JPH08509122A

JPH08509122A - 熟成する果実において異種遺伝子ｅ．ｇ．５−アデノシルメチオニンヒドロラーゼを発現するためのトマトｅ８由来プロモーターの使用

Info

Publication number: JPH08509122A
Application number: JP6523335A
Authority: JP
Inventors: キースベストウィック，リチャード; ジェイ．フェロ，アドルフ
Original assignee: エピトープ，インコーポレイテッド
Priority date: 1993-04-09
Filing date: 1994-04-08
Publication date: 1996-10-01
Also published as: WO1994024294A1; CA2159101C; SG49118A1; US5723746A; CN1121356A; AU6530994A; EP0693127A1; CN1134541C; AU690547B2

Abstract

(57)【要約】植物におけるエチレン生合成を減少させるためのAdoMetアーゼの使用は、トマト由来のE8プロモーターの組織およびステージに特異的な性質の利用により促進される。AdoMetアーゼ発現が熟成するトマト果実に制限されることが示される。E8プロモーターのいくつかの領域の機能的性質が記載される。E8プロモーターおよび本明細書に記載される改変体はAdoMetアーゼ遺伝子および他の遺伝子の発現のために有用で調節可能なプロモーターを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】熟成する果実において異種遺伝子E.G．5-アデノシルメチオニンヒドロラーゼを発現するためのトマトE8由来プロモーターの使用発明の分野本発明は、E8プロモーター、および本明細書に記載された改変体の、AdoMetアーゼ（AdoMetase）遺伝子を含む異種（heterologous）遺伝子の発現に有用な調節可能プロモーターとしての使用を記載する。発明の背景エチレン（ethylene）は、植物代謝の強力な調節物質であって、痕跡量で作用し、そして他の植物ホルモンと相互作用する。エチレンは正常な生理的条件下では気体である。低濃度であっても、エチレンは植物に対し充分なホルモン効果を有する。エチレンの効果は、植物自体が生成したエチレンであろうと外部より与えられたエチレンであろうと数多くあり、劇的であり、そして商業的にかなり重要である。多様な生理的効果には以下のようなものがある：落葉；花の退色；花のしぼみ；葉の黄化；葉の上偏成長；および、果実ならびに蔬菜（vegetables）における熟成（ripening）の刺激。エチレンは、果実、葉、あるいは花のような器官全体および選択された細胞群の両方において植物の老化を促進する。老化は、植物において通常枯死に至る自然な遺伝的に制御された退化プロセスである。通常、植物組織からのエチレン産生は低い。しかしながら、熟成および老化プロセスの間には大量のエチレンが生成される。化学物質、温度窮境（temperatur e extremes）、水ストレス、紫外線光、昆虫による損傷、病気、あるいは機械的な傷害により引き起こされる外傷の後にもまた大量のエチレンが生成される。その様な外傷状態下で植物により生成されるエチレンは「傷エチレン」あるいは「ストレスエチレン」と呼ばれる。果実および蔬菜において、切断あるいは挫傷によるエチレン産生刺激は、非常に大きく、貯蔵有効性にかなり影響し得る。エチレンが誘導する葉の褐色化は、レタスおよびタバコを含む多くの植物における損失の共通の基礎である。特定の組織では、ほんの少量のエチレンへの曝露でさえ、近接の植物あるいは植物組織において新たに生産するようなエチレンのなだれ産生を引き起こし得る。この自己触媒効果は顕著であり、輸送および貯蔵の間に果実品質の損失をもたらし得る。特に収穫後の貯蔵寿命と取り組む現行技術は、何十年もの間存在するが、高い費用、副作用、およびエチレン生成の完全な遮断することができないなどの課題に束縛されている。制御された気相（CA）での貯蔵、化学処理、包装、および照射がこの群に含まれる。 CA設備は以下の工程によりエチレン生合成を遅らせる：（i）低温、（ii）酸素濃度を３％未満に減ずること、および（iii）貯蔵域内の二酸化炭素濃度を３％-５％の範囲までに上げること。高価なガス洗浄機（scrubber）がしばしば付加され、気相に既に発散したエチレンを減少させる。CA設備は高額な建設費がかかり、ユーティリティー費用が高く、そしてエチレン生成および副作用を完全に排除し得ないことが欠点である。さらに、CA貯蔵技術は外部のエチレンを制御し得るのみであり、植物組織内部に存在するエチレンは制御し得ない。CA貯蔵はまた、望ましくない副作用を生じ得：高CO₂濃度、低O₂濃度、あるいは低温により損傷が生じ得る。他の処理は、化学的処理により植物組織内のエチレン生合成を制限することである。アミノエトキシイニルグリシン（aminoethoxyinylglycine）（AVG）は抗生物質リゾビトキシン（rhizobitoxine）の類似化合物であり、そのような阻害剤の一つである。しかしながら、AVGはその高い毒性のために食品には化学添加剤として使用し得ない。チオ硫酸化銀（silver thiosulfate）（STS）もまた、果実の熟成および花の退色を遅らせるために有効であるがまた有毒であり、食品には使用され得ない。さらに、STSは特定の花にのみ作用し、しばしば黒斑を引き起こす。最近、エチレン生合成が損傷したトランスジェニック植物を得る分子遺伝学的アプローチが報告されている。Hamiltonらは、トランスジェニック植物において発現するアンチセンス遺伝子を用いてエチレン合成を阻害することにより、トマトEFE（pTOM13）に対するcDNAクローンを同定した。Oellerらは、エチレンの生合成経路における律速酵素である1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸（1-ami nocyclopropane-1-carboxylate）シンターゼに対するアンチセンスRNAの発現が、トマト植物体において果実熟成を阻害することを示した。Kleeらは、土壌細菌からのACCデアミナーゼをコードする遺伝子をクローニングし、それをトマト植物体に導入した。トランスジェニック植物におけるエチレン合成の減少は、外見上、任意の成長機能の表現型異常を引き起こさなかった。しかしながら、これらの植物からの果実は、有意な熟成の遅れを示し、そして成熟（mature）果実は非トランスジェニック対照果実に比べて、少なくとも６週間長く堅いままであった。発明の要旨本発明は、トランスジェニック植物の開発を、より詳細には、果実を実らせるトランスジェニック植物の開発を記載する。これらの植物は、S-アデノシルメチオニンヒドロラーゼ（S-adenosylmethionine hydrolase）酵素（AdoMetアーゼ）のような目的の遺伝子産物をコードするDNA配列を含有する。