ES2270617T3 - Secuencia de adnc que transcribe un arnm que codifica la oxidasa terminal asociada a la biosintesis de carotenoides y utilizaciones. - Google Patents
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Abstract
Secuencia de ADN que comprende por lo menos una región codificadora constituida por: - la secuencia nucleotídica representada por la SEC. ID nº: 1, que transcribe un ARNm, codificando este ARNm la enzima OTBC (Oxidasa Terminal asociada a la Biosíntesis de Carotenoides) descrita por la SEC. ID nº: 2, o su complementaria. - cualquier secuencia nucleotídica modificada: que presenta, con relación a la SEC. ID nº: 1, una o más modificaciones seleccionadas de entre las adiciones, las supresiones y las sustituciones de nucleótidos, que presenta con la SEC. ID nº: 1 por lo menos 70% de identidad, y que transcribe un ARNm que codifica él mismo la OTBC descrita por la SEC. ID nº: 2, o una proteína modificada de dicha OTBC, presentando una actividad enzimática equivalente a la de la OTBC descrita por la SEC. ID nº: 2 o su complementaria.
Description
Secuencias de ADNc que transcribe un ARNm que
codifica la oxidasa terminal asociada a la biosíntesis de
carotenoides y utilizaciones.
La invención se refiere a una secuencia de ADN
(ácido desoxirribonucleico) descrita por la SEC. ID nº: 1, que
transcribe un ARNm (ácido desoxirribonucleico mensajero),
codificando él mismo la enzima OTBC (oxidasa terminal asociada a la
biosíntesis de carotenoides) descrita por la SEC. ID nº: 2, así como
a los vectores de transformación de células, de plantas o de
fragmentos de plantas, y al procedimiento para modificar la
producción de carotenoides en una planta.
Los carotenoides son pigmentos lipófilos
sintetizados en las plantas, los hongos y las bacterias. En los
tejidos fotosintéticos, los carotenoides tienen una función de
pigmento accesoria de absorción de la luz y sobre todo de
fotoprotección contra los radicales libres, tales como el oxígeno
singlete.
En las plantas y determinados microorganismos,
la vía sintética de los carotenoides produce carotenos, xantofilas y
sus derivados. Estos compuestos son sintetizados a partir del
fitoeno que está modificado mediante reacciones de deshidrogenación
sucesivas para producir fitoflueno, zeta-caroteno,
neurosporeno después del licopeno. El licopeno se acumula en
determinados casos dando por ejemplo el pigmento rojo del tomate, o
más generalmente se encuentra en forma modificada por ciclación,
para formar el alfa- o beta-caroteno. Estos
carotenoides ciclados son los precursores de la vitamina A, y pueden
acumularse o producir, mediante reacciones de oxidación, las
xantofilas, que son pigmentos amarillos, rosas, naranjas o
rojos.
Las etapas de deshidrogenación sucesivas del
fitoeno están catalizadas de la mayor parte de los microorganismos
por una enzima única denominada fitoeno desaturasa CRTI. En las
plantas y las cianobacterias, parece que existen dos enzimas. La
primera, denominada fitoeno desaturasa (PDS), cataliza la conversión
del fitoeno en fitoflueno después en zeta-caroteno.
La segunda, denominada zeta-caroteno desaturasa
(ZDS), cataliza la conversión de zeta-caroteno en
neurosporeno después en licopeno. Cada una de estas reacciones de
deshidrogenación necesita la transferencia de dos electrones y dos
protones del sustrato hacia un receptor. Estas reacciones de
deshidrogenación necesitan por consiguiente enzimas, llamadas
estructurales, y cofactores, que son intermedios en las reacciones
de oxidoreducción.
Los inventores de la presente invención han
descubierto un nuevo gen que codifica una enzima denominada OTBC
(Oxidasa Terminal asociada a la Biosíntesis de Carotenoides),
implicada en la biosíntesis de carotenoides. Parece que esta enzima
esté situada en las membranas de los cloroplastos y sea
indispensable para el buen funcionamiento de la PDS.
Un primer objeto según la invención se refiere
por consiguiente a una secuencia de ADN que comprende por lo menos
una región codificadora constituida por:
- -
- la secuencia nucleotídica representada por SEC. ID nº: 1, que transcribe un ARNm, este ARNm codifica la enzima OTBC (Oxidasa Terminal asociada a la Biosíntesis de Carotenoides) descrita por la SEC. ID nº: 2, o su complementaria
- -
- cualquier secuencia nucleotídica modificada que presenta, con relación a la SEC. ID nº: 1, una o modificaciones seleccionadas de entre las adiciones, las supresiones y las sustituciones de nucleótidos, presentando esta secuencia modificada con la SEC. ID nº: 1 por lo menos el 70% de identidad y transcribiendo un ARNm codificando el mismo la OTBC descrita por la SEC. ID nº: 2, o codificando una proteína modificada de dicha OTBC, poseyendo dicha proteína modificada una actividad enzimática equivalente a la de la OTBC representada por la SEC. ID nº: 2 o su complementaria.
En particular, la invención se refiere a las
secuencias que codifican la OTBC del tomate, identificada por la
SEC. ID nº: 3, y del pimiento, identificada por la SEC. ID nº: 4,
respectivamente, y cualquier secuencia derivada obtenida por
modificación de estas secuencias.
El gen que codifica la OTBC es una doble hélice
de ADN, que comprende intrones y exones. La SEC. ID nº: 1 es la
cadena complementaria (sin los intrones) o ADNc, que corresponde a
la cadena de ADN que transcribe el ARNm que codifica la OTBC.
Por actividad enzimática equivalente, se
entiende que la enzima, aunque puede ser modificada
estructuralmente en alguna de sus partes, no obstante es capaz de
modificar su sustrato. Su actividad es sensiblemente la misma de la
de la enzima natural. Se comprenderá que esta enzima no puede ser
modificada a nivel de su zona activa. De este hecho, cualquier
modificación aportada a la secuencia nativa por adición, supresión o
sustitución de uno o varios aminoácidos, se entiende que engendra
una actividad enzimática equivalente en la medida en que la
actividad de la proteína natural no está afectada por estas
modificaciones.
Por ADN, se puede entender ADN complementario (a
ADNc), es decir la copia del ARNm en forma de ADN gracias a la
acción de una transcriptasa inversa. La ADNc no comprende los
intrones de las secuencias de ADN.
