TW202216994A - 編碼細胞色素p450之基因及其利用 - Google Patents
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Abstract
本發明之細胞色素P450基因對作用性不同之諸多之化合物顯示代謝活性。本發明之細胞色素P450基因編碼包含序列編號2、4、6及8之任一胺基酸序列之蛋白質。
Description
本發明係關於一種編碼具有特徵性基質特異性之細胞色素P450之基因及其利用。
細胞色素P450(以下稱為P450或CYP)係廣泛地存在於微生物乃至植物、動物等範圍廣泛之生物種中之一組血紅素蛋白。P450具有單加氧酶活性之功能，存在具有各種基質特異性之大量分子種。人類中存在57個分子種之P450，植物中阿拉伯芥存在約250個分子種之P450，水稻存在約450個分子種之P450。已知P450對於人類係主要參與藥物代謝之酶，對於植物係參與二次代謝或藥物代謝之酶。
已明確，參與人類之藥物代謝之P450係以一個分子種催化作用性不同之多種基質，另一方面，植物P450之基質特異性極高，僅識別有限作用性之有限化合物而進行代謝分解(非專利文獻1：Hideo Ohkawa and Hideyuki Inui, Pest Manag Sci 2015; 71: 824 - 828)。尤其是於作物中被特定出參與藥物代謝之P450非常少，僅有大豆之CYP71A10、小麥之CYP71C6v1(非專利文獻2：Balazs Siminszky, Phytochem Rev (2006) 5: 445 - 458)、水稻之CYP81A6(非專利文獻3：Gang Pan et al, Plant Mol Biol (2006) 61: 933 - 943)及CYP72A31(非專利文獻4：Hiroaki Saika et al, Plant Physiology (2014) Vol. 166, pp. 1232 - 1240)，該等P450所能夠代謝分解之藥劑極為有限。具體而言，CYP71A10代謝分解綠麥隆等光化學系II抑制劑，CYP71C6v1代謝分解氯磺隆等ALS(acetolactate synthase，乙醯乳酸合成酶)抑制劑，CYP72A31代謝分解雙草醚鈉鹽等ALS抑制劑。
尤其是關於非專利文獻3中所揭示之水稻之CYP81A6，揭示有對本達隆及磺醯脲具有基質特異性，使用CYP81A6製作對本達隆及磺醯脲具有耐受性之轉形植物(專利文獻1：US 8,049,063 B2)。又，非專利文獻5(The 26
thAsian - Pacific Weed Science Society Conference)中揭示有CYP81A6參與芬昆諾三酮(Fenquinotrione)之代謝。
[先前技術文獻]
[非專利文獻]
[非專利文獻1] Hideo Ohkawa and Hideyuki Inui, Pest Manag Sci 2015; 71: 824 - 828
[非專利文獻2] Balazs Simiznszky, Phytochem Rev (2006) 5: 445 - 458
[非專利文獻3] Gang Pan et al, Plant Mol Biol (2006) 61: 933 - 943
[非專利文獻4] Hiroaki Saika et al, Plant Physiology (2014) Vol. 166, pp. 1232 - 1240
[非專利文獻5] The 26th Asian - Pacific Weed Science Society Conference program book (2017) pp. 232
[專利文獻]
[專利文獻1] US 8,049,063 B2
[發明所欲解決之問題]
然而，迄今尚不知曉植物之P450中對多種化合物具有代謝活性者。因此，本發明係鑒於上述實際情況，其目的在於提供一種編碼新穎之細胞色素P450之基因及其利用，該新穎之細胞色素P450與先前公知之P450不同，對更多之化合物具有代謝活性。
[解決問題之技術手段]
本發明者為了解決上述問題而進行了努力研究，結果成功地鑑定出編碼對於對植物之作用性不同之多種化合物具有代謝活性之細胞色素P450之基因，從而完成了本發明。
即，本發明包含以下者。
(1)一種細胞色素P450基因，其編碼以下之(a)～(c)中任一項所記載之蛋白質。
(a)包含序列編號2、4、6及8之任一胺基酸序列之蛋白質；
(b)包含相對於序列編號2、4、6及8之任一胺基酸序列具有80%以上之同一性之胺基酸序列，且對在HRAC分類中被分類為3之微管聚合抑制劑、在HRAC分類中被分類為12之八氫番茄紅素去飽和酶系(PDS)中之類胡蘿蔔素生物合成抑制劑、在HRAC分類中被分類為14之原紫質原氧化酶抑制劑及在HRAC分類中被分類為18之二氫蝶酸合成酶抑制劑具有代謝活性之蛋白質；
(c)包含藉由多核苷酸編碼之胺基酸序列，且對在HRAC分類中被分類為3之微管聚合抑制劑、在HRAC分類中被分類為12之八氫番茄紅素去飽和酶系(PDS)中之類胡蘿蔔素生物合成抑制劑、在HRAC分類中被分類為14之原紫質原氧化酶抑制劑及在HRAC分類中被分類為18之二氫蝶酸合成酶抑制劑具有代謝活性之蛋白質，上述多核苷酸與包含與序列編號1、3、5及7之鹼基序列互補之鹼基序列之多核苷酸於嚴格之條件下進行雜交。
(2)如(1)所記載之細胞色素P450基因，其特徵在於：上述蛋白質包含(d)或(e)之胺基酸序列。
(d)序列編號10、12、14及16之任一胺基酸序列；
(e)相對於序列編號10、12、14及16之任一胺基酸序列具有80%以上之同一性之胺基酸序列。
(3)如(1)所記載之細胞色素P450基因，其特徵在於：上述蛋白質對在HRAC分類中被分類為2之乙醯乳酸合成酶抑制劑、在HRAC分類中被分類為3之微管聚合抑制劑、在HRAC分類中被分類為6之光化學系II抑制劑、在HRAC分類中被分類為12之八氫番茄紅素去飽和酶系(PDS)中之類胡蘿蔔素生物合成抑制劑、在HRAC分類中被分類為14之原紫質原氧化酶抑制劑、在HRAC分類中被分類為18之二氫蝶酸合成酶抑制劑、及在HRAC分類中被分類為27之4-羥基苯基丙酮酸雙加氧酶抑制劑具有代謝活性。
(4)一種表現載體，其包含如上述(1)至(3)中任一項所記載之細胞色素P450基因。
(5)一種轉形體，其包含如上述(4)所記載之表現載體。
(6)一種基因轉殖植物，其包含如上述(4)所記載之表現載體。
(7)如(6)所記載之基因轉殖植物，其中植物為植物體、植物器官、植物組織或植物培養細胞。
(8)一種植物之製造方法，其係製造對在HRAC分類中被分類為3之微管聚合抑制劑、在HRAC分類中被分類為12之八氫番茄紅素去飽和酶系(PDS)中之類胡蘿蔔素生物合成抑制劑、在HRAC分類中被分類為14之原紫質原氧化酶抑制劑及在HRAC分類中被分類為18之二氫蝶酸合成酶抑制劑具有耐受性之植物，其特徵在於：培養或栽培如上述(6)或(7)所記載之基因轉殖植物。
(9)一種防除對如上述(6)或(7)所記載之基因轉殖植物有害之雜草之方法，其係藉由選自由在HRAC分類中被分類為2之乙醯乳酸合成酶抑制劑、在HRAC分類中被分類為3之微管聚合抑制劑、在HRAC分類中被分類為6之光化學系II抑制劑、在HRAC分類中被分類為12之八氫番茄紅素去飽和酶系(PDS)中之類胡蘿蔔素生物合成抑制劑、在HRAC分類中被分類為14之原紫質原氧化酶抑制劑、在HRAC分類中被分類為18之二氫蝶酸合成酶抑制劑、及在HRAC分類中被分類為27之4-羥基苯基丙酮酸雙加氧酶抑制劑所組成之群中之至少1種抑制劑對栽培如上述(6)或(7)所記載之基因轉殖植物之田地進行處理。
(10)一種轉形方法，其包括：對宿主細胞導入包含如上述(1)至(3)中任一項所記載之細胞色素P450基因及其他基因之表現載體之步驟；及選拔於選自由在HRAC分類中被分類為2之乙醯乳酸合成酶抑制劑、在HRAC分類中被分類為3之微管聚合抑制劑、在HRAC分類中被分類為6之光化學系II抑制劑、在HRAC分類中被分類為12之八氫番茄紅素去飽和酶系(PDS)中之類胡蘿蔔素生物合成抑制劑、在HRAC分類中被分類為14之原紫質原氧化酶抑制劑、在HRAC分類中被分類為18之二氫蝶酸合成酶抑制劑、及在HRAC分類中被分類為27之4-羥基苯基丙酮酸雙加氧酶抑制劑所組成之群中之至少1種抑制劑之存在下生長之細胞作為轉形體之步驟。
本說明書包含成為本案之優先權之基礎之日本專利申請案編號2020-110269號及日本專利申請案編號2020-134782號之揭示內容。
[發明之效果]
根據本發明，可提供一種對作用性不同之多種藥劑具有代謝活性之細胞色素P450基因。藉由利用本發明之細胞色素P450基因，能夠對植物賦予對該作用性不同之多種藥劑之耐受性。又，藉由利用本發明之細胞色素P450基因作為選擇標記基因，能夠構築完全新穎之轉形方法。進而，本發明之細胞色素P450基因可用作成為對作用性不同之多種藥劑之耐受性之指標之耐受性標記基因。
以下，詳細地說明本發明。
1.細胞色素P450基因
本發明之細胞色素P450基因(以下，有時亦簡稱為P450基因)係編碼具有特定之胺基酸序列且對作用性不同之多種藥劑具有代謝活性的P450之基因。本發明之P450基因於胺基酸級別上與水稻之CYP81A6具有一定之序列類似性，但於編碼對較CYP81A6範圍更廣之化合物具有代謝活性之P450之方面有所不同。
一般被分類為P450之蛋白質成為如下結構：於N末端側具有跨膜區，緊接著該跨膜區具有活性區。本發明之P450基因可為編碼包含除跨膜序列以外的參與代謝活性之區之胺基酸序列之蛋白質者，亦可為編碼包含含有跨膜區及參與代謝活性之區之胺基酸序列之蛋白質者。
本發明之P450基因中，作為參與代謝活性之區之胺基酸序列(即，除跨膜序列以外之胺基酸序列)，例如可例舉序列編號2、4、6及8之任一胺基酸序列。
此處，序列編號2之胺基酸序列係於基因庫(GenBank)中登記為寄存編號(accession No.)AK454412之來自小麥之P450中除跨膜序列以外之胺基酸序列，藉由序列編號1之鹼基序列來編碼。又，序列編號4之胺基酸序列係於基因庫中登記為寄存編號KJ541960之來自小麥之P450中除跨膜序列以外之胺基酸序列，藉由序列編號3之鹼基序列來編碼。序列編號6之胺基酸序列係於基因庫中登記為寄存編號AK369081之來自大麥之P450中除跨膜序列以外之胺基酸序列，藉由序列編號5之鹼基序列來編碼。序列編號8之胺基酸序列係於基因庫中登記為寄存編號AK375492之來自大麥之P450中除跨膜序列以外之胺基酸序列，藉由序列編號7之鹼基序列來編碼。包含該等序列編號2、4、6及8所示之胺基酸序列之P450(跨膜區除外)係參與對作用性不同之多種藥劑之代謝活性之區。