AdometアーゼはS- アデノシルメチオニンをホモセリン（homoserine）および5'-メチルチオアデノシン（5'-methylthloadenosine）に加水分解し得る。本発明のトランスジェニック植物においては、目的の遺伝子産物が、E8由来プロモーターの転写制御下で発現する。目的の遺伝子産物をコードするDNA配列は、通常E8プロモーターに隣接するDNA配列（同種の（homologous）配列）ではなく、この配列はE8プロモーターと異種（heterologous）である。 E8遺伝子プロモーターは、トマトE8遺伝子のコード配列の5'側に位置する調節領域を含む。E8プロモーターに相同のプロモーターは、標準的なハイブリダイゼーション法あるいはDNA増幅法により同定され得る。図13はE8プロモーターの一部分の代表的なヌクレオチド配列を示す。二つのE8プロモーター領域が本発明により規定され、SE8プロモーターは図13に表された全領域を含み、下流E8プロモーターは1189から2214の塩基配列として示される領域を含む。これらのプロモーターのいずれをも本発明のトランスジェニック植物を作り出す際に使用し得る。 AdoMetアーゼ酵素をコードする配列は、以下を含む多くのバクテリオファージから得られ得る：大腸菌（Escherichia coli）バクテリオファージT3、コリファージ（coliphage）BA14、クレブシエラ（Klebsiella）ファージK11、およびセラシア（Seratti）ファージIV。例示のAdoMetアーゼ酵素をコードする配列は、大腸菌バクテリオファージT3に由来し、そして代表的なコード配列が図11に示される。本発明の一つの実施態様は、E8プロモーターの制御下で発現する異種DNA配列を含むトランスジェニックトマト植物体である。本発明はまた、トランスジェニックトマト果実の細胞をも包含する。AdoMetアーゼをコードし、および発現する DNA配列を含むトランスジェニックトマト植物細胞およびトランスジェニックトマト果実細胞が本発明に包含され、ここで、AdoMetアーゼはE8プロモーターの転写制御下で発現する。本発明はまた、植物の細胞中の遺伝子産物の発現を調節する方法をも包含する。この方法において、ベクターは、植物細胞内で遺伝的選択に有用な遺伝子を含有する第一のDNA配列を含んで提供され、ここでこの配列には植物宿主細胞中でその配列の発現を可能にするに効果的である調節エレメントが近接している。ベクターはまた、目的の遺伝子産物をコードする第二のDNA配列をも包含し、ここで第二のDNA配列はE8プロモーターの転写制御の下で発現し、そしてこのDNA配列は、通常はE8プロモーターと隣接していない配列である。一つの実施態様において、第二のDNA配列は、S-アデノシルメチオニンをホモセリンおよび5'-メチルチオアデノシンに加水分解するS-アデノシルメチオニンヒドロラーゼ酵素をコードする。上記ベクターは植物宿主細胞を形質転換するために使用される。これらの細胞は、トランスジェニック植物を作成するために培養される。ベクターが果実を生じるトランスジェニック植物を作成するために使用される場合、果実細胞が目的の遺伝子産物、すなわちAdoMetアーゼ酵素を発現し得る。AdoMetアーゼ酵素をコードする配列は上記と同じ供給源から得られ得る。ベクターは、アグロバクテリウムを介する形質転換、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、およびマイクロプロジェクタイルボンバードメントを含む多くの形質転換法により宿主植物細胞内に導入され得る。植物細胞内での遺伝的選択に有用な代表的遺伝子は、カナマイシン耐性を与える遺伝子である。本発明は、植物形質転換法において有用な上記のベクターを包含する。選択された遺伝子、例えばAdoMetアーゼ遺伝子の発現はE8プロモーターあるいはそれの誘導体を含む、組織あるいはステージ特異的なプロモーターにより調節され得る。本発明はまた、本明細書に記載されたE8プロモーターの改変体の使用を包含し、それらの制御の下に置かれた任意の遺伝子に組織および/ またはステージ特異的な発現を与える。図面の簡単な説明図１は、正常およびストレス両条件下でメチオニンからエチレンを合成する代謝反応を概略的に示す。図２は、AdoMetアーゼをコードする遺伝子の遺伝子操作を記述する工程を概略的に示す。図３は、トマトE8プロモーターエレメントおよびプロモーター配列を増幅および単離するために使用されるプライマーを示す。図４は、pGA-ESKNからのpGA-SESKNの構築に含まれる工程を概説し、nosT転写終止配列が後にくるAdoMetアーゼ（SAMアーゼ）コード配列に隣接するE8遺伝子のエレメントを示す。図5Aは、pGA-ESKNベクターの構造を概略的に表す。図5Bは、pGA-SESKNベクターの構造を概略的に表す。図６は、２つの異なるトランスジェニック植物から得られた果実中のAdoMetアーゼmRNAレベルを示すオートラジオグラムの写真を示す。図７は、図６に表された結果を数値で示す。これらの結果は、熟成するトマトにおけるAdoMetアーゼmRNAレベルに対するE8プロモーターの改変の影響を示す。図８は、異なるステージの熟成するトマト中のAdoMetアーゼ活性の相対レベルを表すグラフである。図９は、果実のブレーカーステージ（breaker stage）移行後10日間の４つの異なるトランスジェニック植物の果実（図9A、ES 19-2；図9B、LS 4-2；図9C、E S 35-1；および図9D、ES22A-1）におけるエチレン産生のデータを表す。図10は、SESKNトランスジェニック植物より得られたトマトの収穫後の貯蔵寿命を示す。図11は、バクテリオファージT3由来のAdoMetアーゼ遺伝子のSAM-K改変の配列を表す。図12Aは、ベクターpESKNの構築に含まれる工程を概説する。図12Bは、pESKNのベクターpGA-ESKNへの改変に含まれる工程を概説する。図13は、トマトE8遺伝子の上流マイナス2216塩基対領域の配列を表す。発明の詳細な説明本出願は、本明細書に記載されたE8プロモーターの改変体の使用を記載し、それらの制御の下に置かれた任意の遺伝子に組織および/またはステージ特異的な発現を与える。 I.植物におけるS-アデノシルメチオニンヒドロラーゼの使用アミノ酸メチオニンは、植物組織におけるエチレンの前駆体であることが示されている（Imasekiによる概説）。しかし、メチオニンは直接の前駆体ではなく、エチレンに変換される前に、最初にそのスルホニウム化合物であるS-アデノシルメチオニン（SAM）に、次いでアミノシクロプロパン-1-カルボン酸（ACC）に変換されねばならない。正常およびストレス両条件下でメチオニンからのエチレン合成のための代謝反応は、図１に表され、以下のように要約される：メチオニン→SAM→ACC→エチレン ACCシンターゼはSAMのACCおよび5'-メチルチオアデノシン（MTA）への分解を触媒する。この酵素反応はエチレン生成における律速段階であるようである。例えば、天然の植物ホルモンであるインドール酢酸（IAAあるいはオーキシン）は、ACCシンターゼの合成を誘導することによりエチレン生成を促進する。