Se entiende por "capaz de aparearse" en la
presente invención, el hecho de que en las condiciones de
hidratación dadas, se emparejan las secuencias nucleotídicas
complementarias. El experto en la materia conoce bien, según las
condiciones de hibridación utilizadas, cuál es el porcentaje de
identidad que las secuencias deben presentar para que pueda
realizarse un apareamiento o una hibridación. Las condiciones de
severidad para obtener un apareamiento de las secuencias vecinas son
por ejemplo una hibridación en el 50% de formamida a 35ºC. Por lo
que se refiere a las condiciones de hibridación, se referirá
especialmente al artículo "Molecular Cloning, a laboratory manual,
segunda edición, Sambrook, Fritch y Maniatis, 1989. Cold Spring
Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, Nueva York,
USA".
Se entiende por "secuencia nucleotídica
modificada" en la presente invención, cualquier secuencia
nucleotídica que presenta con la secuencia de referencia un grado de
identidad inferior al 100%.
En una forma de realización preferida según la
invención, las secuencias, nucleotídicas modificadas según la
presente invención presentan por lo menos el 80% de identidad con la
secuencia nucleotídica representada por la SEC. ID nº: 1, o su
secuencia complementaria.
Se entiende por "identidad de nucleótido",
la comparación, cuando las dos cadenas están alineadas, de la
secuencia de nucleótidos idénticos presentados en las dos cadenas.
De este hecho se obtiene, volviendo al número de nucleótidos
totales, el porcentaje de nucleótidos idénticos, es decir la
identidad del nucleótido.
Un segundo objeto según la invención se refiere
a un ARNm transcrito a partir de la secuencia de ADN según la
definición del primer objetivo, o a partir de su complementario.
Por "ARNm de cadena complementaria", se
entiende una secuencia de ARN que es complementaria de una
secuencia de bases de un ARNm correspondiente, complementaria en el
sentido en que cada base (o la mayoría de bases) en la secuencia
complementaria (lisándose en el sentido de 3' hacia 5') es
susceptible de emparejarse con la base correspondiente (G con C, A
con U) en la secuencia de ARNm lisándose en el sentido de 5' hacia
3'.
Un tercer objeto según la invención se refiere a
una proteína que posee la actividad de la enzima OTDC descrita por
la SEC. ID nº: 2, y codificada por una secuencia de ADN tal como la
definida anteriormente.
Un cuarto objeto según la invención consiste en
un ADN recombinado que comprende una secuencia de ADN definida en
el primer objeto según la invención, estando dicha secuencia
insertada en una secuencia heteróloga, transcribiéndose dichas
secuencias completa o totalmente en una secuencia de ARNm que
codifica toda o parte de la enzima OTBC, poseyendo esta última una
actividad enzimática equivalente a la enzima OTBC de la planta.
Por "secuencia heteróloga" se entiende,
según la presente invención, cualquier secuencia que pueda ser
cortada por enzimas, y que se sirva de este hecho para insertar
otras secuencias que presentan diversas actividades.
Ventajosamente, el ADN recombinado definido
anteriormente comprende los elementos necesarios para controlar la
expresión de la secuencia insertada, especialmente una secuencia
promotora y una secuencia de terminación de la trascripción de
dichas secuencias.
Un quinto objeto según la invención se refiere a
un vector de transformación de plantas, adaptado para aumentar la
biosíntesis de carotenoides, que comprende toda o parte de la
secuencia nucleotídica SEC. ID nº: 1 como se define en el primer
objeto según la invención, que codifica toda o parte de una enzima
involucrada en la síntesis de los carotenoides, representada por la
SEC. ID nº: 2, precedida por un origen de replicación de la
transcripción de las plantas, de manera que el vector pueda generar
el ARNm en las células de las plantas.
La invención puede utilizarse pues para
modificar la síntesis de los carotenoides, por ejemplo aumentar o
disminuir, es decir interrumpir, la producción de colores asociados
a la deshidrogenación del fitoeno. Por ejemplo, la inhibición del
color rojo en frutas tales como los tomates, por transformación con
un vector que comprende una secuencia complementaria, dado un fruto
de un color atractivo próximo al amarillo, como el de determinados
pimientos. Existen ya tomates amarillos de esta especie, pero la
presente invención proporciona un medio de transferir el color
característico en la descendencia, sin que sea necesario un
programa de reproducción prolongado y pueda por ello engendrar la
alteración de otras características de la planta.
El aumento de la síntesis de carotenoides, por
transformación con un vector que comprende una secuencia
transcrita, puede permitir producir tomates de color más rojo, lo
que puede parecer más apetecible al consumidor. La invención puede
servir igualmente para introducir un color rojo en el interior de
una planta, además de en el fruto. El aumento de la síntesis de los
carotenoides en una planta puede efectuarse insertando una o varias
copias funcionales del gen del ADN complementario, o el gen
completo, bajo el control de un promotor funcional en las células de
las plantas.
Los vectores de transformación de las plantas
para disminuir o interrumpir la síntesis de los carotenoides, es
decir los vectores complementarios, pueden ser muy cortos. En una
forma de realización preferida, se seleccionará secuencias de bases
homólogas que posean una longitud de por lo menos 10 bases. No
existe límite superior teórico para la secuencia de bases, puede ser
tan larga como el ARNm producido por la planta. En una forma de
realización muy preferida, se utilizarán sin embargo secuencias de
longitud comprendida entre 100 y 1.000 bases.
Se sabe que las plantas mutantes en las que el
gen OTBC es inactivo presentan un aspecto veteado, las plantas son
verdes y blancas. Se propone una aplicación de la estrategia de
cadena complementaria, que está orientada a eliminar la producción
de ARNm y por consiguiente la proteína OTBC, que estaría orientada a
producir plantas con follaje veteado como por ejemplo plantas
ornamentales, del tipo Nicotiana o Petunia o cualquier otra planta
ornamental, que se preste a la transformación genética y que podría
recibir una construcción complementaria con el fin de impedir la
producción de la proteína OTBC.
Los productos de recombinación del ADN pueden
ser preparados utilizando técnicas normalizadas. Por ejemplo, la
secuencia de ADN que debe transcribirse puede obtenerse tratando un
vector que contiene dicha secuencia con enzimas de restricción para
cortar el segmento apropiado. La secuencia de ADN de transcripción
puede asimismo ser engendrada ciclando y ligando oligonucleótidos
sintéticos o utilizando oligonucleótidos sintéticos en una PCR
("Polymerase Chain Reaction") para engendrar secuencias de
restricción en cada extremo. La secuencia de ADN se clona entonces
en el interior de un vector que contiene una secuencia promotora de
iniciación y una secuencia de terminación. Si se desea obtener una
secuencia de ADN complementario, la clonación se efectuará de manera
que la secuencia de ADN cortada esté invertida con relación a su
orientación en la cadena de la que se ha
cortado.
cortado.
