beta-mananasa que comprende
las secuencias de proteína de ID. de SEC. Nº:3 a 5 obtenidas
previamente de la purificación de la
endo-\beta-mananasa. Se resalta
también que este cDNA es diferente del que se clonó en el
laboratorio (EP Nº 98203742.6). Por lo tanto, éste constituye un
nuevo cDNA que codifica la
endo-\beta-mananasa del café que
se purificó como se ha descrito antes. También debe notarse que esta
secuencia de ID. de SEC. Nº:1 contiene, sin ninguna diferencia de
nucleótidos, todas las secuencias de los intermediarios clonados
aislados previamente durante las amplificaciones de PCR de la
biblioteca de cDNA en germinación.
El análisis de la secuencia de ácidos nucleicos
muestra que este cDNA de longitud completa contiene una secuencia de
61 pb transcrita pero no traducida, en su extremo 5' y una secuencia
de 174 pb transcrita pero no traducida, en su extremo 3'. No
presenta cola poli A+ en su extremo 3' ya que el oligonucleótido
sintético MAN 301 utilizado anteriormente se escogió precisamente en
posición anterior a esta secuencia. Dentro de esta secuencia
transcrita pero no traducida, se observó la presencia de motivos
ricos en AT que se cree que están involucrados en los mecanismos de
poliadenilación. También se ha detectado la presencia de varias
secuencias repetidas invertidas y directas, que pueden estar
involucradas en los mecanismos de estabilidad de los mensajeros de
RNA, o de la eficacia de la traducción, por ejemplo (Gallie, Plant
Mol Biol, 32 145-158, 1996).
La secuencia ID. de SEC. Nº:1 contiene un marco
abierto de lectura de 417 codones (1251 bases), que comienza con el
codón ATG en la posición 62 y termina con el codón TAA (A en la
posición 1312). También se ha detectado la presencia de un segundo
codón de iniciación de la traducción en la posición 65 de la
secuencia de ID. de SEC. Nº:1. La proteína deducida de este DNA
complementario posee un peso molecular teórico de 46794 Da y un pI
teórico de 7,8. También posee un segmento de proteína hidrofóbica
que corresponde aproximadamente a los primeros 30 aminoácidos de la
secuencia de ID. de SEC. Nº:2. Esta secuencia de proteína puede
corresponder a un péptido señal que contiene los 40 aminoácidos de
la secuencia de ID. de SEC. Nº:1 en posición anterior a la secuencia
de ID. de SEC. Nº:3 y que se corresponde con la secuenciación
N-terminal de la enzima purificada. En este caso, el
peso molecular de la proteína se espera que sea de 42616 Da en su
forma madura, es decir, que corresponda a los últimos 376
aminoácidos de la secuencia de ID. de SEC. Nº:2. En este caso, se
estima que su pI esté cerca de 5,8. Estos datos coinciden con los
observados durante la purificación de la proteína (véase Ejemplo: 2,
\ding{168} 5).
También se ha detectado la existencia de varios
sitios potenciales de glicosilación (Asn/X/Ser o Thr). El primero
está localizado en el potencial péptido señal, en la posición 35 a
37 de la secuencia de ID. de SEC. Nº:2, y se presume por lo tanto
que está ausente en la forma madura de la mananasa. El segundo está
localizado en posición C-terminal, en la posición
398 y 400 de la secuencia de ID. de SEC. Nº:2.
Debe notarse que las secuencias de ID. de SEC.
Nº:3 a 5, que corresponden a la secuenciación de proteína llevada a
cabo utilizando la proteína purificada, se encuentran, sin
ambigüedades, dentro de la proteína (ID. de SEC. Nº:2) deducida de
la secuencia de ID. de SEC. Nº:1. Por ejemplo, la secuencia de ID.
de SEC. Nº:3 corresponde a los aminoácidos 41 a 62 del ID. de SEC.
Nº: 2. De forma similar, se ha encontrado que las secuencias de ID.
de SEC. Nº:4 y 5 corresponden respectivamente a los aminoácidos 99 a
108 y 265 a 281 del ID. de SEC. Nº:2. Las secuencias de los ID. de
SEC. Nº:4 y 5 están, además, precedidas, respectivamente, por los
aminoácidos R (posición 98 del ID. de SEC. Nº:2) y K (posición 264
del ID. de SEC. Nº:2) reconocidos por la tripsina que se utilizó
para llevar a cabo la proteolisis de la mananasa purificada y
después la secuenciación de ciertos péptidos internos (véase
Ejemplo: 2, \ding{168} 5).
