KR930010770B1 - DNA 재조합법으로 형질 전환시킨 숙주에 의한 구아르 α-갈락토시다제의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

DNA 재조합법으로 형질 전환시킨 숙주에 의한 구아르 α-갈락토시다제의 제조방법
본 발명은 α-갈락토시다제 효소군에 속하는 특정부류의 효소에 대한 새로운 제조방법에 관한 것이다. α-갈락토시다제 효소는 다른 당과 갈락토즈가 α-결합되어 있는 당류로부터 갈락토즈를 분리시키는 작용을 한다. α-갈락토시다제 효소는 여러유키체들(미생물로부터 인간에 이르기까지)로부터 알려져 있으나 이 효소중 단지 몇몇, 예를 들면 사카로미세스 칼스버겐시스(Saccharomyces carlsbergensis)의 효소(릴예스트룀, 1985 : 섬너스미드 외., 1985), 인간의 효소(비숍 외., 1985), 및 대장균으로부터 멜(mel) 유전자(릴예스트룀 앤드 릴예스룀, 1987)의 구조만이 최근에 밝혀졌다. 후자 둘에 관한 연구는 본 출원의 최초 우선권 주장일 이후 공고되었다.
본 발명에 관한 연구과정에서 사카로미세스 칼스버겐시스의 효소와 대장균의 효소는 이후 설명되는 특정 용도에 부적당하다는 것을 알게 되었다. 인간의 α-갈락토시다제는 구입이 쉽지 않기 때문에 실험할 수 없었으나, 이후 설명되는 실험(본 명세서의 실시예 4 및 표를 참조)으로 보아 인간의 효소도 또한 특정용도에 적당치 않다는 것이 확실하다.
따라서, 극히 제한된 수의 α-갈락토시다제 효소의 제제(preparation)만이 1-4결합 β-D-만노피라노실 단위 주 사슬에 1-6결합 α-D-갈락토피라노실 단위가 결합되어 있는 갈락토만난의 갈락토즈 함량을 감소시키는 방법에 사용하기에 적합하다(맥클리리 외., 1984 : 유럽특허제 EP-A-0 121 960호). 이 방법에서 갈락토만난은 2-70％의 갈락토만난을 함유하는 수화제제 형태로 배양된다. 본 명세서에서 퍼센트는 별도의 설명이 없는 한 중량기준이다. 이 방법에 의하면 식품 및 가축사료 및 화장품 제조에 유리하게 사용되는 갈락토즈 함량이 감소된 갈락토만난이 제조된다. 그러나 이물질에 특이적 작용을 하는 α-갈락토시다제 효소의 화학적 구조는 알려져 있지 않다.
특히 유럽특허 제EP-A-0 121 960호에 기술된 방법에 의하면 바람직하게 27％-10％정도 갈락토즈 함량이 감소된 갈락토만난이 제조된다. 이로인해 갈락토만난의 상호 작용성은 상당히 개선되었다. 구아(guar : Cyamopsis tetragonoloba), 자주개자리(Iucerne : Medicago sativa) 및 호로파종자(fenugreek ; Trigonella foenum)로부터 얻어지는, 높은 비율의 갈락토즈를 함유하는 갈락토만난은 유럽특허 제EP-A-0 121 960호에 기술된 실시예에서 출발물질로 사용될 수 있는 것으로 설명되어 있다. 이 방법에 의해 개선된 특성을 가진 갈락토만난이 제조되는데 이 갈락토만난은 비-처리구아고무 보다 바람직한 특성(예를 들면 다른 다당류와 겔화하는 특성)을 가진 로커스트 빈(=구주 콩나물)고무의 대체물로서 사용될 수 있다. 로커스트 빈 고무는 수확성이 좋지 못하고 그 밭은 보통 재식되지 않으므로 값이 비싸고 구하기 어렵기 때문에, 로커스트 빈 고무의 대체물을 사용하는 것은 로커스트 빈 고무를 사용하는 산업에서 환영받는 일이다.
유럽특허 제EP-A-0 121 960호에 기술된 방법에서는 특이적인 α-갈락토시다제 활성을 가지고 있고 약한 β-만나나제 활성을 가진 효소제제가 사용된다. 이에 적합한 효소는 식물(예를 들면 자주개자리, 호로파종자, 코피빈 또는 구아종자)로부터 얻어지거나 박테리아(예를 들면 세레우스균, 대장균) 또는 진균 배양물(예를 들면 아스페루길루스 또는 효모균)으로부터 얻어지나, 이 모두가 동일한 유용성을 가진 것은 아니다. 갈락토만난의 갈락토즈 함량이 감소될 때까지 적합한 효소제제로 갈락토만난을 배양하여 얻어지는 생성물은 그 자체만으로 사용할 수 있으며, 특히 한천 카라게난 및 크산탄과 같은 기타 다당류와 배합하여 이 물질들과의 상승적 상호작용의 이점을 살려서 사용할 수 있다. 상기 생성물은 사용이전에 정제될 수 있다.
유럽특허 제EP-A-0 121 960호의 실시예에는 다음의 α-갈락토시다제가 기술되어 있다.
- 구아종자의 α-갈락토시다제 II(참조, 맥클리리, 1983)
- 흑색국균(Aspergillus niger)의 α-갈락토시다제(참조. 발 앤드 아그라발, 1969) :
- 자주개자리(Medicago sative)발아종자의 α-갈락토시다제(참조. 실시예 13)
- 호로파(Trigonella foneum-graecum)의 발아종자의 α-갈락토시다제(참조. 실시예 13)
유럽특허 제EP-A-0 121 960호에 설명된 α-갈락토시다제로 처리하면 구아르로부터 얻어진 구아란 및 갈락토즈 함량이 높은 다른 갈락토만난에 비해 개선된 갈락토만난을 얻을 수 있으나, 이 α-갈락토시다제의 구입성이 현재 극히 제한되어 있으므로 가격이 비싸다.
더구나 바람직한 구아의 α-갈락토시다제를 구아의 발아종자로부터 분리하는 경우 바람직하지 않은 물질인 β-만나나제를 완전히 제거해야 하기 때문에 실험실 공정에 의해 조심스럽게 정제해야만 한다. β-만나나제는 갈락토만난의 만난사슬을 분리하는 작용을 한다(참조. 맥클리리, 1983).
따라서 너무 많은 양을 사용하지 않고서도, 갈락토만난의 백본(backbone)을 절단시키지 않으면서 갈락토만난의 갈락토즈 함량을 감소시킬 수 있는 α-갈락토시다제를 제조하는 방법에 요구된다.
α-갈락토시다제에 의해 갈락토만난의 갈가토즈 함량을 감소시키는 것에 관한 공지의 기술은 본 명세서에서 참조문헌으로 소개된 유럽특허 제EP-A-0 121 960호의 명세서 2-3페이지에 발표되어 있다.
본 발명은 1-4결합 β-D-만노피라노실 단위의 주 사슬에 α--D-갈락토피라노실 단위가 결합되어 있는 갈락토만난으로부터 1-b 결합 α--D-갈락토피라노실 단위를 분리시키는 작용을 하는 α-갈락토시다제의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 의하면 α-갈락토시다제는 DNA 재조합법에 의해 제조된다. 즉 목적하는 α-갈락토시다제 특성을 가진 단백질에 대한 유전암호에 지정하는 유전자를 숙주유기체(organism)내에서 클론화시키면서, 이 결과 형질전환된 숙주유기체 또는 그 후대는 상기 유전자를 발현하게 되므로 이렇게 하여 생성된 단백질을 필요에 따라 처리하여 목적하는 α-갈락토시다제 특성을 가진 폴리펩티드를 얻을 수 있다.
미생물에서 발현이 이루어지게 하는 경우는 천열물질로부터 β-만나나제 없는 α-갈락토시다제를 회수하기 위한 복잡한 분리법을 사용하지 않고 새로운 발효법에 의해 α-갈락토시다제를 제조할 수 있다.
β-만나나제가 없는 α-갈락토시다제는 자연적으로 생겨나는 식물을 사용하는 것 보다는 미생물을 사용하면 훨씬 용이하게 제조될 수 있다. 그 이유는 β-만나나제 생성을 완전히 억제할 수 있는 배양조건을 선택할 수 있고 특히 돌연변이체 미생물의 경우 전혀 β-만나나제를 생성시키지 않고 사용될 수 있기 때문이다.
그러나 다른 방법으로서, 식물 또는 DNA 재조합법에 의해 형질전환시킨 식물 조직 배양, 또는 그 후대를 사용하여 구아 α-갈락토시다제 또는 유사 활성 α-갈락토시다제를 제조할 수 있다.
아직까지 목적하는 α-갈락토시다제 특성을 갖는 단백질의 아미노산 배열 및 이러한 단백질에 대한 유전암호를 지정하는 유전자의 뉴클레오티드 배열이 밝혀지지 않았다.
본 발명자는, 이후 설명되는 바와 같이, 목적하는 α-갈락토시다제 특성을 갖는 단백질에 대한 유전암호를 지정하는 유전자를 분리할 수 있게 되었다. 또한, 본 발명자는 상기 유전자를 클로닝벡터(Cloning Vector), 소위 재조합 발현 플라스미드에 도입시킬 수 있게 되었다. 상기 클로닝벡터는 맥주 효모균(Sacchromyes cerevisiase), 이전에 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis)로 알려진 클루이베로미세스 마르시아누스 베리언트 락티스(Kluyveromyces marxianus Var. lactis), 고초균(Bacillus subtilis) 및 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)와 같은 미생물에서 뿐만 아니라 연초(Nicotiana tabacum)와 같은 식물 및 그 제제에서 유전자를 발현시키기 위해 사용되었으며 합성된 단백질은 사용된 발현 플라스미드에 따라 세포내에 또는 세포외부에 존재한다.
α-갈락토시다제의 효소활성은 최초로 맥클리리(1983)에 의해 설명된 P-니트로페닐-α-D-갈락토피라노시드(pNPG)로 배양함으로써 나타났거나 또는 본 실시예 11에서 설명된 바와 같이 4-메틸움벨리페릴-α-D-갈락토피라노시드를 사용하여 식물 또는 조직에서 나타났다. 더구나 생성된 단백질은 천연구아식물로부터 얻어지는 효소와 거의 동일한 정도로, 구아고무의 갈락토즈 함량을 감소시키는데 활성을 가지고 있음이 밝혀졌다.
본 발명의 실시예중 하나는 단백질 또는 그 전구체에 대한 유전암호를 지정하는 뉴클레오티드 배열이 도입된 재조합 백터의 제조방법에 관한 것으로서 이 벡터가 숙주유기체에 전이되면 숙주유기체에서 뉴클레오티드 배열을 발현하게 되는 것이며 상기 단백질을 α-갈락토시다제 활성을 가지므로 1-4결합 β-D-만노피라실 뉴클레오피라실 단위의 주 사슬에 연결되어 있는 1-6결합 α-D-갈락토피라노실 단위를 절단시킴으로써 갈락토만난의 갈락토즈 함량을 감소시킬 수 있다.
상기 단백질 전구체는 예를 들어 단백질의 전좌(translocation)를 촉진시키는 하나 이상의 올리고펩티드 또는 폴리펩티드로 된 단백질을 갖추고 있다.
구아종자의 α-갈락토시다제에 대항하여 생성되는 항체와의 면역 교차반응에 양성을 나타내는 α-갈락토시다제는 1-4결합 β-D-만노피라노실 단위의 주 사슬에 결합되어 있는 1-6결합 α-D-갈락토피라노실 단위를 절단시킴으로써 갈락토만난의 갈락토즈 함량을 감소시키는 작용을 할 수 있는 반면 구아종자의 α-갈락토시다제에 대하여 생성되는 항체와의 면격 교차반응에 음성을 나타내는 α-갈락토시다제는 목적하는 상승을 가지지 않았다는 것을 발견하였다.
또한 α-갈락토시다제를 코드하는 뉴클레오티드 배열은, 생성된 α-갈락토시다제의 목적하는 상승을 상실시키지 않고 유전공학적으로 수정(modify)시킬 수 있다는 것을 알아내었다.
뉴클레오티드 배열은 다음 중에서 선택될 수 있다.
(a) 상기 설명된 특이적 작용을 하는 α-갈락토시다제를 코드하는 천연성 뉴클레오티드 배열.
(b) 구아종자의 α-갈락토시다제에 대항하여 생성되는 항체와의 면역교차 반응에서 양성을 나타내는 α-갈락토시다제를 코드하는 뉴클레오티드 배열
(c) (a) 또는 (b)와 동일한 α-갈락토시다제 또는 상기 설명된 특이적 특성을 가질 수 있는 상기 α-갈락토시다제의 변이체를 코드하는 유전공학에 의한 뉴클레오티드 배열
예를 들어 설명하면 유전자는 α-갈락토시다제를 생성하는 미생물에 적합한 코돈을 사용하여 만들 수 있다. 이런 경우, α-갈락토시다제를 코드하는 뉴클레오티드 배열, 소위 α-갈락토시다제 유전자는 천연성 α-갈락토시다제와 동일한 α-갈락토시다제에 대한 유전암호를 지정한다. 그 이유는 두 효소 모두 동일한 아미노산 조성을 가지고 있기 때문이다. 그러나 또한 특이적인 α-갈락토시다제 활성을 여전히 갖는 변이효소인 변이체를 코드하는 유전자를 만드는 것도 가능하다. DNA 재조합법을 이용하여 개선된 특성(예를 들면 개선된 열안정성 및/또는 특이활성 등)을 갖는 α-갈락토시다제의 변이체를 코드하는 유전자를 유전공학적으로 만들 수 있다.
본 발명은 특히 다음과 같은 아미노산 내열을 갖는 단백질을 코드하는 뉴클로에티드 배열을 가진 벡터의 제조방법을 제공한다.
Figure kpo00001
만일 구아종자의 α-갈락토시다제를 코드하는 천연성 유전자를 사용하고자 하는 경우 본 명세서에서 설명된 방법에 의해 알게된 바와 같이 이중-가닥 상보 DNA(ds-cDNA)를 사용하는 것이 바람직하다. 이 ds-cDNA의 ＋가닥은 제6도에 나타낸 307-1398의 염기배열을 가지고 있으며 이에 의한 해당 코돈 아미노산 배열은 상기 나타낸 1-364의 아니노산 배열과 같다.
선택된 숙주유기체에 적합한 벡터는 다음 요소로 구성되어 있다.
(a) α-갈락토시다제 또는 그 전구체에 대한 유전암호를 지정하는 이중-가닥 DNA(ds-DNA),
(b) (a)ds-cDNA의 ＋가닥의 유전암호 지정 부분의 3'-말단에 결합되어 있는 해독정지코돈(경우에 따라 선별된 숙주유기체에 적합한 전사 종결배열이 연결됨).
(c) (a)의 ds-DNA의 ＋가닥의 상류에 위치하는 선별된 숙주유기체에 적합한 발현 레규론(regulon)
(d) ds-DNA가 완성형태의 α-갈락토시다제에 대한 유전암호를 지정하고 이러한 형태가 메티오닌잔기로 개시되지 않는 경우, (a)의 ds-DNA의 ＋가닥의 코드부분의 5'-말단에 결합되어 있는 해독개시 코돈 ATG
(e) 선별된 숙주유기체의 게놈 및/또는 선별된 숙주유기체에 적합한 복제오리진과 임의의 선별 표식자에 (a)의 ds-DNA이 통합되는 것을 촉진시키는 뉴클레오디트 배열.
(f) 임의선택적의로, α-갈락토시다제 전구체 형태의 전구부분을 코드하는 ds-DNA
본 발명의 다른 실시예는 이미 설명한 바와 같이 재조합 벡터를 도입함으로써 바람직하게 β-만나나제가 없는 α-갈락토시다제를 합성할 수 있는 능력을 가진 전형된 숙주유기체 및 그 후대를 제조하는 방법에 관한 것이다. 숙주유기체로는 가지과, 특히 담배속(니코티아나)식물, 또는 동물 또는 인간세포 뿐만 아니라 바실루스(Bacillus)와 같은 박테리아, 아스페르길루스(Aspergillus)와 같은 사상균, 사카로미세스 클루이베로미세스, 한세눌라, 및 피치아(Pichia)와 같은 효모균등의 미생물도 사용된다.
본 발명에서는 다음과 같은 숙주유기체를 사용하였다. 즉 맥주 효모균, 클루이베로미세스 마르시아누스 배리언트 락티스, 고초균, 한세눌라 폴리모르파 및 연초를 사용하였다.
이렇게 다양한 숙주유기체에서 유전자가 발현되므로 다른 종류의 숙주유기체에서도 유전자가 발현될 수 있다는 예상이 가능하다. 그 예로는 피치아 파리토리스(Pichia pastoris), 사카로미세스 칼스버겐시스, 혹색국균(Aspergillus nigen), 위소성국균(Aspergillus nidulans)등이 있다.
본 발명은 주요한 실시예는 1-4결합 β-D-난노피라노실 단위 사슬에 결합되어 있는 1-6결합 α-D-갈락토피라노실 단위를 절단시킴으로써 갈락토만난의 갈락토즈 함량을 감소시키는 작용을 하는 α-갈락토시다제의 제조방법에 관한 것이다. 본 제조방법은 숙주유기체의 배양중에 또는 배양 후 유도과정중에 α-갈락토시다제가 생성되도록 하는 조건하에서 본 명세서에서 이미 설명된 바와 같은 전형된 숙주유기체를 배양한 후에 α-갈락토시다제를 수거하는 것을 특징으로 한다. 본 실시예에 의하면 α-갈락토시다제가 숙주유기체에 의해 분비되면 그 다음 이 발효액으로부터 세포를 제거시키고 원하면 발효액을 농축시킴으로써 α-갈락토시다제를 수거하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 β-만난나제가 없는 α-갈락토시다제로 갈락토만난의 수성제제를 배양시킴으로써 갈락토만난의 갈락토즈 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 예를 들면 유럽특허 제EP-A-0 121 960호에서 공지된 것이다. 본 발명은 이전 단락에서 설명한 바와 같은 방법에 의해 제조되는 α-갈락토시다제를 사용하는 것을 특징으로 한다. 본 발명은 갈락토만난을 개선하기 위한 공지방법을 상업적으로 보다 바람직한 양과 비용으로 α-갈락토시다제를 제공한다.
마지막으로 본 발명은 이전 단락에서 설명한 방법에 의해 제조되는 갈락토즈 함량이 낮은 갈락토만난을 식품, 가축사료 및 화장품의 제조방법에 사용하는 것에 관한 것이다. 상기 제조에는 갈락토만난을 1종 이상의 기타 농축제 또는 겔화제 예를 들면 아라비아고무, 트라가칸트, 한천, 알긴, 카라계단, 퍼셀라란, 펙틴, 젤라틴, 전분 및 변이된 고무(예. 카르복시 메틸셀룰로즈)와 혼합하여 사용할 수 있다.
후반의 두 실시예는 다음과 같은 내용을 설명하는 실시예이다.
(1) α-갈락토시다제를 생성하는 전형된 숙주유기체를 사용하는 본 발명의 방법에 의해 제조된 α-갈락토시다제를 갈락토만난의 갈락토즈 함량을 감소시키는데 사용하는 것.
(2) 본 발명의 방법에 의해 합성된 α-갈락토시다제로 갈락토즈 함량이 높은 갈락토만난을 처리하여 얻어진 갈락토즈 함량이 낮은 갈락토만난을 식품, 가축사료 또는 화장품의 제조에 사용하는 것.
본 발명의 여러 특징은 광범위한 연구의 결과이다. 그 특징은 대략 다음과 같으며 실시예에 자세히 설명되었다.
본 발명의 한 특징은 1-4결합 β-D-만난피라노실 단위 사슬에 결합되어 있어 1-6결합 α-D-갈락토피라노실 단위를 절단시킴으로써 갈락토만난의 갈락토즈 함량을 감소시킬 수 있는 α-갈락토시다제 효소의 뉴클레오티드 배열 및 아미노산 배열의 제조방법을 밝힌 점이다.(실시예 1 참조)
이 효소의 활성이 발아하는 구아종자의 내배유속에 존재하고 있다는 것은 알려져 있다. 그러나 구아종자의 어떤 세표가 이 α-갈락토시다제 효소의 생성에 관계하는지는 밝혀지지 않았었다.
발아하는 구아종자에 대한 현미경 조사에서, 종피 및/또는 배아를 제거시킨 후 내배유 분해를 관찰한 결과 효소는 내배유 자체내에서 생성되며, 알류론 세포가 이 효소의 합성과 관계가 있다는 가설이 가능하였다. (실시예 1의 1.1).