相對於序列編號2之胺基酸序列(AK454412)，序列編號4之胺基酸序列(KJ541960)具有96%之序列同一性，序列編號6之胺基酸序列(AK369081)具有80%之序列同一性，序列編號8之胺基酸序列(AK375492)具有93%之序列同一性。又，相對於序列編號1之鹼基序列(AK454412)，序列編號3之鹼基序列(KJ541960)具有96%之序列同一性，序列編號5之鹼基序列(AK369081)具有85%之序列同一性，序列編號7之鹼基序列(AK375492)具有94%之序列同一性。
又，本發明之P450基因並不限定於由序列編號1至8所特定者，例如亦可為編碼以下之蛋白質者，該蛋白質具有相對於序列編號2、4、6或8之胺基酸序列具有80%以上、較佳為85%以上、更佳為90%以上、最佳為95%以上之序列同一性之胺基酸序列，且對作用性不同之多種藥劑具有代謝活性。序列同一性之值可藉由安裝有BLAST演算法之BLASTN或BLASTX程式而算出(預設值之設定)。再者，序列同一性之值係算出將一對胺基酸序列進行雙序列比對分析時完全一致之胺基酸殘基，並算出上述合計數於進行比較之全部胺基酸殘基中之比率。
進而，本發明之P450基因並不限定於由序列編號1至8所特定者，例如亦可為編碼以下之蛋白質者，該蛋白質具有使序列編號2、4、6或8之胺基酸序列置換、缺失、插入或附加1個或數個胺基酸所得之胺基酸序列，且對作用性不同之多種藥劑具有代謝活性。此處，所謂數個，例如為2～50個，較佳為2～40個，更佳為2～30個，更佳為2～20個，更佳為2～10個，最佳為2～5個。
進而，本發明之P450基因並不限定於由序列編號1至8所特定者，例如亦可為編碼以下之蛋白質者，該蛋白質與包含序列編號1、3、5或7之鹼基序列之DNA之互補鏈之全部或一部分於嚴格之條件下進行雜交，且對作用性不同之多種藥劑具有代謝活性。此處所謂之「嚴格之條件」意指形成所謂之特異性雜交，且不形成非特異性雜交之條件，例如可參照『分子選殖：實驗室手冊(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)(第三版)』而適宜決定。具體而言，可藉由南方雜交(Southern hybridization)時之溫度或溶液中所含之鹽濃度、及南方雜交之洗淨步驟時之溫度或溶液中所含之鹽濃度來設定嚴格度。更詳細而言，作為嚴格之條件，例如鈉濃度為25～500 mM、較佳為25～300 mM，溫度為42～68℃、較佳為42～65℃。更具體而言，為5×SSC(83 mM NaCl、83 mM檸檬酸鈉)、溫度42℃。
如上所述，關於包含與序列編號1、3、5或7不同之鹼基序列之基因、或編碼與序列編號2、4、6或8不同之胺基酸序列之基因是否編碼作為細胞色素P450發揮功能且對特定藥劑具有代謝活性之蛋白質，可藉由研究下述情況來確認，即，使用於來自根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)之Nos啟動子與終止子等之間組入有該基因之表現載體而製作轉形植物，於該藥劑之存在下該轉形植物是否能夠生長。再者，作為藥劑，可自後文敍述詳情之作用性不同之多種藥劑中適宜選擇。
另一方面，本發明之P450基因亦可為編碼包含含有跨膜區及參與藥劑之代謝活性之區之胺基酸序列之蛋白質者。作為跨膜區及參與代謝活性之區之胺基酸序列，例如可例舉序列編號10、12、14及16之任一胺基酸序列。
此處，序列編號10之胺基酸序列係於基因庫中登記為寄存編號AK454412之來自小麥之P450中包含跨膜序列之胺基酸序列，藉由序列編號9之鹼基序列來編碼。又，序列編號12之胺基酸序列係於基因庫中登記為寄存編號KJ541960之來自小麥之P450中包含跨膜序列之胺基酸序列，藉由序列編號11之鹼基序列來編碼。序列編號14之胺基酸序列係於基因庫中登記為寄存編號AK369081之來自大麥之P450中包含跨膜序列之胺基酸序列，藉由序列編號13之鹼基序列來編碼。序列編號16之胺基酸序列係於基因庫中登記為寄存編號AK375492之來自大麥之P450中包含跨膜序列之胺基酸序列，藉由序列編號15之鹼基序列來編碼。
再者，上述之序列編號2之胺基酸序列係序列編號10之胺基酸序列之部分序列。同樣地，上述之序列編號4之胺基酸序列係序列編號12之胺基酸序列之部分序列。同樣地，上述之序列編號6之胺基酸序列係序列編號14之胺基酸序列之部分序列。同樣地，上述之序列編號8之胺基酸序列係序列編號16之胺基酸序列之部分序列。
相對於序列編號10之胺基酸序列(AK454412)，序列編號12之胺基酸序列(KJ541960)具有94%之序列同一性，序列編號14之胺基酸序列(AK369081)具有79%之序列同一性，序列編號16之胺基酸序列(AK375492)具有90%之序列同一性。又，相對於序列編號9之鹼基序列(AK454412)，序列編號11之鹼基序列(KJ541960)具有95%之序列同一性，序列編號13之鹼基序列(AK369081)具有85%之序列同一性，序列編號15之鹼基序列(AK375492)具有93%之序列同一性。
又，本發明之P450基因並不限定於由序列編號9至16所特定者，例如亦可為編碼以下之蛋白質者，該蛋白質具有相對於序列編號10、12、14或16之胺基酸序列具有80%以上、較佳為85%以上、更佳為90%以上、最佳為95%以上之序列同一性之胺基酸序列，且對作用性不同之多種藥劑具有代謝活性。序列同一性之值可藉由安裝有BLAST演算法之BLASTN或BLASTX程式而算出(預設值之設定)。再者，序列同一性之值係算出將一對胺基酸序列進行雙序列比對分析時完全一致之胺基酸殘基，並算出上述合計數於進行比較之全部胺基酸殘基中之比率而。
進而，本發明之P450基因並不限定於由序列編號9至16所特定者，例如亦可為編碼以下之蛋白質者，該蛋白質具有使序列編號10、12、14或16之胺基酸序列置換、缺失、插入或附加1個或數個胺基酸所得之胺基酸序列，且對作用性不同之多種藥劑具有代謝活性。此處，所謂數個，例如為2～55個，較佳為2～45個，更佳為2～35個，更佳為2～25個，更佳為2～15個，最佳為2～5個。
進而，本發明之P450基因並不限定於由序列編號9至16所特定者，例如亦可為編碼以下之蛋白質者，該蛋白質與包含序列編號9、11、13或15之鹼基序列之DNA之互補鏈之全部或一部分於嚴格之條件下進行雜交，且對作用性不同之多種藥劑具有代謝活性。此處所謂之「嚴格之條件」意指形成所謂之特異性雜交，且不形成非特異性雜交之條件，例如可參照『分子選殖：實驗室手冊(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)(第三版)』而適宜決定。具體而言，可藉由南方雜交時之溫度或溶液中所含之鹽濃度、及南方雜交之洗淨步驟時之溫度或溶液中所含之鹽濃度來設定嚴格度。更詳細而言，作為嚴格之條件，例如鈉濃度為25～500 mM、較佳為25～300 mM，溫度為42～68℃、較佳為42～65℃。更具體而言，為5×SSC(83 mM NaCl、83 mM檸檬酸鈉)、溫度42℃。
如上所述，關於包含與序列編號9、11、13或15不同之鹼基序列之基因、或編碼與序列編號10、12、14或16不同之胺基酸序列之基因是否編碼作為細胞色素P450發揮功能且對特定藥劑具有代謝活性之蛋白質，可藉由研究下述情況來確認，即，研究使用於來自根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)之Nos啟動子與終止子等之間組入有該基因之表現載體製作轉形植物，於該藥劑之存在下該轉形植物是否能夠生長。再者，作為藥劑，可自後文敍述詳情之作用性不同之多種藥劑中適宜選擇。
且說，本發明之P450與先前之P450、例如CYP81A6相比，對作用性不同之多種藥劑具有代謝活性。作為本發明之P450具有代謝活性之藥劑，可例舉：在HRAC分類中被分類為2之乙醯乳酸合成酶抑制劑、在HRAC分類中被分類為3之微管聚合抑制劑、在HRAC分類中被分類為6之光化學系II抑制劑、在HRAC分類中被分類為12之八氫番茄紅素去飽和酶系(PDS)中之類胡蘿蔔素生物合成抑制劑、在HRAC分類中被分類為14之原紫質原氧化酶抑制劑、在HRAC分類中被分類為18之二氫蝶酸合成酶抑制劑、及在HRAC分類中被分類為27之4-羥基苯基丙酮酸雙加氧酶抑制劑。
該等之中，本發明之P450於對在HRAC分類中被分類為14之原紫質原氧化酶抑制劑、在HRAC分類中被分類為12之八氫番茄紅素去飽和酶系(PDS)中之類胡蘿蔔素生物合成抑制劑、在HRAC分類中被分類為27之4-羥基苯基丙酮酸雙加氧酶抑制劑、在HRAC分類中被分類為18之二氫蝶酸合成酶抑制劑、及在HRAC分類中被分類為3之微管聚合抑制劑具有代謝活性之方面具有與先前公知之其他P450不同之性質。
此處，乙醯乳酸合成酶抑制劑意指藉由抑制乙醯乳酸合成酶而顯示除草劑活性之化合物。作為乙醯乳酸合成酶抑制劑，可例舉：醯嘧磺隆、四唑嘧磺隆、免速隆、氯嘧磺隆、氯磺隆、西速隆、環磺隆、胺苯磺隆、亞速隆、伏速隆、氟啶嘧磺隆、甲醯嘧磺隆、合速隆、依速隆、碘甲磺隆、甲基二磺隆、甲磺隆、煙嘧磺隆、環氧嘧磺隆、氟嘧磺隆、氟磺隆、百速隆、碸嘧磺隆、甲嘧磺隆、磺醯磺隆、噻吩磺隆、醚苯磺隆、苯磺隆、三氟啶磺隆、氟胺磺隆及三氟甲磺隆等磺醯脲化合物；甲咪唑煙酸、咪草酸、甲氧咪草煙、依滅草、滅草喹及咪草煙等咪唑啉酮化合物；氯酯磺草胺、雙氯磺草胺、雙氟磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草唑胺及平速爛等三唑并嘧啶化合物；雙草醚鈉鹽、嘧啶肟草醚、環酯草醚、嘧硫草醚鈉鹽及嘧草醚等(硫代)苯甲酸嘧啶酯化合物；氟酮磺隆鈉鹽及丙苯磺隆鈉鹽等磺醯基胺基羰基三唑啉酮化合物；嘧舒藩、氟酮磺草胺等磺醯苯胺化合物。
在HRAC分類中被分類為6之光化學系II抑制劑意指藉由抑制參與光合作用之光化學系II而顯示除草劑活性之化合物。作為在HRAC分類中被分類為6之光化學系II抑制劑，可例舉：溴酚肟、溴苯腈及碘苯腈等腈化合物；本達隆等苯并噻二𠯤酮化合物；必汰草及羥基達草止(pyridafol)等苯基嗒𠯤化合物。
原紫質原氧化酶抑制劑意指藉由抑制原紫質原氧化酶而顯示除草劑活性之化合物。作為原紫質原氧化酶抑制劑，可例舉：亞喜芬、必芬諾、甲氧基護穀(Chlomethoxyfen)、乙羧氟草醚、氟磺胺草醚、鹵索芬、乳氟禾草靈及復祿芬等二苯醚化合物；異丙吡草酯及乙基派芬草等苯基吡唑化合物；吲哚酮草酯、丙炔氟草胺及氟烯草酸等N-苯基鄰苯二甲醯亞胺化合物；氟噻甲草酯及噻二唑草胺等噻二唑化合物；樂滅草及丙炔㗁草酮等㗁二唑化合物；草芬定、乙基克繁草及甲磺草胺等三唑啉酮化合物；環戊㗁草酮等㗁唑啶二酮化合物；雙苯嘧草酮及佈芬草等嘧啶二酮化合物；乙基派芬草、異丙吡草酯等苯基吡唑化合物；以及雙唑草腈、氟唑草胺及氟嗒𠯤草酯等。