El alineamiento (Feng y Doolittle, J. Mol. Evol.
25, 351-360, 1987) de la secuencia de
proteína de ID. de SEC. Nº:2, llamada mananasa B, con la secuencia
de proteína de la
endo-\beta-mananasa llamada
mananasa A, cuyo DNA complementario había sido clonado previamente
en el laboratorio (Marraccini y Rogers, EP No. 98203742.6), muestra
que existe menos del 56% de identidad entre estas dos proteínas de
la planta del café (Figura 1). Por otro lado, existen varios
segmentos de proteína que están extremadamente conservados entre
estas dos proteínas y las del tomate (Bewley et al., Planta
203, 454-459, 1997) o de otras mananasas
eucariotas, como las de Aspergillus aculeatus (Número de
Clave de la base de datos: L35487) y Trichoderma reesei
(L25310). Alguna de estas conservaciones se refieren además, a
aminoácidos que se creen que son esenciales en la actividad de la
proteína, en particular los residuos de glutamato (E) en la posición
212, 216, 253 y 333 de la secuencia de ID. de SEC. Nº:2, que pueden
ser residuos catalíticos (Bewley et al., 1997). Otros
residuos de aminoácidos, como la histidina (H) 291, la asparagina
(N) 215, la tirosina (Y) 293 y el triptófano (W) 377, de la
secuencia de ID. de SEC. Nº:2 están también conservados y pueden ser
esenciales para la unión y degradación del sustrato.
La secuencia de cDNA manB que corresponde a la
secuencia de ID. de SEC. Nº:1 se utilizó como molde para la
amplificación de la secuencia de proteína madura (sin secuencia
señal) y sin el codón de parada de traducción. El cebador de PCR
B262, que corresponde a la secuencia de ID. de SEC. Nº:14, inicia la
síntesis en el extremo 5' del cDNA maduro de manB e introduce una
diana de restricción única NcoI que incluye un nuevo codón de
inicio ATG directamente antes de la proteína ManB madura, y el
cebador B260, que corresponde a la secuencia de ID. de SEC. Nº:15,
que inicia la síntesis en el extremo 3', y que introduce un sitio de
restricción SalI mientras que elimina el codón de terminación
y consigue una fusión que conserva el marco de lectura con la
secuencia de la cola de HIS proporcionada por el plásmido
pET24-d (Novagen Inc., 601 Science Drive, Madison
WI, USA) (Figura 2). La amplificación se realizó con la polimerasa
de alta fidelidad termoestable Pwo (Roche Diagnostics GmhH,
Alemania). Un \mul de molde de DNA se mezcló con tres \mul de
cada oligonucleótido a 100 pmol.\mul^{-1}, 10 \mul de tampón
de PCR Pwo 10x, 6 \mul de dNTP 2 mM y 0,5 \mul de polimerasa
Pwo. La amplificación se realizó en un aparato de PCR
Perkin-Elmer 9700 (Applied Biosystem Division, USA)
en tubos de 0,2 ml con un tiempo de mantenimiento de 5 min. a 95°C,
seguido
de 30 ciclos de 95°C durante 30 s, 50°C durante 30 s y 68°C durante 2 min., y finalmente otro mantenimiento a 4°C.
de 30 ciclos de 95°C durante 30 s, 50°C durante 30 s y 68°C durante 2 min., y finalmente otro mantenimiento a 4°C.
Tras la PCR, se visualizó una muestra en un gel
de agarosa al 1% para confirmar la amplificación. El amplicón se
purificó utilizando el equipo Qiagen PCR cleanup (Nº Cat. 28204,
Qiagen INC., USA) y se eluyó en un volumen de 50 \mul. Se digirió
un volumen de 25 \mul del amplicón purificado con las enzimas de
restricción NcoI y SalI a 37°C, el producto se
resolvió en un a gel de agarosa al 1% y los fragmentos de DNA
apropiados se cortaron y eluyeron utilizando el equipo Qiagen de
extracción en gel (Nº Cat. 28704). Este fragmento de DNA se ligó en
el vector preparado anteriormente pET24-d digerido
con SalI y NcoI (defosforilado), y transformado en
células XL1-blue (Stratagene, USA). Se seleccionaron
los transformantes en placas de LB con un suplemento de 50
\mug.ml^{-1} de kanamicina, se analizaron mediante
minipreparaciones de plásmido y digestiones con enzimas de
restricción, y finalmente mediante análisis de la secuencia de DNA
utilizando los cebadores "pET-For", que
corresponden a la secuencia de ID. de SEC. Nº:16 y
"pET-Rev", que corresponden a la secuencia de
ID. de SEC. Nº:17.