상기 가설은 입증되어야 했다. 따라서 mRAN를 얄류론 세포로부터 정제해야 했다. 20시간 동안 발아시킨 종자로부터 절단된 카트로피제(chaotropic agents)를 사용하여도 RNA의 추출을 방해한다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 내배유, 다당류를 분해시키기 위한 추가효소를 사용하였다. RNA 정제를 위해서는 주의깊은 조건의 조절이 필요하였다. 그렇지 않으면 알류론 세포자체내에서 합성된 RNase 효소로 인하여 정제도중에 알류는 세포내의 RNA가 분해되었다. 정제된 RNA를 다음 방법에 의해 α-갈락토시다제를 코드하는 nRNA의 존재유무를 분석하는데 사용하였다
-α-갈락토시다제에 특이적인 항체와 반응하는 단백질 인가를 실험관 해독 및분석함
-α-갈락토시다제에 특이적인 올리고 뉴클레오티드 혼합프로브(probe)와 nMNA를 혼성화함 (이러한 이적 특이적 프로브를 구성하기 위해서 본 발명은 정제된 단백질의 아미노산 배열 일부를 결정함).
두 분석법의 결과는 α-갈락토시다제를 코드하는 mRNA가 알류론 세포속에 존재한다는 것을 보여준다(실시예 1의 1.2).
mRNA를 α-갈락토시다제에 특이적인 올리고 뉴클레오티드 프로브를 사용한 표준법에 의해 구아의 α-갈락토시다제 cDNA 클론의 뉴클레오티드 배열을 결정하였고 아미노산 배열을 유도하였다. 정제된 단백질에 대해 결정된 NH2-말단 아미노산 배열은 뉴클레오티드 배열로부터 유도된 아미노산 배열과 동일한 것으로 밝혀졌으며 또한 α-갈락토시다제는 완성 단백질 안에 47개의 아미노산 잔기가 연장되어 있는 전체형태로 합성된다는 것을 보여 주었다(실시예 1의 1.5).
본 발명의 또 다른 특징은 여러 숙주유기체에 의한 구아 대한 α-갈락토시다제의 새로운 제조가 가능하다는 점이다. 본 발명자는 상기 설명한 특이적 특성을 가진 α-갈락토시다제 효소를 제조하는 새로운 방법을 제공한다. 숙주유기체로서 2종의 미생물을 사용하여 실험한 결과 경제적으로 관심이 될 만한 수준을 보였으며 몇몇 다른 숙주유기체(미생물 및 식물)에서도 그 가능성이 나타났다.
설명을 위해 본 발명자는 사카로미세스, 클루이베로미세스, 바실루스, 한세눌라 및 니코티아나에서 효소를 합성할 수 있는 플라스미드를 구성하였다.
맥주 효모균에서 설명한다면, 하나의 플라스미드 pURY 2703에서는 효모 GAPDH 프로모터를 완성 α-갈락토시다제만을 코드하는 유전정보에 융합시켰다. 또다른 하나의 플라스미드 pURY 2705에서는 GAPDH프로모터를 인베르타제 암호배열 : α-갈락토시다제로 구성된 혼성 유전자에 융합시켰다. 두 플라스미드는 P-니트로페닐-α-D-갈락토피라노시드에 대해 활성인 맥주 효모균중에서도 효소를 합성하게 하였다. 그러나 pURY 2705의 생성물은 pURY 2703의 생성물과 대조적으로 효모균 세포 외부에 존재하였다. 또한 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)에 의해 pURY 2705로부터의 생성물은 식물의 효소와 같은 분자량을 가진 반면 pURY 2703으로부터의 생성물은 이보다 약간 작은 분자량을 가진 것을 확인하였다(실시예 2참조).
플라스미드 pURY 2705를 가진 호모균 세포로부터 1ml당 10단위의 α-갈락토시다제가 존재하는 생추출물을 얻을 수 있다. 이러한 생추출물은 구아르고무의 갈락토즈 함량을 감소시킬 수 있는 것이다(실시예 3참조).
또다른 시가로미세스에 대한 설명으로, 탄소원으로서 갈락토즈를 사용하여 효모균 세포를 증식시켜 유도된 GAL7 프로모터를 인베르타제 암호배열 : 완성 α-갈락토시다제로 구성된 혼성 유전자에 융합시켜, 플라스미드 pUR 2706 및 pUR 2703을 구성하였다.
두 플라스미드 사이의 차이점은 pUR 2706에는 271bp의 클로닝 GAL 7DAN 단편이 사용되었고 pUR 2703에서는 7 프로모터가 시험관 내에서 합성된 올리고 뉴클레오티드로부터 얻어졌다는 점이다. 플라스미드 pUR 2706는 갈락토즈를 사용한 증식에 의한 유도체로써 호모균 세포에 의한 효소의 합성을 하게 한다.
이 효소는 정확하게 처리되고 글리코실화된 효소로서, 5000 단위/1 수준까지 증식배지 내에 분비된다. 상기 발효액으로부터 효모균 세포를 여과에 의해 제거시킨 후에 이 발효액을 10 농축시켰다. 이 생농축액은 구아종자로부터 정제된 효소와 동일한 정도만큼 구아고무의 갈락토즈 함량을 감소시킬 수 있다(실시예 10참조).
구아종자의 α-갈락토시다제에 대항하여 생성되는 항체와의 면역교차 반응에 양성을 나타내는 것과 갈락토만난의 갈락토즈 함량을 감소시킬 수 있는 특성 사이에 연관성이 있다는 것은 실시예 4에서 입증된다.
α-갈락토시다제 유전자 맥주 효모균에서 뿐만 아니라 다른 미생물에서도 발현될 수 있다는 것을 설명하기 위해서, 다음과 같은 여러종류의 미생물에서 효소를 합성할 수 있는 플라스미드를 구성하였다.
(a) 클루이베로미세스 마르시아누스 배리언트 락티스
(b) 한세눌라 풀리모르파
(c) 고초균
(a) 클루이베로미세스 마르시아누스 배리언트 락티스에서의 α-갈락토시다제의 제조.
맥주 효모균의 플라스미드 pURY 2705에 클루이베로미세스 자가복제 시스템(즉 KARS 2) 및 선별표 식자(trp-1 유전자)를 도입시킴으로써 pUR 2405인 플라스미드를 구성하였다. 클루이베로미세스 마루시아누스 배리언트 락티스 균주 SD11(lac-4, trp-1)효모균 세포를 플라스미드 pUR 2405로 전형시켰다. 증식 후 전형된 균주의 세포 추출물은 이 플라스미드를 가지지 않은 것 이외에는 동일한 균주와 현저히 달라서인공기질 pNPG를 가수분해 할 수 있는 단백질을 함유하였다. 또한 웨스턴 블롯 분석법에 의해 생세포 추출물을 분석한 결과 구아 α-갈락토시다제 효소가 존재함을 입증하는 것으로 구아 α-갈락토시다제 항혈청과 특이적 반응을 나타내었다(실시예 5참조). 이러한 실험은 전형된 α-클루이베로미세스가 구아 α-갈락토시다제 효소를 합성한다는 것을 입증한다.
(b) 한세눌라 폴리모파에서의 α-갈락토시다제의 제조.
MOX 프로모터 또는 DHAS 프로모터와 같은 유도할 수 있는 프로모터를 특이적으로 사용하여 한세눌라 폴리모르파에서 이형 생성물을 합성하리라는 가능성은 이미 인정되었다.
한세눌라 폴리모르파 내에서 복제가능하고 leu-돌연변이를 보충할 수 있는 벡터 YEp 13을 기본으로 하는 pUR 3510인 플라스미드를 구성하였다. 이 벡터는 다음과 같은 구성으로 이루어져 이다. MOX 프로모터-인베르타제 암호배열-완성 α-갈락토시다제-MOX 종결자.
한세눌라 폴리모르파 균주 L1(leul-1)효모균 세포를 플라스미드 pUR 3510으로 전형시켰다. 이것을 탄소원자로서 글리세롤을 사용하여 한천판상에서 증식시킨 후 긁어 벗겨서 세포 추출물을 수거하였다. 전형된 균주의 세포 추출물은 플라스미드를 가지지 않은 것 이외에는 동일한 균주와 현저히 달라서, 인공기질인 pNPG를 가수분해 할 수 있는 단백질을 함유하였다. 똔한 웨스턴 블롯 분석법에 의해 생세포 추출물을 분석한 결과 구아 α-갈락토시다제 효소가 존재함을 입증하는 것으로 구아 α-갈락토시다제 항혈청과 특이적 반응을 나타내었다(실시예 8 참조). 이러한 실험은 전형된 한세눌라가 구아 α-갈락토시다제 효소를 합성한다는 것을 입증한다.
(c) α-갈락토시다제 유전자가 진핵 미생물에서 뿐만 아니라 전핵 미생물에서도 발현될 수 있다는 것을 설명하기 위해서 고초균에서 효소를 합성할 수 있는 플라스미드를 구성하였다.
α-아밀라제아제 암호배열 : 완성 α-갈락토시다제로 구성된 혼성 유전자 앞에 SPO2 프로모터를 도입시켜 pUR 2601인 플라스미드를 구성하였다.
[실시예 6 참조]
이 플라스미드를 포함하는 고초균 세포를 배양하였을 때 배지중에서 특정의 증식기에 pNPG에 대한 활성을 가지는 단백질이 존재한다. 발효에 최적인 증식배지 및 증식 조건을 선택하면 증식배지 1 1당 1760단위의 양이 존재하여다. 웨스턴 블롯 분석을 실시한 결과 증식배치 내에 α-갈락토시다제 효소가 존재함을 입증하는 구아 α-갈락토시다제 항혈청과 특이적 반응을 나타내었다. 그러나 그 분자량은 식물효소의 분자량보다 약간 낮았다. NH2 말단의 배열에 의해 α-아밀라아제 암호배열이 완전히 바르게 제거되었다는 것을 본 발명자는 알았기 때문에 상기 차이는 고초균 효소가 글리코실화 되지 않는다는 사실에 의해 생긴 것이라고 할 수 있다.
상기 실험은 전형된 고초균은 구아 α-갈락토시다제를 합성할 뿐만 아니라 이 효소를 증식배지 내로 분비한다는 것을 입증한다. 또한 고초균에 의해 합성된 효소는 구아고무의 갈락토즈 함량을 감소시킬 수 있다는 것이 입증되었다(실시예 7 참조).
α-갈락토시다제 유전자가 미생물에서 뿐만 아니라 식물에서도 발현될 수 있다는 것을 설명하기 위해서 연초 즉, 칼루스 배양물, 뿌리 배양물, 현탁액 배양물 및 전체식물에서 효소를 합성할 수 있는 플라스미드를 구성하였다. 즉, 성숙구아 pre-pro-α-갈락토시다제를 함유하는 식물 발현 벡터를 구성하였다(pUR 8001).
이 벡터를 모식균(Agrobacterium tumefaciens)에서 유도된 벡터에 의해 연초식물 또는 제제에 도입시켰다. 그 결과 칼루스 배양물. 털이많은 뿌리 배양물, 잎 및 현탁조직 배양물에서 활성 α-갈락토시다제 효소가 합성되었다. 또한 연소조직에서 합성된 α-갈락토시다제는 웨스턴 블롯 분석결과 구아의 알류론 세포에서 합성된 효소와 같은 분자량을 가지고 있다는 것이 밝혀졌다(실시예 11 참조).
본 발명의 기타 자세한 것은 비한정적인 다음 실시예들에서 설명될 것이다.
실시예들의 주제는 다음과 같으며 실시예 1과 4는 세분되어 있다.
갈락토만난의 갈락토즈 함량을 감소시킬 수 있는 α-갈락토시다제 효소를 코드하는 유전정보의 분리 및 특성.
1.1 α-갈락토시다제를 합성하는 구아종자 내의 세포의 확인
1.2 알류론 세포로부터의 mRNA의 정제 및 분석
1.3 구아종자의 알류론 세포의 mRAN로부터 cDNA 라이브러리 구성.
1.4 구아의 α-갈락토시다제 유전정보를 가지고 있는 클론의 선별.
1.5 구아의 α-갈락토시다제 cDNA 클론의 뉴클레오티드 배열 및 이로부터 유도된 α-갈락토시다제 효소의 아미노산 배열의 결정.
[실시예 2]
유전공학적인 맥주 효모균에 의한 구아 α-갈락토시다제의 제조
[실시예 3]
유전공학적인 맥주 효모균에 의해 제조된 α-갈락토시다제를 사용한 갈락토만난의 갈락토즈 함량의 감소.
[실시예 4]
여러 α-갈락토시다제 효소의 면역학적 관계 및 고무 개선능력
4.1 α-갈락토시다제 효소원(source)
4.2 유전공학적으로 다음의 미생물에 의해 합성된 효소, 맥주 효모균, 클루이베로미세스 마르시아누스 배리언트 락티스, 한세눌라 플리로모르파 및 고초균.
4.3 오크터로니 이중 확산법(Ouchterlony double diffusion)에 의해 분석된 면역학적 관계.
4.4 웨스턴 블롯 분석법에 분석된 면역학적 관계.
4.5 α-갈락토시다제의 갈락토만난중의 갈락토즈 함량 감소능력.
[실시예 5]
유전자 조작 클루이베로미세스 마리시아누스 배리언트 락티스에 의한 구아 α-갈락토시다제의 제조.
[실시예 6]
유전자 조작 고초균에 의한 구아 α-갈락토시다제의 제조.
[실시예 7]
유전자 조작 고초균에 의해 합성된 α-갈락토시다제 효소에 의한 갈락토만난의 갈락토즈 함량의 감소.
[실시예 8]
유전자 조작 한세눌라 폴리모르파에 의한 구아 α-갈락토시다제의 합성.
[실시예 9]
유전자 조작 GAL7 프로모터를 사용한 유전자 조작 맥주 호모균에 의한 구아 갈락토시다제의 제조.
[실시예 10]
유전자 조작 GAL7 프로모터를 사용한 유전자 조작 맥주 효모균에 의해 제조되는 α-갈락토시다제에 의한 갈락토만난의 갈락토즈 함량의 감소.
[실시예 11]
유전자 조작 식물 및 식물조직(특히 연초종)에 의한 구아 α-갈락토시다제의 제조.
본 명세서는 또한 표, 참조문헌 목록, 사용된 약어목록, 도면설명 및 도면 1-21를 포함한다.
[실시예 12]
갈락토만난의 갈락토즈 함량을 감소시킬 수 있는 α-갈락토시다제 효소를 코드하는 유전 정보의 분리 및 특성.
1.1 α-갈락토시다제를 생성하는 구아종자내 세포의 확인
고아고무의 개선에 적합한 효소는 구아종자의 내배유로부터 얻어지는 α-갈락토시다제라는 것이 밝혀졌으므로(맥클리리 외., 1984 : 유럽특허 제EP-A-0 121 960호), 본 발명자는 이 특이적 효소의 설명에 중점을 두었다.
구아는 내배유 콩과 식물이다. 종자의 내배유는 세로층, 알류론 및 저장물질로 이루어져 있으며, 저장물질은 주로 초기에는 세포벽 다당류로서 존재하고 종자 발아중에 분해되는 갈락토만난으로 구성된다. 다른 콩과 식물에서와 같이 저장단백질은 내배유 내에 둘러싸여진 종자 자엽에 존재한다. 내배유 콩과 식물의 발아와 저장물질의 동원(mobilisation)에 관한 연구들은 관련 콩과 식물인 호로파종자 및 자주개자리를 사용하여 실행되어 왔다(참조 : 마이어와 라이드 1982). 팽윤(수분흡수에 의해 달성됨)후에 효소들은 내배유 내로 방출되는데, 두 개의 주요 효소활성은 α-갈락토시다제 및 β-만나나제인 것이 밝혀졌다. 우리가 아는 바로는 결정적인 증거가 지금까지 제시된 바 없지만, 이러한 연구결과들은 효소가 호로파 종자의 발아시에 알류론 세포내에서 합성된다는 것을 시사한다. 구아와 호로파 종자는 같은 종자이기 때문에, 구아종자에서도 이러한 효소가 알류론 세포내에서 매우 유사하게 합성된다는 가정이 가능하다.
우선 현미경을 사용하여 구아종자의 발아를 연구하였다.
종자를 샤프한 레이저 블레이드로 얇게 잘라 1mm 디스크로 만든후에 30℃에서 6시간 동안 0.1M 소디움카코딜레이트 완충액(pH 7.4)에 용해시킨 2.5％ 글루타르알데히드에 고정시켰다. 그 다음에 그 물질을 동일한 완충액으로 여러차례 헹군후 실온에서 0.1M 카모딜레이드 완충액내의 1％ 오스뮴 테트록시드에 4시간동안 고정시켰다. 조직은 에탄올로 탈수시키고 스퍼스 에폭시수지(Spurrs Epoxy resin)속에 묻어 두었다. 75℃에서 24시간 동안 중합시켰다. 라이커트 울트라컬 마이크로톰(Reichert Ultracut microtom)상의 글라스나이프(glass knife)들을 사용하여 박편을 만들었다. 박편들을 1㎛ 두께와 2㎛ 두께로 만들었으며, 깨끗한 글라스 슬라이드에서 한방울의 증류수 위에 띄우고 60℃의 가열판 위에 올려놓고서 건조시켰다. 1％ 톨루이딘 블루 0로 염색시키고 염색된 박편을 DPX 마운탄트(mountant)(BDH 제품)에서 놓았다. 페이스(Phase)와 인터페렌스 콘트라스트옵틱스(Interference Contrast optics)를 함께 이용하여 라이프 오르토룩스 현미경(Leitz Ortholux microscope)상에서 현미경 사진을 찍었다. 매우 두꺼운 종피의 강한 복굴절을 강조하기 위하여 편광을 사용하였다.
제1도에 도시된 발아안된 구아종자의 박편에서, 구아에서는 몇몇 내배유 종자에서 처럼 알류론이 세포의 단일 간섭층을 형서하지 않는다는 것을 알 수 있다. 그 층은 여러지점에서 제시되는 바와 같이 2, 3, 4 또는 그 이상의 세포들로 되어 있다. 발아가 진행됨에 따라 내배유는 점차 유연해져서 절단하기가 점점 어려워진다. 종자가 42시간 발아되었을 때 내배유 구조의 뚜렷한 파괴가 있었으나 알류론 세포는 그 내용이 결실되었음에도 불구하고 그 세포의 외층은 안정한 세포간 매트릭스 내에서 파괴되지 않고 남아있는 것으로 보였다. 알류론 층과 잔류 내배유 사이에 뚜렷한 파괴가 생기는 이 단계에서, 내배유 뷴해는 알류론에 아주 가까운 것을 암시한다. 이것은 내배유 분해효소가 알류론 층으로부터 방출되는 것을 암시한다. 내배유 분해의 진행은 발아중에 종피의 부재에 의해 변경되지 않았다. 또한, 팽윤후 배아를 제거하여도 유사하게 연화된 내배유가 관측되었다. 이것은 종피와 배아가 내배유의 파괴에 관여하지 않는다는 것을 시사한다. 또한 이것은 종피와 배아가 내배유 분해에 관련되는 효소(α-갈락토시다제 및 β-만나나제)의 합성에 관계되지 않는다는 것을 의미한다.
이러한 결과들은 또한 구아종자에서 α-갈락토시다제, 또는 그 전구체가 알류론 세포내에서 합성되고 나서 그 세포에 의해 저장 다당류층내로 분비된다는 가설과 일치한다. 그러나 이 가설에 대한 결정적인 증거는 단지 α-갈락토시다제 효소 또는 α-갈락토시다제를 코드하는 mRNA가 알류론 세포내에 존재한다는 것을 증명하는 것으로부터 얻을 수 있다. 단백질의 존재를 증명하기 위해서는 어려움(신속한 분비, 확인불능의 전구체형)이 따르기 때문에 알류론 세포내의 알파-갈락토시다제를 코드하는 mRNA의 존재를 분석해야만 하였다.
1.2 알류론 세포로부터 mRNA의 정제 및 분서
α-갈락토시다제를 코드하는 mRNA의 존재를 알아보기 위해 알류론 세포의 mRNA 함량의 분석에 다음의 방법을 채택하였다.
-내배유내에 존재하는 대부분의 다당류로부터 유리된 알류론 세포의 분리.
-알류론 세포로부터 mRNA의 정제.
-mRNA의 시험관내 해독, 정제된 α-갈락토시다제에 대항하여 생성된 항체를 가진 단백질 산물의 분리, 및 폴리아클릴아미다 겔 전기영동에 의한 분석.