En un producto de recombinación que expresa un
ARN complementario, la cadena que era inicialmente la cadena matriz
se convierte en la cadena codificante, y viceversa. El producto de
recombinación transcribirá de este hecho un ARNm cuya secuencia de
bases es complementaria de toda o parte de la secuencia del ARNm de
la enzima. De este hecho, las dos cadenas de ARN son complementarias
no solamente en sus secuencias de bases sino igualmente en su
orientación (5' hacia 3').
En un producto de recombinación que expresa un
ARN transcrito, la matriz y sus cadenas transcritas conservan la
orientación del gen inicial de la planta. Los productos de
recombinación que expresan el ARN transcrito transcriben un ARNm que
presenta una secuencia de bases que es homóloga en su totalidad o en
parte con la secuencia del ARNm. En los productos de recombinación
que expresan la enzima fuincional, la zona codificante completa del
gen está religada a las secuencias de control de transcripción
susceptibles de expresarse en la planta.
Por ejemplo, los productos de recombinación
según la presente invención pueden ser preparados como se describe
a continuación. Un vector adaptado que contiene la secuencia de
bases deseada para la transcripción, tal como especialmente un clon
del ADN complementario de OTBC, se trata con enzimas de restricción
para cortar la secuencia. Se clona a continuación el ADN obtenido de
este modo, en una orientación inversa si se desea, en un segundo
vector que contiene la secuencia promotora deseada y la secuencia de
terminación deseada. Entre los promotores adaptados, se puede citar
el promotor denominado 35S del virus del CaMV, a título de ejemplo
de promotor considerado como constitutivo, el promotor del gen de la
poligalacturonasa del tomate (véase Bird et al., 1998,
Plant Molecular Biology, 11:651-662) como
ejemplo de promotor implicado en la regulación de los frutos; o
incluso el promotor del gen de la pequeña subunidad de la ribulosa
bis-fosfato carboxilasa, como ejemplo de promotor
expresado en los tejidos verdes. Las secuencias de terminación
comprenden el terminador NOS del gen de nopalina sintetasa.
Puede ser interesante modificar la actividad
enzimática de la planta solamente durante el desarrollo y/o la
maduración de los frutos. La utilización de un promotor constitutivo
tenderá a modificar la tasa y la actividad de las enzimas en todas
las partes de la planta transformada, mientras que la utilización de
un promotor específico en un tejido controlará de manera más
selectiva la expresión del gen y modificará la actividad, por
ejemplo la coloración de los frutos. De este hecho, poniendo en
práctica la invención, por ejemplo en los pimientos, será
conveniente utilizar un promotor que permitirá la expresión
específica en el curso del desarrollo y/o la maduración de los
frutos. Por último, el ARN transcrito o complementario será
entonces producido solamente en los órganos de la planta donde se
desea que tenga una acción. Entre los promotores específicos del
desarrollo o de la maduración de los frutos que pueden ser
utilizados, se puede citar el promotor de estimulación de la
poligalacturonasa (solicitud de patente internacional publicada con
el número WO-A-92/08798), el
promotor E8 (Dieckman y Fiscer, 1998, EMBO,
7:3315-3320) y el promotor específico de frutos 2A11
(Pear et al., 1989, Plant Molecular Biology,
13:639-651).
Un sexto objeto según la invención se refiere a
una célula de planta transformada mediante un vector definido en el
quinto objeto según la invención.
El experto en la técnica de la ingeniería
genética vegetal conoce bien actualmente las diferencias técnicas de
la obtención de plantas genéticamente modificadas. Se sabe que la
pared vegetal constituye una barrera mecánica natural especialmente
eficaz a la penetración de cualquier material extraño en la célula
y, en especial, a la del ADN. Las diferentes técnicas específicas de
introducción del ADN en la célula vegetal son por ejemplo la
utilización de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, la
electroporación de protoplastos, la microinyección del ADN desnudo,
la utilización del disparador de partículas o biolística o la
transformación de protoplastos.
A fin de poder seleccionar las células
transformadas de manera efectiva, se introduce, además del gen que
codifica el carácter que se investiga, un gen marcador. Se
seleccionará preferentemente un gen que comunique una resistencia a
un antibiótico. Las células se seleccionan a continuación para el
cultivo en el medio que contiene este antibiótico. Sólo las células
que poseen el gen con resistencia podrán multiplicarse. La presencia
del gen de interés puede comprobarse igualmente mediante la
hibridación con el ADN complementario del ADN introducido.
La producción de recombinación según la
invención se transfiere al interior de una célula de la planta
diana. La célula de la planta diana puede ser una parte de una
planta completa o puede ser una célula aislada o parte de un tejido
que puede ser regenerado en el interior de una planta completa. La
célula de una planta diana puede seleccionarse de entre cualquier
especie de planta monocotiledónea o dicotiledónea. Las plantas
adaptadas que comprenden cualquier planta con frutos, tales como
especialmente los tomates, los mangos, los melocotones, las
manzanas, las peras, las fresas, los plátanos, los melones, los
pimientos, los pimientos dulces, el pimiento de España, las plantas
con hojas, flores o cualquier otro órgano en los que se desee
modificar el contenido en carotenoides.
Los productos de recombinación según la
invención pueden ser utilizados para transformar cualquier planta,
utilizando cualquier técnica adaptada para transformar plantas según
la invención. Las células de las plantas monocotiledóneas y
dicotiledóneas pueden ser transformadas de diferentes maneras
conocidas por el experto en la materia. En la mayor parte de los
casos, las células de estas plantas, particularmente cuando son
células de plantas dicotiledóneas, pueden ponerse en cultivo para
generar una planta completa que se reproduce a continuación
engendrando generaciones sucesivas de plantas modificadas
genéticamente. Puede utilizarse cualquier procedimiento adaptado
para la transformación de las plantas. Por ejemplo, plantas
dicotiledóneas, tales como el tomate y el melón, pueden ser
transformadas utilizando el plásmido Ti Agrobacterium. Dichas
plantas transformadas pueden reproducirse por cruzamiento, o por
cultivo de la célula o del tejido.
Un séptimo objeto según la invención se refiere
a una planta, o fragmento de la planta, especialmente fruto, grano,
pétalo, hoja, que comprenda células definidas según el sexto objeto
de la invención.
Las plantas o fragmentos de plantas,
genéticamente modificadas según la invención con un vector que
comprende una secuencia transcrita, especialmente para aumentar la
producción de carotenoides, comprenden una tasa elevada en precursor
de la vitamina A con relación a la tasa normal producida por la
planta.