El plásmido resultante se llamó pDP580, cuyo
mapa se muestra en la Figura 3. El plásmido pDP580 se transformó en
el huésped de expresión T7 BL21 (DE3) CodonPlus^{TM} RIL
(Stratagene, USA) para el análisis de la expresión.
La cepa portadora del plásmido de expresión se
hizo crecer en medio LB suplementado con los antibióticos adecuados
a 37°C con agitación durante 16 h, para proporcionar un cultivo
fresco de iniciación. Un ml del cultivo de inicio se inoculó en 60
ml de medio LB suplementado con los antibióticos apropiados y se
incubó a 37°C con agitación hasta que el cultivo alcanzó una
densidad óptica (DO-600) de aproximadamente 0,6. Se
añadió IPTG a una concentración final de 1 mM y la incubación
continuó durante otras 4 h a 37°C con agitación. Una muestra de 40
ml se retiró y se centrifugó a 10000 rpm y se recogió el botón
celular (botón A). El botón bacteriano se resuspendió en un ml de
KPO_{4} 50 mM pH 7,0, tampón imidazol 10 mM, se enfrió en hielo y
se sonicó durante 30 s. seguido de 20 s. a 0ºC. Los restos celulares
se centrifugaron a 12000 rpm durante 30 min. (botón B), se retiró el
sobrenadante (sobrenadante B) y se almacenaron el botón y el
sobrenadante a -20ºC. Para poder analizar las proteínas mediante
SDS-PAGE, el botón B se solubilizó en KPO_{4} 50
mM pH 7,O, imidazol 10 mM y urea 8 M. Las muestras se resolvieron
entonces en un gel Ready Gel Tris-HCl al 10%
(Bio-Rad Lab., 200 Alfred Nobel Drive, 94547
Hercules CA. USA, Nº Cat. 161-1101) utilizando las
condiciones recomendadas.
Recientes publicaciones han mostrado que algunas
proteínas sobreexpresadas que precipitan como cuerpos de inclusión
se pueden recuperar en la fracción de proteína soluble mediante la
co-expresión del operón groESL o del factor
de activación del huésped (Vonrhein et al., FEBS Letters 443,
167-169, 1999; Nishihara et al., Appl.
Environ Microbiol 33, 884-889, 2000). Para comprobar
si la sobreexpresión simultánea del operón groESL de E.
coli puede ayudar a la solubilización de la de la enzima
endo-\betamananasa del café sobreexpresada, el
operón groESL se clonó y se expresó en el plásmido de
expresión pKK223-3 (Brosius y Holy, Proc Natl Acad
Sci 81, 6929-6933, 1984). El plásmido
pKK223-3 (Amersham Pharmacia Biotech, Inglaterra, Nº
Cat. 27-4935-01) se eligió porque
utiliza el gen de la resistencia a la ampicilina para la selección
(sin entrar en conflicto con el resto de plásmidos) y debido a que
la expresión de los genes insertados está también inducida por IPTG,
como en el caso de pET24-d (Novagen Inc., USA).
El DNA cromosómico total de E. coli se
amplificó por PCR utilizando la polimerasa Pwo y los
cebadores B452, que corresponde a la secuencia de ID. de SEC. Nº:18,
y B543, que corresponde a la secuencia de ID. de SEC. Nº:19, como se
ha descrito antes.
Tras la reacción de PCR, se visualizó una
muestra en un gel de agarosa al 1% para confirmar la amplificación.