-부분 결정된 아미노산 배열에 의거한 α-갈락토시다제-특이올리고 뉴클레오티드 프로브(probe)에 의한 mRNA의 노던 블롯 혼성화(Northern blot hybridzation)
1.2.1 알류론 세포의 분리
구아종자(시판변종 King Guar Var. Seah 90 : 살균제 처리, Crown Quality Seed Co. Texas로부터 구입)를 10％ 클로로스(Chloros)(표백제 : 유효 염소 4％)로 1시간 동안 살균하였다. 계속해서, 이 종자를 살균된 수돗물로 이 수돗물을 수차 교환하면서 5시간 동안 세척하여 팽윤시켰으며(종피로부터 색소가 방출되어 물이 갈색이 됨)투명마가린 텁(tub)내에 들어 있는 수돗물/1％ 아가로즈 겔의 표면상에 놓아 발아시켰다. 발아는 20시간 동안 계속되었다.
그 다음에 종자를 개별적으로 절개하였다. 맨 먼저 마이크로필(micropile)부분을 꿰찔러서 종피를 벗겼다. 그 다음 2개의 자엽의 가장자리에 퍼져있는 내배유의 얇은 부분을 살며시 찢어서 내뱅를 배로부터 분리시켰다. 그런후 내배유를 두쪽으로 분리시켰다.
이러한 발아하는 내배유로부터 RNA를 직접 정제하기 위한 시도는 가장 강력한 카오트로피제(예, 구아니디늄 티오시아네이트)를 사용하여도 이 내배유들이 가공하기 매우 힘든 겔이 되기 때문에 실패하였다.
그러므로, 그 다당류로부터 알류론 세포를 추가로 분리하는 것이 필요하였다.
따라서, 본 발명자는 외부로부터 가하는 효소제제로 그 다당류를 분해시키기로 결정하였다.
두쪽으로 분리된 내배유를 12％ 자당이 보충된 갬보그(Gamborg) B5배지(Gibco)에 용해시킨 효소용액내에서 22℃로 배양시켰다.
내배유 내용물의 완전소화는 눈으로 모니터 될 수 있으며 이것은 사용된 효소와 그 농도에 죄우된다. 분해가 진행됨에 따라 내배유는 점차 그 반구형상을 상실하며 부드럽고 유연하게 되었다. 여러 가지 시중구입 가능한 효소들 [오나주카 R10(Jinki Honsha Co, Ltd, 제품), 감마나제(NOVO 제품) 및 드리젤라제(Fluka 제품)]을 서로다른 농도로 시험하였다. 초기연구들에서 시판의 농축효소제제에 알류론 세포를 노출시킨 결과 알류론 세포를 원형질 분리시켜 죽게한다는 것이 밝혀졌으므로 그 효소제제를 고 농축 형태로 처리하여 사용하였다. 이것은 벤조일화 투석관(시그마제품)을 사용한 투석에 의해 행하여졌다. 이 효소를 12％ 자당함유 B5배지에 용해(10％)시킨 다음에 4℃의 동일한 배지에 대하여, 사용전에 18-24시간 동안 투석하였다. 그 다음에 이 효소를 내배유를 소화시키는데 사용하였다. 이들중에서, 드리젤라제가 10％ 농도에서 가장 효과적인 것으로 나타났다. 7-8시간의 배양후에, 지지 다당류 조직이 모두 소화되면서 내배유가 동그래졌다. 알류론이 둥그래지는 점을 소화의 종결점으로 취하였다. ＂동그래진＂ 알류론 샘플을(괴사에 대하여) 현미경 시험하였으며 또한 FDA 염색을 이용하여 생존율을 체크하였다(플루오레세인 디아세테이트 염색제, Hoechst를 아세톤으로 5mg/ml 농도로 만들었으며 사용직전에 배지에 1/50 희석시켰다). 최적의 효소처리(10％ 효소, 7-8시간 배양)를 하였더니 약간(20％ 이하)의 죽은 또는 괴사 세포가 생겼다. 이 세포로부터 얻은 RNA 제제는 리보좀 RNA의 통합성으로 판단할 때 잘 보존되었다는 것이 밝혀졌다.
원하는 외관(희고 둥그래진 외관)의 알류론층을 소화배지로부터 개별적으로 분리시켜 동일한 삼투압에서 5회 세척하여 잔류 다당류를 제거한다.
마지막으로 이것을 액체질소속에 넣어 저장하였다. 현미경으로 관찰하기 위하여 제조한 이 물질의 박면들은 그 알류론 2-3개의 세포 두께를 가졌으며 그 세포는 효소제제에 의한 분해를 억제시키는 매트릭스내에 내포되어 있다는 것이 밝혀졌다.
1.2.2 알류론 세포로부터 RNA의 정제
냉동된 알류론 물질을 드라이아이스 온도로 유지된 몰타르와 페스틀(pestle)로 분쇄하였다. 분쇄된 물질을 1용량의 분해 완충액(50mM Tris-HCI pH 8.0, 2％ 사르코실)+2용량의 페놀(1M Tris- HCI pH 8.0으로 평형)에서 해동시켰다. 혼합 및 원심분리(10분, 5000rpm)후에, 이 페놀 추출을 수상에서 두 번 반복하였다 마지막으로, 1/10 용량의 3M 초산나트륨(NaAc) pH 5.4와 2.5용량의 에탄올을 부가한 후에 -20℃에서 밤새동안 핵산을 침전시켰다.
정성분석을 위해, RNA를 침전시켜서, STE완충액(100mM Na치, 10mM Tris-HCI pH 7.5, 1mM EDTA)에 용해시키고, 1분동안 끊인 다음에 즉시 얼음속에서 냉각시켰다. 동일한 용량의 샘플 완충액[E 완충액(40mM TRIS-HCI pH 7.6, 20mM NaNc, 20mM EDTA)내에 10M 요소, 10％ 자당, 0.02％ 브로모페놀 블루 용해됨]을 부가하였다. 샘플들(3-10㎍)을 아가로스-요소 겔(E 완충액내에서 1.85 아가로스, 5M 요소가 용해됨) 전기영동 시켰다. RNA 밴드는 에테디움 브로마이드(0.5㎍/ml)로 15분동안 염색하고, 장파 자외선에 노출시킴으로써 가시화 되었다.
추가 정제를 위하여, STE 완충액에 용해시킨 RNA를 1용량 8M LiCl을 가하여 바람직하게 침전시켜 얼음속에서 밤새 배양하였다. 그 침전물을 10, 000rpm에서 10분동안 원심분리하여 수집하였다(이 단계에서는 존재하고 있는 DNA와 대부분의 다당류를 제거한다). 이 RNA 펠리트를 0.1％ 사르코실이 부가된 STE 완충액에 용해시켜서 260nm의 흡광도를 측정하므로써 그 농도를 결정하였고, 1/10용량의 3M NaAc pH 5.4와 2.5용량의 에탄올을 가한 후에 그 일부를 -20℃에서 저장시켰다.
폴리아테닐화된 mRNA(폴리- A RNA)DML 정제를 위하여, 2.5mg RNA를 에펜도르프관에서 침전시켜, 300㎕ 물에 용해시키고, 65℃에서 5분동안 가열시킨 다음 얼음물로 냉각시켰으며, 그후에 10mM Tris-HCL pH 7.5, 1M NaCl 및 0.1％ 사르코실을 함유하는 혼합물을 300㎕가하였다.
그 RNA를 0완충액(10mM Tris-HCL pH 7.5, 1mM EDTA 0.5M NaCl, 0.1％ Sarkosyl)으로 3회 세척된 올리고-dT 셀롤로즈(type T 2, Collaborative Research) 50mg에 가하였다.
회전시키면서 실온에서 4시간이상 배양후, 그 혼합물을 실리콘 처리한 글라스울 플러그가 내장된 청색의 에펭도르트 1ml 피페팅 팁에 적층하였다. 그 유출액중의 RNA 농도를 측정하고, 그 컬럼을 OD260에서 흡광도가 0.05이하가 될 때까지 0완충액으로 세척하였다.
마지막으로 컬럼에 남아있는 폴리-A RNA를 10mM Tris-HCI pH 7.5 1mM EDTA 및 0.1％ 사르코실을 함유하는 혼합물을 6×100㎕ 가하여 용출시켰다. 폴리-A RNA의 양(보통 RNA의 1％)은 260nm에서의 흡광도를 측정하므로써 결정되었다.
1.2.3 폴리-A RNA의 시험관내 해독
휘트 게름 트랜스레이션 시스템(Wheat Germ Translation System)을 뉴잉글랜드 뉴클리어(newEngland nuclear)로부터 구입하여 방사활성 전구체로서35S-메티오닌(1066 Ci/mmol)을 사용하여 해독을 시행하였다. 해독 합성물은 에덴스(Edens)등 (1982)에 의해 설명된 바와 같이 폴리아크릴아미드겔에서 분리한 후에 방사선 사진법으로 분석하였다.
해독 합성물은 메클리리(1983)에 의해 설명된 바와 같이 정제된 α-갈락토시다제 단백질로 토끼를 면역처리하여 얻은 α-갈락토시다제-특히 항혈청으로 배양한 후에 또는 직접 사용하였다. 이 항혈청과 반응한 단백질은 에덴스등(1982)에 의해 설명된 바와 같이 단백질 A- 세파로스(파르마시아 제품)와 함께 침전시켜 분리하였다.
제2도에 도시된 바와 같이, 알류론 세포로부터 정제된 mRNA에 의해 코드된 단백질 들의 변종중에서 하나가 α-갈락토시다제-특이 항체와 반응한다. 그 단백질의 왼관 분쟈량은 44Kd이다.
1.2.4 α-갈락토시다제 특히 올리고뉴클레오티드 프로브의 노던블롯 혼성화.
1.2.4.1 올리고뉴클레오티드프로브.
α-갈락토시다제를 코드하는 mRNA에 대한 프로브로서, NH2-말단의 일바 및 내부 펩티드에 대하여 설정된 아미노산 배열에 의거한 올리고뉴클레오티드를 사용하였다. 정제된 단백질로부터 베크만 890C 스피닝컵 단백질 시퀘네이터(sequenator)를 사용하여 에드만 분해법(Edman과 Begg : 1967)으로 직접 N- 말단 아미노산 배열분석을 시행하였다. 내부 펩티드는 시아 노겐 브로마이드 및 트립신으로 정제된 단백질을 분해한 후 동일하게 배열을 결정하고, 그후에 그 펩티드는 컬럼 크로마토그라피에 의해 다른 펩티드들로부터 균일하게 정제하였다. 설정된 아미노산 배열에 의거하여, 아미노산 배열을 코드하는 가능한 모든 뉴클레오티드 배열이 유도되었다. 가능한 뉴클레오티드 배열(소위 혼합 프로브)을 모두 또는 일부 함유하는 데옥시-올리고뉴클레오티드는 아인산염법(마테우치와 케러더스, 1981)을 사용한 DNA 신디사이저(어플라이드 바이오시스템스 제품)에 의해 합성하였다. 올리고뉴클레오티드는 16％ 또는 20％ 폴리아크릴아미드겔에 의해 정제되었다(마이아티스의 1982).
보통, 정제된 올리고튜클레오티드 0.1-0.3㎍은 50mM Tris-HCI pH 7.5, 10mM MgCl2, 0.1mM EDTA, 10mM 디티오트레이톨(DTT), 70μ Ci α-32P-ATP(3000-Ci/mmol, 아메트샴 제품). 10단위 T4 폴리뉴클레오티드 키나제(아메르샴 제품)를 함유하는 혼합물 15㎕에서 37℃, 30분동안의 배양에 의해 표식하였다. 10㎕의 0.5M EDTA pH 8.0으로 반응을 종료시키고 페놀/클로포름(1 : 1)으로 추출하였다. 그 수상을 TE 완충액(10mM Tris-HCl Ph 8.0과 1mM EDTA)으로 평형을 시킨 2.5ml의 세팍덱스(Sephadex) G 25 컴럼에 통과 시켰다. 250㎕의 프렉션(fraction)들을 수집하였는데, 그중에서 처음 두 개의 방사활성 프렉션(보통 플렉션 4와 5)은 함께 수집되었다.
1.2.4.2 노던블롯 혼성화
정제된 RNA를 포름 알데히드 존재하에 전기영동에 의해 분리하였다. (레라크의, 1977). 10mM Tris-HCl(pH 7.5), 1mM EDTA 0.1 M NaCl 및 0.1％ SDS의 혼합물속에서 1㎍/㎕FH 융해된 5㎕의 RNA에 10㎕의 포름아미드(BDH케미칼스), 3.3㎕의 여과된 포름알데히드(메르크) 및 2㎕의 10×MOPS 완충액(0.2M MOPS pH 7.0 10mM EDTA)을 가하였다. 이 샘풀들을 70℃에서 15분간 가열하고 얼음으로 냉각시킨후 1％ 아가로스 겔(1g 아가로스를 73ml 물에서 가열용해 시키고 65℃로 냉각한 후에 10ml의 10×MOPS완충액 및 16.5ml의 포름알데히드를 부가)에 적용시켰다.
1×MOPS 완충액속에 3-5 시간동안 30-40mA로 전기영동시켰다. 눈으로 관측할 수 있게끔 RNA를 에티디움 브로마이드(0.1M 초산암모늄중 1㎍/ml)로 30분동안 염색하고, 증류수 중에서 30-60분동안 탈색한 다음 장파 UV광에 노출시켰다.
계속해서, RNA를 제조자의 지시서에 따라서 모세관 흡수에 의해 10×SSC(1.5M NaCl, 0.15M 시트로산 나트륨)와 간이 게네스크린 플러스(Gene Screen Plus, Dupont NEN)에 전이시켰다. 전이는 20시간동안 계속되었다. 2×SSC에서 헹군후에 막을 감압하여 80℃에서 2시간동안 건조하였다.
혼성화에 앞서, 막들을 65℃에서 4-5시간동안 5×SSC, 2×덴하르드르스(10×Denhardts : 0.1％ Ficoll, 0.1％ 폴리비닐피롤리돈 .0.1％ 소의 헐청 알부민) 1％ SDS 및 100㎍.ml의 전단(초음파 처리) 및 변성(2분간 끊임)시킨 송아지의 흉선 RNA으로 이루어진 혼합물속에서 사전-혼성화 시켰다. 32p-라벨을 붙인 올리고뉴클레오티드 프로브가 보충된 이와 동일한 완충액속에서 계속적인 교반하에 30℃에서 혼성화를 시행하였다.
이 혼성화 이후에, 이 막을 5×SSC로 세척하고(실온에서 15분동안 3회)이어서 0.1％ SDS가 부가된 5×SSC로 30℃에서 30분동안 세척하였다. 지적된 바와 같이 훨씬 높은 온도 및/ 또는 보다 낮은 염 농도에서 보다 엄중한 세척을 시행하였다.
그 결과, 프로브 MP 33이 약 1600 뉴클레오티드의 mRNA와 특이적으로 혼성화된다는 것이 밝혀졌다.(제4도). 이러한 크기의 mRNA는 45kd까지의 단백질을 코드할 수 있다.
이러한 실험들, 즉 시험관내의 해독 및 노던블롯 혼성화의 결과로부터 α-갈락토시다제는 발아시에 구아종자 내배유의 알류론 세포내에서 합성된다는 본 발명자의 가설이 옳은 것이라고 결론지었다.
1.3 구아종자 알류론 세포의 mRNA로부터의 cDNA 라이브러리의 구성
구블러 및 호프만(1983)에 의해 설명된 방법에 의거한 cDNA 합성방법을이용하였다. 10㎕물에 용해된 3㎍폴리-A RNA를 10㎕ 물에 용해된 2.5㎍올리고-dT 12-18(Callborative research)와 함께 100℃에서 30초동안 가열하고 얼음물에서 30초동안 가열하고 얼음물에서 30초동안 냉각하므로써 아닐시켰다. 그 상보가닥은 30㎕의 혼합물 I[사용하기 바로전에 준비함 : 즉 갓만든 25㎕ 2×RT 완충액 (0.1M Tris-HCl pH 8.3 43℃ 10mM MgCL2, 150mM KCl, 20mM DTT, 1mM dATP, 1mM dCTP 1mM DGTP, 0.2mM TTP), 40-50단위 역전사효소(Anglian Biotechnology로부터 구입) 및 증류슈로부터 30㎕로 만듬]의 부가후 43℃에서 45분동안 배양함으로써 합성하였다. 이 반응은 얼음물속에 2분동안 방치하여 둠으로써 종결되었다.
그후 즉시 제1가닥 150㎕에 혼합물 II[0℃에서 사용하기 바로전에 준비 : 40Mm Tris-HCl pH 7.5, 10mM MgCl2, 75mM KCl, 25㎍/ml 소의 혈청 알부민.(Dnase와 RNase 비함유 : Bethesda Research Laboratory) : 2㎕ 알파-32P-TTP(3000Ci/mmol : 아메르샴) ; 40단위 DNA 폴리머라제 I 및 8단위 RNase(양자는 Anglian Biotechnology로부터 구입)]을 함유하는 혼합물에 가함으로써 제2가닥을 합성하였다. 이 반응은 11℃에서 60분동안 계속되었다. 그 다음 결합은 2㎕ 20mM ATP 및 400단위 T40-DNA리가제(Bioabs)를 직접 부가하고 18℃에서 2시간동안 배양시킴으로써 이루어졌다. 이 반응은 20㎕ 0.4MEDTA 및 1㎕ 20％ SDG를 부가함으로써 종결되었다.
수득된 ds_cDNA를 10mM Tris-HCl pH 7.5, 0.3M NaCl 및 1nm EDTA 로 평형화시킨 세파텍스 G-50(10ml 컬럼)을 사용하여 겔 여과시켜 정제하였다. 150㎕의 프렉션들이 수집되었고 신틸레이션(scintillation) 유체를 가하지 않고 프렉션들을 직접적으로 방사활성 검사하여(소위 세렌코느 카운팅이라함) DNA-함유 프렉션들을 함께 수집하였다. ds-cDNA를 알콜로 침전시켜 10mM Tris-HCl pH 7.5, 0.3M NaCl, 1nM EDTA, 0.1％ SDS의 혼합물에 용해시키고 동일한 완충액으로 평형화 시킨 세파텍스 CL-4B(Pharmacia 제품) 컬럼(파스퇴르 피펫중 2ml)에서 치수에 의해 분별하였다. 약 100㎕의 프렉션들을 수집하고 아가로스겔 전기영동 한후 방사선 사진법에 의해 cDNA의 길이를 분석하였다. 500bp 이상의 ds-cDNA 프렉션들을 함께 수집하여 알콜로 침전시켰다. 이 ds-cDNA를 10㎕물에 용해시켰다.
호모폴리머 dc-테일링은 0㎕의 ds-cDNA에 4㎕의 5×TdT 완충액(1M 소디움 카모딜레이트 pH 7.0, 10mM CoCl2, 0.5mM dCTP), 3.4㎕몰, 0.6㎕ 5mM DTT를 부가함으로써 이루어졌다. 이 샘플을 37℃에서 2분동안 배양하고 2㎕의 말단 전이효소(20단위/㎕ : Bethesda Research Laboratories에서 공급)를 보충시켜 37℃에서 8분동안 배양하였다. 이 반응은 1㎕의 0.5M EDTA 및 20㎕의 페놀을 가함으로써 종결되었다. 이러한 혼합후에, 10㎕의 클로로포름을 부가혼합하고 2분동안 원심분리시켰다. 페놀층을 재추출 하였으며, 수상을 함께 수집하고 에테르로 두 번 추출하여 페놀을 제거시키고, 새로운 에펜도르프관(디클로로디메틸히드록시 실란으로 코팅된것)으로 이동시켜서 에틴올로 DNA를 침전시켰다. dO-테일된 ds-cDNA를 10mM Tris-HCl(pH 7.5), 1mM EDTA 및 0.1M NaCl의 혼합물 (안닐 완충액) 20㎕에 용해시켰다. 이 ds-cDNA를 G-테일된 벡터(Pst I로 절단된 pBR 322와 호몰폴리머 dG-테일 : Dupont NEN으로부터 구입)와 함께 안닐시켰다. 즉 약 4ng ds-cDNA, 25ng 벡터의 비율로 최종 용량이 25㎕되도록 하여 65℃에서 10분간 가열한 다음 4℃로 서서히 냉각시킴으로써 아닐시켰다. 이 안닐된 샘플들은 사용하여 ＂하나한(Hanahan)＂방법(마니아티스의. 1982)에 의해서 대장균 균주 294(endo I-, B-, rk-, mk+ : 바크만 외, 1976)를 전형시켰다. 그 결과 클론 3×104개의 클론뱅크(clone-bank)가 얻어졌다.
1.4 구아의 α-갈락토시다아제 유전정보를 가지고 있는 클론의 선별
전형된 대장균 세포의 샘플들을 테트라시클린(10㎍/ml)이 부가된 한천판에 배치된 셀롤로스 필터(밀리포어형 HATF, 0.45㎛)상에 직접 펼쳐놓고 37℃에서 밤새 배양하였더니 필터당(3-5)×103콜로니들이 존재하였다.