Los carotenoides, además de su función en el
color de la planta, ejercen igualmente una función de protección de
las plantas contra los daños que pueden producir una elevada
intensidad luminosa. De este hecho, las plantas, que contienen por
modificación genética una tasa muy elevada de estos carotenoides,
pueden presentar un gran interés para las zonas en las que se
efectúa el cultivo con cambios de temperatura importantes. Las
plantas modificadas genéticamente pueden presentar colores
diferentes, según haya aumentado o disminuido la síntesis de
carotenoides. Más especialmente, los productos de recombinación de
OTBC pueden utilizarse para estimular o inhibir la producción de
colores asociados a los carotenoides producidos en reacciones de
desaturación, por ejemplo un rojo de licopeno, o derivados de
productos como el color amarillo/naranja asociado al
beta-caroteno. La estimulación de la producción de
los beta-carotenos, con un producto de recombinación
transcrita de sobreexpresión, puede permitir producir pimientos de
color amarillo/anaranjado, o bien de un color determinado por un
derivado de los beta-carotenos tal como un rojo más
intenso, por el hecho de la biosíntesis de capsorrubina o de
capsantina. Los pimientos obtenidos se demuestra que son más
apetecibles para el consumidor.
Como ejemplo de plantas genéticamente
modificadas según la presente invención, se citarán más
especialmente las plantas con frutos. Los frutos de estas plantas
pueden ganar en atractivo para el consumidor, estimulando o
intensificando en el interior un color específico. Como otras
plantas que pueden ser modificadas genéticamente, se pueden citar
los tubérculos tales como los rábanos, los nabos y las patatas,
incluso los cereales tales como el maíz, el trigo, la cebada y el
arroz.
Las plantas modificadas genéticamente según la
invención, pueden contener igualmente otros productos de
recombinación, por ejemplo productos de recombinación que tengan
otros efectos, especialmente en la maduración de los frutos. Por
ejemplo, los frutos que poseen un color muy intenso, modificado
según la presente invención, pueden contener igualmente productos de
recombinación, ya sea los que inhiben la producción de determinadas
enzimas tales como la poligalacturonasa y la peptinaesterasa, ya sea
los que interfieren con la producción de etileno. Los frutos que
contienen estos dos tipos de productos de recombinación pueden
engendrarse, ya sea mediante transformaciones sucesivas, ya sea
cruzando dos variedades que contienen cada una uno de los productos
de recombinación, seleccionando a continuación de entre la
descendencia los que contienen los dos productos de
recombinación.
El octavo objeto de la invención se refiere a un
procedimiento para modificar la producción de carotenoides en una
planta, ya sea aumentando la producción de carotenoides, o
disminuyendo o inhibiendo la producción de carotenoides por la
planta, en relación con el contenido normal de carotenoides
producidos por la planta, comprendiendo dicho procedimiento la
transformación de células de dichas plantas que deben transformarse
con un vector definido en el quinto objeto según la invención.
Un noveno objeto según la invención se refiere a
un procedimiento para producir carotenoides en una célula de la
planta, o eucariota u procariota, comprendiendo dicho procedimiento
la transformación de las células de dichas plantas, de las células
eucariotas o procariotas que deben transformarse con un vector
definido en el quinto objeto según la invención.
Los beta-carotenos, producidos
por un organismo eucariota o procariota que expresa un producto de
recombinación que codifica la enzima OTBC, pueden ser extraídos
para ser utilizados como colorante, antioxidante o precursor de la
vitamina A.
Por último, la invención se refiere también a un
procedimiento para la selección del compuesto que presenta un
herbicida característico según el cual se pone en contacto dicho
agente con células o membranas de las células, especialmente células
de la invención, y se observa una disminución del consumo de oxígeno
por las membranas de dichas células, ligadas a la inhibición de la
oxidasa terminal asociada a la biosíntesis de carotenoides. Las
técnicas apropiadas para efectuar esta observación se ilustran
especialmente en el ejemplo 6.
La figura 1 presenta la secuencia de ADNc y la
secuencia de aminoácidos correspondiente a la OTBC. El péptido
N-terminal del transcrito potencial del cloroplasto
está subrayado. El punto probable de escisión está indicado mediante
un asterisco (*). Los triángulos blancos indican la posición de los
intrones.
La figura 2 muestra la comparación entre la
proteína OTBC y la proteína AOX del grano de soja. (+) indica los
aminoácidos similares. Los aminoácidos encuadrados forman parte de
los dominios previstos en la hélice de la transmembrana. Los motivos
de enlace del hierro están subrayados.
La figura 3 presenta la alineación de las
secuencias en los aminoácidos para el tomate (T), el pimiento dulce
(P) y Arabidopsis (A) y la secuencia de consenso. En esta
secuencia de consenso, los aminoácidos conservados están indicados
en letras mayúsculas y los aminoácidos relativamente conservados
están indicados en letras minúsculas.
La figura 4 representa el consumo de oxígeno en
las membranas celulares de E. coli para las células testigo
transformadas por un vector de clonación de la invención y para la
células que expresan el producto del gen "IMMUTANS" (plastid
terminal oxidase).
Ejemplo
1
Se ha provocado la mutación mediante la
utilización de un transposón introducido en el genoma de la planta
Arabidopsis thaliana cultivar
landsberg-erecta.
Esta técnica se describe ampliamente en un
artículo (Long D., Martin, M., Sundberg, E., Swinburne, J.,
Puangsomlee P. y Coupland, G. (1993) The maize transposable element
system Ac/Ds as a mutagen in Arabidopsis: Identification of an
albino mutation induced by Ds insertion. Pro. Natl. Science
USA, 10, 10370-10374) y ha sido puesta en
práctica por otros en el laboratorio de George Coupland en el John
Innes Centre for Plant Science, Colney, Norwich, NR47UH, Nordwich,
Gran Bretaña.
La transposición del elemento Disociador (Ds)
móvil utilizado aquí ha sido desencadenada por la producción de la
proteína transposasa (o transposasa del elemento promotor, Ac).
Entre la descendencia de una planta que ha
sufrido la transposición del elemento Ds, se han identificado
varias plantas en el aspecto mutante albino, diferentes de la
silvestre por ausencia de pigmentación verde (clorofila). Se ha
identificado asimismo plantas de aspecto silvestre pero que
transmiten la mutación a su descendencia. Estas plantas están
identificadas como heterozigotos, llevando la mutación en un solo
cromosoma. Las plantas homozigóticas tienen un fenotipo mutante y
llevan la mutación en los dos cromosomas homólogos.
Esta experiencia ha sido realizada con el fin de
probar que la mutación observada está producida por la inserción
del elemento Ds en un gen necesario para el buen funcionamiento de
la planta y de su aspecto silvestre.