八氫番茄紅素去飽和酶系(PDS)中之類胡蘿蔔素生物合成抑制劑意指藉由抑制八氫番茄紅素去飽和酶系而顯示除草劑活性之化合物。作為類胡蘿蔔素生物合成抑制劑，可例舉：達草滅等嗒𠯤酮化合物；吡氟醯草胺及氟滅草胺等吡啶甲醯胺化合物；以及氟丁醯草胺、氟啶草酮、氟咯草酮及呋草酮。
4-羥基苯基丙酮酸雙加氧酶抑制劑意指藉由抑制4-羥基苯基丙酮酸雙加氧酶而顯示除草劑活性之化合物。作為4-羥基苯基丙酮酸雙加氧酶抑制劑，可例舉：芬昆諾三酮、甲基磺草酮及磺草酮等三酮化合物；異㗁氯草酮及異㗁唑草酮等異㗁唑化合物；吡草酮、吡唑特(Pyrazolynate)及普芬草等吡唑化合物；以及苯并雙環酮。
二氫蝶酸合成酶抑制劑意指藉由抑制二氫蝶酸合成酶而顯示除草劑活性之化合物。作為二氫蝶酸合成酶，可例舉亞速爛等胺基甲酸酯化合物。
微管聚合抑制劑係指藉由作用於球狀蛋白質微管蛋白來抑制微管之聚合而顯示除草劑活性之化合物。作為微管聚合抑制劑，可例舉：氟草胺(倍尼芬)、比達寧、撻乃安、丁氟消草、歐拉靈、施得圃及三福林等二硝基苯胺化合物；甲基胺草磷及抑草磷等胺基磷酸酯化合物；汰硫草及噻草定等吡啶化合物；戊炔草胺及牧草胺等苯甲醯胺化合物；TCTP(大克草)等苯甲酸化合物。
於該等例示例舉之具體之化合物中，本發明之P450尤其對嘧舒藩、平速爛、免速隆、甲磺隆、滅草喹、煙嘧磺隆、甲嘧磺隆、本達隆、丙炔㗁草酮、甲磺草胺、乙基派芬草、氟磺胺草醚、吡氟醯草胺、氟滅草胺、氟啶草酮、達草滅、吡唑特、吡草酮、芬昆諾三酮、亞速爛、施得圃具有優異之代謝活性。
2.表現載體
本發明之表現載體可藉由將本發明之細胞色素P450基因連結(插入)至適當之載體而獲得。用以供本發明之細胞色素P450基因插入之載體只要為能夠於宿主中複製者，則並無特別限定，例如可例舉質體、穿梭載體、輔助質體等。
作為質體DNA，可例舉：來自大腸桿菌之質體(例如pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescript等)、來自枯草菌之質體(例如pUB110、pTP5等)、來自酵母之質體(例如YEp13、YCp50等)等，作為噬菌體DNA，可例舉λ噬菌體(Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等)。進而，亦可使用反轉錄病毒或牛痘病毒等動物病毒、桿狀病毒等昆蟲病毒載體。
為了將本發明之細胞色素P450基因插入至載體，可採用如下等方法：首先，將包含細胞色素P450基因之DNA片段進行純化，利用適當之限制酶將經純化之該DNA片段切斷，插入至適當之載體DNA之限制酶部位或多選殖位點，從而連結於載體。
本發明中，為了使任意基因表現，可向上述表現載體進而插入該任意基因。插入任意基因之方法與向載體插入本發明之細胞色素P450基因之方法相同。
本發明之細胞色素P450基因可連結於來自根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)之Nos啟動子與終止子等之間使用而導入至植物後，調查除草劑耐受性。再者，作為啟動子，除了Nos啟動子以外，例如亦可例舉：椰菜嵌紋病毒35S啟動子(CaMV35S)、各種肌動蛋白基因啟動子、各種泛蛋白基因啟動子、胭脂鹼合成酶基因之啟動子、煙草之PR1a基因啟動子、番茄之核酮糖1,5-二磷酸羧化酶・氧化酶小次單元基因啟動子、Napin基因啟動子、Oleosin基因啟動子等。其中，可更佳地使用椰菜嵌紋病毒35S啟動子、肌動蛋白基因啟動子或泛蛋白基因啟動子。
如此，於本發明中可使用各種載體。進而，可製作於本發明之細胞色素P450基因以正義或反義方向連接有目標之任意基因者，將其插入至被稱為雙偶載體之pBI101(Clontech公司)等載體。
3.轉形體之製作
本發明之轉形體例如可藉由將上述本發明之表現載體導入至宿主中而獲得。此處，作為宿主，只要為能夠表現本發明之細胞色素P450基因者，則並無特別限定，但較佳為植物。若將本發明之表現載體導入至宿主，則藉由本發明之細胞色素P450基因之表現，而獲得對上述之作用性不同之多種藥劑之耐受性。因此，確認是否能夠將上述本發明之表現載體導入至宿主中時，可將對該藥劑之耐受性作為指標而進行評價。即，本發明之細胞色素P450基因亦可用作導入其他基因時之選拔標記。
本發明中成為轉形對象之植物意指植物體整體、植物器官(例如葉、花瓣、莖、根、種子等)、植物組織(例如表皮、韌皮部、柔組織、木質部、維管束等)或植物培養細胞之任一種。作為轉形所使用之植物，可例舉屬於十字花科、禾本科、茄科、豆科等之植物(參照下述)，但並不限定於該等植物。
十字花科：阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)
茄科：煙草(Nicotiana tabacum)
禾本科：玉米(Zea mays)、水稻(Oryza sativa)
豆科：大豆(Glycine max)
上述表現載體可藉由通常之轉形方法、例如電穿孔法(electroporation method)、土壤桿菌法、粒子槍法、PEG(polyethylene glycol，聚乙二醇)法等導入至植物中。
例如於使用電穿孔法之情形時，藉由具備脈衝控制器之電穿孔裝置，於電壓500～1600 V、25～1000 μF、20～30 msec之條件下進行處理，將基因導入至宿主。
又，於使用粒子槍法之情形時，可直接使用植物體、植物器官、植物組織本身，亦可於製備切片後使用，還可製備原生質體而使用。可使用基因導入裝置(例如Bio-Rad公司之PDS-1000/He等)對如此製備之試樣進行處理。處理條件根據植物或試樣而異，通常以1000～1800 psi左右之壓力、5～6 cm左右之距離進行。
又，藉由利用植物病毒作為載體，能夠將本發明之細胞色素P450基因導入至植物體。作為可利用之植物病毒，例如可例舉椰菜嵌紋病毒。即，首先，將病毒基因組插入至來自大腸桿菌之載體等而製備重組體後，向病毒之基因組中插入本發明之細胞色素P450基因。藉由限制酶將如此修飾之病毒基因組自重組體切出，接種於植物宿主，藉此能夠將本發明之細胞色素P450基因導入至植物宿主。
利用土壤桿菌之Ti質體之方法中，利用如下性質將本發明之細胞色素P450基因導入至植物宿主，即，若屬於土壤桿菌(Agrobacterium)屬之細菌感染植物，則會使其所具有之質體DNA之一部分移行至植物基因組中。屬於土壤桿菌屬之細菌中之根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)感染植物而形成被稱為冠癭之腫瘤，又，發根土壤桿菌(Agrobacterium rhizogenes)感染植物而產生鬚根。該等起因於：在感染時，被稱為Ti質體或Ri質體之存在於各種細菌中之質體上之被稱為T-DNA區(Transferred DNA，轉移DNA)之區移行至植物中，從而組入至植物之基因組中。
若向Ti或Ri質體上之T-DNA區中插入欲組入至植物基因組中之DNA，則於土壤桿菌屬之細菌感染植物宿主時，能夠將目標DNA組入至植物基因組中。
轉形之結果所獲得之腫瘤組織或胚芽、鬚根等可直接用於細胞培養、組織培養或器官培養，且可使用先前已知之植物組織培養法，藉由投予適當濃度之植物激素(生長激素、細胞分裂素、赤黴素、脫落酸、乙烯、芸苔素內酯等)等而使其再生為植物體。
且說，可利用導入有本發明之細胞色素P450基因之轉形體，篩選可用作針對植物之新穎之除草劑的化合物。即，可使候選物質與導入有本發明之細胞色素P450基因之轉形體接觸。又，使相同之候選物質亦與未導入有本發明之細胞色素P450基因之細胞(較佳為成為上述轉形體之基礎之宿主細胞)接觸。然後，選擇使上述轉形體生長且使未導入有本發明之細胞色素P450基因之細胞致死之化合物。可得出以下結論：所選擇之化合物即為可用作藉由本發明之細胞色素P450基因來解毒、代謝之除草劑之化合物。
所篩選之化合物對具有本發明之細胞色素P450基因之植物不具有毒性，但對不具有該細胞色素P450基因之植物具有毒性。因此，所篩選之化合物可用作選擇性地使具有本發明之細胞色素P450基因之植物生長時之除草劑。
且說，本發明之表現載體不僅可導入至上述植物宿主，亦可導入至屬於大腸桿菌(Escherichia coli)等艾氏菌屬、枯草桿菌(Bacillus subtilis)等桿菌屬、或戀臭假單胞菌(Pseudomonas putida)等假單胞菌屬之細菌，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)等酵母，COS細胞、CHO細胞等動物細胞，或Sf9等昆蟲細胞等而獲得轉形體。於以大腸桿菌、酵母等細菌為宿主之情形時，較佳為本發明之表現載體於該細菌中能夠自主複製，同時藉由本發明之細胞色素P450基因、核糖體結合序列、目標基因、轉錄終止序列所構成。又，亦可包含控制本發明之細胞色素P450基因之基因。
向細菌導入重組載體之方法只要為向細菌導入DNA之方法，則並無特別限定。例如可例舉使用鈣離子之方法、電穿孔法等。
於以酵母為宿主之情形時，例如可使用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)等。向酵母導入重組載體之方法只要為向酵母導入DNA之方法，則並無特別限定，例如可例舉電穿孔法、原生質球法、乙酸鋰法等。
於以動物細胞為宿主之情形時，可使用猴細胞COS-7、非洲綠猴腎細胞(Vero)、中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)、小鼠L細胞等。作為向動物細胞導入重組載體之方法，例如可例舉電穿孔法、磷酸鈣法、脂轉染法等。
於以昆蟲細胞為宿主之情形時，可使用Sf9細胞等。作為向昆蟲細胞導入重組載體之方法，例如可例舉磷酸鈣法、脂轉染法、電穿孔法等。
可藉由PCR(polymerase chain reaction，聚合酶鏈反應)法、南方雜交法、北方雜交(Northern hybridization)法等來確認基因是否組入至宿主。例如，由轉形體製備DNA，設計DNA特異性引子而進行PCR。PCR係於與用以製備上述質體之條件相同之條件下進行。其後，對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯醯胺凝膠電泳或毛細管電泳等，藉由溴化乙錠、SYBR Green溶液等進行染色，然後以檢測擴增產物為1條條帶，藉此確認已進行了轉形。又，亦可使用預先藉由螢光色素等標記之引子進行PCR，檢測擴增產物。進而，亦可採用如下方法：使擴增產物與微量盤等固相結合，藉由螢光或酶反應等確認擴增產物。
4.植物之製造