逆に、メチオニンからのSAMの合成およびACCからのエチレンの生成はオーキシン誘導を必要としない。さらに、傷害および果実の熟成はACCシンターゼの形成を誘導し、それ故SAMの ACCへの変換を誘導する。ACCシンターゼ反応の他の生成物であるMTAは、連続的なエチレン産生のために十分なメチオニンを供給するように、リサイクルされてメチオニンに戻されなければならない。MTAからのメチオニンへのこのリサイクル経路が植物組織に存在していることが示されている（Adamsら；Kushadら）。M TAの分解は、MTAがACCシンターゼの強力な阻害剤であるという発見を考慮して重要性を増している。正常植物組織におけるMTAの分解およびリサイクルの重要性は、それ故、以下の二面性を有する：1）MTAによるエチレン合成の直接阻害を妨げること、および2）連続的なエチレン合成に十分なメチオニンを供給すること。この代謝経路の要約を図1aに示す。植物組織中でのMTA分解の最初の工程は、特異的なMTAヌクレオシダーゼによる、このヌクレオシドの5-メチルチオリボース（5-methylthioribose）（MTR）への加水分解である。MTRは、メチオニン形成にそのメチルチオ部分を供給するだけでなく、そのリボースからこのアミノ酸の合成に向かう４つの炭素に寄与する。それ故メチルチオ基はリサイクルにより保存される。この経路は単にエチレン生合成に対してメチオニンの供給を維持するのみで、メチオニン合成の正味の増加とはならないことに注意すべきである。本明細書および同一出願人による1990年12月12日出願のPCT国際出願PCT/US90/ 07175で報告された、植物におけるエチレン生合成を減少させるためのアプローチは、酵素S-アデノシルメチオニンヒドロラーゼをコードする遺伝子を利用する。大腸菌バクテリオファージT3によりコードされるこの酵素はAdoMetをホモセリンおよびMTAに加水分解する。この酵素は、推奨される名称AdoMetヒドラーゼ（A doMetアーゼ）として、または他の名称S-アデノシルメチオニン開裂酵素（SAMアーゼ）として知られている（Studierら）。反応の両生成物（即ち、ホモセリンおよびMTA）は、メチオニンにリサイクルされる；MTAは先に示した（図１）ように、そしてホモセリンは植物組織に存在することが知られる代謝経路を通じてリサイクルされる。 AdoMetアーゼ遺伝子は同定され、単離され、クローン化および配列決定されている（Hughesら、1987a；Hughesら、1987b）。この遺伝子は、17105および13978 ダルトンのポリペプチドを特定する２つのフレームが合った（inframe）リーディング配列を含む。両ポリペプチドとも同一のオーカー（ochre）コドンで終止する。このことにより、17kdのポリペプチドの82％と同一であり、より長いポリペプチドのカルボキシル末端で開始する14kdのポリペプチドを生じる。両ポリペプチドは部分的に精製された細胞中に存在し、クローン化された遺伝子を発現する大腸菌由来である（ Hughesら、1987b；Studierら、１976）。AdoMetアーゼ遺伝子すなわちSAMアーゼ遺伝子をコードする他のバクテリオファージは、コリファージBA14、クレブシエラファージK11、およびセラシア（Serratia）ファージIVである（Mertensら；Ho rstenら）。植物細胞におけるAdoMetアーゼの発現が有する植物メチオニンリサイクル経路に対する影響を図1bに概略的に示す。AdoMetアーゼ遺伝子を発現するトランスジェニック植物を使用し、そしてエチレン産生をモニターして、本発明を支持するために実施された実験は、AdoMetアーゼの上記経路に関する影響はエチレンを産生する分枝路を「短絡」することであることを示す：そのようなトランスジェニック植物では、葉組織および果実における産生を含むエチレン産生が減少する。 II.AdoMetアーゼをコードする遺伝子異なるバクテリオファージは、それらのDNA配列に変種（variation）を有する AdoMetアーゼ遺伝子を含むと期待され得る。バクテリオファージコード配列からのAdoMetアーゼコード配列の単離は、バクテリオファージT3からのAdoMetアーゼに対して先に記載されたように達成され得る。あるいは、AdoMetアーゼコード配列に対する縮重（degene rative）ハイブリダイゼーションプローブが作成され得、そして相同の配列の存在について、選択されたバクテリオファージ遺伝子のフラグメントを保有するプラスミドをスクリーニングするために使用され得る。AdoMetアーゼ酵素活性は標準的な生化学試験により評価され得る（例えば、実施例５を参照）。さらに、AdoMetアーゼのアミノ酸配列は、改変された生物学的活性を有する酵素を生成するための遺伝学的手法により改変され得る（以下参照）。生物学的活性における増加は、植物におけるエチレン生合成を制御するためにより少量の酵素の使用を可能にし得る。一連の組換えDNA操作を、アグロバクテリウム発現ベクター内に配置する前にA doMetアーゼ遺伝子において実施した。最初に、M13HB1由来のMaeIII〜BamHIフラグメント（Hughesら、1987a）を、pUC19プラスミドベクターへサブクローン化してpUC19-SAMを生成した（実施例１）。植物におけるAdoMetアーゼ遺伝子の翻訳効率を増大させるために、ATG開始コドンを囲む核酸配列の部位特異的変異誘発を実施した。合成二本鎖構造である39塩基対のオリゴヌクレオチドを合成し、そしてその遺伝子の5'末端でBamHI〜XmnIフラグメントに置換した（図２）。この置換の正味の効果はネイティブのT3配列中の配列CACCAAATGAを最適の真核生物翻訳開始配列であるGCCACCATGGに変えることであった（Kozakら；Lutckeら）。この変化はまた、異なるプロモーターへの融合を促進するNcoI部位（CCATGG）をSAMアーゼの開始コドンに導入する。AdoMetアーゼコード配列に対する唯一の改変は、アミノ酸位置２のアミノ酸であり、イソロイシン（isoleucine）からバリン（valine）へ変えられた：これは高度に保存的なアミノ酸変化である。AdoM etアーゼの改変形態をSAM-Kと名付けた（図11）。 SAM-Kを有する組換えワクチニア（vaccinia）ベクター（vv:SAM-K）を構築した。アフリカミドリザル細胞あるいはT3-感染細菌細胞におけるこのベクターの発現を、遺伝子について同一細胞で発現した場合に、ネイティブのT3遺伝子に対して比較した。AdoMetアーゼの比活性は、vv:SAM-K感染細胞中においてT3感染細菌細胞中より高く、SAM-KはAdoMetアーゼの十分に機能的な改変体をコードしていることを示す。本発明の支持において行われた実験は、トランスジェニックトマト植物体およびトランスジェニックタバコ植物体においてAdoMetアーゼの構成的発現を示した。これらの植物において、リーフディスクアッセイ（leaf disk assay）で測定されたようにこれら植物のエチレン合成能は有意に減少した。 III.プロモーターが調節するSAMアーゼ遺伝子発現調節可能なプロモーターが本発明の方法に用いられた。