El elemento móvil, o transposón, Ds, está
construido de manera que lleva un gen resistente al antibiótico
higromicina (descrito en las referencias anteriores). Se ha hecho
brotar la descendencia de 35 plantas heterozigóticas que llevan la
mutación albina sobre un medio gelatinoso que contiene una dosis
letal de higromicina, todas las plantas que llevan la mutación son
asimismo resistentes a la higromicina. Se concluye que la mutación
está ligada al gen resistente que lleva el transposón.
Se ha aislado una parte del ADN de la planta
resistente al antibiótico higromicina, yuxtaponiendo el transposón.
Esto se ha hecho según el método IPCR o PCR inversa descrito en las
referencias anteriores.
Mediante el experimento conocido como
"transferencia Southern" se ha resaltado que las líneas que
llevan la mutación presentan una alteración del ADN genómico. Esta
alteración se pone de manifiesto cuando se utiliza como "sonda"
la fracción del ADN aislada yuxtaponiendo el transposón.
Utilizando un método de cribado del banco
genómico de ADN, se ha aislado un clon que contiene un fragmento
del ADN genómico que puede contener la versión silvestre inalterada
del gen interrumpido en el mutante.
Se ha construido el banco de ADN cribado. Se
describe en la publicación de Whitelam, G. C., Johnson, E., Peng,
J., Carol, P., Anderson, M. L., Cowl, J. S. y Harberd, N. P. (1993)
Phytochrome A null mutants of Arabidopsis display a
wild-type prenotar sin hite lignito. The Planta
Cell 5, 757-768.
Se ha determinado la secuencia total de un
fragmento de restricción obtenido por digestión ofimática del clon
del ADN genómico por la enzima EcoR I. La secuencia obtenida
comprende 3.000 pares de bases. Entre estas 3.000 pares de bases, se
encuentra una parte idéntica a la secuencia del fragmento límite
aislado previamente, confirmando la identidad entre el ADN aislado y
el gen interrumpido por el transposón.
Se ha utilizado un banco de ADNc, que es un
banco comercial suministrado por CLONTECH Laboratories, Inc. Se
trata de un banco de ADNc construido a partir de extractos de ARNm
de Arabidopsis thaliana, transformados en ADNc, clonados a
continuación en el vector plasmídico pGAD10.
A partir de este banco de datos de ADNc, y según
las técnicas habituales, utilizando el gen identificado
anteriormente como sonda, se ha aislado varios clones que contienen
un ADNc de un tamaño de aproximadamente 1.400 pares de bases.
Se ha determinado la secuencia total del ADNc y
demuestra que ésta está comprendida en su totalidad en el fragmento
de ADN genómico identificado anteriormente. Se ha colocado la parte
codificadora (o exones) y la parte no codificadora (intrones) del
gen en la secuencia del gen. El gen lleva 9 exones y 8 intrones. La
inserción del transposón Ds está identificada al principio del
segundo exón e interrumpe por lo tanto la parte codificadora del
gen.
La secuencia del ADNc presenta un codón de
partida potencial seguido de un marco de lectura abierto de 350
aminoácidos, que codifica una proteína potencial de 39 kDa
denominada OTBC. Una investigación de la homología utilizando el
programa blastp [(Altshul et al. (1997), Gapped BLAST and
PSI-BLAST: a new generation of protein database
search programs Nucleics Acids Res. 25,
3389-3402] ha puesto de manifiesto una homología
débil pero significativa con los polipéptidos que pertenecen a la
familia de las proteínas oxidasa alternativa o terminal oxidasa de
mitocondrias (AOX). No se ha encontrado ninguna otra homología
significativa. La homología comienza en el aminoácido 111 y presenta
29% de identidad (45% de similitud) con la oxidasa de soja. A pesar
de la débil identidad con la proteína AOX, una investigación por
ordenador de las estructuras secundarias y de los dominios
potenciales de la significación biológica ha puesto de manifiesto
una similitud estructural entre la proteína OTBC y AOX. Los dominios
en hélice de transmembrana encontrados en AOX están situados en
posiciones similares sobre la secuencia peptídica de OTBC, lo que
sugiere una localización membranosa de OTBC y asimismo una
configuración similar a la de AOX en la membrana. Además, un motivo
de enlace del hierro se encuentra conservado entre OTBC y AOX. La
alineación de las secuencias entre las proteínas OTBC y AOX muestra
una inserción de 19 aminoácidos en la proteína OTBC que corresponde
a una parte de los exones 7 y 8.
La secuencia N-terminal de la
proteína OTBC presenta las características de un péptido de señal
del cloroplasto, que es rico en leucina, arginina y serina/treonina.
Un análisis por ordenador del potencial péptido de señal (programa
informático psort, Nakai y Kanehisa, 1992) ha sugerido una diana
posible de OTBC a nivel de los compartimentos de los tilacoides del
cloroplasto.
El aspecto del mutante es próximo al de un
mutante ya descrito en la bibliografía: el mutante "immutans",
Wetzel C. M., Jiang C-Z., Meehan L. J., Voytas D.
L., Rodermel S. R. (1994) Nuclear-organelle
interactions: the immutans variegation mutant of Arabidopsis is
autonomous and impaired in carotenoid biosíntesis, Plant
Journal 6, 181-175.
Se ha cruzado el mutante "immutans" (alelo
moteado, de la referencia anterior) con el que se ha aislado según
la invención. La descendencia del cruzamiento es de aspecto mutante,
que es un resultado alcanzado si las dos mutaciones afectan al mismo
gen. Se ha podido afirmar pues que el gen identificado corresponde a
la versión silvestre del locus IMMUTANS y el mutante obtenido lleva
una versión interrumpida del gen cuyo producto es entonces
inactivo.
El primer objeto de la presente invención se
distingue por consiguiente del mutante anterior, porque codifica una
proteína que presenta una actividad ofimática idéntica o equivalente
a la de la OTBC, aunque el producto codificado por "immutans"
no tiene actividad.
Ejemplo
2
El vector pBI121 (comercializado por Clontech
Laboratories, Inc.) es un vector adaptado a esta construcción.
Conlleva una zona T-ADN que la
bacteria Agrobacterium tumefaciens puede transferir en el genoma de
las plantas. Esta zona T-ADN conlleva, entre otros,
un promotor constitutivo (el promotor denominado 35S del virus
CaMV), el gen GUS seguido del terminador NOS (del gen de nopalina
sintetasa). El gen GUS que no presenta ningún interés para la
invención, se sustituye por un ADNc que codifica la OTBC. Este ADNc
se dispondrá por consiguiente bajo el control del promotor 35S y del
terminador NOS.
Cualquier otro promotor constitutivo o no (en
este último caso, deberá ser específico del órgano del que se desea
modificar las propiedades) y cualquier otro terminador son
igualmente utilizables.