本發明中，可由上述轉形植物細胞等再生為轉形植物體。作為再生方法，可採用如下方法：將愈傷組織狀之轉形細胞移至改變了激素之種類、濃度之培養基而進行培養，形成不定胚，獲得完全之植物體。作為所使用之培養基，可例示LS培養基、MS培養基等。
本發明之「製造植物體之方法」包括以下之步驟：將插入有本發明之細胞色素P450基因之植物表現載體導入至宿主細胞而獲得轉形植物細胞，由該轉形植物細胞再生轉形植物體，由所獲得之轉形植物體獲得植物種子，由該植物種子生產植物體。
為了由轉形植物體獲得植物種子，例如自生根培養基採取轉形植物體，移植至加入有含水之土之盆(pot)，於一定溫度下使其生長，形成花，最終形成種子。又，為了由種子生產植物體，例如待於轉形植物體上所形成之種子成熟後，進行單離，播種至含水之土中，於一定溫度、照度下使其生長，藉此生產植物體。如此生產之植物由於表現本發明之細胞色素P450基因，故而對上述之作用性不同之多種藥劑顯示耐受性。此處，所謂「對藥劑顯示耐受性」，與如下概念同義：與導入本發明之細胞色素P450基因之前相比具有統計學上的有意義差，顯示出對藥劑之耐受性。對藥劑之耐受性可基於以特定之濃度接觸該藥劑時之植物體之枯死率或莖葉部及根部等之生長抑制率等進行判斷。
5.有害雜草之防除方法
植物中導入有本發明之P450基因之基因轉殖植物如上所述對作用性不同之多種藥劑具有耐受性。因此，於將植物中導入有本發明之P450基因之基因轉殖植物於田地中進行栽培時，可使用自上述之作用性不同之多種藥劑中選擇之藥劑作為除草劑，使基因轉殖植物以外之雜草枯死。
如上所述，對於植物中導入有本發明之P450基因之基因轉殖植物，用以去除田地中之雜草之藥劑之選擇範圍較大，可容易地去除雜草而進行栽培。
[實施例]
以下，使用實施例對本發明加以更詳細之說明，但本發明之技術範圍並不限定於以下之實施例。
[實施例1]
1.代謝除草劑之新穎小麥P450之探索
1)代謝芬昆諾三酮之小麥P450基因之探索及單離
目前，已知水稻之CYP81A6對HRAC分類中之ALS抑制劑、光化學系II抑制劑及HPPD(hydroxyphenylpyruvate dioxygenase，羥基苯基丙酮酸雙加氧酶)抑制劑此3種不同作用機制之藥劑具有代謝活性。其中，已明確作為水稻用HPPD抑制劑之芬昆諾三酮係藉由被CYP81A6去甲基化而代謝分解，對水稻具有較高之安全性。本劑對小麥亦具有較高之安全性，本劑於小麥體內之主要代謝物與水稻同樣為去甲基體，由此提示於小麥中存在具有與CYP81A6類似之功能之P450。
然而，已知為小麥之除草劑代謝P450之CYP71C6v1與CYP81A6之同源性不高，由此認為對芬昆諾三酮之代謝分解活性係取決於與CYP71C6v1不同之未知之P450。因此，乃進行小麥中之CYP81A6類似基因之探索。將CYP81A6之ORF序列設為查詢(Query)，利用基因庫進行blastn檢索。其結果，來自大麥之P450搜索到2種(寄存編號AK375492(80%)及AK369081(80%))，來自小麥之P450搜索到1種(寄存編號AK454412(選殖ID：tplb0005j01)(81%))。又，將AK454412之ORF序列設為查詢(Query)，利用基因庫進行blastn檢索，結果新搜索到作為來自小麥之P450之寄存編號KJ541960(80%)(括號內之數字表示相對於CY81A6基因之CDS序列之同一性(Identity))。圖1中示出了CYP81A6、AK375492及AK369081之多序列比對，圖2中示出了CYP81A6、AK454412及KJ541960之多序列比對。
為了對所搜索到之作為來自小麥之推定P450基因之AK454412基因進行活體外之芬昆諾三酮代謝活性之驗證，乃進行本基因之選殖，並且驗證是否存在於各種小麥品種。供試之小麥品種係使用日本產之農林61號、澳洲產之Bolak、歐洲產之Apach、杜蘭小麥(Durum)品種之Tamarai。以該等4個品種之cDNA為模板，使用AK454412 5'-UTR (Fd)及AK454412 3'-UTR (Rv)之引子組將夾著UTR區之CDS區全長進行PCR擴增。其結果，任一品種中均確認到目標位置之條帶(1791 bp)，由此提示無論品種如何均有可能存在本基因(圖3)。繼而，為了選殖本基因，將以小麥品種Apach基因組為模板進行了擴增之DNA片段作為模板，使用AK454412 IF (Fd)及AK454412 IF (Rv)之引子組再次進行PCR，從而擴增AK454412基因之CDS序列。使用無縫(In-Fusion)HD選殖套組(TaKaRa)使本DNA片段與經限制酶Nde I、Xho I處理之pET-22b(+)載體連結，製作pET-22b-AK454412。對本構建物進行序列分析，結果與基因庫中所記載之序列相比，第453號之C突變為T，第1137號之T突變為C，但該等為不伴隨胺基酸突變之突變。
以下示出所使用之引子之序列。
AK454412 5'-UTR (Fd): 5'-CAACCTGA GACCTCAAGTGTCAC -3'(序列編號17)
AK454412 3'-UTR (Rv): 5'-GTACTACCTGGATCCACGAGC-3'(序列編號18)
AK454412 IF (Fd): 5'-AAGGAGATATACATATGGATAAGGCGTA CATTGCC-3'(序列編號19)
AK454412 IF (Rv): 5'-GTGGTGGTGCTCGAGTCAGAGGC TCTG AAGCACGT-3'(序列編號20)
2)來自小麥之P450還原酶之探索及單離
一般而言，為了使P450進行單加氧酶反應，雙電子還原及伴隨於其之質子轉移不可或缺。催化該反應之酶為P450還原酶(CPR)，為了使認為係小麥P450之一種之AK454412發揮功能，需要來自小麥之CPR。因此，進行來自小麥之CPR之探索及選殖。首先，將作為水稻P450還原酶(CPR)之Os09g0558900設為查詢(Query)，於基因庫中進行Blast檢索。其結果，發現寄存編號AK333516(來自Chinese Spring，序列編號21)、AJ303373(來自Darius，序列編號22)此2個基因，但兩個基因之CDS序列幾乎一致(自AJ303373來看第1665號之A被置換為G(胺基酸：I555V))，由此認為係同一基因，因此此處係基於AJ303373(以下記載為TaCPR)而進行選殖。
首先，與小麥P450探索同樣地，以農林61號、Bolak、Apach、Tamarai此4個品種之cDNA為模板，使用CPR_AJ303373_UTR (Fd)及CPR_UTR (Rv)之引子組將夾著UTR區之CDS區全長進行PCR擴增。其結果，此次供試之全部品種中均確認到目標位置之條帶(2397 bp)，由此提示無論品種如何均有可能存在本基因。繼而，為了選殖本基因，將以小麥品種Apach基因組為模板進行了擴增之DNA片段作為模板，使用TaCPR (AJ303373) IF (Fd)及TaCPR IF (Rv)之引子組再次進行PCR，從而擴增AJ303373基因之CDS序列。使用無縫HD選殖套組(TaKaRa)使本DNA片段與經限制酶Nde I/Xho I處理之pACYC Duet-2載體(Novagen)連結，製作pACYC-TaCPR。對本構建物進行序列分析，結果所選殖之AJ303373基因之序列與資料庫記載之序列完全一致。
以下示出所使用之引子之序列。
CPR_AJ303373_UTR (Fd): 5'-CACGCGTCCGATCGAACCAAC-3'(序列編號23)
CPR_UTR (Rv): 5'-CGATGAATCGTCATCCTCTGTTCCAC-3'(序列編號24)
TaCPR(AJ303373) IF (Fd): 5'-AAGGAGATATACATATGGAC TCCGCCGCCGCGGGG-3'(序列編號25)
TaCPR IF (Rv): 5'-CTTTACCAGACTCGATTACCAGACGTCTC TCAGGT-3'(序列編號26)
3)AK454412之大腸桿菌表現用構建物之製作
已知真核生物之P450通常於N末端具有跨膜區(膜錨定結合區)，於大腸桿菌表現時，藉由去除本區，且將Barnes序列(MALLLAV)或來自兔6β-羥化酶之序列(6β序列：MAKKTSS)附加至N末端，而使得能夠表現之可能性提高。因此，以上述之pET-22b-AK454412質體為模板，利用6βAK454412_Nde IF (Fd)及AK454412 IF (Rv)之引子組進行PCR，藉此獲得於編碼去除AK454412之N末端33胺基酸殘基且附加7胺基酸殘基(6β序列：MAKKTSS)之序列的鹼基序列之兩末端進而附加有與載體側之末端互補之15鹼基之DNA片段。使用無縫HD選殖套組(Clontech)使本DNA片段與經Nde I/Xho I處理之pET-22b (+)連結，藉此構築pET-22b-del33_6βAK454412。將所製作之構建物導入至大腸桿菌BL21 star (DE3)株(圖4)。
以下示出所使用之引子之序列。
6βAK454412_Nde IF (Fd): 5'-AAGGAGATATACATATGGCTAAGA AGACTTCTTCT-3'(序列編號27)
AK454412 IF (Rv): 5'-GTGGTGGTGCTCGAGTCAGAGGCTCTGA AGCACGT-3'(序列編號28)
4)AJ303373之大腸桿菌用表現構建物之製作
CPR於N末端具有葉綠體移行訊息肽，藉由該去除序列，能夠實現大腸桿菌中之異種表現。因此，以上述之pACYC-TaCPR質體為模板，使用del31_TaCPR_Nde IF (Fd)及del31_TaCPR_Xho IF (Rv)之引子組進行PCR，獲得於編碼去除AJ303374之N末端31胺基酸殘基之序列的鹼基序列之兩末端進而附加有與載體側之末端互補之15鹼基之DNA片段。使用無縫選殖HD(Clontech)使本DNA片段與經Nde I/Xho I處理之pACYC Duet-2連結，藉此構築pACYC-del31_TaCPR。將所製作之構建物導入至大腸桿菌BL21 star (DE3)株(圖5)。
以下示出所使用之引子之序列。
del31_TaCPR_Nde IF (Fd): 5'-AAGGAGATATACATATGGA CCAGAACCGCCGCCTG-3'(序列編號29)
del31_TaCPR_Xho IF (Rv): 5'-TTTACCAGACTCGAGTTACC AGACGTCTCTCAGGT-3'(序列編號30)
5)基於AK454412及AJ303373之大腸桿菌表現系之蛋白質共表現
將分別導入有上述兩種表現構建物之重組大腸桿菌之單菌落植菌於3 ml之LB液體培養基，於37℃、200 rpm下徹夜培養。於容積為1 L之錐形燒瓶內之TB培養基250 mL(含有卡本西林100 ppm、氯黴素50 ppm)中添加該培養液2.5 mL，於37℃、200 rpm下培養至OD