一つの例示の調節可能プロモーターはトマトE8遺伝子プロモーターである。E8遺伝子の発現は、（i）熟成開始時、および（ii）トマトをエチレンで処理することにより誘導されることが示されている（Deikma nら、1988；Lincolnら；Giovannoiら）。E8プロモーターの配列は公開されており（Deikmanら、1988；Deikmanら、1992）、マイナス2216塩基対領域のDNA配列を図13に表す。図13に示された配列を使用して、プライマーをポリメラーゼ連鎖反応（PCR）において使用するために調製し、トマトゲノムDNA由来の1124塩基対のプロモーターを増幅した（実施例１）。プライマーは各末端に独特な制限部位を有して設計され、pUC19内で、SAM-K遺伝子の5'側に正しい向きでプロモーターを配置するために使用された（図３）。プロモーターフラグメントの3'末端は、E8遺伝子産物のATG開始コドンがNcoI部位中のATGとして使用されるように配置されたNcoI部位（CCATGG）を有していた。このことは、完全なE8プロモーターを、介在配列なくSAM-Kアミノ酸コード配列の直前に正確に配置することを可能にした（実施例１、図12A）。２つのAdoMetアーゼ発現ベクター、pGA-ESKNベクター（図１2A、12Bおよび図5 A）およびpGA-SESKNベクター（図４および図５B）を構築した（実施例１）。pGA -ESKNベクターはAdoMetアーゼコード配列に隣接するE8プロモーターの一部分を含む（図４、下流E8プロモーター）。-1124 E8領域にハイブリダイズするゲノムトマト配列を含むλEMBL-3クローンを単離し、そして-1124 E8（下流E8）プロモーターの上流領域の供給源として使用した。制限酵素地図分析およびサブクローニングは、約1200bp のHindIII〜XbaIフラグメントを元の-1124bpのE8プロモーターのすぐ上流の領域として同定することを可能にした（図４）。この領域をpGA-ESKN構築物に付加してpGA-SESKNを得た。pGA-SESKNはAdoMetアーゼ遺伝子に融合した約-2254bpのE8 プロモーターを含んでいた（図４、SE8）。これら両ベクターをトマト植物体に移入し（実施例２）、AdoMetアーゼを発現するトランスジェニック植物を作成した。アグロバクテリウムを基礎にした方法に加えて、多くの方法、例えばエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、およびマイクロプロジェクタイルボンバードメントを植物宿主の形質転換を引き起こすために用い得る。これらの方法は当該分野において周知である（Kl einら；Mikiら；Belliniら）。さらに、これらの方法は選択されたDNAを植物ゲノムに導入するための手段を提供し：そのようなDNAは、AdoMetアーゼコード配列と機能的に隣接したE8遺伝子プロモーターから成るDNAカセットを含み得る。高感度のRNAアーゼ保護アッセイ（RPA）を使用して、いくつかのトランスジェニック植物を、それらのAdoMetアーゼmRNA合成能について評価した（実施例３）。図６および７は、異なる果実熟成ステージで２種のトランスジェニック植物（ ESKNおよびSESKN）由来の果実を使用したRPAの結果を示す。これら植物からの他の組織は（未成熟および成熟葉、花、および茎を含む）、AdoMetアーゼRNAの存在についてはネガティブであった。ESKNトランスジェニック植物におけるAdoMet アーゼの発現は成熟後のグリーン果実（green fruit）に対しては調節されたが、AdoMetアーゼ発現は完全に熟し切った（ripe）果実では止まっていたことが繰り返し（図６および７に示されるように）観察された。他方、SESKNトランスジェニック果実は、熟し切った果実中てAdoMetアーゼmRNAの発現を維持した。 AdoMetアーゼ酵素活性の存在が、AdoMetアーゼmRNAのレベルと相関するか否かを決定するために、ESKNトランスジェニック植物から異なるステージで得た４つの果実からの抽出物を使用してAdoMetアーゼアッセイを実施した（実施例５）。図８は、１本のpGA-ESKNトランスジェニック植物からの成熟した、グリーン（gr een）果実、ブレーカー（breaker）果実、オレンジ（orange）果実、および熟し切った（ripe）果実におけるAdoMetアーゼ活性のレベルを示す。これらのデータは、AdoMetアーゼ活性が、熟成する果実においてAdoMetアーゼmRNAのレベルと概して同じ発現パターンに従うことを示す。上に示されたデータは、AdoMetアーゼを発現する構築物中のネイティブのE8プロモーターの上流領域を含むことが、熟成するトランスジェニックトマトにおいて長寿命のAdoMetアーゼ遺伝子発現を増強することを示唆する。図６は、pGA-SE SKN 22A-1株からおよびpGA-ESKN 18株からのRPAの結果を示す。ESKN 18株は、全てのESKNトランスジェニック株の中で最も高いAdoMetアーゼ発現レベルの一つを有した。AdoMetアーゼmRNAの定量測定を図７に示す。この結果は、-2254bp E8プロモーター発現が果実成長の完全に熟し切ったステージを通じて維持されることを示す。この発現パターンは、図６にも示された-1124bp E8プロモーター（ESKN）mRNAレベルとは明らかに対照的である。ブレーカーステージで採取された果実からの日毎に分析されたエチレン放出の測定値を図９に示す。SESKN22A株および35-1株からの果実がリコピン（lycopene ）を生成する速度は、オレンジ果実成長に必要な時間により明示されたように減少した。さらに、これらのトマトから生成されるエチレンの総量は約80%減少した。AdoMetアーゼの発現およびエチレン生合成の減少は、分析された25種のSESK Nトランスジェニック植物において厳密に相関していた。室温（22℃）で貯蔵された場合に、より少量のエチレンを合成したSESKNトマトを、それらの貯蔵寿命特性を評価した（実施例５）。SESKN22A-1株および35-1 株からのそれぞれ３つの果実を、形質転換されていない正常トマトと比較した。老化を、トマト果皮上の収縮およびしわを視覚的に観察することにより決定した。堅さは測定しなかったが、トランスジェニック株ではかなりより堅いことが目立っていた。この老化評価の結果を図10に示す。ブレーカーステージ後55日でさえ、22A-1トマトは堅いままであり、正常トマトの軟化して誘導される老化からというよりも脱水で傷ついているようであった。これらの結果は、トランスジェニック植物におけるAdoMetアーゼ酵素に対する組織特異的な調節を提供する能力を示す。さらに、２つの異なるE8プロモーター（下流E8およびSE8）を使用して得られた結果は、これらのプロモーターが、任意の目的の遺伝子産物の同様な組織特異的な発現に対して使用されることを示唆する。組織あるいはステージに特異的なプロモーターは、直近（下流）の遺伝子の翻訳を、特定の植物組織、あるいは植物または植物組織の特定の成長ステージに調節するDNA領域である。