다음과 같은방법으로 하나의 마스터 필터로부터 두 개의 동일한 래플리카(replica)를 수득하였다. 즉, 마스터 필터를 건조 페이퍼 필터상에 배치한 다음 마크하였다. 제1니트로셀롤로스 레플리카 필터를 L-배지 한천판으로 적시고 마스터 필터의 상부에 배치시켰다. 4개의 페이퍼 필터들을 래플리카 필터상에 배치하고 글라스 스파툴라를 사용하여 매우 조심스럽게 내리눌었다. 4개의 페이퍼 필터를 제거하고, 방향 마크를 레플리카에 자세리 배껴내어, 레플리카 필터를 L-배지 한천판(콜리니가 있는쪽이 위로 향함)에 배치하였으며 이 절차를 제2레플리카에 대해서도 반복하였다. 레플리타 필터를 콜로니들이 관측될때까지 37℃에서 3-5시간동안 증식시켜 클로람페니콜(150㎍/ml)이 들어있는 L-배지 한천판에 이동시킨 다음 37℃에서 밤새 배양하였다. 마스터 필터는 테트라시클린이 부가된 한천판에 되돌려 놓고 4℃에서 보존하였다.
레플리카 필터상의 박테리아를 0.5M NaOH와 0.1NaCl로 15분동안 포화시킨 다수의 화트만 3mm 페이퍼상에 배치하므로써 용군시켰다. 이 필터들을 건조 페이퍼상에 배치하여 그 필터로부터 과량의 유체를 제거한 후에 1M Tris-HCl(pH 7.0)과 1.5M NaCl로 2-3분동안 포화시킨 페이퍼상에 필터를 배치하므로써 중화를 시행하였다. 마지막으로, 이 필터들을 15-20초동안 3×SSC속에 담그고 공기건조 시킨다음 80℃에서 감압하에 2시간동안 건조시켰다. (사전) 혼성화에 앞서, 필터들을 65℃에서 16-24시간동안 3×SSC 0.1％ SDS 속에서 완충액을 수차례 바꿔가면서 완전히 세척하였다. 콜로니-프린트가 더 이상 관측되지 않으면 세척이 완결된 것이다. 사전 혼성화는 37℃에서 2시간동안 사전 혼합물 A[5×SSC, 5×Denhardts, 0.1％ SDS, 50mM 인산나트륨 pH 7.5, 1％ 글리신, 25㎍/ml 송아지 흉선 75㎍/ml 대장균 DNA(시그마형 Ⅷ : 상기 두 DNA는 모두 전단되고 변성되었다). 500㎍/ml tRNA, 50％ 탈이온 포름아미드]속에서 시행하였다. 혼성화는 프로브 MP 33에 대하여 앞서 설명한 바와 같이 본질적으로 r-32p-ATP로 라벨을 붙인 올리고뉴클레오티드 프로브 MP 44(제3도 참조)와 함께 혼성화 혼합물 A(5×SSC, 1×Denhardts, 0.1％ SDS, 20mM 인산나트륨 pH 7.5 25㎍/ml 송아지 흉선 DNA, 75㎍/ml 대장균 DNA, 500㎍/ml tRNA, 50％ 탈이온 포름아미드)속에서 실해하였다. 혼성화는 30℃에서 밤새 수행되었다. 계속해서, 필터를 실온에서 6×SSC로 3×15분동안 세척하고, 2×SSC, 0.1％ SDS로 1×15분동안 세척하고 나서 마지막으로 미리 가온시킨 0.1×SSC(0.1％ SDS 함유)속에서 37℃에서 15분동안 세척하였다. 이 필터를 건조시키고 -70℃에서 밤새 X-선 필름에 노출시켰다. 양자의 레플리카에 대해 양성반응을 나타낸 콜로니들을 마스터판으로부터 떼어내었다.
8개의 양성 콜론들로부터 알칼리 용해법(비른보임과 돌리 : 1979)을 사용하여 플라스미드 DNA를 정제하고, pst I(Amersham)로 소화시켜 1％ 아가로스 겔(Maniatis 외 : 1982) 전기영동후 분석하였다. 8개의 모든 경우에서 플라스미드 DNA는 벡터 단편(34.3kb)을 함유하였다. 그중의 7개는 동일한 1250bp DNA 단편과 크기가 300-500bp인 보다 작은 단편을 함유하였다. 독립적으로 분리된 두 개의 클론들을 선별하였는데. 이것은 약 1750bp의 클론삽입체를 가진 플라스미드, pUR 2302와 약 1550bp의 클론삽입체를 가진 플라스미드 pUR 2314를 가진 것이었다. 플라스미드 pUR 2302를 가진 대장균 균주는 부다페스트 조약하에 센트라알부리우 포아 쉼멜컬쳐스(Centraalbureau Voor Schimmelcultures(CBS), 네델란드 왕국 3740 에이지 바론.P.O.Box 273소재)에 1986년 5월 30일자로 임시 기탁번호 CBS 267.86으로 기탁되었다.
1.5 구아 α-갈락토시다제 cDNA 클론의 뉴클레오티드 배열 및 유도된 α-갈락토시다제 효소의 아미노산 배열의 결정.
플라스미드 pUR 2302와 pUR 2314는 Pst I로 절단되어 벡터단편과 함께 각각 1250bp+500bp의 단편과 1250bp+300bp의 단편이 생겨났다. 이들 4종의 단편들을 1％ 아가로스 겔로부터 따로따로 정제한 다음 전기영동후에 투석백(dialysis bag)내로 전기용출시켰다(마니아티스 외, 1982). 정제된 단편들을 Pst I로 절단된 벡터 M 13mp 18(Bethesda Research Inc.로부터 구입. 나란터 등에 의해 설명됨, 1983)과 연결시키고 이 연결시킨 샘플을 사용하여 대장균 균주 JM 130(Messing등에 의해 설명됨, 1981)를 CaCl2방법으로 전형시켜서 X-gal 과 IPTG가 보충된 L-배치상에 얇게 배치하였다.(Maniatis 외 1982).
그 결과 생신 무색의 플라크(Plaque)로부터 단일 가닥 파지 DNA를 분리하여, 비긴(Biggin)등에 의해 설명된 수정을 가한 생거(sanger) 디데옥시 체인터미네이션 방법으로 α-35s-dATP(2000Ci/mmol)와 클레노우(Klenow) 효소(Amersham 제품), ddNTP's(Pharmacia-PL Biochemical), 및 dNTP's(Boehringer)를 사용하여 뉴클레오티드 배열을 결정하는데 이용하였다. 배열결정 반응 생성물은 변성 폴리아크릴아미드 겔에 의해 완충액 구배로 분리시켰다(비긴 외, 1983).
뉴클레오티드 배열을 계단식 연구법을 이용하여 결정하였다(제5도 참조).
서브클론된 단편들의 가장자리의 뉴클레오티드 배열은 유니버설 M 13배열결정 프라이머(Amerrsham으로부터 구입)를 사용하여 우선 결정하였다. 배열 데이터가 아직 신빙성이 있는 가장 말단의 위치에서 상술한 바와 같이 특수하게 합성된 두 개의 새로운 것중의 하나는 3'-5'방향으로 뉴클레오티드 배열의 지속을 위한, 다른하나의 상보 가닥의 배열결정을 위한 프라이머를 사용하여 배열결정을 지속시켰다. 이러한 계단식 연구법에 의해서 클론 pUR 2302와 클론 pUR 2314 양자의 서브클론의 완전한 뉴클레오티드 배열이 설정되었다. 내부 Pst I자리 주위의 뉴클레오티드 배열은 수퍼-코일 배열결정 방법(켄과 시버그에 의해 설명, 1985)을 이용하여 결정하였다. 그 결과 양자의 Pst I-단편들이 직접 결합되어 있다는 것이 밝혀졌다.
구아 α-갈락토시다제 cDNA 클론의 완전한 뉴클레오티드 배열은 제5도에 도시되어 있다. 플라스미드 pUR 2303내의 뉴클레오티드 263에서 시작하여 폴리-A 테일에 이르는 뉴클레오티드 배열(제6도)은 플라스미드 pUR 2314 삽입체의 뉴클레오티드 배열과 동일하다.
뉴클레오티드 배열을 분석한 결과(제6도), 뉴클레오티드 166 위치에서 메티오닌으로 시작되는 411개의 아미노산 잔기를 코드라는 오픈해독 플레임(frame)과 뉴클레오티드 1399-1404위치의 두 개의 연속적인 해독정지 코돈이 나타나있다. 유도된 아미노산 배열은 제6도의 뉴클레오티드 배열위에 IUPAC식 한문자 표시법으로 나타내었다.
구아종자로부터 정제된 α-갈락토시다제 효소의 NH2-말단 아미노산배열은 AENGLGQTPP…로서 확인되었다(상기 설명과 제3도 참조). 이 아미노산배열은 뉴클레오티드 307-336에 의해 코드된다(제6도). 첫째로 이러한 발견으로부터 성숙 α-갈락토시다제 효소가 계산된 분자량이 39, 777 달톤인 364개의 아미노산 잔기들로 되어있다고 결론지을수 있다. 이것은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(메클리리, 1983)으로 측정한 분자량 40, 500과 잘 일치한다.
둘째로, 천연 효소는 47개의 아미노산 잔기(-47번부터 -1번까지)가 연장되어 있는 전구에 형태로 합성되는 것이 거의 확실하다.
내부 펩티드 DYLKYDN(제3도 참조)는 NH2-말단 펩티드 이외에 뉴클레오티드 배열(뉴클레오티드 680-701)에서 발견되므로, 구아로부터 α-갈락토시다제 효소가 클론화 되었다는 것을 명확하게 알 수 있다.
[실시예 2]
유전공학적인 맥주 효모균에 의한 구아 α-갈락토시다제의 합성.
미생물에 의한 구아 α-갈락토시다제의 합성을 설명하기 위해 본 발명자는 구성개시성 GAPDH 프로모터를 사용하여 맥주효모균에서 α-갈락토시다제 발현되는데 적합한 벡터를 구성하였다.
벡터 pURY 2703 및 pURY 2705의 유전공학
상기 벡터의 기본체로서 대장균-맥주효모균 셔틀 벡터 pURY 528-03을 사용하였다.(에덴스 외., 1984, 유럽특허제 0-0129 269호, 제14도 : pURY 528-03 플라스미드를 함유하는 맥주효모균 AH 22는 네델란드 왕국, 3704 에이지 바른, P.O.Box 273 소재의 센트라알부리우 포아 쉼멜컬쳐스에 1983년 5월 19일자로 기탁번호 CBS 8155로서 기탁됨). 이 벡터는 맥주효모군 내에서의 발현에 있어서 GAPDH 플로모터 조절하에 프리프로타우마틴(preprothaumatin)유전자를 가지고 있다. 두벡터의 구성은 다음과 같이 수행되었다(제7도 참조). 즉 벡터 pURY 528-03으로부터 Sac I-Hind III 단편을 분리시켰는데 여기에는 완성 프리프로타우마틴 유전자와 프리프로타우마틴 ATG 해독개시 코돈의 23염기쌍 상류가 포함되어 있다. 그후 합성 단편을 가하였다. pURY 2703의 경우(제7도 참조) 상기 23염기쌍, 해독개시 코돈 ATG, 추가 ala-코돈 및 ala1에서부터 성숙 단백질(제6도)의 아미노산잔기 31주위에 위치하는 Pvu II 자리에 이르는 성숙 α-갈락토시다제 유전자의 NH2- 말단부를 함유한다. 이러한 아미노산 잔기를 코드하는 DNA는 바람직한 코돈을 가진 효모군내에서 합성하였다(투이드 외., 1982). pURY 2705의 경우(제7도 참조)는 상기 23염기쌍, SUC2(인베르타제)암호 배열(타우싱 및 칼슨에 의해 공보됨, 1983) 및 ala1에서부터 Pvu III자리에 이르는 성숙 α-갈락토시다제 유전자를 함유한다. 뉴클레오티드 배열 및 합성 단편의 구성은 제8도에 나타나 있다.
합성 올리고뉴클레오티드는 실시예 1에 기술한 바와 같이 DNA 신디사이저(Applied Biosystems에서 구입)상에서 합성되어 폴리아크릴아미드겔 전기영동에 의해 정제하였다. 용출된 DNA를 50㎕ TE(10mM의 트리스-HCL pH 7.6 1mM 의 EDTA)에 용해시킨 후 260nm에서 광학적밀도를 측정하여 농도를 결정하였다, 유리 5'-말단을 가진 가장자리의 단편들을 제외한 모든 각 단편 0.5㎍을 함께 모아서 효소 폴리뉴클레오티드 키나제에 의해 인산화시켜 최종 부피가 100㎕되도록 하였다. 페놀 추출과 알콜침전을 시행한 후, 펠리트를 용해시키고 여기에 가장자리 단편들을 각각 0.5㎍씩 가하여 DTT 및 ATP가 없는 결합 완충액에서 안닐을 수행하였다. 안닐은 70℃에서 10분간 가열시키고 서서리(2시간동안) 30℃로 냉각시킴으로써 수행되었다. DTT 및 ATP((최종 농도 각각 10mM 및 0.5mM)와 T4 리가제 효소를 첨가시켜 15℃에서 18시간동안 결합시켰다. 다음 합성된 단편을 2％ 아가로즈겔 상에서 전기영동시켜 원하는 원하는 길이를 가진 띠를 겔 전기용출에 의해 겔로부터 절단분리 하였다. 이 분리된 단편을 적합한 벡터(pEMB L9 : 덴테 외., 1983)와 결합시켜서 이렇게 생성된 결합혼합체를 대장균 세포 균주 JM 103을 전형시키는데 사용하였다. 이러한 전형체로부터 플라스미드를 분리시켜 합성된 단편을 DNA배열 결정법에 의해 분석하였다.
마지막으로 성숙 α-갈락토시다제유전자의 남은 333개의 잔기들을 코드하는 유전정보를 첨가하였다. Bg1 I 자리가 Hind III 자리로 변화되는 동안 플라스미드 pUR 2302로부터 1.4kb Pvu II-Bg1 I 단련이 얻어졌다(제7도 참조).
최종 결합혼합체는 대장균 균주 294를 전형시키는데 사용되었다. 이러한 전형체로부터 플라스미드를 분리시켜, 올바른 제한 효소형을 가진 플라스미드 pURY 2703(제9도) 및 pURY 2705(제10도)를 선별하였다.
pURY 2703 및 pURY 2705를 사용한 맥주 효모균의 전형 및 분석
맥주효모균 균주 AH 22(a, leu 2, his 4, 힌넨 외., 1978)의 세포를 베그스에 의해 기술된 방법(1978)에 의한 구형원시 세포법에 의해 플라스미드 pURY 2703 및 pURY 2705로 전형시켰다. α-갈락토시다제 효소의 존재 여부를 알아보기 위해, 이렇게 leu+ 전형된 효모균 콜로니를 부크홀즈 및 아담스(1981)에 의해 기술된 바와 같이 p- 니트롤페닐 α-D-갈락토피라노시드(pNGP : Sigma 제품)기질을 가한 한천판위서 곧바로 선별하였다.
이 결과 플라스미드 pURY 2703을 가진 효모균 세포주위에는 검출될 만한 양의 α-갈락토시다제 효소가 존재하지 않는다는 것이 밝혀졌다. 그러나 플라스미드 pURY 2705를 가진 세포 주위에 노란색이 관찰되는 것은 이 경우 세포외부에 생물학적으로 활성인 효소가 존재한다는 것을 보여주는 것이다.
본래 세포를 분석한 후에 또한 생세포 추출물을 분석하였다. 플라스미드 pURY 2703 및 pURY 2705 및 pURY 2705를 가진 효모균 세포는 히스티딘을 보충시킨 효모균 최소배지(Yeast Minimal Medium : 0.67％ 아미노산 없는 효모 질소베이스와 디프코 ; 즉 2％ 글루코즈)상에서 증식시켜 600nm에서의 광학적 밀도가 1.0이 되었다. 이 효모세포를 수거하여 추출 완충액(10ml의 트리스-HCl pH 8.0, 0.1mM의 EDTA, 1mM의 DTT)중에 1010세포/ml 농도로 재현탁시키고 동력-해동 사이클에 의해 또는 프랑스압력셀 통과에 의해 분해시켰다.
0.1M 아세트산 나트륨(pH 4.5)에 용해된 10mM pNPG와 함께 37℃에서 5분간 추출 완충액내의 적당농도의 생세포 추출물을 배양하였다. 다음 1ml의 2％ 탄산나트륨을 첨가시켜 이 반응을 종결시켰다. 에펜도르프 원심분리기에 의해 5분간 원심분리하여 세로 및 세포편을제거시킨 후 상기 혼합체의 410nm에서의 흡과도를 측정하였다. 410nm에서의 p-니프로페놀의 흡광 계수는 18.4㎠/μmol이다. α-갈락토시다제 1단위는 pH 4.5, 37℃에서 1분동안에 1μmol의 기질을 가수분해 할 수 있는 효소의 양을 나타낸다.
그 결과 플라스미드 pURY 2703을 가진 효모균 세포 108내에 약 (1-2.5)×10-3단위가 존재하였으며, 플라스미드 pURY 2705를 가진 효모균 세포 108내에 약 (3-5)×10-3단위가 존재하였다는 것을 알았다.
면역학적 분석에 있어서 본 발명자는 소위 웨스턴 블롯 분석법을 이용하였다.
생세포 추출물에 샘플 완충액(에덴스 외., 1982)을 가한후 이것을 5분간 끓였다.
2분동안만 가열시킨 후에 겔 샘플 완충액에 정제된 단백질을 가하였다. 단백질을 위코프외의 방법(1977)에 따라 10％ 폴리아크릴아미드 겔 전기영동시켜 분리시켰다. 전기영동 전이(참조 부르네트, 1979)에 의해 이 단백질을 겔로부터 니트로셀룰로즈상에 전이시켰다. 니트로셀룰로즈를 배양(I) 완충액 (150mM NaCl, 5mM EDTA, 50mM 트리스 -HCl pH 7.0, 0.005％ 트리톤 × -100, 0.25％ 젤라틴)으로 헹군다음 (I) 완충액중에 0.1％ BSA 와, 구아로부터 정제된 α- 갈락토시다제로 토끼를 면역화 함으로써 생성된 항혈청과 함께 배양시켰다.
배양은 교반을 시키면서 4시간 동안 실온에서 행해졌다. 흡수되지않은 항체는 I - 완충액 (2번)과 인산염완충액 pH 7.0(PBS)로 세척하여 제거시켰다. 항원과 결합된 항체는 1시간 동안125I 단백질 A(아메르산 제품)과 반응시켜 검충하였다. I- 완충액 (2번)과 PBS(3번)으로 세척한후, 니트로셀룰로즈를 건조시키고 -70℃에서 X-선 필름에 노출시켰다.
그 결과 (제11도), 플라스미드 pURY 2705를 가진 세포(3선)는 구아 α-갈락토시다제에 특이적인 항체와의 반응에서 양성을 나타내며 식물효소 (1선 및 2선)와 같은 분자량을 가진 α-갈락토시다제 효소를 합성한다는 것이 입증되었다. 플라스미드 pURY 2703을 가진 세포(4선)는 구아 α-갈락토시다제의 항체와 면역학적 방응에 양성을 나타내지만 분자량은 약간 낮은 α-갈락토시다제 효소를 합성한다. 플라스미드가없는 효모균 세포 (5선)은 구아α-갈락토시다제와 면역학적으로 관련이 있는 효소를 합성하지 못한다.
결론적으로, 두 플라스미드 pURY 2703 및 pURY 2705는 구아로부터 정제된 α-갈락토시다제에 대항하여 생성되는 항체와의 반응에서 양성을 나타내는 효소 활성 산물을 합성한다. 전자의 경우 효소는 식물의 효소보다 약간 낮은 분자량을 가지며 세포의 세포질속에 존재한다. 후자의 경우 효소는 식물의 효소와 같은 분자량을 가지며 세로외부에 존재한다.(이것은 글로코실화 및 분비장소인 소포체로 단백질을 도달시킨 결과로 인한 듯하다).
[실시예 3]
유전공학적으로 맥주효모균에 의해 합성된 α- 갈락토시다제를 사용한 갈락토만난의 갈락토즈 함량감소.
플라스미드 pURY 2705를 가진 맥주 효모균 군주 AH22는 효모균 최소배지(YMM : 실시예2 참조)상에 증식시켰을 때 108세포당 (3-5)×10-3단위의 α-갈락토시다제 효소를 합성하였다. 상기 합성량은 YMM으로 지수형태적으로 증식된 효모균 세포를 풍부한 YPD배지(2％ 글루코즈 : 2％ 박토펩톤, 디프코 ; 1％ 효모추출물, 디프코)에 전이시켜서 약 4시간동안 증식시키면 108세포당 0.1단위까지 증가시킬 수 있다.