600＝0.5～0.6左右。連同燒瓶一起進行冰浴冷卻後，以最終濃度成為1 mM之方式添加IPTG(Isopropyl-β-D-Thiogalactoside，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，以最終濃度成為0.5 mM之方式添加胺基乙醯丙酸，於20℃、110 rpm下進行培養。對IPTG誘導後22小時之培養液進行離心(4℃、15,000 rpm、1分鐘)。將所獲得之500 mL份之培養液之菌體於P450緩衝液[50 mM磷酸鉀緩衝液(pH值7.3)、20%甘油、1 mM EDTA(ethylenediamine tetraacetic acid，乙二胺四乙酸)、1 mM DTT(dithiothreitol，二硫蘇糖醇)]35 mL中懸浮並進行超音波破碎，以4℃、6000×g離心10分鐘。將該上清液以4℃、100,000×g離心1小時，向所獲得之沈澱以1 mL為單位添加P450緩衝液，使用鐵氟龍均質器使溶液變得均勻，將該溶液設為AK454412及TaCPR之共表現粗酶溶液。使用該粗酶溶液進行基於SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳)(CBB(Coomasie brilliant blue，考馬斯亮藍)染色)之蛋白質表現確認，結果於54kDa附近確認到AK454412之條帶，於75kDa附近確認到TaCPR之條帶，因此成功地表現兩酶。將SDS-PAGE之結果示於圖6。圖6(A)示出確認去除N末端33胺基酸殘基且附加6β序列之AK454412(6βAK454412)之表現的結果(箭頭)，圖6(B)示出確認去除N末端31胺基酸殘基之TaCPR(del31_TaCPR)之表現的結果(箭頭)。
6)使用AK454412與TaCPR之共表現粗酶之活體外代謝試驗
藉由活體外代謝試驗驗證作為新穎之來自小麥之P450之AK454412是否參與除草劑代謝。作為對小麥之安全性較高之化合物，使用芬昆諾三酮。反應液組成係設為50 mM磷酸鉀緩衝液(pH值7.3)、粗酶1 mg、β-NADPH(β-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt hydrate，β-煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鈉鹽)1 mM、芬昆諾三酮10 μM，於30℃下反應1小時後，藉由旋渦混合器使反應停止。將酶反應結束後之溶液以15,000 rpm離心1分鐘，使所獲得之上清液通過0.45 μm過濾器後，供試於LC/MS(liquid chromatography-mass spectrometry，液相層析質譜聯用儀)。LC/MS條件記載於以下。
＜HPLC(high performance liquid chromatography，高效液相層析)條件＞
裝置：Prominence UFLC(SHIMAZU)
檢測器：UV 254 nm
溫度：35℃
流速：0.3 mL/min
管柱：TSKgel ODS-80Ts (0.5 μm, 2.0 mm×150 mm, TOSOH)
流動相：乙腈(含有0.5%乙酸)/水(含有0.5%乙酸)＝20/80(保持5 min)→(15 min)→80/20(保持10 min)→(4 min)→20/80(保持6 min)
＜MS條件＞
裝置：Triple Quad
TM4500 (SCIEX)
接口：ESI(electrospray ionization，電噴霧電離)
掃描模式：Q1掃描，產物離子掃描 m/z 140-700
極性：正
離子噴霧電壓：4500
離子源溫度：400
氣簾氣體：40
離子源氣體1：50
離子源氣體2：50
去簇電壓：20
入口電壓：4.5
將LC/MS分析之結果示於圖7-1及7-2。圖7-1示出對陰性對照區(空載體表現粗酶反應區)進行LC/MS分析時之結果。圖7-2示出對AK454412及TaCPR之共表現粗酶反應區進行LC/MS分析時之結果。如圖7-2所示，於使用AK454412及TaCPR之共表現粗酶溶液之情形時，於RT＝17.4、14.8附近檢測到波峰，各波峰之分子量依序為m/z 425、m/z 411。利用樣品進行對照，結果可明確m/z 425之波峰為母化合物之芬昆諾三酮，m/z 411之波峰為芬昆諾三酮之去甲基體。可知，該去甲基體係芬昆諾三酮於小麥體內之主要代謝物，本代謝物不顯示除草活性。由以上情況可明確，AK454412係將芬昆諾三酮代謝分解為去甲基體而賦予小麥選擇性之P450。
[實施例2]來自小麥之新穎P450 AK454412之功能分析
1)AK454412強制表現阿拉伯芥之製作
為了調查利用活體外試驗驗證之芬昆諾三酮之去甲基化反應對植物體所造成之影響，而製作導入有AK454412基因之重組阿拉伯芥，調查芬昆諾三酮敏感性與野生型之差異。
首先，進行阿拉伯芥轉形用雙偶載體pMLH7133-AK454412_for At之製作。以實施例1中所製作之pET-22b-AK454412為模板，使用pMLH-tplb Xba IF (Fd)及pMLH-tplb Sac IF (Rv)之引子組進行PCR，獲得於AK454412基因之CDS序列全長之末端附加有Xba I/Sac I之識別序列及15鹼基之無縫識別序列之DNA片段。使用無縫HD選殖套組(Clontech)使所獲得之DNA片段與經限制酶Xba I/Sac I消化之pMLH7133載體連結，製作阿拉伯芥轉形用雙偶載體pMLH7133-AK454412_for At(圖8)。所獲得之構建物係藉由電穿孔法導入至土壤桿菌EHA105株。阿拉伯芥之轉形係使用本重組土壤桿菌藉由花序浸漬(Floral dip)法進行。
以下示出所使用之引子之序列。
pMLH-tplb Xba IF (Fd):5'-TACAACTACATCTAGAATGGATAAG GCGTACATTG-3'(序列編號31)
pMLH-tplb Sac IF (Rv):5'-GGGGAAATTCGAGCTCTCA GAGGCTCTGAAGCACG-3'(序列編號32)
2)使用AK454412強制表現阿拉伯芥之芬昆諾三酮敏感性試驗
以與野生型阿拉伯芥之敏感性差為指標，驗證所製作之轉形體有無芬昆諾三酮耐受性。於以最終濃度成為10000、1000、100、10、1 nM之方式添加有芬昆諾三酮且無處理區以成為0.1%之方式添加有DMSO(dimethyl sulfoxide，二甲基亞碸)之MS固形培養基，分別播種經殺菌之AK454412強制表現阿拉伯芥及野生型阿拉伯芥之種子，於22℃下使其生長10天左右。對本劑之敏感性係藉由仔細觀察評價作為作用症狀之白化之程度。將其結果示於圖9。圖9(A)表示使用野生型阿拉伯芥時之結果，圖9(B)表示使用AK454412強制表現阿拉伯芥時之結果。如圖9所示，野生型阿拉伯芥於芬昆諾三酮10 nM處理時90%以上發生白化，相對於此，AK454412強制表現阿拉伯芥即便於芬昆諾三酮10000 nM時亦無法確認到白化症狀。由該結果可明確，AK454412基因較大程度地參與芬昆諾三酮之代謝分解，於植物內表現，因而對植物賦予對芬昆諾三酮之耐受性。
[實施例3]使用AK454412強制表現阿拉伯芥之各種藥劑敏感性試驗
已明確芬昆諾三酮於小麥中之安全性因素係被AK454412代謝分解。另一方面，揭示出於水稻中CYP81A6代謝分解芬昆諾三酮，且報告其除了芬昆諾三酮以外，亦參與本達隆或免速隆等磺醯脲系ALS抑制劑之代謝分解(Gang Pan et al, Plant Mol Biol (2006) 61: 933 - 943)。由於該CYP81A6與作為小麥P450之AK454412之同源性相對較高，故而認為AK454412基因亦有可能與CYP81A6同樣地參與該等藥劑之代謝分解。
因此，對包含該等磺醯脲系ALS抑制劑之HRAC中所記載之各種作用性之化合物進行同樣之試驗，進行AK454412所能夠代謝分解之化合物之探索。具體而言，對自HRAC2020全部25分類中任意選拔之61種化合物進行導入有AK454412之阿拉伯芥及野生型之敏感性調查。對各藥劑之敏感性係連同作用症狀一起藉由仔細觀察進行評價。
其結果，將於野生型-重組阿拉伯芥間確認到敏感性差之化合物示於圖10-1～10-4。再者，圖10-1～10-4中由照片所示之培養盤之各孔中所含之藥劑之濃度自上邊一行左側起依序為0、0.1及1 nM，自下邊一行左側起依序為10、100及1000 nM。又，下述彙總確認到敏感性差之化合物。( )內之數字表示根據有效果之藥劑濃度藉由仔細觀察所評價出之大致之敏感性差。
・HRAC分類2(ALS抑制劑)
雙草醚鈉鹽(＜5)、嘧硫草醚鈉鹽(100)、嘧舒藩(100)、平速爛(100)、免速隆(10)、甲磺隆(＜10)、滅草喹(≦10)、煙嘧磺隆(＜10)、甲嘧磺隆(5)
・HRAC分類6(PS II抑制劑)
本達隆(＜5)
・HRAC分類14(PPO抑制劑)
丙炔㗁草酮(2)、甲磺草胺(10)、乙基派芬草(10)、氟磺胺草醚(3)
・HRAC分類12(PDS抑制劑)
吡氟醯草胺(2)、氟滅草胺(2)、氟啶草酮(2)、達草滅(2)
・HRAC分類27(HPPD抑制劑)
吡唑特(＜100)、吡草酮(＜100)
・HRAC分類18(DHP合成酶抑制劑)
亞速爛(＜10)
・HRAC分類3(微管聚合抑制劑)
施得圃(＜100)
根據以上之結果表明，AK454412所能夠代謝分解之化合物係包括芬昆諾三酮在內之全部62種化合物中之23種化合物，係在HRAC分類中被分類為2之乙醯乳酸合成酶抑制劑、在HRAC分類中被分類為6之光化學系II抑制劑、在HRAC分類中被分類為14之原紫質原氧化酶抑制劑、在HRAC分類中被分類為12之八氫番茄紅素去飽和酶系(PDS)中之類胡蘿蔔素生物合成抑制劑、在HRAC分類中被分類為27之4-羥基苯基丙酮酸雙加氧酶抑制劑、在HRAC分類中被分類為18之二氫蝶酸合成酶抑制劑、及在HRAC分類中被分類為3之微管聚合抑制劑。
另一方面，此前作為CYP81A6顯示代謝反應性之化合物所報告者僅為本達隆、免速隆等磺醯脲系ALS抑制劑、芬昆諾三酮、嘧舒藩、嘧草醚(HRAC分類中3種作用性)。由此亦可明確，AK454412基因編碼與CYP81A6基因之同源性較高，但基質識別存在較大差異之P450。尤其表明，來自小麥之AK454412基因與來自水稻之同源基因CYP81A6或先前公知之P450基因相比能夠代謝分解作用性不同之更多藥劑。
[實施例4]AK454412基因於各小麥品種中之保守性之驗證