これらのプロモーターを使用して発現すると有用な他の遺伝子産物は、（i）香りあるいは色を変化させるタンパク質、および（ii）リコピン合成を改変するタウマチン（taumatin）遺伝子によりコードされるような酵素を包含する。さらに、いくつかの遺伝子−−例えば構成的に発現すると植物にとって有害である任意の遺伝子、の発現を果実のような特定の組織に限定することは有益である。そのような遺伝子は、必要な代謝物を枯渇する分解性酵素をコードする遺伝子を含み得る。上述の結果より明らかなように、E8プロモーター領域の誘導体は、それらの制御下で発現する遺伝子の、組織およびステージ特異的な発現のオン/オフスイッチとして使用され得る。本方法は全ての高等植物に適用可能である。E8プロモーター以外の調節可能なプロモーターもまた、本発明の実施に使用され得、限定されないが以下を含む：トマト由来のE4遺伝子プロモーター；およびトマト由来のエチレン形成酵素（EF E）のプロモーター。さらに、E8プロモーターの２つの領域（下流E8および上流E 8、図４）を、他の植物種のゲノムを代表するDNAライブラリーに対するハイブリダイゼーションプローブとして使用し得る。E8プロモーターに相同な配列が、次いでそれらが単離された植物種中で組織特異的な発現について試験される。そのようなプロモーターおよびE8 プロモーター自体は、本明細書に記載された方法を使用して異種植物系における調節可能な発現について試験され得る。GUS（β-グルクロニダーゼ）（β-glucu ronidase）のようなレポーター遺伝子を、これらのプロモーターから組織特異的な調節可能発現を試験するために使用し得る。GUSタンパク質の発現は、蛍光、分光光度あるいは組織化学的アッセイにより容易に測定され得る（Jefferson、1 987）。 E8プロモーターの改変体を、プライマー特異的増幅（Mullis；Mullisら）あるいはオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（Ausubelら；Sambrookら）の様な標準的な組換え操作により種々のトマト品種から単離し得る。そのプロモーターがAdoMetアーゼの発現のために使用され得る別の遺伝子は、トマト由来のポリガラクツロナーゼ（polygalacturonase）遺伝子プロモーターである。以下の実施例は本発明を例示するが、決して本発明を限定することを意図しない。材料および方法トマト種子（Lycopersicon esculentum Mill．var．cerasiforme（Dunal）Ale f．cv.Large Red Cherry）をPeto Seed，Inc.（Saticoy，CA）より入手し、標準的な温室条件下で育成した。収穫した果実を室温（22℃）で貯蔵した。実施例１ AdoMetアーゼ遺伝子のクローニングＡ．AdoMetアーゼ遺伝子の単離 AdoMetアーゼ遺伝子を、精製T3 DNA由来のAluI-HaeIII制限フラグメント（Hug hesら、1987a）上で同定した。バクテリオファージT3はATCC No.11303-B3（アメリカンタイプカルチャーコレクション，12301 Parklawn Dr.，Rockville MD 208 52）により入手可能である。DNAフラグメントを、まず、バクテリオファージM13 MP8ベクター（Pharmacia LKB Biotechnology，Inc.，Piscataway，NJ）にクローニングした。MaeIII〜BamHIフラグメントを、pUC19プラスミドベクター（Phar macia）にサブクローニングし、pUC19-AdoMetアーゼ（pUC19-SAMアーゼ；図２）を作製した。pUC19-AdoMetアーゼベクターの作製は、同一出願人の1990年12月12 日出願のPCT国際出願PCT/US90/07175に記載され、これは本明細書中で参考として援用される。このベクターを大腸菌に形質転換し、後続の構築実験およびDNA 配列決定のためのDNA供給源として使用した。Ｂ．クローン化されたAdoMetアーゼ遺伝子のアミノ末端配列の改変クローン化されたAdoMetアーゼ遺伝子を、合成二本鎖オリゴヌクレオチドを使用して、SAMアーゼのATG開始コドンの周囲のヌクレオチド配列を変化させることにより、真核生物に共通の翻訳開始部位（Kozak；Lutckeら）を含むようにさらに処理する。プラスミドpUC19-AdoMetアーゼを、XmaIおよびBamHIで切断し、そして1.9kbおよび1.3kbのフラグメントをアガロースゲル電気泳動後の電気溶出により精製した。図３に示された配列を有する二本鎖合成オリゴヌクレオチドリンカーを1.9k bフラグメントに連結し、そして過剰なリンカーを取り除くためにこの連結したD NAをXmaI切断にさらした。次いで、リンカーを連結された1.9kbフラグメントを低融点アガロース上での電気泳動により再精製し、1.3kbフラグメントに連結してプラスミドpUC19-SAM-K を形成した。変化させた遺伝子領域をDNA配列解析にかけた。その遺伝子配列を図11に示す。この遺伝子をSAM-Kと命名し、以下の植物発現ベクターを構築するために使用した。このプラスミドDNAはまた、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、あるいはマイクロプロジェクタイルボンバードメントによって植物宿主を直接形質転換させるために使用し得る。Ｃ．トマトE8プロモーターを使用したベクター構築２つの異なる形態のE8プロモーターを、SAM-Kを含むベクターを構築するために使用した。第一のプロモーター（-1124bp）をトマト（Lycopersicon esculent um var．cerasiform）のDNAから、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて単離した（Mullis； Mullisら；Perkin-Elmer Cetus，Norwalk CT）。PCR反応に使用したプライマーはDeikmanら（1988）により記載された配列を基本にした。オリゴヌクレオチドプライマーの配列を図３に表す。このオリゴヌクレオチドを、増幅したE8-プロモーターフラグメントの5'末端および3'末端に、それぞれ制限エンドヌクレアーゼ部位（XbaIおよびNcoI）を組み込むよう設計した。これらの制限エンドヌクレアーゼ開裂部位はpUC19-SAM-Kベクター（図２参照）へのサブクローニングを促進した：NcoI部位は、合成オリゴヌクレオチド中のATG開始コドン領域の近くに存在する。図12Aは、ベクターpNCN（Pharmacia，Inc.、Piscataway、NJ）およびpUC-SAM- K（上述）から始まるベクターpESKNの作製の概略を示す。E8プロモーターの配列（下流E8プロモーター）は図13中で1189から2214までの塩基として表される配列と同様である。図12Bは、本発明において使用するアグロバクテリウムベクターを作製するための一つのアプローチを概説する。しかし、例えばpESKNに存在するE8/AdoMetアーゼカセットを、植物の形質転換に有用な多くのベクターに組み込み得る。