Un ADNc que codifica la OTBC ha sido subclonado
originalmente en la secuencia de restricción Notl del plásmido
bacteriano pBluescript KS: de este modo se han flanqueado las
secuencias de los cortes BamHI en 5' y SacI en 3'.
Este ADNc es escindido del plásmido pBluescript
KS por las enzimas de restricción BamHI y SacI. Este fragmento
BamHI-SacI se inserta en el vector pBI121 cortado
por estas enzimas: la secuencia BamHI se encuentra en 3' del
promotor 35S y en 5' del gen GUS, la secuencia SacI se encuentra en
3' del gen GUS y en 5' del terminador NOS.
Después de la ligadura, se seleccionan los
derivados del vector pBI121 en el que el ADNc que codifica la OTBC
(es decir sin intrón) ha sustituido al gen GUS.
Ejemplo
3
El vector de transformación de la planta
derivado de pBI121 obtenido en el ejemplo 2 se introduce en la cepa
LBA4404 de Agrobacterium por electroporación. La cepa
recombinante se selecciona en presencia de 50 \mug/ml de
kanamicina.
Esta cepa transformada de Agrobacterium
se utiliza para la transformación de células de plantas, por
ejemplo de tabaco.
La técnica utilizada con este fin y que puede
ser sustituida por cualquier otra técnica de transformación, es la
de la infección de discos foliares de plantas de tabaco cultivados
in vitro. Las células transformadas de plantas se seleccionan
en presencia de kanamicina. El antibiótico cefotaxima elimina
Agrobacterium. Los discos foliares se cultivan en medio de
cultivo vegetal en presencia de hormonas vegetales (auxina y
citoquininas) que favorecen el crecimiento de callos. Los callos
resultantes del crecimiento de las células transformadas se utilizan
para la regeneración de plantas completas por las técnicas
clásicas. Por ejemplo, los callos son transferidos al medio de
cultivo vegetal en presencia de citoquinina para provocar la
formación de brotes. Estos se cortan a continuación y se transfieren
al medio de cultivo vegetal sin hormona a fin de regenerar las
raíces. Los antibióticos kanamicina (para seleccionar el crecimiento
de los tejidos transfor-
mados) y cefotaxima (para eliminar completamente Agrobacterium) se mantienen durante todas las fases del cultivo.
mados) y cefotaxima (para eliminar completamente Agrobacterium) se mantienen durante todas las fases del cultivo.
Las plantas transformadas se ponen en el cultivo
de forma estéril en presencia de kanamicina y cefotaxima a
continuación se transfieren a la tierra y se cultivan en un
invernadero hasta la cosecha de las semillas. La presencia del
transgén se ha confirmado por hibridación del ADN genómico de estas
plantas con una sonda específica resultante del vector de
transformación utilizado.
Ejemplo
4
Se ha utilizado el fragmento de ADNc de
"immutans" de Arabidopsis que codifica el péptido OTBC
maduro como sonda para investigar un banco de ADNc de pimiento verde
o rojo en condiciones no severas. Todos los clones positivos que se
han analizado, parece que se derivan del mismo gen, como lo sugieren
las secuencias idénticas observadas en la zona no traducida en 3'.
La secuencia de ADN del clon completo está presente en la lista de
secuencias bajo el indicador SEC. ID nº: 3. La secuencia deducida en
aminoácidos se presenta en la lista de secuencias con el indicador
SEC. ID nº: 4. El ADNc de pimiento se ha utilizado a continuación
para aislar el ADNc correspondiente a partir de un banco de ADNc de
tomate rojo (SEC. ID nº: 5).
La figura 3 presenta la comparación entre la
secuencia deducida en aminoácidos citada anteriormente y las
secuencias de la OTBC de pimiento y de Arabidopsis.
Los péptidos de señal utilizados para el
reconocimiento de los plástidos han puesto de manifiesto una
similitud de secuencia, a excepción de la zona
N-terminal y de la zona cerca del punto de escisión
supuesto (ATR/Q-AT). Los polipéptidos de OTBC maduro
comparten por lo tanto una fuerte similitud de secuencia, lo que
significa que presentan las mismas propiedades.
Una alineación de las secuencias de la OTBC ha
puesto de manifiesto además la presencia de dos dominios de
transmembrana potenciales conservados, separados por un segmento
hidrófilo muy conservado. El dominio N-terminal es
esencialmente hidrófilo y contiene un segmento largo de aminoácidos
poco conservados. El dominio C-terminal es también
principalmente hidrófilo y contiene un motivo (EAEH) conservado que
concuerda con un supuesto punto de fijación del hierro (ExxH).
Además, la zona contiene 6 restos de cisteína conservados en la
OTBC, mientras que el resto del polipéptido está desprovisto de
restos de cisteína.
Algunos de estos restos de cisteína pueden estar
implicados en la dimerización covalente de la proteína.
Ejemplo
5
A fin de definir el mecanismo de expresión de
los genes de la OTBC, se ha extraído el ARN total del fruto en
diferentes fases de maduración. El mecanismo de expresión ha sido
determinado por transcriptasa inversa del ARN completo, seguido de
una reacción de polimerización en cadena
(RT-PCR).
El gen de la OTBC se expresa en el transcurso
del desarrollo y de la maduración del fruto para el pimiento.
Además, existe un mecanismo de expresión similar al de los genes que
codifican las carotenoide-desaturasas, es decir la
fitoeno-desaturasa y la
zeta-caroteno-desaturasa. Se observa
un aumento de la tasa de transcripción entre la fase verde no madura
y la fase verde madura (fruto de tamaño adulto), seguido de otro
aumento entre la fase verde madura y la fase de degradación (signos
visibles precoces de cambio de color). La tasa de transcripción
permanece a continuación bastante constante (con una ligera
disminución en el transcurso de la etapa de enrojeci-
miento).
miento).
El gen de la OTBC se expresa asimismo durante el
desarrollo y la maduración del fruto en el tomate.
En el tomate, presenta también un mecanismo de
expresión similar al de los genes que codifican las
carotenoide-desaturasas
(fitoeno-desaturasa y
zeta-caroteno-desaturasa). Se
observa un aumento de la tasa de transcripción entre la fase verde
no madura y la fase verde madura (fruto de tamaño adulto), seguido
de otro aumento más fuerte entre la fase verde madura y la fase de
degradación.
Cuando la huella de la proteína de los frutos
del pimiento y del tomate se ha buscado, utilizando anticuerpos
dirigidos contra la OTBC, este polipéptido se ha encontrado en
diferentes fases de desarrollo del fruto. Estos ensayos han puesto
en evidencia un aumento de la tasa de la proteína OTBC, desde la
fase verde madura hasta la fase de degradación. Esta tasa de
proteína ha quedado elevada en el transcurso de la maduración del
fruto.