如上所述，表明作為來自小麥之新穎P450之AK454412基因於此前已明確之植物P450中能夠解毒代謝數量最多之藥劑。上述實施例中，使用自作為麵包小麥品種之Apache單離之AK454412基因進行了研究，但為了驗證是否無論小麥品種如何本基因均發揮功能，而對各種小麥品種調查本基因之保守性。
具體而言，藉由對麵包小麥13個品種(Yumekaori、Hanamanten、Yumeseiki、農林61號、Kitahonami、Kinuhikari、Syunyou、Bolak、Sentinel、EGA Wedgtail、Gatalina、Yopti、Apache)、杜蘭小麥5個品種(Orlo、Miradoux、Argeles、Tamarai、Jandaroi)，進行基因序列分析及基因表現量分析來進行驗證。
以下示出基因序列分析方法。利用液氮將於Hoagland's No.2 (Sigma-Aldrich)固形培養基中栽培1週左右之小麥幼苗冷凍粉碎，使用RNeasy植物迷你套組(RNeasy Plant Mini Kit)(Qiagen)提取全部RNA。藉由熱終止用脫氧核糖核酸酶RT級(Deoxyribonuclease RT Grade for Heat Stop)(NIPPON GENE)對所獲得之全部RNA進行DNase I處理後，使用轉錄因子第一鏈cDNA合成套組(Roche)合成cDNA。反轉錄反應中併用寡聚胸腺嘧啶引子及隨機六聚物引子。以所製作之各小麥品種之cDNA為模板，使用AK454412 5'-UTR (Fd)及AK454412 3'-UTR (Rv)之引子組進行PCR，藉此使本基因之5'-UTR～3'-UTR之區擴增。使用GFX PCR DNA及凝膠帶純化套組(GE Healthcare Science)將該等DNA片段進行純化，使用各種引子進行序列分析。
對麵包小麥、杜蘭小麥合計18個品種進行序列分析，結果作為麵包小麥品種之農林61號、Kinuhikari、Sentinel及EGA Wedgtail具有與基因庫記載之AK454412基因之鹼基序列完全一致之基因序列。又，作為杜蘭小麥品種之Miradoux、Argeles、Tamarai、Jandaroi具有AK454412基因之鹼基序列中第1137號之T突變為C(C1137T)之基因序列。進而，麵包小麥品種之Yumekaori、Hanamanten、Yumeseiki、Kitahonami、Syunyou、Bolak、Gatalina、Yipti、Apache具有AK454412基因之鹼基序列中第453號之C突變為T(C453T)且第1137號之T突變為C(T1137C)之基因序列。再者，該等兩點之突變為沉默突變，對胺基酸序列無影響。進而，作為杜蘭小麥品種之Orlo具有AK454412基因之鹼基序列中具有C453T、G1114A、T1137C及C1179T之突變之基因序列。該等之中，伴隨胺基酸突變之突變僅有G1114A(V372M)。根據以上之結果可知，本實施例中所供試之幾乎全部品種均具有與AK454412基因相同之基因或功能同等之基因。
繼而，以如下方式進行表現分析。以如上述般製作之各小麥品種之cDNA為模板進行即時PCR。即時PCR之反應系之製備使用GoTaq qPCR Master Mix(Promega)，熱循環器使用Thermal Cycler Dice Real Time System TP800(TaKaRa)。PCR之反應條件係於95℃下進行30秒初始改性，於95℃下進行5秒改性，於60℃下進行30秒(45循環)退火/延伸。參考基因使用ADP-核糖基化因子基因(寄存編號AB050957)。Ct值之解析方法係使用交點(Crossing Point)法，相對定量之計算方法係藉由校準曲線法來進行。將其結果示於圖11。如圖11所示，於任一品種中，基因表現量均確認到以參考基因表現比計為0.5～4.5左右之與參考基因同程度至其以上之相對較高之表現。
由以上內容表明，AK454412基因於各種小麥品種保守，且發揮功能。
以下示出所使用之引子之序列。
ADP-RF (Fd): 5'-GCTCTCCAACAACATTGCCAAC-3'(序列編號33)
ADP-RF (Rv): 5'-GCTTCTGCCTGTCACATACGC-3'(序列編號34)
AK454412 RT (Fd): 5'-CTCTGCGCGAATTTATTTGG-3'(序列編號35)
AK454412 RT (Rv): 5'-TCACGATGCACTGCAGGTAG-3'(序列編號36)
[實施例5]作為AK454412同源基因之KJ541960之功能分析
如實施例1中所記載，將AK454412基因設為查詢(Query)，於基因庫中進行blast檢索，結果搜索到作為來自小麥之推定P450基因之寄存編號KJ541960(在除了跨膜區之胺基酸序列中與AK454412基因具有一致度為96%之同源性)。由於具有與AK454412基因之較高之同源性，故而關於KJ541960基因亦驗證是否具有與AK454412基因同樣之功能。以小麥18個品種之cDNA為模板，使用KJ541960 5'-UTR (Fd)及KJ541960 3'-UTR (Rv)之引子組進行PCR，擴增KJ541960之5'-UTR～3'-UTR之區。其結果，僅1個品種(Tamarai)確認到目標位置附近之條帶(圖12)。為了確認該DNA片段是否與目標基因一致，而進行本DNA片段之序列分析，結果可明確並非為目標基因。根據以上之結果可認為，此次所供試之小麥品種中有可能不存在本基因。
因此，KJ541960基因要委託Eurofins Genomics公司合成人工基因。此時，於本基因之CDS序列之5'及3'末端分別附加Nde I及EcoR I位點。自所合成之pEX-A2J2-KJ541960質體藉由Nde I/EcoR I處理切出KJ541960基因之DNA片段，使用連接便捷套組(Ligation-Convenience Kit)使其與同樣經Nde I/EcoR I處理之pET-22b (+)載體連結，藉此製作pET-22b-KJ541960(圖13)。本表現構建物係與pACYC-del31_TaCPR一起共導入至BL21 star (DE3)株而用於蛋白質表現。
再者，由人工基因所合成之KJ541960基因係設為編碼於與AK454412基因相同之條件下去除作為膜錨定區之N末端35胺基酸殘基且附加6β序列(MAKKTSS)之胺基酸序列者。以下之蛋白質表現、酶製備、活體外反應及分析係藉由實施例1中所記載之試驗方法及條件進行。活體外藥劑代謝試驗中，以芬昆諾三酮作為基質與重組蛋白質反應，以有無生成作為代謝物之去甲基體作為指標而進行評價。將其結果示於圖14。如圖14所示，用作陰性對照區之空載體粗酶反應區中未檢測到去甲基體，相對於此，作為陽性對照區之AK454412反應區及KJ541960反應區中芬昆諾三酮之母峰減少，去甲基體之波峰出現。又，所檢測到之去甲基體之波峰之強度於兩個反應區中為同程度。由此認為，KJ541960具有與AK454412相同之藥劑代謝能力。
以下示出所使用之引子之序列。
KJ541960 5'-UTR (Fd): 5'-CAACCTGAGACCTCAAGTGTCAC-3'(序列編號37)
KJ541960 3'-UTR (Rv): 5'-CAGTGCTACCGCAAGATAGCTAC-3'(序列編號38)
[實施例6]作為來自大麥之AK454412同源基因之AK375492及AK369081之功能分析
實施例1中所記載之作為來自大麥之CYP81A6同源基因之寄存編號AK375492及AK369081在除了跨膜區之胺基酸序列中與AK454412基因分別具有一致度為93%及80%之同源性。如此，來自大麥之兩個基因亦具有與AK454412基因之較高之同源性，因此關於該等基因亦驗證有無芬昆諾三酮代謝活性。
具體而言，與KJ541960同樣地，製備各自之重組蛋白質，利用活體外試驗評價有無芬昆諾三酮代謝活性。首先，設計於pET-22b (+) 之Nde I/EcoR I位點之間插入有編碼去除寄存編號AK375492基因及AK369081基因之跨膜區(AK375492：N末端35胺基酸殘基、AK369081：N末端37胺基酸殘基)且於N末端附加6β序列(MAKKTSS)之序列的鹼基序列之表現載體，委託GenScript公司合成人工基因。所合成之表現載體(pET-22b中之6βAK375492、pET-22b中之6βAK369081)分別與pACYC-del31_TaCPR一起共導入至蛋白質表現用大腸桿菌BL21 star (DE3)株(圖15)。以下之蛋白質表現、酶製備、活體外反應及分析係藉由實施例1中所記載之試驗方法及條件進行。
蛋白質表現之結果為，僅確認到AK369081於不溶性組分中表現，AK375492於本表現系中並未表現目標蛋白質(圖16)。因此，活體外藥劑代謝試驗僅對AK369081進行。活體外藥劑代謝試驗中，以芬昆諾三酮作為基質使其與重組蛋白質反應，以有無生成作為代謝物之去甲基體作為指標而進行評價。將其結果示於圖17。如圖17所示，用作陰性對照區之空載體粗酶反應區中，未檢測到母化合物以外之波峰，相對於此，AK369081反應區中出現去甲基體之波峰(RT＝15.1附近)。由此認為，AK369081與AK454412同樣地具有芬昆諾三酮代謝能力。
本說明書中所引用之全部刊行物、專利及專利申請案均直接藉由引用而併入至本說明書中。
圖1係示出對CYP81A6、AK375492及AK369081進行多序列比對分析所得之結果之圖。
圖2係示出對CYP81A6、KJ541960及AK454412進行多序列比對分析所得之結果之圖。
圖3係示出使用擴增AK454412基因之引子組之PCR之結果的電泳照片。
圖4係示出AK454412基因之大腸桿菌表現用構建物之製作步驟之特性圖。
圖5係示出AJ303373基因之大腸桿菌用表現構建物之製作步驟之特性圖。
圖6A、B係示出AK454412蛋白質及TaCPR蛋白質之表現之SDS-PAGE照片。
圖7-1係示出對陰性對照區(空載體表現粗酶反應區)進行LC/MS分析時之結果之特性圖。
圖7-2係示出對AK454412及TaCPR之共表現粗酶反應區進行LC/MS分析時之結果之特性圖。
圖8係示出AK454412基因之強制表現用雙偶載體之製作步驟之特性圖。
圖9A、B係示出驗證野生型阿拉伯芥及AK454412強制表現阿拉伯芥有無芬昆諾三酮耐受性所得之結果之照片。
圖10-1係示出驗證野生型阿拉伯芥及AK454412強制表現阿拉伯芥有無對各種除草劑之耐受性所得之結果之表。
圖10-2係示出驗證野生型阿拉伯芥及AK454412強制表現阿拉伯芥有無對各種除草劑之耐受性所得之結果之表。
圖10-3係示出驗證野生型阿拉伯芥及AK454412強制表現阿拉伯芥有無對各種除草劑之耐受性所得之結果之表。