El amplicón se purificó utilizando el equipo Qiagen PCR cleanup y se
eluyó en un volumen de 50 \mul. Se digirió un volumen de 25 \mul
del amplicón purificado con las enzimas de restricción EcoRI
y SalI a 37°C, el producto se resolvió en un gel de a agarosa
al 1%, se cortó el fragmento apropiado de DNA y se eluyó utilizando
el quipo de extracción en gel de Qiagen. El fragmento de DNA se ligó
en el vector previamente preparado pKK223-3
(Amersham Pharmacia Biotech, Inglaterra) digerido con SalI
más EcoRI (defosforilado) y se transformó en células
XLl-blue. Las construcciones se seleccionaron en
placas de LB con un suplemento de 100 \mug.ml^{-1} de
ampicilina, se analizaron mediante minipreparaciones de plásmidos y
digestiones con enzimas de restricción, y se detectó un clon
positivo llamado pDP588 (Figura 4). El plásmido pDP588 se transformó
en el huésped de expresión de E. coli SL21 (DE3)
CodonPlus^{TM} RIL (Stratagene, USA) que contiene el plásmido de
expresión de la
endo-\beta-mananasa del café
pDP580 y se seleccionó en placas de LB con un suplemento de
ampicilina, cloramfenicol y kanamicina. La expresión de proteínas
fue como se ha descrito antes, con la excepción que el cultivo
creció en medio LB, con un suplemento de ampicilina, cloramfenicol y
kanamicina a 37°C.
La actividad
endo-\beta-mananasa, se ensayó en
cultivos de E.coli, que se prepararon y se sometieron a una
expresión inducida por IPTG exactamente como se ha descrito
anteriormente. Los cultivos (100 ml) se dividieron en dos cuando la
densidad óptica (D.0._{600}) llegó a 0,6. La expresión de proteína
recombinante se indujo mediante IPTG en un cultivo (dando lugar a la
actividad inducida por IPTG), mientras el otro cultivo se mantuvo en
paralelo sin inducción (control). Estos cultivos de 50 ml se
llevaron entonces hasta las fases de botón B y sobrenadante B, como
se ha descrito anteriormente.
La actividad se ensayó en muestras de las fases
de botón B y sobrenadante B. La muestra a analizar (200 \mul de
sobrenadante o botón B se resuspendieron en 200 \mul de tampón de
reacción del ensayo) se añadió a tiempo cero a 800 \mul de tampón
de reacción (acetato sódico/ácido acético 200 mM, NaCl 100 mM, pH
5,0) que contiene una suspensión del sustrato insoluble
AZCL-galactomano al 1% (p/v) (Megazyme, Irlanda).
Las reacciones se agitaron de forma continua a 37°C. Se recogieron
alícuotas (200 \mul) a lo largo del tiempo, se calentaron a 100ºC
durante 5 min. y se centrifugaron a 12.000 g durante 5 min., y el
sobrenadante se fraccionó en alícuotas en una microplaca de
96-pocillos. La coloración se mantuvo estable tras
el calentamiento. La lectura de la absorción del sobrenadante se
realizó a 595 nm y la actividad se expresó como \Delta595
nm.min^{-1}.ul de muestra^{-1}. Como se realizaron comparaciones
entre los sobrenadantes o entre el material de los botones, no se
realiza intento alguno de expresar la actividad específica.
A los cultivos del huésped de expresión E.
coli BL21 (DE3), que contiene los plásmidos CodonPlus RIL
(Stratagene, USA) y pDP580, con y sin plásmido pDP588, se les
introdujo IPTG durante 4 h, se fragmentaron las células mediante
sonicación y las proteínas solubles (sobrenadante B) y las proteínas
en el botón celular (botón B) se separaron en un
SDS-PAGE. El SDS-PAGE de las
proteínas solubles (sobrenadante B) (Figura 5) mostró que no estaba
presente ninguna banda intensa de proteína correspondiente al tamaño
esperado de la construcción de
endo-\beta-mananasa del café. Por
otro lado, el SDS-PAGE del botón celular disuelto
(botón B) mostró la presencia de una nueva banda intensa de proteína
de la expresión del plásmido pDP580. Estos resultados se mantuvieron
invariables cuando se incluyó el plásmido de expresión
groESL. También se detectó que una construcción que expresaba
el gen completo de la
endo-\beta-mananasa no produjo
ninguna nueva banda de proteína, posiblemente debido a la secuencia
señal de secreción asociada.