또다른 실험에서, 60nm에서 광학적 밀도가 1.5 되도록 200ml 의 YMM중에서 효모균 세포를 증식시킨후 1ℓ 의 YPD배지에 전이시켜서 30℃에서 4시간동안 추가 배양 시켰다. 세포를 수거하여 4ml의 추출 완충액에 재현탁시켜서 프랑스 압력 셀(5회)에 통과시켰다. 이 현탁액을 초원심분리(Sorvall SW 60, 30000rpm, 4℃에서 1시간)시켜 맑게 하였다. 이 투명 상청액에는 90％이상의 효소 활성이 존재하였다. 마지막으로 이 투명 상청액을 40μl RNase(10㎎/ml, Boehringer) 및 100μl DNase(20단위/μl Amersharn 제품)를 사용하여 37℃에서 15분간 배양시켜 ml당 약 10 단위의 α- 갈락토시다제를 함유하는 생세포 추출물을 얻었다. 이추출물을 유럽특허 제 EP-A-0 121 960호 (맥클리리 외., 1984)에 기술한 바와 같이 구아 고무의 갈락토즈 함량을 감소시키는 실험에 사용하였다.
사용된 효소는 다음과 같다.
- 실시예로서 상기 샘 효모균 추출물.
- 비교용으로서 사카토미세스 칼스버겐시스 α-갈락토시다제.
후자물질은 다음과 같이 정제되었다.
사카로미세스 칼스버겐시스(ATCC 9080)후 26℃ 수정 YMM(칼락토즈 대신 글루코즈함유 20g/l)속에서 배양시켰다. 정지기에 원심분리에 의해 세포를 수거하여, 그 상청액을 농축시킨다음 우선 아미콘 DC-2콘센트레이터(Amicon DC-2 Concentrator)내에서 아세트산염 완충액(0.1 M pH 4.5)에 대해, 그 다음 FEg(시그마 제품)에 대해 투석하였다. 이 제제는 추가정제 없이 사용되었다.
구아분말(구아고무 THI, 헤클레스 제품 )과 효소(1.5ml의 0.1M 아세트산나트륨 pH 4.5 에 10단위)를 그 혼합물이 미세한 빵가루와 비슷한 정도로 혼합하였다. 이것을 밀폐용기에 넣어 55℃에 하였다. 지정된 시간에 샘플(100mg)을 회수하여 100℃로 가열시켜 반응을 완결시키고 상기 결정하였다.
Figure kpo00002
이 결과는 맥주호모균에 의해 합성된 이질성 ＂구아 α-갈락토시다제＂는 갈락토만난의 갈락토즈 함량을 감소시킬 수 있는 반면, 사카로미세스 칼스버켄시스에 의해 합성된 동질성 효모 α-갈락토시다제 는 원하는 조건하에서 갈락토즈 함량을 감소시키지 못한다는 것을 명백히 입증한다.
상기 실험들(실시예 2 및 3)로부터 β-만나나제가 없는, 갈락토만난의 갈락토즈 함량을 감소시킬 수 있는 α-갈락토시다제 효소는 실시예 3에서 사용된 맥주효모균과 같은 전형된 미생물에 의해서 합성될 수 있다는 것이 입증되었다.
[실시예 4]
여러 α-갈락토시다제 효소의 면역학적 관계 및 고무 개선능역
4.1 α-갈락토시다제 효소원
효소 활성은 10 mM pNPG(p-니트로페닐-α-D-갈락토피라노시드)를 함유하는 반응부피 45㎕속에서 최적온도 및 pH하에 5분간 pNPG를 가수분해 함으로써 정량하였다. 이 반응을 종결시키기 위해 1ml의 2％ 탄산나트륨을 가하였다. 에펜도르프 원심분리기에 의해 5분간 원심분리하여 세포 및 세포편을 제거시킨 후 적절히 상기 혼합체의 흡광도를 410nm에서 측정하였다. 410nm, 에서의 p-니트로페놀의 흡광계수는 18.4㎠/㎛ol이다. α-갈락토시다제 1단위는 1분동안 1㎛ol의 기질을 가수분해할 수 있는 효소의 양을 나타낸다.
대장균의 α-갈락토시다제는 보에링거(Cat, N°662038, lot N°1503401)로부터 동결-건조분말(18mg에 50단위)로서 구입할 수 있다.
흑색국균의 α-갈락토시다제는 3.5M 황산암모늄, 50mM 아세트산나트륨(pH 5.5)에 용해된 현탁액(2.7ml에 48단위)으로서 시그마(Cat. n°9007, lot N°105/8640)로부터 구입할 수 있다.
그린코피빈의 α-갈락토시다제는 3.2M 황산암모늄(pH 약 6)에 용해된 현탁액(1.0ml에 83단위)으로서 보에링거(Cat. N° 105023, lot N° 10118722-20)로부터 구입할 수 있다.
사카로미세스 칼스버겐시스(ATCC 9080)은 최소배지(아미노산-비함유 효모균질소 기본물, 디프코 6.7g/ℓ, 갈락코즈 20g/ℓ)속에서 26℃로 배양하였다. 정지기에서 원심분리에 의해 세포를 수거하였다. 그 상청액을 농축시킨 다음 우선 아미콘 DC-2 콘센트레이터내에서 아세트산염 완충액(0.1M pH 4.5)에 대해 그 다음 폴리에틸렌글리콜(시그마제품)에 대해 투석하였다. 이 제제는 배양상청액 1ℓ당 약 20단위의 효소를 함유하였다.
구아의 α-갈락토시다제는 맥클리리(1983)에 의한 방법으로 합성되었다. 자주개자리 및 호로파종자의 효소는 거의 동일한 방법으로 합성되었다. 즉 2.5일간 발아(호로파종자는 100％, 자주개자리종자는 50％)시킨 다음, 에세트산염 오나충액으로 균질화시키고 원심분리하여, 나일론메쉬 여과를 수행한 다음 50％ w/v 황산 암모늄으로 침전시켰다. 이 침전율은 약 20ml의 0.1M 아세트산염 완충액(pH 4.5)에 용해시켜서 추가정제없이 사용하였다. 200g의 종자로부터 호로파에서는 1050단위의 효소를 얻었고 자주개자리에서는 65단위의 효소를 얻었다. 구조ㅎ콩나무의 종자는 세일러(1977)의 방법으로 발아시켰다. 종자를 표면이 거친 사포로 문질러서 단단한 종피를 부분 제거시키고, 70％ 에탄올/물에서 5분간 살균시킨 다음 탈이온수에 48시간 담구어 두었다. 이것을 26℃로 9일간 습한 크로마토그래피 페이퍼상에서 발아시켰다. 발아된 종자를 상기와 같은 방법으로 추출함으로써 9개씩 구주콩나무종자로부터 7단위의 α-갈락토시다제를 얻었다.
4.2 맥주효모균, 클루이베로미세스 마르시아누스 배리언트락티스, 한세눌라 폴리모르파 및 고초균 등의 미생물에 의해 유전공학적으로 합성되는 효소.
구아 α-갈락토시다제를 코드하는 유전정보는 여러가지 벡터에 의해 설정되어(실시예 2,5,6,7 및 9)여러 미생물의 세포외에서 또는 세포내에서 발현되었다.
맥주 효모균 및 고초균에서, 정제된 효소제제를 사용하였다. 따라서 벡터를 가진 세포는 증식배지내로 효소를 분비하게 하는데 사용되었다.
마이크로여과(0.22㎛)에 의해 상기 발효배지로부터 세포를 제거시킨 후, 0.03M 트리스-HCl(pH 8.0)으로 평형시킨, PD-10 컬럼(파르마시아 제품)을 사용하여 탈염법에 의해 저분자량의 기질을 제거시켰다. MONO-Q 컬럼(HR 5/5, 파르마시아 제품)을 사용하여 음이온-교환 크로마토그래피에 의해 사익 프렉션으로부터 α-갈락토시다제를 분리시켰다. 용출은 0.03M 트리스-HCl(pH 8)의 NaCl 구배(0-1 M)법으로 수행하였다. 검출은 파르마시아 FPLC 시스템을 사용하여 214/280 nm에서 수행하였다.
α-갈락토시다제 활성을 가진 프렉션(약 0.3M 의 NaCl에서 용출됨)을 함께 모아서 탈염시켰다(PD-10컬럼사용, 용출액은 0.01M의 아세트산나트륨 pH 4.5).
이 효소제제를 진공 건조에 의해 약 10배로 농축시켰따.
클루이베로미세스 마루시아누스 배리언트락티스 및 한세눌라 폴리모르파는 생세포 추출물을 사용하였다. 적정조건하에 한천판상에서 세포를 증식시킨 후, 세포를 수거하여 용출완충액(10mM 트리스-HCl pH 8.0 : 0.1mM EDTA 1mM DTT)에 현탁시킨 다음 3회 동결-해동사이클에 의해 분해시켰다.
4.3 오크터로니 이중 확산법에 의해 분석된 면역학적 관계
바르비탈-아세트산염 완충액(8.93g의 Na--바르비탈; 5.87g의 Na-아세트산염 3H2O; HCl pH 8.2)내에 용해된 1％ 아가로즈 A(파르마시아 제품)과 폴리에틸렌글리콜-6000의 용액은 극초단파 오븐에서 가열시켜 제조되었다. 이 용액을 60℃로 냉각시킨 후 14ml를 유리슬라이드(8.3×9.4cm)상에 부었다. 몰드(LKB)를 사용하여 이 겔에 직경 4mm의 구멍을 내었다. 10㎕의 항혈청과 정제된 효소액(인산완충식염용액 pH 7.0중 약 10단위/ml의 농도)을 가한 후 습한 티슈페이퍼가 들어있는 밀폐상자 내에서 실온으로 밤새 방치시켜 확산이 이루어지게 하였다. 이 면역 침전물을 곧바로 회수하거나 또는 겔을 0.9％ NaCl로 여러번 세척한 후에 물-아세트산-에탄올(4.5 : 1 : 4.5)에 용해된 0.5％ 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250(Coonassie Brilliant Blue R-250 : 바이오라이드 제품)의 용액으로 염색하였다. 이 겔을 물-아세트산-에탄올(9 : 2 : 5)로 탈색시켰다.
그 결과(표 1), 동질인 구아효소 및 호로파종자, 자주개자리의 효소와의 반응에서 양성을 나타내었다. 또한 유전공학적으로 맥주효모균에 의해 합성된 효소도 양성반응을 나타내었다. 코피빈, 흑색국균, 사카로미세스 칼스버겐시스 및 대장균의 효소와의 면역반응은 관찰되지 않았다.
4.4 웨스턴 블롯법에 의해 분석된 면역학적 관계.
이 분석법의 장점은 민감하다(0.01단위/ml의 효소용액을 분석할 수 있음)는 점과 생제제를 사용할 수 있다는 점이다.
생 추출물에 샘플 완충액(에덴스 외, 1982)을 가한후 이것을 5분동안 끓였다. 2분동안 가열시킨 후 겔샘플 완충액에 정제단밸질을 가하였다. 위코프 외(1977) 방법에 의해서 10％ 폴리아크릴아미드겔 전기영동시켜 단백질을 분리하였다.
그 다음 전기영동 ㅈ이(참조 부르네트, 1979)에 의해 이 단백질을 겔로부터 니트로셀룰로즈로 전이시켰다. 니트로셀룰로즈를 배양(I) 완충액(150mM NaCl EDTA, 50mM 트리스 HCl pH 7.0, 0.05％ 트리톤×-100, 0.25％ 젤라틴)으로 헹군 다음 0.1％ BSA와, 구아로부터 정제된 α-갈락토시다제로 토끼를 면역화 함으로써 생성된 항혈청을 함유하는 I-완충액내에서 배양시켰다. 배양은 교반을 시키면서 4시간 동안 실온에서 행해졌다.
흡수되지 않은 항체는 I-완충액(2회)과 인산염-완충액(PBS pH 7.0)로 세척하여 제거시켰다. 항원과 결합된 항체는 1시간동안125I 단백질 A(아메르샴 제품)와 반응시켜 검출하였다. I-완충액(2회)과 PBS(3회)으로 세척한 후, 니트로셀룰로즈를 건조시키고 -70℃에서 X-선 필름에 노출시켰다.
이 분석법을 12종의 다른 생물(표 1 참조)로부터 합성된 α-갈락토시다제 제제에 작용시켰다. 그 결과 식물종으로부터 합성된 모든 α-갈락토시다제에 양성반응을 나타내었다.
또한 구아 α-갈락토시다제를 코드하는 유전자를 사용하여 미생물로부터 유전공학으로 합성된 모든 효소들도 양성반응을 나타내었다. 이와 대조적으로 흑색국균, 사카로미세스 칼스버겐시스 및 대장균으로부터 생긴 미생물의 효소는 구아 α-갈락토시다제에 대항하여 생성된 항혈청과 반응을 하지 않았다.
상기 결과는 코피빈의 효소를 제외하고는 오크너로니 분석법의 결과를 확인시켜 주는 것이다. 코피빈의 효소는 식물종의 효소보다 구아 α-갈락토시다제와의 관련성이 낮다고 결론지을 수 있다.
4.5 갈락토만난의 갈락토즈 함량을 감소시킬 수 있는 α-갈락토시다제 효소의 능력.
효소제제(15-30단위)를 1.5ml의 100mM 아세트산나트륨 완충액(pH 4.5)에 용해시켰다. 이것을 1g의 구아고무에 가하고 철저히 적어도 1분간 혼합시켜서 혼합물이 ＂미세한 빵가루＂감촉을 갖도록 하여 55℃에서 배양시켰다. 이 효소의 갈락토만난에 대한 활성을 분석하기 위하여 샘플을 취해서 다음과 같이 분석하였다. 이 ＂빵가루＂ 혼합물 약 150mg을 샘플로 취하여 무게를 달았다. 이 효소를 끓는 물통에 10분간 넣어 불활성화시켰다. 그 다음 5ml의 10％ 수산화나트륨을 가하고 작은 균등기를 사용하여 샘플을 분산시켰다. 이 샘플이 25ml될 때까지 물을 넣어 30분동안 흔들어서 다시 균질화시킨 후 15분간 방치하였다. 이러한 처리를 한후, 이 다당류를 완전히 용해시켜서 유리된 갈락토즈(보에링거제품인 효소테스트키트사용) 및 탄수화물 총량을 결정하였다. 탄수화물 총량을 결정하는 데는 안트론분석(모리스, 1984) 이용하였다. 이 수정된 방법(로에우스, 1952)은 다음과 같다.
에틸아세테이트의 안트론 포화용액을 제조하여 최소한 1시간동안 방치하였다. 분석용액 25㎕를 피펫으로 취하여 시험관에 넣고 증류된 탈이온수를 가하여 1ml되도록 하였다(물은 블랭크실험에, 80㎍의 갈락토즈는 표준실험에 사용되었다). 안트론이 포화된 에틸아세테이트 0.2ml를 가한 다음 2.5ml의 진한 황산을 넣었다. 이것을 철저히 혼합시킨 다음 냉각시켰다. 약 30분후 610nm에서 흡광도를 측정하였다.
본 명세서의 표 1에 요약되어 있는 바와 같이, 그 결과는 모든 식물의 효소가 갈락토만난의 갈락노즈함량을 상당히(존재하는 갈락토즈의 25％ 이상이 18시간후 방출됨)감소시킬 수 있었다는 것을 입증한다. 또한 유전공학적으로 구아 α-갈락토시다제 유전정보로부터 미생물에 의해 합성된 효소도 같은 능력을 가지고 있다.
상기 결과로부터, 구아에서 합성된 α-갈락토시다제 효소 다음으로 다른 α-갈락토시다제 효소도 갈락토만난을 개선시키는 데 적합하다는 것이 입증되었다.
면역학적 관계가 어떤 시사를 제공하지만, 구하효소와 관련이 없는 효소가 갈락토만난을 개선할 가능성은 또한 배제할 수 없다.
[실시예 5]
유전공학적인 클루이베로미세스 마르시아누스 배리언트 락티스에 의한 구아 α-갈락토시다제의 합성
벡터 pUR 2405의 유전공학
그 구성방법은 제12도에 요약되어 있다.
이 벡터의 기본체는 클루이베로미세스 복제오리진 KARS 2와 선별표식자 trp 1이다. 플라스미드 pURK 528-03(에덴스외 : 1983)를 Bg1 II(아메르샴에서 구입)으로 절단시키고 1％ 아라고즈겔 전기영동시킨 후 투석백내로 전기용출시켜(마니아티스외, 1982) 상기 두 요소를 포함하는 3.1kb Bg1 II 단편을 분리시켰다. 이 분리된 단편을 Bg1 II와 결합된 플라스미드 pURY 2705(제10도)와 결합시켰다. 이 결합샘플을 사용하여 CaCl2방법으로 대장균 균주 JM 103을 전형시켰으며 (메싱외, 1981), 설명한 바와 같이 암피실린(100㎍/ml)으로 보충된 L-배지상에 플레이트하였다. 이결과 생겨난 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 비론보임 및 돌리(1979)에 의해 설명된 알칼리용해법에 의해 정제하였다. Bg1 II로 절단시킨 후 3.1kb Bg1 II 단편이 pURY 2705의 Bg1 II자리에 삽입된 플라스미드를 선별함으로써 플라스미드 pUR 2405(제12도)를 얻었다.
pUR 2405에 의한 클루이베로미세스의 전형 및 분석
클루이베로미세스 마르시아누스 배리언트 락티스 균주 SD 11(lac-4, trp-1 : 에덴스 외, 1983) 호모균 세포를 이토의, (1983)에 의해 기술된 LiCl법을 이용하여 플라스미드 pUR 2405로 전형시킨다. 이 결과 얻어진 trp+전형체를 구아 α-갈락토시다제의 존재유무에 대해 분석하였다.
YMM으로 증식시킨 후 세포를 수거하여 용출완충액(10mM 트리스-HCl pH 8.0; 0.1mM EDTA; 1mM DTT)에 현탁시킨 후 3회 동결-해동사이클에 의해 분해시켰다. 이 생세포 추출물을 인공기질 pNPG로써 활성 α-갈락토시다제 효소가 있는지를 분석하였으며 면역학적분석(웨스턴블록법)도 행하였다.
용출완충액에 용해된 생세포유출물의 적당희석액을 10mM pNPG와 함께 함께 37℃로 5분간 0.1M 아세트산나트륨(pH 4.5)내에서 배양시켰다. 1ml의 2％ 탄산나트륨을 첨가시켜 반응을 종결하였다. 상기 혼합물을 에펜도르프 원심분리기에 의해 5분간 원심분리하여 세포 및 세포편을 제거시킨 후 흡광도를 410nm에서 측정하였다. 410nm에서의 p-니트로페놀의 흡광계수는 18.4cm2/μmol이다. α-갈락토시다제 1단위는 pH 4.5, 37℃에서 1분동안 1μmol의 기질을 가수분해할 수 있는 효소의 양을 나타낸다. 플라스미드 pUR 2405를 가진 세포의 세포 추출물은 이 플라스미드가 없는 비교용 효모균세포제제와는 대조적으로 상기 분석에서 양성 반응을 나타내었다.
면역학적 분석으로는 소위 웨스턴 블롯분석법을 이용하였다. 생세포추출물에 샘플완충액(에덴스외, 1982)을 가한후에 이것을 5분간 끓였다. 2분간 가열시킨 후 겔샘플 완충액에 정제단백질을 가하였다. 위코프외, (1977)방법에 의해 10％ 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 시킴으로써 단백질을 분리시켰다. 다음에 전기영동전이(참조, 브르네트, 1979)에 의해 단백질을 겔로부터 니트로셀룰로즈로 전이시켰다. 니트로셀룰로즈를 배양(I) 완충액(150mM NaCl, 5mM EDTA, 50mM 트리스-HCl pH 7.0, 0.05％ 트리톤 X-100, 0.25％젤라틴)으로 세척한 다음 0.1％ BSA와, 구아로부터 정제된 α-갈락토시다제로 토끼를 면역화함으로써 생성된 항혈청을 함유하는 I-완충액내에서 배양시켰다.
배양은 교반을 시키면서 4시간 동안 실온에서 행해졌다. 흡착되지 않은 항체는 I-완충액(2회)과 인산염완충염 pH 7.0(PBS)로 세척하여 제거시켰다. 항원과 결합된 항체는 1시간동안125I 단백질 A(아메르샴제품)와 반응시켜 검출하였다. I-완충액(2회)과 PBS(3회)으로 세척한 후 니트로셀룰로즈를 건조시켜 70℃에서 X-선 필름에 노출시켰다.