アグロバクテリウム二元性（binary）ベクターは、pGA482（Anら、1985）から開発された（Anら、1988）。ここで、pGA482は、ノパリン（nopaline）合成遺伝子プロモーターと融合したネオマイシンホスホトランスフェラーゼII遺伝子を含むpBIN19誘導体（Clontech Laboratories）である。得られたベクターはp GA-ESKNと呼ばれ、これを図5Aに示す。第二のE8プロモーター（-2254bp）を、E8遺伝子全体を含むλEMBL-3クローンから単離した。そのE8遺伝子クローンを、PCRから得られたE8プロモーターフラグメント（上記）をプラークリフトフィルターハイブリダイゼーションにおけるハイブリダイゼーションプローブとして使用して、Clontech Laboratories（Pal o Alto，CA）から入手したトマト（Lycopersicon esculentum var．VFN8）のゲノムライブラリーから選択した。E8遺伝子を有するλクローンをポジティブなハイブリダイゼーションシグナルにより同定した。そのE8運搬ファージは精製されたプラークであり、λファージDNAを単離した。 λE8ゲノムクローンを、E8プロモーターの約-2254から-1124bpまでの上流領域であるHindIII〜XbaIフラグメントの供給源として使用した。このフラグメントをHindIIIおよびXbaI部位でpGA-ESKNの約-1124bpのE8プロモーターの5'側に挿入した（図４）。この得られたプラスミドをpGA-SESKNと命名した。図13は、１つの品種からの-2216bp領域のヌクレオチド配列を示す（Deikmanら、1988、1992）。（約-2254のプロモーターの構築に使用される）HindIII〜XbaIフラグメントは、この-2216bp配列の5'側からその配列の末端までに別の配列を含む。図４は、pGA-SESKNに存在するE8プロモーターの２つの部分の関係を示す。標準的な組換えDNA技法を全ての構築に用いた（Adamsら；Ausubelら）。別の λベクターであるpGEM7Zf（+）SAM-Kを、pGEM 7Xf（+）（Promega,Inc.、Madison、WI）の同一部位に、pUC19:SAM-K由来のBamH I〜KpnIのAdoMetアーゼフラグメントをクローン化することにより構築した。 pBI121（Clontech Laboratories，Inc.、Palo Alto、CA）の様な他の植物クローニングベクターもまた、本発明の実施に使用され得る。AdoMetアーゼ遺伝子配列の上流の植物のプロモーターを変化させて、トランスジェニック植物における組織特異的発現、温度依存的発現、あるいは光依存的発現を獲得し得る。別の有用な植物プロモーターは、上述のE8プロモーターに加えて、構成的カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）プロモーター（Pharmacia）である。実施例２植物の形質転換 pGA-ESKNおよびpGA-SESKNのAdoMetアーゼプラスミドを、直接形質転換法を使用してアグロバクテリウムに別々に導入した。アグロバクテリウムツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）C58株の無力化誘導体である、アグロバクテリウムツメファシェンスEHA101株（Hoodら）を用いて、コーディング配列を植物に導入した。この菌株はT-DNA欠損Tiプラスミドを含む。pGA-ESKNおよびpGA-SESKNのAdoMetアーゼプラスミドをEHA101内に、本質的にはNagelらにより記載されたエレクトロポレーションを使用して移入した。簡潔には、アグロバクテリウムツメファシエンス培養物をYEP培地（１リットルあたり10gの酵母抽出物、 10gのペプトン、および５gのNaCl）中で対数増殖期の中間期（OD 600 0.5から1. 0）まで培養した。氷上で冷却後、50mlのこれらの細胞をペレットにし、１mlの氷冷20mM CaCl₂に再懸濁し、そして１mlのアリコートに分液した。代表的には、１μgのプラスミドDNAを、アリコートに加え、氷上で30分間インキュベートした。次いで、このアリコートを液体窒素中で凍結し、37℃で５分間解凍した。１mlのYEP培地を加え、そして28℃で２時間インキュベートした。細胞をペレットにし、50μlのYEPに再懸濁し、そして20μg/mlのカナマイシン（ka namycin）を含むYEP寒天プレート上に播いた。カナマイシン耐性形質転換コロニーは２日以内に出現する。トマト子葉組織の外植片（explant）を子葉の先端部および基部の両方から切り出した。子葉外植片をタバコフィーダープレート（tobacco feeder plate）上で２日間予備馴化した（Filiattiら）。予備馴化した外植片を目的のpGA-ESKNあるいはpGA-SESKNのAdoMetアーゼプラスミドを含むEHA101に植え付け、そして最後に10mlのEHA101/［pGA-ESKNあるいはpGA-SESKN］の一晩培養物中に５分間置いた。次いでこの外植片を、Fillattiらにより記述されたように、タバコフィーダープレート上で２日間EHA101株と共に培養した。この外植片を、２Z培地、MS塩、ニッチアンドニッチビタミン類（Nitsch and Nitsch vitamins）、３%スクロース、２mg/lセアチン（seatin）、500mg/lカルベニシリン（carbenicillin）、 100mg/lカナマイシンおよび0.7%寒天を含む組織培養培地（Fillattiら）中で培養した。この外植片を、８から10週間組織培養物中で培養した。カルベニシリン処理を全ての培地において２から３ヶ月間その場で続けた。外植片および植物を、それらが土壌植えられるまで、植物から生存可能なアグロバクテリウムツメファシエンス細胞を取り除くための逆選択として、カルベニシリン上に維持した。実施例３ SAMアーゼmRNAを検出するためのRNAアーゼ保護アッセイトランスジェニック植物および野生型植物からの様々な成長ステージのトマト果実をmRNA供給源として使用した。mRNAをトマト細胞から抽出し、Pharmacia，I nc.の「QUICK PREPRNA」キットを使用して精製した。RNAアーゼ保護アッセイ（R PA）をAmbion，Inc.（Hialeah、FL）の「RPAII」キットを使用して製造業者の使用説明書に従い実施した。この方法は以前にLeeらにより記述されている。 Promega，Inc.の「RIBOPROBE IT T7 RNA POLYMERASE SYSTEM」に含まれているように、バクテリオファージT7のRNAポリメラーゼを使用して³²P-UTP標識RNAプローブを作製するために、pGEM7Zf（+）SAM-Kを使用した。放射標識プローブを、プレパラティブポリアクリルアミドゲル上で精製し、１週間後までに使用した。１マイクログラムの単離mRNAを、約10,000CPMのRNAプローブとハイブリダイズし、さらに「RPA II」キットでその使用説明書通りに処理した。簡潔にいえば、１マイクログラムの精製mRNAを10,000CPMのRNAプローブと混合して全量15μlにした。