Se analizó la actividad del producto
recombinante del gen manB
(endo-\beta-mananasas ManB) (Tabla
1). Puede reconocerse que la expresión de
endo-\beta-mananasa del pDP580 es
detectable sólo tras la inducción mediante IPTG, y solamente a
niveles bajos. Este resultado confirma que la designación del gen y
la actividad enzimática se corresponden. Cuando se incluye el
plásmido de expresión groESL de E. coli pDP588, la
expresión de endo-\beta-mananasa
aumenta más de 50 veces, lo que confirma que la
co-expresión de esta chaperona mejora la eficiencia
del plegamiento de la proteína
endo-\beta-mananasa. Sin embargo,
sólo pequeñas cantidades de la proteína permanecen en forma soluble
para dar lugar a una actividad enzimática detectable, mientras que
permanecen indetectables en SDS-page entre el
contenido de proteínas globales.
- ND = no detectado
La actividad se expresa como \Delta595
nm.min^{-1}.ul de muestra^{-1} x 10^{-5}. Los resultados
representan el promedio de al menos 3 experimentos.
La secuencia de cDNA de manB que
corresponde a la secuencia con ID. de SEC. Nº:1 se utilizó como
molde para la amplificación de la secuencia que codifica la proteína
madura (sin la secuencia señal) y sin el codón de parada
traduccional. El cebador de PCR B281 que corresponde al ID. de SEC.
Nº:20 inicia la síntesis en el extremo 5' del cDNA maduro de
manB e introduce una diana SfiI que permite el clonaje
direccional en el marco de lectura en una secuencia señal híbrida
xPR2-lipasa presente en el plásmido de
expresión/secreción de Yarrowia lipolytica pNFF296 (Figura
6). El cebador de PCR B282 que corresponde al ID. de SEC. Nº:2
inicia la síntesis en el extremo 3' del cDNA maduro de manB e
introduce en el marco de lectura una secuencia 3xHIS justo antes del
codón de parada y la diana de clonaje SfiI frente al
terminador de la lipasa del pNFF296. La expresión del gen insertado
está bajo el control de un promotor sintético derivado del XPR2
(Mazdak et al., J Mol Microbiol Biotechnol 2,
207-216, 2000). La amplificación se realizó con la
polimerasa de gran fidelidad termoestable nativa Pfu (Stratagene,
USA). Un microlitro de DNA molde se incubó con KCl 10 mM,
(NH4)_{2}SO_{4} 6 mM, Tris-HCl 20 mM pH
8,0, Triton X-100 0,1%, MgCl_{2} 2 mM, 0,2 mM de
cada dNTP, 10 \mug.ml^{-1} BSA, 0,25 \muM de cada cebador y 3
unidades de polimerasa de DNA Pfu (Stratagene, USA) en un
RoboCycler de Stratagene (Stratagene. USA). La PCR se realizó como
sigue: 1 ciclo (95°C - 1 min., 50°C - 1 min., 72°C - 3 min.), 30
ciclos (95°C - 1 min., 50°C - 1 min., 72°C - 3 min.) y un ciclo
final (95°C - 1 min., 50°C - 1 min., 72°C - 10 min.). El producto de
PCR se visualizó en un gel de agarosa al 1% para confirmar la
amplificación, se purificó utilizando el equipo de purificación
Qiaquick PCR purification (nº cat. 28704, Qiagen INC., USA), se
digirió con SfiI y a continuación se realizó la ligación con
en el vector pNFF296 (Figura 6) previamente digerido con
SfiI. Esta ligación se utilizó para transformar E.
coli BZ234 (Biozentrum, University of Basel, Klingelbergstr.
50-70CH, 4056 Basilea, Suiza). Las construcciones se
seleccionaron en placas de LB suplementadas con kanamicina 50
\mug.ml^{-1}, se analizaron mediante
mini-preparaciones de plásmido y la digestión con
enzimas de restricción, y finalmente mediante el análisis de la
secuencia de DNA con los cebadores internos de manB B360 y
B36l que corresponden, respectivamente, a las secuencias con ID. de
SEC. Nº:22 e ID. de SEC. Nº:23, y también con los cebadores externos
B358 y B359 que corresponden, respectivamente, a los ID. de SEC.
Nº:24 e ID. de SEC. Nº:25. El plásmido resultante se denominó pCY316
(Figura 7).