그 결과는 클루이베로미세스 세포추출물속에서는 식물의 효소와 같은 또한 맥주효모균에서의 플라스미드 pURY 2705에 의해 합성되는 효소와 같은 분자량을 가진 단백질이 존재한다는 것을 입증한다.
[실시예 6]
유전공학적인 고초균에 의한 구아 α - 갈락토시다제의 합성
α- 갈락토시다제 유전자가 친핵생물에서 뿐만아니라 전핵미생물에서도 발현될 수 있다는 것을 설명하기 위해서, 고초균에서 효소를 합성할 수 있는 플라스미드를 구성하였다.
벡터 pUR 2601의 유전공학
플라스미드 pURY 2703내에 존재하는 성숙구아 α- 갈락토시다제 유전자를 α-아밀라제 암호배열에 융합되어 있고 이 융합단백질을 코드하는 유전자는 SP 02프로모터에 의해 조절되는 구성물(제13도 참조)의 기본체로서 플라스미드 pMS 48(코크, J, 외, 1985 : 유럽특허 제0, 157, 441호, P-51-57)를 사용하였다. 플라스미드 pMS48을 SacII 및 HinIII로 절단시켜 SP02 프로모터와 α-아밀라아제 암호 배열을 포함하는 보다 큰 벡터단편을 정제하였다. α- 갈락토시다제 유전자를 가진 pURY 2073(제9도 참조)의 1.5 kb SacII-HindIII 단편을 정제하여 pms48의 보다 큰 벡터단편에 결합시킴으로써 성숙 α- 갈락토시다제 유전자와 α- 아밀라아제 암호 배열을 정확히 융합시켜 소위 플라스미드 pUR 2061을 얻었다. 이 결합 샘플은 선별용 네오마이신을 사용한 원형질법(코크, 제이외, 1985 : p52)을 이용하여 가와무리 및 도이(1984)에 의해 기술된 바와 같이 고초균 균주 DB104를 전형시키는데 사용되었다.
이 결과 생긴 네오마이신- 저항성 콜로니를 선별하고 4℃대신 37℃에서 30분간 용해단계를 수행하는 수정법을 이용한 비른보임 및 돌리(1979) 방법으로 플라스미드 DNA를 정제한후 적당한 제한효소로 절단시킴으로써 분석하였다.
올바른 플라스미드 pUR 2601을 가진 전형체를 pNPG-분석법 및 웨스턴 블롯법에 의해 α- 갈락토시다제를 합성하는지 분석하였다.
고초균에 의한 구아 α-갈락토시다제의 합성여부분석
고초균에 대해서는 이질의 단백질을 세포의 특정증식상태에서만 검출할수 있다(그란디, G.외, 1986)고 보고되어 있다. 1 : 50 희석시킨 네오마이신(20μg/ml)의 L-배지상에서 배양물을 밤새증식시키고 수회에걸쳐 pNPG를 이용하여 증식배지속에 α-갈락토시다제가 존재하는지를 분석하였다. 그 결과(제14도) α-갈락토시다제는 7시간 증식후에 최대량 약 0.1단위/ml양으로 증식배지내의 세포 외부에 존재한다는 것을 알수 있다. 배양시간을 연장시키면 프로테아제 작용으로 인해 효소의 농도가 최소한 30배정도 감소되었다.
플라스미드 pUR 2601을 가진 고초균 균주 DB104에 의한 구아 α-갈락토시다제의 합성은 적절한 증식배지 및 증식조절을 이용하여 프로테아제 생성이 억제되도록 하기 위해 10ℓ 의 발효탱크내에서 연구되었다.
사전 배양시킨 pUR 2601을 가진 균주 DB104를 네오마이신(20㎍/ml)을 보충시킨 배지 500ml가 들어있는 쉐이크 플라스크안에서 16시간동안 증식시켰다. 배지의 조성은 다음과 같다(g/l) : NH4Cl.8 : KH4PO4, 4 : 자당, 40 : NaCl, 2 : 효모추출물(디프코)(살균된 것), 10 : MgSO4, 7aq, 1 : 비타민용액, 1 : 미량금속용액, 1
미량금속용액의 조성은 다음과 같다(g/l) :
Figure kpo00003
pH 4.0을 유지하면서 염들을 용해시켰다.
Figure kpo00004
비타민용액의 조성은 다음과 같다(g/L) :
10ℓ의 발효탱크안에서 120℃로 20분간 8ℓ의 배지(항생물질 비함유)를 살균시켰다.
500ml의 사전-배양물을 접종하여 발효가 시작되게 하였다. 온도는 30±0.1℃로 유지시켰다. pH는 12.5％DML NH4OH를 가하여 6.5로 조절하였다. 용존산소압은 분당 1.5-3.5l의 공기가 유통되게 조절함으로써 25％ 이상의 공기포화도가 되도록 유지시켰다. 8-날이 있는 프로펠러의 교반속도는 500rpm을 유지시켰다.
발효후에 온-라인 호흡량(On-line respiration measurement) (산소 소비량 및 이산화탄소 방출량)을 측정하고 610nm에서의 광학적 밀도를 측정하였다. α-갈락토시다제 활성은 매 30분마다 측정되었다. α-갈락토시다제 활성은 균체 생성과 매우 관련이 깊다. α-갈락토시다제 활성의 최대량 1760단위/ℓ은 12시간후에 얻어졌는데 이는 지수적 증가형태의 말기에 해당된다. 생물량 농도는 10.2g이었다. 이 최대활성에 도달된 후에 배양물을 +8℃로 냉각시키고 세포를 원심분리하였다
결과적으로 특정증식 조건을 선택함으로써, 고초균은 다량의 구아 α-갈락토시다제를 합성하여 분비할 수 있다.
면역학적 분석으로는 수위 웨스텐 블롯법을 이용하였다. 배양 배지에 샘플 완충액(에덴스 외, 1982)을 가한후 샘플을 5분동안 끓였다.
2분동안 가열시킨 후 이 겔셈플완충액에 정제된 단백질을 가하였다. 위코프 외, (1977)에 의한 방법으로 10％ 폴리아크릴아미드 겔 전기영동시켜 단백질을 분리하였다.
전기영동 전이(참조 : 부르네트, 1979)에 의해 단백질을 겔로부터 니트로셀룰로즈로 전이시켰다. 니트로셀룰로즈를 배양(I)완충액(150mM NaCl, 5mM EDTA, 50mM 트리스-HCl pH7.0, 0.05％)의 트리톤 x-100, 0.25％ 젤라틴)으로 세척한 다음 0.1％ BSA와, 구아로부터 정제된 α-갈락토시다제로 토끼를 면역화함으로써 생성된 항혈청을 함유하는 I-완충액내에서 배양시켰다.
배양은 교반을 시키면서 4시간동안 실온에서 행해졌다. 흡착되지 않은 항체는 I-완충액(2회)과 인산염완충액 pH 7.0(PBS)로 세척하여 제거시켰다. 항원과 결합된 항체는 1시간동안125I 단백질 A(아메르샴제품)과 반응시켜 검출하였다. I-완충액(2회)과 PBS(1회)으로 세척한 후 니트로셀롤로즈를 건조시켜 70℃에서 X-선 필름에 노출시켰다.
웨스턴 블롯 분석결과(제15도)는 구아 α-갈락토시다제 효소의 존재를 입증하는 것으로 구아 α-갈락토시다제의 항혈청과 특이적 반응을 하였다는 것이 밝혀졌다. 그러나 배지에 존재하는 효소(5선)는 식물의 효소(1선)보다 약간 낮은 분자량을 가졌으나, 플라스미드 pURY 2703을 가진 효모균세포에 의해 합성된 효소(참조, 실시예 2, 제11도)와는 동일하였다. 세포추출물(3선)은 배지에 존재하는 효소와 같은 분자량을 가진 두드러진 띠를 나타내었다. 또한 보다 낮은 분자량을 가지는 띠도 관찰되었는데 이는 단백질분해 때문인 듯 하다. 또한 보다 높은 분자량을 가진 띠로 관찰되었는데 이는 암호배열이 진행되지 않는 형태로 기인하는 듯하다.
N- 말단배열분석을 위한 α-갈락토시다제의 분리 및 정제
마이크로여과(0.02㎛)에 의해 상기 발효배지로부터 세포를 제거시킨후, 0.03M 트리스-HCl(pH8.0)으로 평형시킨, PD-10 컬럼(파르마시아제품)을 사용하여 탈염법에 의해 저분자량의 기질을 제거시켰다. MONO-Q 컬럼(HR 5/5, 파르마시아제품)을 사용하여 음이온-교환 크로마토그래피에 의해 α-갈락토시다제를 분리시켰다. 용출은 0.03M 트리스-CHl(pH 8.0)중 NaCl구배(0-1M)법으로 수행하였다. 검출은 파르시아 FPLC 시스템을 사용하여 214/280nm에서 수행하였다. α-갈락토시다제 활성을 가진 프렉션(약 0.3M의 NacL에서 용출됨)을 함께 모아서 탈염시켰다.(PD-10컬럼 사용, 용출액은 0.01M의 아세트산나트륨 pH4.5). 마지막 정제는 큰 공극을 가진 C-4컬럼(베이커본드제품, 4.6*250mm)를 사용한 역상 크로마토그래피에 의해 25분간 행해졌다. 검출은 위터스 HPLC 시스템을 이용하여 214/254nm에서 수행되었다. α-갈락토시다제 피크(55％ CH3CN에서 용출)를 스피드 바크 콘센트레이터(Speed Vac Concentrator : 사반트 제품)에서 농축시켜 N-말단 배열분석에 사용하였다. 이 분석은 온라인 PTH-분석기(120A)를 사용한 어플라이드 바이오시스템 제품인 가스페이스 세퀀서(Gas phase Sequencer : 모델 470A)에서 수행되었다.
그 결과 고초균에 의해 합성된 효소의 처음 7개의 NH2말단기는 구아종자로부터 정제된 효소의 배열과 같다(참조 실시예 1, 2, 4 : 제3b도)는 것을 알수 있다.
따라서 본 발명자는 구아 α-갈락토시다제 효소가 분비되고 올바로 처리되었다고 결론지을 수 있다. 이 효소는 원핵세포가 능력을 갖고 있지 않으므로 글리코실화되지 않는다.
[실시예 7]
유전공학적으로 고초균에 의해 합성된 α-갈락토시다제 효소에 의한 갈락토만난의 갈락토즈함량의 감소 플라스미드 pUR 2601를 가진 균주 DB104 세포로부터 합성된 구아 α-갈락토시다제 효소가 갈락토만난의 갈락토즈 함량을 감소시키는 특성을 갖고 있는지를 실험하였다.
따라서 MONO-Q컬럼을 사용하여 발효배지로부터 효소제제를 정제하였다(실시예 6참조).
α-갈락토시다제 활성을 가진 프렉션(약 0.3M NaCl에서 용출됨)을 함께 모아서 탈염시켰다 (PD-10 컬럼사용, 용출액은 0.01M의 아세트산나트륨. pH4.5).
이 효소제제를 진공건조에 의해 약 10배 농축시켰다.
비교용으로 사용된 효소는 맥클리리(1983)방법에 의해 기술된 구아종자로부터 정제된 α-갈락토시다제 효소이다.
구아고무의 갈락토즈함량을 감소시킬 수 있는 이러한 α-갈락토시다제 효소의 능력은 다음 방법에 의해 분석되었다.
효소제제(구아효소에 대해서는 25단위, 고초균에 의해 합성된 효소에 대해서는 15단위)를 1.5ml의 100mM 아세트산나트륨 완충액(pH4.5)속에서 용해시켰다. 이것을 1g의 구아고무에 가하고 최소한 1분간 철저히 혼합시켜 그 혼합물이 미세한 ＂빵가루＂감촉이 되도록 한다음 55℃에서 배양시켰다.
효소가 갈락토만난에 대해 활성이 있는지를 분석하기 위해서, 심플을 취해 다음과 같이 실험하였다.
＂빵가루＂혼합물 약 150mg을 샘플로 취하여 무게를 달았다. 이 효소를 끓는 물통에 10분간 넣어 불활성화시켰다.
그 다음 5ml의 10％ 수산화나트륨을 가하고 작은 균등기를 사용하여 샘플을 분산시켰다. 이 용액에 물을 가하여 25ml 되도록 하여 30분동안 흔들어서 다시 균질화시킨후 15분간 방치하였다. 이렇게 처리한 후 다당류를 완전히 용해시켜서 유리된 갈락토즈 및 탄수화물 총량을 결정하기 위해 마련해두었다. 이 분석용액(0.1ml+0.1ml H2O)을 0.2M의 트리스-HCl pH8.6(2.7ml)에 가한 후 1％ w/v DAD용액(0.1ml)을 넣고 0.2M의 트리스-HCl pH8.6(0.05ml)에 녹인 0.25단위의 β-갈락토시다제 탈수소효소(시그마제품)을 가함으로써 유리된 갈락토즈를 측정하였다. β-갈락토시다제 탈수소요소를 생략하고 상기와 동일하게 만든 용액을 블랭크 실험용으로서, 80㎍의 갈락토즈를 표준실험용으로서 사용하였다. 이 용액들을 37℃에서 1시간동안 배양시킨 다음 곧 340nm에서 흡광도를 측정하였다. 탄수화물총량을 결정하는 데에는 안트론 분석법(모리스 : 1948)을 이용하였다. 수정된 방법(로에우스, 1952)은 다음과 같다.
에틸 아세테이트의 아트론 포화용액을 제조하여 최소한 1시간동안 방치하였다. 분석용액 25㎕를 피펫으로 취하여 시험관에 넣고 증류된 탈이온수를 가하여 1ml되도록 하였다(물은 블랭크실험용으로, 80㎍의 갈락토즈는 표준실험용에 사용되었다). 안트론으로 포화된 에틸아세테이트 0.2ml을 가한 다음 2.5ml의 진한 황산을 넣었다. 이것을 철저히 혼합시킨 다음 냉각시켰다. 약 30분후에 610nm에서의 흡광도를 측정하였다.
이 결과로부터 다당류에 대하여 존재하는 갈락토즈 ％를 계산할 수 있다.
Figure kpo00005
상기 결과는 구아의 효소 및 유전공락적으로 고초균으로부터 합성된 효소가 구아고무의 갈락토즈함량을 감소시킬 수 있다는 것을 입증한다.
또한 놀라운 사실은 글리코실화 결여가 갈락토만난에 대한 효소의 작용에 악 영향을 주지는 않는다는 것이다.
[실시예 8]
유전공학적인 한세눌라 폴리모르파에 의한 구아 α-갈락토시다제의 합성. 벡터 pUR 3510의 유전공학
그 구성방법은 제16도에 요약되어 있다.
이 벡터의 기본체는 효모균 YEp13 벡터(브로치 외. 1979)와 선별표식자 leu2이다. 이 벡터는 상기 기술된 MOX 프로모터(레데보어와, 1984), 맥주효고균의 인베르타제 암호배열(타우싱 및 칼손, 19839), 성숙 α-갈락토시다제 유전자(제6도) 및 MOX 종결자(레테보어 외, 1984)의 융합체로 되어 있다.
다음의 여러 단계에 의해 생성되는 플라스미드 pUR 3510을 하기 자세히 설명할 것이다.
a. 해독정지부 이후의 비-해독 배열을 제거시킴(pUR 2303을 얻음 : 제16-1도)
b. MOX 프로모터를 인베르타제 암호배열 및 성숙 α-갈락토시다제 유전자에 융합시킴(pUR 3501을 얻음 : 제16-2도).
c. MOX 종결자를 연결시킴(pUR 3505를 얻음 : 제16-3도)
d. YEp13 벡터에 도입시킴(pUR 3510을 얻음 : 제16-4도)
pUR 2303의 구성 (제16-1도)
뉴클레오티드 1400(제6도)의 해독 정지부 이후의 mRAN의 비해독 부분 또한 폴리 Δ/T 및 G/C테일을 제거하기 위해서, 뉴클레오티드 1223-12339(제6도)의 Xmn 1 자리로부터 해독정지부에 이르는 유전자부분을 시험관내에서 합성된 단편으로 대체하였다. 이 단편은 이중해독정지부를 갖는 α-갈락토시다제 유전자 배열만을 정확히 코드하는 13개의 올리고 뉴클레이티드로 구성되어 있다. 클론화의 편의성을 위해 Sal I 및 HindII자리를 해독정지부 바로 뒤에 도입시켰다.
그 과정은 다음과 같다. 올리고뉴클레오티드를 정제한 후에 1과 13을 제외한 모든 것을 인산화시켰다. 안닐시키고 결합시킨후, 정확한 크기의 단편을 아가로즈겔 전기영동에 의해 정제시킨후, BarnH I 및 HindIII로 절단시킨 벡터 pEMBL9과 융합시켰다. 이것으로 대장균세포를 전형시켜서 플라스미드 DNA를 분리하였다. 0.18kb의 원하는 BanH I 및 HindIII 단편을 가진 플라스미드에 대해 뉴클레오티드 배열을 분석하였다. 정확한 배열을 가진 클론으로부터, Xmn I 및 HindIII 단편을 정제하여 이것을 몰비 약 4 : 2 : 1로, BamH I 및 HindIII로 절단시킨 벡터 pUR 322와 pre-pro-α-갈락토시다제 유전자를 코드하는 플라스미드 pUR 2303(제 7도)로부터의 1.2kb BamH I 및 Xmn I 단편과 연결시켰다. 이 연결혼합체로 대장균세포를 전형시키고 이 암피실린-저항성, 테트라시클린-민감성 전형체로부터 플라스미드 DNA를 분리시켰다. 정제된 플라스미드 DNA를 제한효소로 절단하였다. 이 결과 해독정지부 이후의 비-해독배열이 제거된 완전구아 pre-pro-α-갈락토시다제 유전자를 코드하는 플라스미드 pUR 2303이 생성되었다.
pUR 3501의 구성(제16-2)
MOX프로모터와 인베르타제 암호 배열-성숙 α-갈락토시다제를 정확히 융합시키기 위해서, 6개의 올리고뉴클레오티드로 구성된 합성 ds-DNA단편을 사용하였다. 이 합성단편은 MOX프로모터의 마지막부분 Hgi AI 자리(참조 레데보어 외, 1984)로부터, 맥주효모균(타우싱 및 칼손, 1983)의 인베르타제 암호 배열, 성숙 α-갈락토시다제의 처음 10개 아니모산, NCo I 자리(제6도)에 이르기까지를 코드한다. 코드부분에 대해서는 한세눌라 폴리모르파(레데보어 외, 1985)에 사용되는 최적코돈을 선택하였다.
6개의 올리고뉴클레오티드에서 1, 2, 3 및 4를 인산화시키고 올리고뉴클레오티드 0 및 5를 첨가시킨후 안닐시키고 결합시켰다. 다음 단계로 이 합성단편을 pUR 3102로부터의 Sal I -HgiA I MOX프로모터 단편(레데보어 외, 1984 : 제12a도와 M13벡터(Sal I 및 EcoR I 로 절단시킨후 탈인산화시킨 것)에 연결시켰다. 이 연결혼합체로 대장균 세포를 전형시키고 흰색편을 선별하엿다.
단일가닥의 파지 DNA 및 이중가닥 DNA를 모두 정제하였다. 정확한 제한효소 형태와 정확한 합성 단편의 뉴클레오티드 배열을 가진 클론으로부터 계속적인 클론화를 위해 Sal I - Nco I 단편을 정제하였다. 이 Sal I 및 Nco I 단편을 성숙 α-갈락토시다제 α-갈락토시다제-갈락토시다제를 코드하는 pUR 2303으로부터의 Nco I Sal I 단편(제16-1도)과 벡터 pEMBL9(Sal I로 절단시킨 후 탈인산화시킴)에 연결시켰다.