次いで、相補的な配列のハイブリダイゼーションを可能にする20μlのハイブリダイゼーション緩衝液（Ausubelら；Maniatisら；Samb rookら）を加えた。このハイブリダイゼーション溶液をAmbionの「RPAII」キットに供給した。この溶液を90℃まで３〜４分間加熱して全てのRNAを変性させ、そして45℃で一晩インキュベートして相補的な配列をハイブリダイゼーションさせた。この溶液を３℃まで冷却し、ハイブリダイズしていない全てのプローブを分解する（Ambionのキットで提供されている）RNアーゼを加えた。保護されたプローブを、変性ポリアクリルアミドゲル上で分離し、乾燥し、そして16時間までフィルムに曝した。ゲルからそれぞれのバンドを切り取り、バンドを液体蛍光体に溶解し、液体シンチレーションカウントを用いて試料中に存在する放射能を測定することにより、RPAシグナルの定量分析を行った。pGEM5Z（+ ）にセンス方向にクローニングしたAdoMetアーゼフラグメントから合成された様々な量の非標識RNAを使用して標準曲線を作成した。アッセイの直線範囲は、RNA アーゼ保護アッセイにおいて加えられた³²P標識RNAプローブの量に依存したが、代表的には10pgから１ngのmRNAの範囲であった。実施例４エチレン測定個々の果実をガラス容器の中に密封し、ガスクロマトグラフ分析用に２mlのアリコートを採取することにより、0.5から1.0時間にわたってトマトのエチレン放出のアッセイを行った。水素炎イオン化検出器を備えたヒューレットパッカード（Hew lett Packard）5890（Palo Alto、CA）ガスクロマトグラフおよび６フィートのPorapak Nカラムをエチレン測定に使用した（Adamsら）。HP Vectraコンピュータと組み合わせられたこのシステムおよび「CHEMSTATION」（Hewlett Pac kard）の現行版は、試料２ml中の0.2nlのエチレン（0.1ppm）もの低いエチレン濃度の測定を可能にする。上部空間中のエチレン測定後、値を組織１グラム１時間あたりのエチレンのnlに変換した。実施例５トランスジェニックトマトの特徴付けＡ．トランスジェニック果実の熟成中のSAMアーゼmRNA レベルに対するプロモーターの効果。トランスジェニック果実を、熟成の３ステージ、ブレーカー（Br）ステージ、オレンジ（Or）ステージ、および熟し切った（Ri）ステージでの２つのトランスジェニック植物、ESKN #18およびSESKN #22Aから選択した。トランスジェニック植物ESKN #18は、Sam-K AdoMetアーゼ遺伝子に隣接する下流E8プロモーター（図４）を含んでいた。トランスジェニック植物SESKN #22Aは、Sam-K AdoMetアーゼ遺伝子に隣接する完全なSE8プロモーター（図４）を含んでいた。熟成するトランスジェニック果実におけるAdoMetアーゼmRNAレベルを実施例３に記述したように決定した。 RNA保護アッセイの産物をポリアクリルアミドゲル上で分離し、X-線フィルムに曝した。RNA保護アッセイの代表的なオートラジオグラムを図６に示す。この図に見られ得るように、AdoMetアーゼmRNAは果実熟成のブレーカーステージでは両方のトランスジェニック植物に存在していた。しかし、果実熟成のオレンジステージおよび熟し切ったステージでは、ESKNトランスジェニック植物のAdoMetアーゼmRNAレベルは、SESKNトランスジェニック植物と比較した場合、低下する。 AdoMetアーゼmRNAレベルを、実施例３で記述したように液体シンチレーションカウントおよび標準曲線に対するmRNA濃度の決定により定量した。図７にこの分析結果を示す。その結果は図６に示された結果と一致している。AdoMetアーゼmR NAは、果実熟成のブレーカーステージでは両方のトランスジェニック植物に存在しており、その濃度はESKN #18において、より低かった。果実熟成のオレンジステージおよび熟し切ったステージにおいて、ESKNトランスジェニック植物のAdoM etアーゼmRNAのレベルは、ブレーカーステージのレベルおよびSESKNトランスジェニック植物の果実のレベルと比較すると、低下する。SESKNトランスジェニック植物のAdoMetアーゼmRNAのレベルは比較的一定のままである。Ｂ．熟成するトランスジェニックトマトにおけるSAMアーゼ活性の相対レベル。 AdoMetアーゼ酵素活性の存在がAdoMetアーゼmRNAのレベルに関連するか否かを決定するために、14C-SAMに基づくAdoMetアーゼアッセイを単一のpGA-ESKNトランスジェニック植物の４つの異なる果実ステージからの抽出物を使用して行った。 AdoMetアーゼ酵素活性についてアッセイする植物組織を、液体窒素中で凍結し、粉末に砕いた。次に、粉末にした組織を1.5倍量の200mM Tris-HCl（pH7.5）、 10mM DTT、および10mM EDTA中に懸濁した。その懸濁液を激しくボルテックスで撹拌し、それから40,000×gで４℃にて20分間の遠心分離に供した。以下のものを50μlの抽出物に加えた：５μlの20μCi/mlで比活性58.0mCi/mmolの¹⁴C-SAM（ DuPont-New England Nuclear、NEC-363）。この反応液を37℃で１時間インキュベートし、次いで40μlの反応液を、セルロース薄層クロマトグラフィー（TLC）プレート（J.T.Baker，Inc.、Phillipsburg、N.J.、Baker-Flex Cellulose F）上にスポットし、70:70:20:40のブタノール：アセトン：酢酸：水で３時間分離した。MTAおよびMTRスポットをオートラジオグラフィーを使用して同定し、切り取り、そして液体シンチレーションを使用してカウントした。図８は、成熟したグリーンステージ、ブレーカーステージ、オレンジステージ、および熟し切ったステージの果実のAdoMetアーゼ活性レベルを示す。AdoMetアーゼ活性のレベルは、SAM（S-アデノシルメチオニン）のMTA（5'-メチルチオアデノシン）およびMTR（5'-メチルチオリボース）への変換百分率として定義される。ES KNトランスジェニック植物においてAdoMetアーゼ活性レベルがブレーカー果実から熟し切った果実への間で減少することは、図７に示されたAdoMetアーゼmRNAレベルと一致している。非形質転換トマト果実の抽出物は、このアッセイに使用される場合、成熟の任意のステージにおいてSAMをMTAあるいはMTRに分解しない。Ｃ．熟成するトランスジェニック果実におけるエチレン産生。 SE8プロモーター（図４）の調節下にAdoMetアーゼ遺伝子を有するトランスジェニックトマトから産生されたエチレンを実施例４に記述されたように測定した。４つのトランスジェニック株からの温室栽培トマトを試験した。分析の結果を図9Aから9Dに表す。図9に示された４つのグラフはそれぞれ、１つのpGA-SESKNトランスジェニック株の果実（Es 19-2、LS 4-2、ES 35-1、およびES 22A-1）と非形質転換対照の果実との比較を表す。