La cepa huésped Yarrowia lipolytica YLP3
se derivó de la cepa polf (MatA
ura3-302 leu2-270 x
pr2-322 axp-2 SUC2) (Mazdak
et al., 2000) mediante la transformación de dicha cepa en un
protótrofo para la leucina con un fragmento SalI de 5,1 kb
que contienen el gen salvaje LEU2 de Yarrowia
lipolytica y la selección de los transformantes LEU2. La cepa
huésped Yarrowia lipolytica se sembró en estría en una placa
de agar YPD (extracto de levadura Difco Bacto al 1%, peptona Difco
Bacto al 2%, glucosa al 2%, agar Difco Bacto al 2%;
Difco-Lee lab., 1475 Athens Hwy, Grayson 30017, GA,
USA) y se hicieron crecer durante toda la noche a 28ºC. Se
inocularon 4 ml de YFD líquido, pH 4,0 (extracto de levadura Difco
Bacto al 1%, peptona Difco Bacto al 1%, glucosa al 1%, tampón
citrato 50 mM a pH 4,0) con células recientemente obtenidas de la
placa de YPD y se hizo crecer en un tubo en un agitador orbital a
200 rpm, 28°C, 8-9 h). Una cantidad adecuada de este
precultivo se utilizó para inocular 20 ml de YPD, pH 4,0, en un
frasco Erlenmeyer de 250 ml sin deflectores. Este cultivo se agitó
en un agitador orbital a 200 rpm y 28°C (durante toda la noche)
hasta que se alcanzó un título de 10^{8} células.ml^{-1}. Las
células se centrifugaron durante 5 min. a 3000 g, se lavaron con 10
ml de agua estéril y se centrifugaron de nuevo. El botón celular se
resuspendió en 40 ml de acetato de litio0,1 M pH
6,0\cdot(ajustado con ácido acético al 10%) y se agitó en
un Erlenmeyer de 250 ml a 140 rpm y 28°C durante 60 minutos. Las
células se centrifugaron de nuevo durante 5 min. a 3000 g. El botón
celular se resuspendió en 2 ml de acetato de litio pH 6,0, y las
células competentes se mantuvieron en hielo hasta su
transformación.
Se mezclaron cien microlitros de células
competentes con 5-20 \mul de plásmido linearizado
con NotI y 50 \mug de DNA transportador (DNA de esperma de arenque
sonicado hasta alcanzar 100-600 pb, Promega, USA) en
un tubo de 2 ml y se incubó durante 15 minutos a 28°C. Se añadieron
700 \mul de PEG 4000 al 40%, acetato de litio 0,1 M, pH 6,0, y los
tubos se agitaron vigorosamente a 240 rpm en un agitador orbital a
28°C durante 60 minutos. Se añadió un volumen de 1,2 ml de acetato
de litio 0,1 M, pH 6,0, se mezcló y se plaquearon hasta 250 \mul
en placas de agar selectivas (base nitrogenada de levadura Difco
Bacto al 0,17% sin aminoácidos y sulfato de amonio, glucosa al 1%,
L-leucina al 0,006%, glutamato sódico al 0,1%,
casaminoácidos Difco Bacto al 0,1%, agar al 2%). El plásmido de
expresión pNFF296 contiene un alelo defectivo URA3 que permite la
selección de integración múltiple del casete de
expresión-secreción en la cepa huésped YLP3 (Le Dall
et al., Current Genetics, 26, 38-44,
1994).
Los transformantes (Ura^{+}) se aislaron de
nuevo en medio selectivo (base nitrogenada de levadura Difco Bacto
al 0,17% sin aminoácidos y sulfato de amonio, glucosa al 1%,
L-leucina al 0,006%, glutamato sódico al 0,1%,
casaminoácidos Difco Bacto al 0,1%, agar al 2%). Se cultivaron una
serie de clones en frascos en agitación para comprobar la expresión
y secreción de la mananasa del café ManB al medio de cultivo.