이 연결혼합체로 대장균세포를 전형시키고 정확한 제한 효소형태를 가진 플라스미드를 분리하여 플라스미드 pUR 3501을 얻었다.
pUR 3505의 구성(제16-3도)
플라스미드 pUR 3501의 2.6kb Sal I 단편을 정제하여, MOX종결자 단편을 가진 플라스미드 pUR 3104(레데보어 외, 1984 : 제14a도)에 연결시켰다. 이 연결 혼합체로 전형된 전형체의 플라스미드를 적절한 방향을 갖는 단편(MOX프로모터-인베르타제 암호배열-α-갈락토시다제-MOX 종결자)을 얻기 위해 제한효소로 절단하여 플라스미드 pUR 3505를 얻었다. 이 플라스미드는 한세눌라 폴리모르파 게놈내에 통합(자리지정)되기에 적합하다. 본 발명자는 전형체가 활성 α-갈락토시다제가 존재하기 때문에 탄소원으로서 멜리비오즈를 증식시키는 특성을 가지게 된다는 것을 예상할 수 있다. 그러나 본 발명자는 우선적으로 leu-2 영양요수성(auxotrophic)선별표식자를 가지고 있고 한세눌라 폴리모르파내에서 자가복제할 수 있는(글리손 외, 1986) YEp13벡터를 사용하기 위해 선택한다.
pUR 3505의 구성(제16-3도)
플라스미드 pUR 3505의 5.2kb HindIII-EcoR I 단편으로서 완전프로모터-유전자-종결자배열을 정제하였다. tet-유전자내에 위치하는 YEp13의 유일한 BaMH I 자리에서 이 단편을 클론화하기 위해, BamHI-HindIII아덥터(adapter) 및 BamH I - EcoR I 아덥터를 사용하였다. 인산화된 아덥터를 단편에 결합시킨 후, 이 혼합체를
BamH I 로 절단시켜서 5.2kb단편을 분리하였다. 이 BamH I 단편을 YEp13(Bam I로 절단시킨 후 탈인산화시킴)에 연결시켰다. 이 연결혼합체로 대장균 세포를 전형시켜서 이 암피실린-저항성이고 테트라시클린-민감성인 클론으로부터 플라스미드 DNA를 정제하였다. 이로부터 정확한 제한효소 형태를 가진 플라스미드 pUR 3510을 선별하였다.
pUR 3510에 의한 한세눌라 폴리모르파의 전형 및 분석
한세눌라 폴리모르파 균주 L1(Leu1-1)을 LiCl 및 원형 플라스미드 DNA를 사용한 글리손 외(1988)에 의한 방법으로 전형시켰다. 전형체를 선별하여, 로이신을 함유하지 않고 탄소원으로서 글루코즈를 함유한 MM에서 증식시켰다. 이 결과 생긴 leu+전형체를 구아 -갈락토시다제 효소의 존재유무에 대해 분석하였다.
탄소원으로서 글리세롤을 함유하는 YMM한천판상에서 균주세포를 증식시킨후, 세포를 수거하여 용출완충액(10mM 트리스-HC1 pH 8.0, 0.1mM EDTA, 1mM DTT)으로 현탁시킨 다음 3회 동결-해동사이클에 의해 분해시켰다. 이 생세포 추풀물을 인공적 기질 pNPG를 사용하여 α-갈락토시다제 효소 활성인지에 대해 분석하였으며 면역학적 분석(웨스턴 블롯법)도 시행하였다.
용출완충액에 용해된 생세포추출물의 적당희석액을 10mM pNPG와 함께 37℃로 5분간 0.1M 아세트산나트륨(pH 4.5)내에서 배양시켰다. 1ml의 2％ 탄산나트륨을 첨가시켜 반응을 종결하였다. 에펜도르프 원심분리기에 의해 5분간 원심분리하여 세포 및 세포편을 제거시킨후 상기 혼합물의 흡광도를 410nm에서 측정하였다.
410nm에서의 P-니트로페놀의 흡광계수는 18.45㎠/㎛ol이다. α-갈락토시다제 1단위는 pH4.5 37℃에서 1분간 동안 1㎛ol의 기질을 가수분해할 수 있는 효소의 양을 나타낸다.
플라스미드 pUR 3510을 가진 세포의 세포-추출물은 이 플라스미드가 없는 비교용 효모균세포제제와는 대조적으로 상기 분석에서 양성반응을 나타내었다. 면역학적 분석으로는 소위 웨스턴 블롯 분석법을 이용하였다. 생세포 추출물에 샘플완충액(에덴스 외, 1982)을 가한 후에 이것을 5분 끓였다. 2분간 가열시킨후 겔샘플완충액에 정제단백질을 가하였다. 위로프 외. (1977)방법에 의해 10％ 폴리아크릴아미드 겔 전기영동시킴으로써 단백질을 분시켰다.
다음에 전기영동 전이(참조 부르네트, 1979)에 의해 단백질을 겔로부터 니트로셀룰로즈로 전이시켰다. 니트로셀룰로즈를 배양(I) 완충액(150mM NaCl, 5mM EDTA, 50mM의 트리스-HCl pH7.0 0.05％의 트리톤 X-100, 0.25％ 젤라틴)으로 헹군다음 0.1％ BSA와, 구아로부터 정제된 α-갈락토시다로 토끼를 면역화함으로써 생성된 항혈청을 함유하는 I-완충액내에서 배양시켰다.
배양은 교반을 시키면서 4시간동안 실온에서 행해졌다. 흡착되지 않은 항체는 I-완충액(2회)과 인산염완충염 pH 7.0(PBS)로 세척하여 제거시켰다. 항원과 결합된 항체는 1시간동안 125 l 단백질 A(아메르샴제품)과 반응시켜 검출하였다. I-완충액(2회)과 PBS(3회)으로 세척한 후 니트로셀룰로즈를 건조시켜 70℃에서 X-선 필름에 노출시켰다.
그 결과(제17도)플라스미드 pUR 3510을 가진 한세눌라 세포(C선)에는 식물의 효소의 단백질(B선)과 같은 분자량을 가진 단백질이 존재하였으며, 이 단백질은 플라스미드 pURY 2705를 가진 맥주효모균에서 합성된 단백질과도 같은 분자량을 가졌다. 상기 플라스미드가 없는 한세눌라 세포에는 단백질이 존재하지 않았다.(A선)
[실시예 9]
유전공학적으로 GAL7 프로모터를 사용한 맥주효모균에 의한 구아 α-갈락토시다제의 합성
미생물에 의한 구아 α-갈락토시다제의 합성을 설명하기 위해서, GAL7 프로모터를 사용하여 맥주효모균의 효소의 발현을 유도하기 위한 벡터를 구성하였다. 이 프로모터의 뉴클레오티드 배열은 공지되어 있다(노기 및 후가사와, 1983)
이 프로모터 배열은 유도조건(유일 탄소원으로서 갈락토즈를 함유하는 배지에서 증식 : 호피 및 로에, 1978)하에 GAL7이 코드된 효소를 합성하게 한다. 또한 이 프로모터가 이질적 유전자(예 : 대장균으로부터 알려진 LacZ 유전자)의 발현을 유도하는 데에 이용되는 것도 공지된 것이다(타지마 외, 1985 : 야거 외, 1985) 따라서 본 발명자는 GAL7 프로모터를 사용하여 혼성유전자 인베르타제 암호배열 : : 성숙 α-갈락토시다제의 발현여부를 분석하였다.
벡터 pUR 2706 및 pUR 2730의 유전공학
이 벡터의 기본체는 GAPDH 프로모터-인베르타제 암호배열 : : 성숙 α-갈락토시다제를 가진 셔틀벡터pUR 2705(실시예 2 : 제10도 참조)이다. 이 벡터에서 GAPDH프로모터를 거의 다 제거시키고 그 대신 티후가사와 박사(일본, 도쿄, 게이오의과대학, 분자 유전학 연구실)로부터 얻어진 클론화된 271bp GAL7프로모터단편(타지마 외, 1985)으로 대치시켜 벡터 pUR 2706을 얻거나 또는 시험관내 합성된 DNA프로모터단편으로 대치시켜 벡터 pUR 2730을 얻는다.
플라스미드 pUR 2706은 다음과 같이 구성되었다(참조 제18-1도). 우선 벡터 pUR 2705의 GAPDH프로모터에 위치하는 Sal I 자리를 BamH I자리로 변환시켰다.
따라서 벡터 pURY 2705를 Sac I으로 절단하고 Sl엑소뉴클레아제와 배양시켜 끝이 무딘 말단이 생기게 한 다음 여기에 BamH I 연결자(5＇ C G G A T C C G)를 결합시켰다. 이 결합혼합체를 사용하여 대장균 세포를 전형시켰다.
이 결과 생긴 전형체로부터 플라스미드 DNA를 분리시켜서 제한 효소로 분석하였다. Sac I 자리는 없고 BamH I 자리를 가진 플라스미드를 선별하였다.(pURY 2705). 뉴클레오티드 배열분석으로 Sac 자리가 제거되었다는 것 뿐만아니라 Sac I 자리 주위의 많은 뉴클레오티드로 제거되었다는 것을 알 수 있다. 그러나 인베르타제 암호배열의 해독개시 ＂ATG＂는 영향을 받지 않았다. 다음과 같은 배열이 그 결과였다.
5＇- - - c c t t g a a c t t c g g a t c c g A T G T G C T T - - - 3＇
(인베르타제 암호 배열은 대문자로 표시된 것이고 GAPDH 프로모터는 소문자로 표시된 것이며 BamH I 연결자는 밑줄을 쳐서 표시한 것이다).
이 플라스미드 pURY 2705＇를 Bgl II 및 BamH I로 절단시켜 GAPDH프로모터를 거의 다 제거시키고, 아가로즈 겔 전기영동에 의해 보다 큰 벡터 단편을 정제하였다. GAL프로모터는 플라스미드상에 271bp BamH I - Bgl II 단편(타지마 외, 1985)으로서 존재한다. 또한 이 단편을 절단시킨후 아가로즈겔 전기영동하여 정제하였다. 두 정제된 단편을 결합시킨후 이 결합혼합체를 사용하여 대장균세포를 전형시켰다. BamH I 및 Bgl II가 동일한 점성말단을 생성하게 되면 271bp 프로모터 단편은 2종의 방향으로 결합될 수 있다. 그러나 ＂BamH I 점성말단＂이 ＂Bgl II 점성말단＂과 결합하는 경우에는 BamH I에 의해서도 인식되지 않고 Bgl II에 의해서도 인식되지 않는 배열이 생기게 된다. 따라서 BamH I 및 Bgl II자리의 존재유무는 프로모터의 배향에 관한 직접적인 정보를 준다.
따라서, 플라스미드 DNA는 전형체로부터 분리되어 이러한 제한효소로 처리되었다. 바른 배향물의 프로모터 단편을 가진 , 따라서 Bgl II 및 BamH I자리가 없는 플라스미드를 선별하였다.(pURY 2706). 이러한 결과 얻어진 염기 배열은 다음과 같이 GAL7 프로모터(소문자), Bgl III-BamH I 연결자(밑줄친 소문자) 및 인베르타제 암호배열(대문자)이 통합된 것이다.
g a a t a t t c c c a g a t c c g A T G A T G C T T
플라스미드 pUR 2730은 다음과 같이 구성되었다.(참조 제18-2도).
우선 GAL 7 프로모터 배열은 실시예 2에서 다른 군의 뉴클레오티드와 결합되어 처리되는 16개의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 ds DNS배열로서 합성되었다. 앞부분 5개는 pEMBL9의 EcoR I - BamH I 단편으로서 클론화 되었고 뒷부분 11개는 pEMBL9의 BamH I-EcoR I 단편으로서 클론화되었다. 전형체로부터 플라스미드 DNA를 분리하여 제한효소로 절단하였다. 예상되는 크기를 가진 삽입체가 도입된 플라스미드의 배열을 결정하여 정확한 뉴클레오티드 배열을 가진 클론을 계속되는 과정에 사용하였다.
GAPDH프로모터를 제거시키기 위해, 플라스미드 pUR 2705를 Bgl II으로 절단하여 탈인산화시킨 후 Sac I으로 절단하여 겔전기영동에 의해 10.7kb벡터 단편을 정제하였다. GAL7 프로모터를 코드하는 두 단편은 두 pEMBL클론을 상기와 같이 BamH I로 절단하고 탈인산화시킨후 각각 Bgl II로, BamH I 및 Sac I으로 절단시켜 정제되었다. 두 GAL프로모터 단편을 상기 벡터 단편에 연결시키고 이 연결혼합체를 사용하여 대장균을 전형시켰다. 이 전형체로부터 플라스미드 DNA를 정제하여 제한 효소로 분해하였다. 적합한 제한효소 형태를 가진 플라스미드를 선별하여 플라스미드 pUR 2730을 얻었다.
GAL7프로모터를 사용한 사카로미세스에 의한 α-갈락토시다제의 합성의 분석
균주 SU10(α, leu2 , ura3 , his3 , Cir+: 네델란드왕국, 3740에이지 바른, P. O. BOX 273의 센트라알부리우포아쉼멜컬쳐스에 기탁번호 CB323.87 기탁되어 있음)효모균세포를 구형원시세포법(베그스, 1978)에 의해 플라스미드 pURY 2706으로 전형시켰다. 이 결과 leu+전형된 효모균 세포를 α-갈락토시다제 효소가 존재하는지에 대해 분석하였다. 전형체를 우라실과 히스티딘으로 보충된 YMM상에서 증식시켰다. 그 다음 이 효모균세포를 10X대용량의 YPG 배지에 옮기고 정지기까지 증식시켰다. 발효배지로부터 원심분리 또는 여과(0.22㎛, 밀리포어)에 의해 세포를 분리시켰다. 발효배지 및 생세포 추출물을 실시예 2에서와 같이 α-갈락토시다제 존재에 대해 분석하였다. 그 결과, 1ml의 발효배지는 5단위의 효소가 존재하는 반면, 생세포 추출물에는 상기 농도의 10％ 이하의 효소가 존재하였다. 그러므로 많은 함량의 α-갈락토시다제 효소가 분비된다는 것을 알 수 있다.
합성된 효소를 더 세부적으로 분석하기 위해서, α-갈락토시다제를 다음과 같이 정제하였다. 플라스미드 pUR 2606을 가진 효모균 세포균주녀10을 이미 설명한 바와 같은 방법으로 배양하였다. 마이크로 여과(0.22㎛)에 의해 상기 발효배지로부터 세포를 제거시킨후, 0.03M 트리스-HCI(pH 8.0)으로 평형시킨, PD-10컬럼(파르마시아 제품)을 사용하여 탈염법에 의해 저분자량의 기질을 제거시켰다. MONO-Q컬럼(HR 5/5, 파르마시아 제품)을 사용하여 음이온-교환 크로마토그래피에 의해 α-갈락토시다제를 분리시켰다. 용출은 0.03M 트리스-HCI(pH 8.0)중 NaCl 구배(O-1M)법으로 수행하였다. 검출은 파르마시아 FPLC시스템을 사용하여 214/280mm에서 수행하였다. α-갈락토시다제 활성을 가진 프랙션(약 0.3M의 NaCl에서 용출됨)을 함께 모아서 탈염시켰다(PD-10 컬럼사용, 용출액은 0.01M의 아세트산나트륨 pH 4.5).
이 제제를 구아고무의 갈락토즈 함량을 감소시키기 위한 정제효소제제로 사용하였다.(실시예 10참조).
α-말단배열분석을 위한 마지막 정제는 큰 공극을 가진 C-4컬럼(베이커본드, 4.6*250nm)을 사용한 역상크로마토그래피에 의해 25분간 행해졌다. 구배용출액으로는 A완충액(0.1％ TFA(v/v), B완충액(0.1％ TFA+60％ CH3CN(v/v)을 사용하였다.
검출은 워터스 HPLC시스템을 이용하여 214/254nm에서 수행되었다. α-갈락토시다제 피크(55％ CH3CN에서 용출)를 스피드 바크 콘센트레이터(사반트 제품)에서 농축시킨 N-말단 배열분석에 사용하였다. 이 분석은 온라인 PTH-분석기(120A)를 사용한 어플라이트 바이오시스템제품인 가스 페이스 세퀀서(모델 470A)에서 수행하였다. 그 결과 NH2말단으로부터 배열결정된 12개의 잔기는 구아 α-갈락토시다제의 NH2말단 아미노산 배열과 완전히 일치하였다. 인베르타제 암호 배열은 정확히 처리한 결과 구아 α-갈락토시다제의 아미노산 배열과 같았다.
[실시예 10]
유전공학적으로 GAL 7 프로모터를 사용한 맥주효모균에 의해 합성되는 α-갈락토시다제에 의한 갈락토만난의 갈락토즈 함량의 감소.
플라스미드 pUR 2706을 가진 효모균세포 균주 SU10에 의해 합성된 구아 α-갈락토시다제가 갈락토만난의 갈락토즈함량을 감소시키는 작용을 하는지를 실험하였다.
따라서 2종의 다른 효소제제를 사용하였다. 그 하나는 MOMO-Q컬럼을 사용하여 발효배지로부터 정제되었다.(실시예 9참조). α-갈락토시다제 활성을 가진 프렉션(약 0.3M NaCl에서 용출됨)을 함께 모아서 탈염시켰다.(PD-10 컬럼사용. 용출액은 0.01M의 아세트산나트륨 ph 4.5)
이 효소세제를 진공건조에 의해 약 10배 농축시켰다. 다른 한 효소제제는 10, 000달톤이상의 분자를 보유하는 아미콘 콘센트레이터를 사용하여 투명한 발효배지를 10배 농축하여 얻은 생농축제제이다.
비교용으로서는 맥클리리(1983)에 의해 설명된 구아 종자로부터 정제된 α-갈락토시다제 효소를 사용하였다. 구아고무의 갈락토즈함량을 감소시킬 수 있는 이 α-갈락토시다제의 능력은 다음과 같이 분석되었다.
효소제제(25단위)를 1.5ml의 100mM 초산나트륨 완충액(pH 4.5)에 용해시켰다. 이것을 1ｇ의 구아고무에 가하고 최소한 1분동안 철저히 혼합시켜 이 혼합물이 미세한 ＂빵가루＂촉감을 가지도록 한 다음 55℃에서 배양시켰다.
효소가 갈락토만난에 활성이 있는지를 분석하기 위해서, 샘플을 취해 다음과 같이 실험하였다.
＂빵가루＂ 혼합물 약 150mg을 샘플로 취하여 무게를 달았다. 이 효소를 끓는 물통에 분간 넣어 불활성화시켰다.
그 다음 5ml의 10％ 수산화나트륨을 가하고 작은 균등기를 사용하여 샘플을 분산시켰다. 이 용액에 물을 가하여 25 ml되도록 하여 30분동안 흔들어서 다시 균질화시킨 후 15분간 방치하였다. 이러한 처리후 다당류를 완전히 용해시켜서 유리된 갈락토즈(실시예 7참조) 및 탄수화물총량을 결정하기 위해 마련해 두었다. 탄수화물 총량을 결정하는 데에는 안트론분석법(모리스, 1948)을 이용하였다. 수정된 방법(로에우스, 1952)은 다음과 같다.
에틸아세테이트의 안트론 포와용액을 제조하여 최소한 1시간동안 방치하였다. 분석용액 25㎕을 피펫으로 취하여 시험관에 넣고 증류된 탈이온수를 가하여 1ml되도록 하였다 (물은 블랭크실험으로, 80㎍의 갈락토즈는 표준실험용에 사용되었다). 안트론으로 포화된 에틸아세테이트 0.2ml를 가한 다음 2.5ml의 진한 황산을 넣었다. 이것을 철저히 혼합시킨 후 냉각시켰다. 약 30분후에 610nm에서의 흡광도를 측정하였다.
이 결과로부터 다당류에 대한 갈락토즈의 존재％를 계산할 수 있다.
Figure kpo00006
상기 결과는 구아의 효소와 유전공학적으로 효모균세포에 의해 합성된 효소는 구아고무의 갈락토즈함량을 감소시키는 능력에 있어서 별차이가 없다는 것을 보였다.
[실시예 11]
유전공학적인 식물에 의한 구아 α-갈락토시다제의 합성 : 연초종에 의한 합성
유전공학적인 미생물에 의한 구아효소의 합성다음으로, 식물세포에 의한 합성도 또한 경제적인 측면에서 가능성을 제공한다. 그러나, β-만나나제가 없어야 한다는 분명한 필수조건외에도 식물은 유전공학적 방법에 의해 처리되어야만 한다. 본 실시에는 일예로 연초에 초점을 맞춘다. 왜냐하면 이 식물종은 유전공학 시험에 광범위하게 이용되어 왔기 때문이다. 다른 식물종에 대해서도 기술을 응용할 수 있게 됨에 따라 구아 β-갈락토시다제의 합성은 다른종으로 쉽게 변경될 수 있다.
식물에 의한 구아 α-갈락토시다제의 합성을 설명하기 위하여, 벡터를 구성하였으며 이 벡터를 연초에 전이시켰다.