Estos resultados demuestran que los genes de la
OTBC se expresan y que la proteína OTBC está presente en el fruto.
De manera análoga a las enzimas estructurales que intervienen en la
desaturación de los carotenoides, el gen de la OTBC se induce y las
proteínas se acumulan en el transcurso de la maduración cuando
aumenta la biosíntesis de los carotenoides.
Los resultados expuestos en la descripción
evidencian que la OTBC es un elemento del sistema de la biosíntesis
de los carotenoides.
Se puede considerar la utilización de la
proteína OTBC para modificar la biosíntesis de los carotenoides,
especialmente en los tejidos o las células vegetales o en las
bacterias que presentan un sistema de biosíntesis de carotenoides
poco eficaz o ineficaz. La OTBC podría ser producida al mismo tiempo
que las enzimas estructurales de la biosíntesis de los carotenoides
para aumentar la eficacia de la producción de carotenoides.
Ejemplo
6
Se ha insertado un producto de síntesis
constituido por la región codificadora del polipéptido maduro OTBC
de Arabidopsis en un vector de expresión procariota (tal como
pQE31, comercializado como QIAGEN, entendiéndose que cualquier otro
vector conduciría a resultados idénticos).
La región codificadora destinada a ser insertada
en el vector de expresión puede ser obtenida por escisión con ayuda
de enzimas de restricción que intervienen junto a los codones
correspondientes al punto de escisión del péptido de señal.
Alternativamente, puede efectuarse una
ampliación para PCR de la región codificadora. Los oligonucleótidos
siguientes se utilizarán con ventaja para la ampliación de la
secuencia de la OTBC de Arabidopsis:
5'-GCAACGATTTTGCAAGACG-3'
y
5'-TTAACTTGTAATGGATTTCTTGAG-3'
También pueden emplearse otros productos de
ensamblado que conllevan la región codificadora para la OTBC en
otras especies (como el pimiento o el tomate).
Estos plásmidos pueden ser introducidos en las
células de E. coli según las técnicas clásicas. A fin de
obtener la proteína recombinante en E. coli, se cultivan las
células en las condiciones siguientes: 10 ml de un precultivo de
toda la noche en un medio enriquecido se depositan en 300 ml de
medio M9 (Na_{2}HPO_{4} 34 mM, KH_{2}PO_{4} 22 mM,
NH_{4}Cl 18 mM, NaCl 8,5 mM, MgSO_{4} 1 mM, CaCl_{2} 0,1 mM,
tiamina 1 mM) que contiene 0,2% de glicerol y el aporte en
antibiótico necesario para interrumpir el crecimiento de las células
que han perdido el plásmido. El desarrollo de bacterias se continúa
a 37ºC en agitación intensa hasta la fase de desarrollo
semiexponencial, preferentemente hasta la lectura de una densidad
óptica de 0,3 a 600 nm.
Tras la producción de este gen híbrido para el
inductor IPTG y la adición de FeSO_{4} a 1 mg/l, el cultivo se
mantiene a 25ºC en agitación intensa durante 3 horas. Las células se
recogen a continuación por centrifugación a 4ºC, se lavan con
MgCl_{2} 10 mM, sacarosa 0,75 M, Tris-HCl 20 mM, a
pH 7,5, y de nuevo se centrifugan. Las células se ponen a
continuación en suspensión en sacarosa 0,75 M,
Tris-HCl 20 mM, a pH 7,5, y se lisan por adición de
lisozima (0,2 mg/ml) y EDTA (25 mM) a 30ºC durante 30 minutos,
después se someten a un choque osmótico por adición de dos volúmenes
de agua, después se tratan con ultrasonidos a 0ºC. Una
centrifugación normal en una centrifugadora de velocidad lenta
permite eliminar las células no lisadas y los residuos. Una
centrifugación a gran velocidad (por ejemplo en un rotor 50Ti de
Beckman a 40.000 revoluciones/min) a 4ºC conduce a la obtención de
una membrana que se pone en suspensión en sacarosa 0,75 M,
Tris-HCl 20 mM, a pH 7,5, y se mantiene a 4ºC.
Para probar la actividad ofimática de la OTBC,
se mide el consumo de oxígeno por las membranas resultantes con
ayuda de un electrodo de oxígeno normal y se expresa en nmoles de 02
consumidos por minuto y por gramo de proteína.
Como muestra la Figura 4, la adición de NADH
provoca el consumo de oxígeno a la vez en la membrana testigo
(transformada por el vector de clonación) y en la membrana que
contiene la OTBC. Este consumo de oxígeno aumenta cuando se añade
platoquinona 0,2 mM. La adición de KCN inhibe fuertemente el consumo
de oxígeno en las membranas testigo. En las membranas que contienen
OTBC, se observa un consumo de oxígeno resistente a cianuro elevado.
Esto refleja la actividad de oxidorreductasa platoquinol: oxígeno de
OTBC, cuya actividad puede ser inhibida por adición de galato de
n-propilo (nPG) 0,5 mM. La adición de nPG (0,5 mM) a
la membrana testigo antes de KCN no produce el efecto que indica que
el compuesto no interfiere con el flujo normal de electrones en las
membranas de E. coli (Figura 4).
Esta prueba puede utilizarse para estudiar el
poder inhibidor de un compuesto sobre la actividad de la OTBC. Así
un inhibidor puede ser controlado cuando no hay efecto sobre la
cadena respiratoria endógena de E. coli, en particular sobre
el complejo I de la cadena que oxida a NADH. No obstante, si se da
este caso, NADH puede ser sustituido por el succinato como donante
de electrones sin pasar por el complejo I. Cualquier inhibidor de
actividad de la OTBC puede probarse en plantas apropiadas, mediante
riego del suelo, adición de un medio de cultivo y colocación directa
en las hojas, frente a la inhibición de la biosíntesis de los
carotenoides que lleva consigo un blanqueamiento y por lo tanto
encontrar una aplicación como herbicida. El ensayo descrito puede
modificarse para realizar un reconocimiento a gran escala de los
inhibidores de la actividad de la OTBC, y su aplicación como
herbicida. En este caso, la medición del consumo de oxígeno con
ayuda de un electrodo de oxígeno será preferentemente sustituida por
otro método de medición.
La actividad de oxidasa de OTBC puede
determinarse midiendo el consumo de NADH en el transcurso de la
reacción, por ejemplo, por electrofotometría, midiendo la
absorbancia a 340 nm. El consumo de NADH y la producción de NAD en
el transcurso del ensayo debe llevar consigo una disminución de la
absorbancia a 340 nm. Alternativamente, puede utilizarse cualquier
coloración específica de NAD o de NADH para controlar los cambios de
NAD o de NADH durante el ensayo.