Se sembraron en estría pequeños grupos de
células sobre placas de agar YPD y se hicieron crecer durante toda
la noche a 28°C. Las finas capas de células que crecieron se
utilizaron para inocular 50 ml de medio DMI en un Erlenmeyer de 500
ml con 4 deflectores laterales. El medio DMI contenía, por litro: 10
g de KH_{2}PO_{4}; 2,5 g de MgSO_{4}.7H_{2}O, 20 g de
glucosa; 5,1 ml de solución de elementos traza; 17 ml de solución de
vitaminas; 3 g de urea. La urea se disolvió en 15 ml de agua y se
filtró de forma estéril. La solución de elementos traza contenía,
por litro: 12,5 g de EDTA, 4 g de ZnSO_{4}.7H_{2}O, 6,5 g de
MnSO_{4}.H_{2}O, 5 g de CaCl_{2}.2H_{2}O, 30 g de
NaH_{2}PO_{4}.H_{2}O; 2,5 g de FeSO_{4}.7H_{2}O; 0,008 g
de H_{3}BO_{3}, 0,0009 g de KI; 0,1 g de CuSO_{4}.5H_{2}O,
0,004 g de Na_{2}MoO_{4}.2H_{2}O, 0,007 g de
CoCl_{2}.6H_{2}O, 0,0008 g de NiSO_{4} 7H_{2}O, 0,04 g de
EDTA, y se esterilizó en el autoclave durante 20 min. a 121°C. La
solución de vitaminas se preparó como se ha descrito previamente
(Verduyn et al., Yeast, 8, 501, 1992). El pH inicial
del medio se ajustó a 5,0. Los cultivos se agitaron a 140 rpm en un
agitador orbital a 1°C durante tres días. Se centrifugaron alícuotas
de los cultivos a velocidad máxima (3000 g)durante 15 min. y
el sobrenadante se utilizó para la determinación de la actividad
endo-\beta-mananasa.
Se añadió sobrenadante del cultivo (250 \mul)
a 750 \mul de tampón de reacción (acetato sódico ácido acético 200
mM, pH 5,0) que contenía AZCL-galactomanano
(Megazyme, Irlanda) para dar lugar a una concentración final de 0,5%
p/v. Las muestras se incubaron a 40°C con agitación ocasional,
durante 60 minutos. Las reacciones se detuvieron mediante
precipitación con 5 ml de etanol al 95%.
Tras la centrifugación a velocidad máxima (3000
g), se realizó la lectura de la absorción del sobrenadante a 590 nm.
La actividad endo-\beta-mananasa
se expresó como \Delta595 nm.h^{-1} .ml de sobrenadante^{-1}.
Se incluyeron paralelamente como controles un blanco (250 \mul de
tampón de reacción) y un sobrenadante del cultivo de un
transformante YLP3 que contiene un plásmido vacío (pNFF296). Se
cribaron un total de 21 transformantes para la actividad
endo-\beta-mananasa. Todos los
transformantes transformados con el plásmido pCY316 mostraron
diferentes niveles de actividad enzimática, mientras que no se pudo
detectar actividad en los transformantes control que contenían el
plásmido vacío pNFF296. En seis transformantes pCY316
independientes, el experimento se repitió dos veces y los resultados
de los ensayos de actividad se muestran en la Tabla 2.
| (*) \begin{minipage}[t]{152mm} La actividad se expresa como \Delta 590nm.h^{-1} . 250 \mu l de sobrenadante^{-1}. Los valores del ruido de fondo del blanco [tampón] ya se han deducido de los valores finales que se han proporcionado anteriormente.\end{minipage} |
| (Nº): indica el número de clon transformado. |
Los resultados representan el promedio de 3
experimentos.
<110> SOCIETE DES PRODUITS NESTLE S.A.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> mananasa del café
\vskip0.400000\baselineskip
<130> mananasa II
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1486
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Coffea arabica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 416
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Coffea arabica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Coffea arabica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Phe Ser Phe Val Lys Thr Arg Gly Thr Glu
Phe Val Met Asn Gly}
\sac{Arg Pro Leu Tyr Leu Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Coffea arabica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Trp Ala Phe Ser Asp Gly Gly Tyr
Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Coffea arabica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Tyr Asn Pro Gly Tyr Gln Val Gly Thr Asp
Phe Ile Ser Asn Asn}
\sac{Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: nucleótido sintético Man 202
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggnacngart tygtnatg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: nucleótido sintético Man 203
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccrtcrctra angccca
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: nucleótido sintético Man 214
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcaaccacc ttccaacaa
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido sintético Man 215
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaccttcgtc ctcgtaga
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: nucleótido sintético T3
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<400> 10
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\hskip-.1em\dddseqskipaattaaccct cactaaaggg
\hfill20
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<211> 22
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido sintético T7
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<400> 11
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\hskip-.1em\dddseqskipgtaatacgac tcactatagg gc
\hfill22
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<210> 12
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<211> 21
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido sintético Man 300
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<400> 12
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\hskip-.1em\dddseqskipgtgaccagac tctagttcga a
\hfill21
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<210> 13
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<211> 22
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido sintético Man 301
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<400> 13
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\hskip-.1em\dddseqskiptgaatgtgca aatacacggg ta
\hfill22
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<210> 14