圖10-4係示出驗證野生型阿拉伯芥及AK454412強制表現阿拉伯芥有無對各種除草劑之耐受性所得之結果之表。
圖11係示出對各種小麥進行AK454412基因之表現分析所得之結果之特性圖。
圖12係示出使用擴增KJ541960基因之引子組之PCR之結果的電泳照片。
圖13係示出KJ541960基因表現載體之製作步驟之特性圖。
圖14係示出對KJ541960蛋白質進行針對芬昆諾三酮之活體外藥劑代謝試驗所得之結果之特性圖。
圖15係示出AK375492及AK369081基因表現載體之製作步驟之特性圖。
圖16係示出AK375492、AK369081蛋白質及TaCPR蛋白質之表現之SDS-PAGE照片。
圖17係示出對AK369081蛋白質進行針對芬昆諾三酮之活體外藥劑代謝試驗所得之結果之特性圖。
<![CDATA[<110> 日商組合化學工業股份有限公司(Kumiai Chemical Industry Co., Ltd.)]]>
<![CDATA[<120> 編碼細胞色素P450之基因及其利用]]>
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<![CDATA[<213> 麵包小麥]]>
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<![CDATA[<400> 1]]>
ctg ccg ccg agc ccc ccg gcc atc ccg ttc ctc ggc cac ctc cac ctc 48
Leu Pro Pro Ser Pro Pro Ala Ile Pro Phe Leu Gly His Leu His Leu
1 5 10 15
ctg gag aag ccg ttc cat gcc gcg ctg cgc cgc ctc gcc gcg cgc ctc 96
Leu Glu Lys Pro Phe His Ala Ala Leu Arg Arg Leu Ala Ala Arg Leu
20 25 30
ggc ccg gtc ttc tcg ctg cgg ctc ggc tcg cgc cgc gcc gtt gtg gtc 144
Gly Pro Val Phe Ser Leu Arg Leu Gly Ser Arg Arg Ala Val Val Val
35 40 45
tcc tcg gcg gag tgc gcc agg gag tgc ttc acg gag cac gac gtg acg 192
Ser Ser Ala Glu Cys Ala Arg Glu Cys Phe Thr Glu His Asp Val Thr
50 55 60
ttc gcc aac cgg ccc cgg ttc ccc tcg cag ctg ctc gtc tcc ttc gac 240
Phe Ala Asn Arg Pro Arg Phe Pro Ser Gln Leu Leu Val Ser Phe Asp
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aag gcc gtg ccg ctc gag gcc gtc tgc agg ccg cgc gcg gcc atg cgc 1536
Lys Ala Val Pro Leu Glu Ala Val Cys Arg Pro Arg Ala Ala Met Arg
500 505 510
gac gtg ctc cag agc ctc tga 1557
Asp Val Leu Gln Ser Leu
515
<![CDATA[<210> 16]]>
<![CDATA[<211> 518]]>
<![CDATA[<212> PRT]]>
<![CDATA[<213> 大麥]]>
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Met Asp Lys Ala Tyr Ile Ala Ile Leu Ser Phe Thr Phe Leu Phe Leu
1 5 10 15
Leu His Tyr Ile Leu Gly Lys Val Ser Asn Gly Arg Arg Ser Lys Gly
20 25 30
Asp Val Gln Leu Pro Pro Ser Pro Arg Pro Ile Pro Phe Leu Gly His
35 40 45
Leu His Leu Leu Glu Lys Pro Phe His Val Ala Leu Cys Arg Leu Ala
50 55 60
Ala Arg Leu Gly Pro Val Phe Ser Leu Arg Leu Gly Ser Arg Arg Ala
65 70 75 80
Val Val Val Ser Ser Ala Asp Cys Ala Arg Glu Cys Phe Thr Glu His
85 90 95
Asp Val Ile Phe Ala Asn Arg Pro Gln Phe Pro Ser Gln Leu Leu Val
100 105 110
Ser Phe Asp Gly Thr Ala Leu Ser Thr Ser Ser Tyr Gly Pro His Trp
115 120 125
Arg Asn Leu Arg Arg Val Ala Ala Val Gln Leu Leu Ser Ala His Arg
130 135 140
Val Ala Cys Met Ser Gly Val Ile Ala Gly Glu Val Arg Ala Met Ala
145 150 155 160
Arg Arg Leu Phe Arg Ser Ala Glu Ala Ser Pro Gly Gly Gly Gly Ala
165 170 175
Ala Arg Val Gln Leu Lys Arg Arg Leu Phe Glu Leu Ser Leu Ser Val
180 185 190
Leu Met Glu Thr Ile Ala Gln Thr Lys Gly Thr Arg Ser Glu Ala Asp
195 200 205
Ala Asp Thr Asp Met Ser Val Glu Ala Gln Glu Phe Lys Lys Val Val
210 215 220
Asp Glu Ile Ile Pro Tyr Leu Gly Ala Ala Asn Thr Trp Asp Tyr Leu
225 230 235 240
Pro Val Val Arg Trp Phe Asp Val Phe Gly Val Arg Asn Lys Ile Leu
245 250 255
Ala Ala Val Ser Arg Arg Asp Ala Phe Leu His Arg Leu Ile Asp Ala
260 265 270
Glu Arg Arg Arg Leu Asp Gly Gly Gly Ala Glu Ala Asp Lys Lys Ser
275 280 285
Met Ile Ala Val Leu Leu Thr Leu Gln Lys Thr Glu Pro Glu Val Tyr
290 295 300
Thr Asp Thr Met Ile Thr Ala Leu Cys Ser Asn Leu Phe Gly Ala Gly
305 310 315 320
Thr Glu Thr Thr Ser Thr Thr Thr Glu Trp Ala Met Ser Leu Leu Leu
325 330 335
Asn His Pro Ala Ala Leu Arg Lys Ala Gln Ala Glu Ile Asp Ala Ala
340 345 350
Val Gly Thr Ser Arg Leu Val Thr Ala Asp Asp Val Pro Arg Leu Ala
355 360 365
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370 375 380
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485 490 495
Lys Ala Val Pro Leu Glu Ala Val Cys Arg Pro Arg Ala Ala Met Arg
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Asp Val Leu Gln Ser Leu
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caacctgaga cctcaagtgt cac 23
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gtactacctg gatccacgag c 21
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aaggagatat acatatggat aaggcgtaca ttgcc 35
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gtggtggtgc tcgagtcaga ggctctgaag cacgt 35
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atgagggact cggcgctcga cctgctggcg gcgctgctca cgggccgggc cccgccggcc 60
gccgccgacg gggaccagaa ccgccgcctg ctcgcgctgc tcgccacctc cctcgccgtg 120
ctcgtcggct gcggcgtcgc gctcctcttc cgccgctcct cctccggcgc cgcgccgctc 180
gcccacaagt ccgccgcggc caagcccctc gcagcgaaga aggaccagga gcccgacccc 240
gacgacggcc gccagcgggt cgccctcttc ttcggcacgc agaccggcac cgccgagggc 300
ttcgccaagg cgctcgcgga ggaggccaag gccaggtacg acaaggccgt cttcaaggtg 360
ctcgatctgg atgactatgc cgcggaggac gaggagtacg aggagaagct caagaaggag 420