Si se utiliza el succinato como donante de
electrones, en el ensayo, la actividad respiratoria de las
membranas bacterianas conducirá a la oxidación del succinato en
fumarato. A continuación la actividad de la OTBC podrá prolongarse
en presencia de KCN, midiendo las concentraciones en succinato y
fumarato que evolucionan en el transcurso el ensayo.
Según otra posibilidad, puede utilizarse un
donante artificial de electrones. El meto-sulfato de
feazina (PMS) es un ejemplo. Puede oxidarse mediante la succinato
deshidrogenasa de las membranas bacterianas; es incoloro en estado
reducido y es de color amarillo en estado oxidado.
Las muestras de membrana bacteriana que
contienen la OTBC van a oxidar el PMS en presencia de KCN. Un
inhibidor de actividad de OTBC impedirá la aparición del color
amarillo debido a la oxidación del PMS. Esta prueba de puesta en
práctica sencilla puede realizarse en las cajas multipocillos que
permiten realizar un seguimiento en masa de las moléculas
susceptibles de inhibir la actividad de la OTBC.
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<110> UNIVERSITÉ JOSEPH FOURIER
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<120> Secuencia de ADNc que transcribe un
ARNm que codifica la oxidasa terminal asociada a la biosíntesis de
carotenoides y utilizaciones
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<130> OTBC
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<140>
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<141>
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR9813283
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<151>
1998-10-20
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<160> 5
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<170> Patentln Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 1
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<211> 1396
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<212> ADN
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<213> Arabidopsis thaliana
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 351
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<212> PRT
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<213> Arabidopsis thaliana
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 1387
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<212> ADN
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<213> pimiento
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 357
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<212> PRT
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<213> pimiento
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 1284
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<212> ADN
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<213> tomate
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<400> 5
Claims (15)
1. Secuencia de ADN que comprende por lo menos
una región codificadora constituida por:
- -
- la secuencia nucleotídica representada por la SEC. ID nº: 1, que transcribe un ARNm, codificando este ARNm la enzima OTBC (Oxidasa Terminal asociada a la Biosíntesis de Carotenoides) descrita por la SEC. ID nº: 2, o su complementaria.
- -
- cualquier secuencia nucleotídica modificada:
- que presenta, con relación a la SEC. ID nº: 1, una o más modificaciones seleccionadas de entre las adiciones, las supresiones y las sustituciones de nucleótidos,
- que presenta con la SEC. ID nº: 1 por lo menos 70% de identidad,
- y que transcribe un ARNm que codifica él mismo la OTBC descrita por la SEC. ID nº: 2, o una proteína modificada de dicha OTBC, presentando una actividad ofimática equivalente a la de la OTBC descrita por la SEC. ID nº: 2 o su complementaria.
2. Secuencia según la reivindicación 1,
caracterizada porque comprende por lo menos una región
codificadora constituida por cualquier secuencia nucleotídica
modificada:
- que presenta, con relación a la SEC. ID nº: 1, una o más modificaciones seleccionadas de entre las adiciones, las supresiones y las sustituciones de nucleótidos,
- que presenta con la SEC. ID nº: 1 por lo menos 80% de identidad,
- y que transcribe un ARNm que codifica él mismo la OTBC descrita por la SEC. ID nº: 2, o una proteína modificada de dicho OTBC, presentando una actividad ofimática equivalente a la de la OTBC descrita por la SEC. ID nº: 2 o su complementaria.
3. Secuencia según la reivindicación 1,
caracterizada porque comprende por lo menos una región
codificadora constituida por una secuencia nucleotídica que
transcribe un ARNm que codifica una proteína descrita por la SEC ID
nº: 4.
4. Secuencia según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque dicha secuencia
nucleotídica se selecciona de entre la SEC ID nº: 3 y la SEC ID nº:
5.
5. ARNm transcrito a partir de una secuencia
según la reivindicación 1, o a partir de su complementaria.
6. Proteína que presenta una actinidad
ofimática, Oxidasa Terminal asociada a la Biosíntesis de
Carotenoides, codificada por una secuencia según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4.
7. Proteína según la reivindicación 6,
caracterizada porque se selecciona de entre SEC ID nº: 2, SEC
ID nº: 4 y la secuencia codificada por la SEC ID nº: 5.
8. ADN recombinante caracterizado porque
comprende una secuencia de ADN según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, estando insertada dicha secuencia en una
secuencia heteróloga, transcribiendo dichas secuencias toda o parte
de una secuencia de ARNm que codifica toda o parte de la enzima
OTBC, presentando esta última una actividad ofimática equivalente a
la enzima OTBC de la planta.
9. ADN recombinante según la reivindicación 8,
caracterizado porque comprende los elementos necesarios para
controlar la expresión de la secuencia nucleotídica insertada,
especialmente una secuencia promotora y una secuencia de terminación
de la transcripción.
10. Vector de transformación de plantas,
adaptado para aumentar la biosíntesis de los carotenoides, que
comprende toda o parte de la secuencia nucleotídica de SEC. ID nº: 1
según la reivindicación 1, que codifica toda o parte de una enzima
involucrada en la síntesis de los carotenoides, descrita por la SEC.
ID nº: 2, precedida por un origen de replicación de la transcripción
de las plantas, de manera que el vector pueda generar el ARNm en las
células de las plantas.
11. Célula de planta transformada por un vector
según la reivindicación 10.
12. Planta o fragmento de planta, especialmente
fruto, semilla, pétalo, hoja, que comprende las células según la
reivindicación 11.
\newpage
13. Procedimiento para modificar la producción
de carotenoides en una planta, o bien aumentando la producción de
carotenoides, o bien disminuyendo o inhibiendo la producción de
carotenoides por la planta, en relación con el contenido normal de
carotenoides producidos por la planta, comprendiendo dicho
procedimiento la transformación de las células de dichas plantas
que deben transformarse según la reivindicación 10.
14. Procedimiento para producir carotenoides en
una célula de la planta, o eucariota u procariota, comprendiendo
dicho procedimiento la transformación de las células de dichas
plantas, de las células eucariotas o procariotas que deben
transformarse con un vector según la reivindicación 10.
15. Procedimiento para la selección de
componentes que comprende un carácter herbicida, según el cual se
pone en contacto dicho agente con las células o las membranas de las
células de la reivindicación 11, y se observa una disminución del
consumo de oxígeno por las membranas de dichas células, ligada a la
inhibición de la oxidasa terminal asociada a la biosíntesis de los
carotenoides.
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