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador B262
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<400> 14
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\hskip-.1em\dddseqskipatatatccat ggtgagcttc agctttgtca aaactagggg
\hfill40
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<210> 15
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador B260
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<400> 15
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\hskip-.1em\dddseqskipatatatgtcg acggtaagag atgatagcct gttgg
\hfill35
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<210> 16
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador "pET-For"
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<400> 16
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\hskip-.1em\dddseqskiptagttattgc tcagcggtgg
\hfill20
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<210> 17
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador "pET-Rev"
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<400> 17
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\hskip-.1em\dddseqskipagcggataac aattcccctc
\hfill20
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<210> 18
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador B452
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<400> 18
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\hskip-.1em\dddseqskiptcaaaggaat tctatcaatg aatattcgtc cattgc
\hfill36
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<210> 19
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<211> 30
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador B453
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<400> 19
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\hskip-.1em\dddseqskipgggtttgtcg acttctgcga ggtgcagggc
\hfill30
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<210> 20
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<211> 49
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador B281
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<400> 20
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\hskip-.1em\dddseqskipccggcctctt cggccgccaa gcgaagcttc agctttgtca aaactaggg
\hfill49
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<210> 21
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador B282
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<400> 21
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcccacgtg gccttagtgg tggtgggtaa gagatgatag cctgttg
\hfill47
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador B360
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<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaacctcgtt gccaaagtga cctatc
\hfill26
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<211> 26
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador B361
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<400> 23
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\hskip-.1em\dddseqskipcaatgtctag gaggtgatcg ctatcg
\hfill26
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<211> 24
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador B358
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<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccagccaca gattttcact ccac
\hfill24
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<210> 25
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<211> 26
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador B359
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<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaggaacgca tatacagtaa tcatag
\hfill26
Claims (9)
1. El proceso para el tratamiento de las
semillas de café, en el que se utiliza la proteína de acuerdo con el
ID. de SEC. Nº:2.
2. El proceso de acuerdo con la reivindicación
1, que comprende los pasos de:
- sobre-expresar un DNA con el
ID. de SEC. Nº:1 en un microorganismo, hongo o en una célula vegetal
no diferenciada,
- purificar la enzima,
- tratar los sedimentos de las semillas de café
con el enzima para aumentar el rendimiento de extracción o tratar la
solución de café con el enzima para reducir la sedimentación debida
a la gelificación de los mananos.
3. Un fragmento de DNA derivado del café que
codifica al menos una enzima involucrada en la hidrólisis de
polisacáridos que consisten al menos en moléculas de manano simples
o ramificadas unidas entre ellas a través de un enlace
\beta(1\rightarrow4), y este fragmento de DNA tiene la
secuencia de ácido nucleico con el ID. de SEC. Nº:1 o la secuencia
de ácido nucleico de los nucleótidos 62 a 1312 de la secuencia de
ácido nucleico con ID. de SEC. Nº:1.
4. El vector recombinante que comprende un
fragmento de DNA de acuerdo con la reivindicación 3.
5. Una proteína derivada de la semilla del café,
que está codificada por un gen del café y está involucrada en la
hidrólisis de polisacáridos que consisten al menos en moléculas de
manano simples o ramificadas unidas entre ellas a través de un
enlace \beta(1\rightarrow4), y que tiene la secuencia de
aminoácidos con ID. de SEC. Nº:2.
6. Una célula vegetal que comprende, a través de
un vector recombinante, un fragmento de DNA de acuerdo con la
reivindicación 3.
7. Una célula vegetal de acuerdo con la
reivindicación 6, que se caracteriza por ser una célula de
café.
8. Una planta o semilla formada por células
vegetales de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 o
7.
9. Un microorganismo que comprende un fragmento
de DNA de acuerdo con la reivindicación 3, integrado en su genoma o
a través de un plásmido capaz de replicarse, de forma que expresa al
menos una enzima involucrada en la hidrólisis de polisacáridos que
consisten al menos en moléculas de manano simples o ramificadas
unidas entre ellas a través de un enlace
\beta(1\rightarrow4).
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