対照値（白ヌキ四角）は、４つのグラフのそれぞれにおいて同一であり、２つの異なる植物体からの６つの果実の平均を表す。それぞれのトランスジェニック株の値（黒塗りの記号）は、３つの果実のエチレン測定値の平均である。エラーバーはデータの１×標準偏差を表す。データは、果実熟成のブレーカーステージの後（ブレーカー後）10日の期間を表す。これらのデータは、この10日間にわたってトランスジェニックトマトのエチレン産生量が正常果実に対して減少していることを示す。Ｄ．SESKNトマトの収穫後貯蔵寿命。より少量のエチレンしか合成しないSESKNトランスジェニック植物からのトマトを、22℃で貯蔵した場合の貯蔵寿命特性について評価した。SESKN35-1株、22A -1株、およびLS4-2株のそれぞれからの３つの果実を、２つの非形質転換正常植物体（M16およびM15）からのトマトと比較した。老化を、果実の収縮およびトマト果皮上のしわの発生を目視で検査することにより毎日測定した。これら老化評価の結果を図10に示す。この図の結果から理解され得るように、棒グラフは果実がそれぞれのステージに達する時間を示す：全ての果実をブレーカーステージに採取した。例えば、35 -1株は熟成する（熟し切ったステージ）までに18日要したが、その後27日目に老化に進展した。22A-1株はオレンジ色に変わるまでに７日要し、赤くなるまでに1 3日要し、それから老化するまでに52日要した。ブレーカー後55日目でさえ、22A -1トマトは堅さを維持しており、正常トマトで見られる軟化して誘導される老化からよりも脱水で傷ついているようであった。堅さを上述の５つの植物体のトマトについては測定しなかったが、トランスジェニック株からの果実の方がより堅いことが目立っていた。本発明は、特定の方法および実施態様に関して記載されているが、様々な改変および変更を本発明がら逸脱することなく実施し得ることが認識される。

Claims

【特許請求の範囲】１．トランスジェニックな果実を生じる植物であって、（i）目的の遺伝子産物をコードするDNA配列、および（ii）果実の熟成中あるいは該果実によるエチレン合成により発現が誘導されるトマトE8遺伝子プロモーターと相同なプロモーターを包含し、ここで該DNA配列が該プロモーターに対して異種であり、そして該DNA配列が該プロモーターと作動可能に連結され該産物の発現を可能にする、植物。２．前記DNA配列が前記植物からの果実におけるエチレン生合成を減少するために有効な産物をコードする、請求項１に記載のトランスジェニック植物。３．前記DNA配列が、S-アデノシルメチオニンをホモセリンおよび5'-メチルチオアデノシンに加水分解するS-アデノシルメチオニンヒドロラーゼ酵素をコードする、請求項２に記載のトランスジェニック植物。４．前記DNA配列が、アミノシクロプロパン-1-カルボン酸（ACC）デアミナーゼ、エチレン形成酵素（EFE）アンチセンス分子、およびACCシンターゼアンチセンス分子からなる群より選択される産物をコードする、請求項２に記載のトランスジェニック植物。５．前記プロモーターがトマトE8遺伝子由来である、請求項１に記載のトランスジェニック植物。６．前記E8プロモーターが図13に示された配列から本質的になる、請求項５に記載のトランスジェニック植物。７．果実を生ずる植物の熟成する果実を改変する方法であって、請求項１から６のいずれかに記載の植物を成長させて果実を生ずるトランスジェニックな植物を産生する工程を包含し、ここで該植物により産生される果実が非形質転換正常植物により産生される果実と比較してエチレン生合成が減少している、方法。８．果実の収穫後の貯蔵寿命を延長する方法であって、請求項１から６のいずれかに記載の植物を成長させて果実を生ずるトランスジェニック植物を生成する工程を包含し、ここで該植物により生産される果実が非形質転換正常植物により生産される果実と比較してエチレン生合成が減少している、方法。９．請求項１から６に記載の任意の植物により生産される果実。１０．請求項１から６に記載の任意の植物により生産される種子。１１．請求項１から６のいずれかに記載のトランスジェニック植物の細胞。１２．植物細胞の形質転換に使用される発現ベクターであって、（i）目的の遺伝子産物をコードするDNA配列、および（ii）果実の熟成中あるいは該果実によるエチレン合成により発現が誘導されるトマトE8遺伝子プロモーターと相同なプロモーターを包含し、ここで該DNA配列が該プロモーターに対して異種であり、そして該DNA配列が該プロモーターと作動可能に連結され該産物の発現を可能にする、ベクター。１３．前記ベクターが植物細胞における遺伝的選択に有用な遺伝子を含む第二の DNA配列をさらに含む請求項１２に記載のベクターであって、植物宿主において該配列を発現させるに有効な調節エレメントが該第二のDNA配列に隣接する、ベクター。１４．植物細胞における遺伝的選択に有用な前記遺伝子がカナマイシン耐性を与える、請求項１３に記載のベクター。１５．前記DNA配列が前記植物からの果実におけるエチレン生合成を減少させるに有効な産物をコードする、請求項１２に記載のベクター。１６．前記DNA配列がS-アデノシルメチオニンヒドロラーゼをコードする、請求項１５に記載のベクター。１７．前記DNA配列がアミノシクロプロパン-1-カルボン酸（ACC）デアミナーゼ、エチレン形成酵素（EFE）アンチセンス分子、およびACCシンターゼアンチセンス分子からなる群より選択される産物をコードする、請求項１５に記載のベクター。１８．前記プロモーターがトマトE8遺伝子と相同な遺伝子から得られる、請求項１２に記載のベクター。１９．前記プロモーターがトマトE8遺伝子由来である、請求項１２に記載のベクター。２０．前記E8プロモーターが図13に示された配列から本質的になる、請求項１９に記載のベクター。２１．前記プロモーターが以下の工程により単離される請求項１２に記載のベクター：（i）トマトE8遺伝子DNAの領域に相同な配列を含むプローブ DNA分子を選択する工程；（ii）該プローブを、該プローブ分子と該プローブ分子に相同な標的分子との特異的なハイブリダイゼーションに好都合な条件下で、選択された果実を生ずる植物のゲノム由来の複数の標的DNA分子と接触させる工程；（iii）トマトE8遺伝子と相同なDNA配列を有する標的分子を同定する工程；および（iv）該標的分子に関連するプロモーター配列を単離する工程。２２．トランスジェニックな果実を生ずる植物を生成する方法であって、該植物により生成された果実が改変された熟成する表現型を有し、該方法は：該植物の始原（progenitor）細胞に請求項１２から２１のいずれかに記載のベクターを導入する工程；および該ベクターを含む始原細胞を成長させてトランスジェニックな果実を生ずる植物を産生する工程；を包含し、ここで該植物により生成される果実はエチレン生合成が減少する、方法。２３．前記ベクターを植物宿主へ導入する工程が、アグロバクテリウムを介する形質転換、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、およびマイクロプロジェクタイルボンバードメントからなる群より選択される直接形質転換法により実施される、請求項２２に記載の方法。