aacatcgcct tcttcttcct cgcaacgtat ggggacggtg agccaaccga caatgccgcc 480
agattctaca aatggttctc cgagggaaac gagaggggtg agtggttgag caacctcaag 540
ttcggggtgt ttgctcttgg gaataggcag tacgagcatt tcaacaaggt cggaaaggag 600
gtcgatcagc tcctcgccga acaaggtgga aagcgcatag ttcctgttgg ccttggagat 660
gacgatcaat gcattgagga tgacttcaat gcctggaagg aactactgtg gccagaattg 720
gacaaactgc tccgcgttga agataattct tcaacagcac aatctcctta cacagctgct 780
attccgcaat atagagttgt gcttaccaaa ccagaggatg ccacacatat caacaagtct 840
ttcagtctta gcaatggtca tgtcgtctac gacagtcaac atccttgcag ggcaaatgtg 900
gctgtgcgac gggagcttca cacaccagct tctgaccggt cctgcattca tttggaattt 960
gatattgcag gaactagcct tacatatgag actggagatc atgttggtgt gtacgcagaa 1020
aattcaattg agactgtaga ggaggcagaa aagctattag attattcacc agatacttat 1080
ttctcaattt atgctgacca agaggatggc actccacttt ttgggggctc tttgccacct 1140
cctttcccat ctccctgtac tgtgagggtt gcacttgcca gatatgccga tctgttgaat 1200
tcacctaaaa agagtgtttt acttgctttg gctgctcatg catctgatcc caaagaggcc 1260
gagcggctca gacatctagc atctcctgct ggaaagaagg agtattctca gtggataatc 1320
gctagtcaaa gaagtctctt ggaagttatt tcggagtttc catcggcgaa acctccgctt 1380
ggtgtcttct ttgcagctat tgctcctcgc cttcagccga gatactactc aatatcttcc 1440
tcaccaagaa tggcacctac aagaattcat gtaacatgtt cactagttca tgggcaaacc 1500
ccaactggaa ggatccataa aggagtttgt tctacttgga tgaagaattc aactcccttg 1560
gaagagagcc aagaatgtag ctgggctcca atttttgtga ggcagtcaaa cttcaaattg 1620
cctgctgatc ccacagtgcc tgttataatg gtaggccctg ggactggcct tgcacctttc 1680
aggggcttct tacaggaaag attagcttta aaagagaccg gggtggaact gggccgtgcc 1740
atcctgtttt tcgggtgcag aaaccgccag atggacttca tatatgagga tgagctgaac 1800
aactttgccg aatccggagc cctgtctgag ttggtcgtcg ccttttctcg tgagggtcct 1860
acaaaggagt acgtccaaca taaaatggca gagaaggctg cagagctgtg gagcattgtt 1920
tcccagggcg gctatgtgta cgtctgcggc gacgccaagg gcatggcgag agacgtgcac 1980
cgcgcgctgc acaccatagt tcaggagcag ggatctctgg acagctccaa ggcggagggc 2040
tatgtgaaaa accttcagat ggaagggaga tacctgagag acgtctggta a 2091
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atggactccg ccgccgcggg gatgagggac tcggcgctcg acctgctggc ggcgctgctc 60
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ctcgccacct ccctcgccgt gctcgtcggc tgcggcgtcg cgctcctctt ccgccgctcc 180
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gacaaggccg tcttcaaggt gctcgatctg gatgactatg ccgcggagga cgaggagtac 420
gaggagaagc tcaagaagga gaacatcgcc ttcttcttcc tcgcaacgta tggggacggt 480
gagccaaccg acaatgccgc cagattctac aaatggttct ccgagggaaa cgagaggggt 540
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catccttgca gggcaaatgt ggctgtgcga cgggagcttc acacaccagc ttctgaccgg 960
tcctgcattc atttggaatt tgatattgca ggaactagcc ttacatatga gactggagat 1020
catgttggtg tgtacgcaga aaattcaatt gagactgtag aggaggcaga aaagctatta 1080
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cagtgctacc gcaagatagc tac 23
Claims (10)
- 一種細胞色素P450基因，其編碼以下之(a)～(c)中任一項所記載之蛋白質， (a)包含序列編號2、4、6及8之任一胺基酸序列之蛋白質； (b)包含相對於序列編號2、4、6及8之任一胺基酸序列具有80%以上之同一性之胺基酸序列，且對在HRAC分類中被分類為3之微管聚合抑制劑、在HRAC分類中被分類為12之八氫番茄紅素去飽和酶系(PDS)中之類胡蘿蔔素生物合成抑制劑、在HRAC分類中被分類為14之原紫質原氧化酶抑制劑及在HRAC分類中被分類為18之二氫蝶酸合成酶抑制劑具有代謝活性之蛋白質； (c)包含藉由多核苷酸進行編碼之胺基酸序列，且對在HRAC分類中被分類為3之微管聚合抑制劑、在HRAC分類中被分類為12之八氫番茄紅素去飽和酶系(PDS)中之類胡蘿蔔素生物合成抑制劑、在HRAC分類中被分類為14之原紫質原氧化酶抑制劑及在HRAC分類中被分類為18之二氫蝶酸合成酶抑制劑具有代謝活性之蛋白質，上述多核苷酸與包含與序列編號1、3、5及7之鹼基序列互補之鹼基序列之多核苷酸於嚴格之條件下進行雜交。
- 如請求項1之細胞色素P450基因，其中上述蛋白質包含(d)或(e)之胺基酸序列， (d)序列編號10、12、14及16之任一胺基酸序列； (e)相對於序列編號10、12、14及16之任一胺基酸序列具有80%以上之同一性之胺基酸序列。
- 如請求項1之細胞色素P450基因，其中上述蛋白質對在HRAC分類中被分類為2之乙醯乳酸合成酶抑制劑、在HRAC分類中被分類為3之微管聚合抑制劑、在HRAC分類中被分類為6之光化學系II抑制劑、在HRAC分類中被分類為12之八氫番茄紅素去飽和酶系(PDS)中之類胡蘿蔔素生物合成抑制劑、在HRAC分類中被分類為14之原紫質原氧化酶抑制劑、在HRAC分類中被分類為18之二氫蝶酸合成酶抑制劑、及在HRAC分類中被分類為27之4-羥基苯基丙酮酸雙加氧酶抑制劑具有代謝活性。
- 一種表現載體，其包含如請求項1至3中任一項之細胞色素P450基因。
- 一種轉形體，其包含如請求項4之表現載體。
- 一種基因轉殖植物，其包含如請求項4之表現載體。
- 如請求項6之基因轉殖植物，其中植物為植物體、植物器官、植物組織或植物培養細胞。
- 一種植物之製造方法，其係製造對在HRAC分類中被分類為3之微管聚合抑制劑、在HRAC分類中被分類為12之八氫番茄紅素去飽和酶系(PDS)中之類胡蘿蔔素生物合成抑制劑、在HRAC分類中被分類為14之原紫質原氧化酶抑制劑及在HRAC分類中被分類為18之二氫蝶酸合成酶抑制劑具有耐受性之植物，其特徵在於：培養或栽培如請求項6或7之基因轉殖植物。
- 一種防除對如請求項6或7之基因轉殖植物有害之雜草之方法，其係藉由選自由在HRAC分類中被分類為2之乙醯乳酸合成酶抑制劑、在HRAC分類中被分類為3之微管聚合抑制劑、在HRAC分類中被分類為6之光化學系II抑制劑、在HRAC分類中被分類為12之八氫番茄紅素去飽和酶系(PDS)中之類胡蘿蔔素生物合成抑制劑、在HRAC分類中被分類為14之原紫質原氧化酶抑制劑、在HRAC分類中被分類為18之二氫蝶酸合成酶抑制劑、及在HRAC分類中被分類為27之4-羥基苯基丙酮酸雙加氧酶抑制劑所組成之群中之至少1種抑制劑對栽培如請求項6或7之基因轉殖植物之田地進行處理。
- 一種轉形方法，其包括：對宿主細胞導入包含如請求項1至3中任一項之細胞色素P450基因及其他基因之表現載體之步驟；及選拔於選自由在HRAC分類中被分類為2之乙醯乳酸合成酶抑制劑、在HRAC分類中被分類為3之微管聚合抑制劑、在HRAC分類中被分類為6之光化學系II抑制劑、在HRAC分類中被分類為12之八氫番茄紅素去飽和酶系(PDS)中之類胡蘿蔔素生物合成抑制劑、在HRAC分類中被分類為14之原紫質原氧化酶抑制劑、在HRAC分類中被分類為18之二氫蝶酸合成酶抑制劑、及在HRAC分類中被分類為27之4-羥基苯基丙酮酸雙加氧酶抑制劑所組成之群中之至少1種抑制劑之存在下生長之細胞作為轉形體之步驟。
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