구아 α-갈락토시다제를 가진 식물 발현 벡터(pUR 8001)의 구성
성숙효소(제6도)의 앞에 pre-pro-부분을 코드하는 배열을 포함하는 완전한 α-갈락토시다제 유전자를 도입시키기로 결정하였다. 다시 A/T 및 G/C테일을 포함하는 해독정지부 이후에 비-해독 DNA 배열을 제거하였다. 마지막으로 완전한 유전자는 BamH I 자리에 의해 이동되어 식물발현 벡터내의 카울리플라우어 모자이크 비루스 35S 프로모터와 노파린 신세타제 말단 배열 사이에서 이 유전자를 클로닝하였다. 이 유전공학적 단계들은 다음에 상세히 설명된다.
pUR 2303의 구성(제16-1도)
폴리 A/T 및 G/C 테일뿐만아니라, 뉴클레오티드 1400(제6도) 해독정지부 이후의 mRNA의 비-해독부분을 제거하기위하여, 뉴클레오티드 1223-1223(제6도) XmnⅠ자리로부터 해독정지부까지의 유전자 부분을 시험관내에서 합성된 단편으로 대체하였다. 이 단편은 이중해독정지부를 포함하는 α-갈락토시다제 유전자의 배열을 정확하게 코드하는 13개의 올리고뉴클레오티드로 구성되어 있다. 간편하게 클론하기 위하여 SalⅠ 및 HindⅢ 자리를 해독정지부 뒤에 즉시 도입시켰다.
그 과정은 다음과 같다. 올리고뉴클레오티드의 정제후 1과 13 이외의 모든 것을 인산화하였다. 안닐 및 결합시킨 후, 올바른 크기의 단편을 아가로스 겔 전기영동에 의해 정제하고 BamHⅠ 및 HindⅢ으로 절단시킨 벡터 pEMBL9와 연결시켰다. 이것으로 균주 JM103으로부터의 대장균 세포를 전형시켜 플라스미드 DNA를정제하였다. 뉴클레오티드 배열결정법에 의해 0.18kb의 BamH I-HindIII 기대단편을 가진 플라스미드를 분석하였다. 올바른 배열을 가진 클론으로부터 XnnI-HindIII 단편을 정제하고 이것을 몰비 약 4 : 2 : 1로, BamH I-HindIII로 절단시킨 벡터 pbR322와 pre-pro-α-갈락토시다제 유전자를 코드하는 플라스미드 pUR 2302(제7도)로부터의 1.2kb BamH I-Xmn I 단편과 연결시켰다.
대장균 세포를 이 연결혼합체로 전형시켜 이 암피실린-저항성, 테트라시클린-민감성 전형체로부터 플라스미드 DNA를 정제하였다. 정제된 플라스미드를 제한효소로 절단하였다. 그 결과 해독정지부 이후의 비-해독 배열이 제거된 완전한 구아 pre-pro-α-갈락토시다제 유전자를 코드하는 플라스미드 pUR 2302이 수득되었다.
pUR 2304의 구성
플라스미드 pUR 2303을 Sal I로 절단하여 얻어진 단일가닥 점성말단을 DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편과 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트로 처리하여 이중가닥으로 만들었다. 합성된 BamH I 연결자 배열들[5' CCGGATCCGG]을 1몰과량의 사건 인산화된 연결자들과의 연결에 의해 첨가하였다. 그 다음에 플라스미드를 BamH I로 분해하여 1.2kb 단편을 겔 전기영동에 의해 정제하여 벡터 pUC9의 BamH I 자리에 연결시켰다(비에이라이, 1982). 이 연결혼합체를 사용하여 대장균 JM101(야니시-폐론외, 1985)를 전형시키고 백색의 암피실린-저항성 콜로니를 선별하였다. 전형된 클론으로부터의 플라스미드 DNA를 정제하여 제한 효소로 절단하였다. 올바른 플라스미드를 정제하여 pUR 2304로 지정하고 다음에 사용하였다. 즉 후자의 플라스미드 1.2kb BamH I 단편에 존재하는 α-갈락토시다제를 코드하는 배열의 원으로서 사용되었다.
식물발현 벡터 pU8001의 구성
식물발현 벡터는 식물에 전이시킬 수 있는 모식균내의 2성분 벡터시스템 pBin 19(Bevan, 1984)의 한 성분을 형성하며, 다음과 같이 구성된다. 즉, 대장균 또는 모식균에 안정한 유지를 부여하는 광범위 숙주 레플리콘; 박테리아내에서 작용하는 카나마이신 저항성 유전자; 식물속에서 작용하는 카나마이신 저항성 유전자와, 카울리플라우어 모자이크 비루스의 35S RNA 프로모터 및 노파린 신세타제 유전자의 전사 종결자로 구성되는 발현 카세트를 함유하는 TDNA의 25염기에 대해 리피드가 측면에 위치하는 BamH I 분할자리를 통해 연결된 영역 및; 이 벡터가 pRK2013에 의해 접합전이(in trans)에 대해 이동되게 할 수 있는 이동가능자리로 구성된다.
이 발현자리내에 α-갈락토시다제 유전자를 삽입하기 위하여 이 벡터를 BanH I로 절단하여 탈인산화시키고 전기영동 후에 정제하였다.
1.2kb α-갈락토시다제 BamH I 단편을 pUR 2304로부터 정제하고, 선형화된 탈인산화 벡터와 혼합하여 이 둘을 함께 연결하였다. 연결된 혼합체를 사용하여 대장균 JM101(야니시-폐론외, 1985)을 전형시켜서 양성 클론을 카네마이신-저항자로서 선별하였다. 여러개의 클론들로부터 플라스미드 DNA를 분리하여 1) 1.2kb 알파-갈락토시다제 유전자 단편의 존재 및 2) 이 단편의 올바른 배향, 즉 유전자의 N-말단을 코드하는 부분이 발현 카세트의 프로모터 유전자에 인접하는 배향에 대한 분석을 제한효소 분석을 통해 수행하였다. 후자의 특징은 Pst I 의 비대칭배치된 절단자리를 이용하여 결정한다는 점이다. 올바른 배향을 가진 플라스미드를 선별하였다(pUR 8001 : 제19도 참조 : 센트라알브리우 포아 쉼멜컬쳐스에 대장균 JM101중 기탁번호 CBS337.87으로 기탁됨).
연초 세포내에 벡터 pUR 8001의 도입
pUR 8001을 모식균 균주에 전이시키기 위해 pUR 8001 함유 대장균 클론을 모식균 균주 LBA4404(훼케마외, 1983) 및 pRK2031을 가진 대장균 균주 HB101(보에르외, 1969)와 함께 삼자교배(tripartite mating)에 사용하였다. 후자는 리팜피신
Figure kpo00007
(Rifampicin
Figure kpo00008
)에 저항성이 있으므로, 이 항생물질을 교배에서의 공급자에 대한역선택에 타나마이신과 결합하여 사용하였다.
전형된 칼루스의 발생
TDNA를 식물로 이동시키도록 작용하는 원래의 Ti 플라스미드와 pUR 8001을 함유하는 모식균 LBA4404의 유도체를 분리한 다음 호르쉬(Horsch)등(1985)의 잎 디스크(LEAF DISC)법의 유도체를 이용하여 균주의 발현 카세트내의 α-갈락토시다제 유전자를 식물조직내로 전이시키는데 사용하였다. 직경 8mm의 잎 디스크는 박테리아 없이 순배양한 연초 SR1(종자는 영국, Unilever Research Laboratory Colworth House, R.Shields으로부터 구입가능)의 새로 생겨난 잎으로부터 천공된 것이다,
이 디스크를 렌녹스 배지(Lennox Broth)내에서 밤새 배양한 상기 모식균 유도체(109세포/ml)내로 무균상태하에서 전이시켰다. 이것을 10분동안 배양한 후 꺼내서 습기를 빨아들여 건조시킨 다음에 2ml의 니코티아나 플롬바기나 폴리아 현탁 배양액을 접종시킨 한천 배지[발아 배지 또는 칼루스 생성 배지]의 표면상의 살균 필터 위에 축방향으로 맞대이게 플레이트하였다. 접종된 잎 디스크를 26℃ 빛이 있는 소에서 2일동안 배양한 다음 100㎍/ml 카나마이신과 500㎍/ml 세포탁심(Claforan
Figure kpo00009
, Roussell에 의해 공급됨)을 함유하는 선별배지에 전이시켰다. 칼루스 배양물을 보유하고 매 3주 간격으로 적당한 배지상에서 증식시켜, 카나마이신과 세포탁심으로 계속적으로 선별하였다.
전형된 식물의 발생
발아가 촉진되는 배양물의 경우(발아배지)는 발아가 모식균으로 감염된 후 2-4주일 후에 나타났을 때, 이 슈트를 파이토호르몬-비함유 세포탁심-함유 배지상의 잎 디스크로부터 절개하였다. 슈트상에 뿌리가 나타날 때, 슈트를 재차 절제하여 세포탁심 및 카나마이신-함유 파이토호르몬-비함유 배지에 전이시켰다. 따라서, 카나마이신 선택하에 초록색을 유지하고 뿌리의 생산을 촉진하는 슈트는 벡터상에 존재하는 표식자의 존재에 대해 시험하여 전형되어 있다는 것이 밝혀졌다.
상기 절차와 병행해서, α-갈락토시다제 배열들을 함유하지 않지만 식물에 노파린 합성능력을 부여하는 벡터-Bin 6(영국 캠브리지 CB2 2LQ. 트럼핑톤, 모리스 레인, 플랜트 브리딩 인스티튜트, M. Bevan 박사로부터 자유로이 구입가능함)를 이용하여 비교 전형을 시켰다.
전형된 칼루스로부터 현탁배양액의 생성
카나마이신(100㎍/ml)과 세포탁심(500㎍/ml)을 함유하는 칼루스생성 배지(고체)상에서 증식시킨 전형된 칼루스의 작은 조각들(200mg)을 상기 항생물질을 함유하는 액상 칼루스생성배지속에 넣고 어두운 곳에 놓인 오비탈 쉐이터(orbital Shaker)에서 배양시켰다. 배양이 심화되었을 때, 무균상태하에 걸러내어 균일한 세포현탁액이 생기게 하였다. 이 현탁 배양물을 14일 간격으로 2차 배양하였다.
전형된 식물로부터 털이 많은 뿌리 배양물의 생성
잎 디스트를 100㎍/ml의 카나마이신에서 증식하는 전형된 식물의 잎으로부터 잘라내었다. 잘라낸 디스크를 하루밤 배양된 아그로박테리움 리조게네스 R1000(리히텐슈타인, 임페리알 컬리지 런던의 콘라느 박사로부터 구입가능)배양물과 10분동안 배양시켰다. 이 디스크를 박테리아 배양물로부터 꺼내어 건조시킨 다음 니코티아나 플룸바기나폴리아 공급층 위에 표면을 아래로 하게 배치하였다. 10-15일 후에, 생겨난 뿌리를 잘라내어 100㎍/ml의 카나마이신-함유 털이 많은 뿌리 배양물을 배지(액상)속에 넣고 오비탈쉐이커에서 배양시켰다. 뿌리는 약 10일동안 2차 배양시켰다.
칼루스 생성 배지 :
무라시게 앤드 스쿠그 기본 배지(Flow Laboratory)
+ 3％자당
+ 2mg /l 나프틸초산(오옥신)
+ 0.5mg/l 벤젤아미노 푸린(사이토키닌)
(고체배지에서는 필요에 따라 한천)
발아배지 :
무라시게 앤드 스쿠그 기본 배지(Flow Laboratory)
+ 3％ 자당
+ 0.02mg/l 인돌 초산(오옥신)
+ 1mg/l 벤질아미노푸린(사이토키닌)
(고체배지에서는 필요에 따라 한천)
털이 많은 뿌리 배양물 배지 :
무라시게 앤드 스쿠그 기본배지(Flow Laboratory)
+ 3％ 자당
+ 0.1mg/l 나프틸 초산
α-갈락토시다제의 합성 여부를 알아보기 위한 전형된 식물조직의 시험
a) 직접화학분석
연초식물, 예를 들어 칼루스, 잎 또는 털이 많은 뿌리로부터 얼음-냉각추출 완충액(1ml)중에 균질화된 100-300mg의 조직을 이용하여 추출액을 준비하였다. 또 다른 방법으로는 현탁배양물의 상청액을 사용하였다. 이 추출물 또는 상청액을 37℃에서 2ml 검출완충액(추출완충액내에 4-메틸움벨리페릴-α-D-갈락토시다제(시그마 제품, 1mM)가 용해됨)으로 배양시키고, 0.5, 10 및 15분 간격으로 부분표본을 500㎕씩 회수하고 3ml 0.2M Na2CO3을 부가하여 종결하였다. 유리된 4-메틸움벨리페론의 형광성을 바이르드노바 2스펙트로 플루오리미터(Baird Nova 2 Spectrofluorimeter)를 사용하여 슬리트폭세트 10nm에 있어서 365nm의 여기광과, 455nm의 방사광을 측정하고, 새로 제조한 4-메틸움벨리페론 용액으로 검량하였다
추출완충액 : 초산나트륨(50mM, pH5)
EDTA 디나트륨 염(1mM)
디티오쓰레이톨(10mM)
트리톤 x-100(0.1％)
이 검출방법으로 측정한 값들을 제20도에 나타내었다. 제20도로부터 전형된 세포 제제는 비교용 제제보다 훨씬 높은 α-갈락토시다제 활성을 가진다는 것을 쉽게 파악할 수 있다. 비교용은 구아의 α-갈락토시다제 유전자를 수반하는 플라스미드를 함유하지 않았다.
b) 면역학적분석
a) 샘플제조
전형된 식물조직(칼루스 또는 잎)의 작은 조각들을 원추형 팁(tip)을 가진 테프론페스톨을 사용하는 1.8ml 에펜도르프관내의 액체질소중에 분해하였다. 이 분말을 200㎕의 2×표준농도 SDS 겔 샘플 완충액(Laemmli1970)속에서 서서히 균질화되도록 해동시켰다. 진정한 α-갈락토시다제를 함유하는 구아 내배유의 샘플은 실시에 1에 설명한 바와 같이 조절된 동시 발아에 의해 제조되었다. 24시간 발아된 내배유 (추출물당 4)를 상술한 바와 같이 액체질소속에서 분쇄하여 200㎕의 6×표준농도 샘플 완충액속에서 서서히 균질화 되도록 해동시켰다. 이 균질물을 증류수로 600㎕로 희석시켰다. 모든 추출물을 5분동안 끓인 다음 5분에 10, 000g으로 원심분리시켰다. 상청액을 10％ SDS 겔상에 부하하고 300V에서 3시간동안 전기영동시키고 100V에서 2시간동안 전기영동시켰다.(부하의 경우, 해당 도면 설명을 참조). 그 다음에 이 겔은 니트로셀룰로스 필터상에서 전기블로팅(electroblotting)시켰다. 이 필터를 다음과 같이 처리하였다. 즉,
1) TBS (0.5M NaCl, 20mM의 트리스- HCL, pH 7.5) +1％ 헤모글로빈내에서 16시간 배양.
2) 유연(affinity)의 정제한 항-α-갈락토시다제를 TBS +1％ 헤모글로빈 +0.1％트윈 20에 1 : 100비로 희석한 희석액 25ml 내에서 3시간동안 배양(제1항체).
3) TBS + 1％ 헤모글로빈+0.1％ 트윈 20(2×50ml)에서 다음에 1M NaCl, 20mM 트리스- HCl, pH 7.5, 0.1％ 트윈 20(4×100ml)에서 2시간에 걸쳐 세척.
4) 고트-안티-래빌 고추냉이 페록시다제 콘쥬게이트(goat-anti-rabbit horse-radish p.c.)를 TBS, 0.1％ 트윈 20, 1％ 헤모글로빈 1 : 2000비로 희석한 희석액에서 2시간동안 배양(제2항체).
5) 1M NaCl, 20mM 트리스-HCl, 0.1％ 트윈(4×100ml)에서 1시간에 걸쳐 세척.
6) 증류수에 최종 린스.
7) 표준 고추냉이 페록시다제 발색제(HRP kit-Bioard의 설명에 따라)와 2분동안 배양.
상기 전기-면역블로팅 방법(Western Blotting A.)으로 전형된 칼루스 C1, F11 및 B1은 비교용 플라스미드 빈(Bin) 6로 전형된 칼루스내에 존재하지 않는 항-α-갈락토시다제와 교차 반응할 수 있는 단백질을 함유하였다는 것을 밝혔다는데 성공하였다(제21도). 더군다나, 교차반응하는 종은 발아하는 구아내배유의 추출물속에 존재하는 지정한 α-갈락토시다제와 같은 유동성(분자량)을 가진다.
이것은 전이된 유전자에 의해 코드되는 α-갈락토시다제의 pre-pro형은 연초 칼루스에 의해 발현되었을 경우 성숙형으로 올바르게 처리된다는 것을 시사하며, 이것은 C1, F11 및 B1의 현탁배양물의 상청액에 α-갈락토시다제 활성이 관찰된 것에 기인하여 α-갈락토시다제가 전형된 연초세포에 의해 분비될 수 있다는 본 발명자들의 결론을 뒷받침해 준다. α-갈락토시다제 유전자를 함유하는 전형된 연초 잎(pUR 8001로 전형)의 전기-면역블로팅 분석결과 이러한 효소의 성숙처리형에 상당하는 크기를 가진 α-갈락토시다제형의 발현이 나타났다.
Figure kpo00010
오크터로니법 및 웨스턴 블롯법에 의한 면역학적 관계에 대해서 뿐만아니라 갈락토만난의 갈락토스함량을 감소시키는 능력에 대해서 12종류원의 α-갈락토시다제 효소를 분석하였다.
오크터로니 분석의 경우, 약 10단위/ml 농도의 효소제제를 사용하였다. 웨스턴 블롯법의 경우, 0.1단위/ml-0.5단위/ml 농도의 용액들을 5μl사용하였다.
상기 표에서 ND는 측정불가를 나타낸다.
사용된 약어
EP-A- : 최초의 우선권주장일 또는 우선권자장이 없는 경우 그 출원일로부터 약 18개월 후에 공개된 유럽특허출원서
pNPG : p-니트로페닐 -α-D-갈락토피라노시드
ATP : 아데노신 트라포스페이트
DCTP : 데옥시시토신 트리포스페이트
TTP : 데옥시티민 트리포페이트
GAPDH : 글리셀알데히드-3-포르페이트 탈수소효소
OD260 : 260nm에서의 광학적 밀도
SDS : 도데실 황산나트륨
HAc : 초산
NaAc : 초산나트륨
E 완충액 : 40ml트리스-HAc(pH7.6), 20mM NaAc, 20mM EDTA
O 완충액 : 100mM 트리스-HCl(pH7.5), 1ml EDTA, 0.5M NaCl, 0.1시코실
STE 완충액 : 100mM NaCl, 10mM 트리스-HCl(pH7.5), 1nM EDTA
MOPS : 3-(N-모르폴리노)프로판술폰산
MOPS 완충액 : 0.02M MOPS(pH7.0), 1mM EDTA
SSC : 150mM NaCl, 15mM 시트르산나트륨
YMM : 아미노산이 없는 효모균 질소 기본물 0.67％와 글루코스 2.0％를 함유하는 효모 최소배지(Yeast Minimal Medium)
YPD 배지 : 2％ 글루코즈, 2％ 박토-펩톤(디프코), 1％ 효모추출물(디프코)
YPG 배지 : 2％ 갈락토즈, 2％ 박토-펩톤(디프코), 1％ 효모추출물(디프코)
FDA 염색 : 플루오레스세인 디아세테이트 염색
기타 약어 및 여러 표현 기호는 캠브리지대락 출판부의 유전공학사전(1985년, 올리버, 에스, 지 및 와드, 제이.엠.)에 설명되어 있다.
pURY 2703, pURY 2705, pURY 2705' 및 pURY 2606은 각각 pUR 2704, pUR 275, pUR 2705' 및 pUR 2706의 이명(異名)이다.
도면설명
제1도 : 구아종자의 단면
A=종피
B=알류론 세포
C=내배유
D=자엽
E=내배유박층
제2도 : 주형으로서 구아종자의 알류론 세포로부터 정제된 RNA에 의한 시험관내 해독산물의 분석
효모균으로부터의 폴리-A RNA 제제(2㎍ : B.C 선) 및 구아로부터의 폴리-A RNA 제제(5㎍ : B, C 선)을 해독을 위한 주형으로서 사용하였다.
해독산물을 직접 겔전기영동시키거나(A, B 선), α-갈락토시다제에 특이적인 항체로 배양시킨 후 겔전기영동시켰다(C선), 14C-라벨을 붙인단백질(아메르샴제품)을 분자량 기준물로 사용하였다(D선), C선의 노출은 다른 샘플에 대한 노출보다 5배 걸어서 -70℃에서 밤새 노출되었다.
제3도 : 펩티드의 아미노산 배열 및 이로부터 유도된 프로브의 뉴클레오티드 배열
내부펩티드(A) 및 NH2-말단배열(B)는 아미노산에 대해 한 문자로 표기되어 있다. 혼합된 프로브의 뉴클레오티드 배열은 아미노산 배열로부터 유도된 것으로 아미노산 배열 바로 아래에 나타내었다. 혼합된 위치에 대한 기호로서 U=A 또는 G; V=T 또는 C; X=A, G, T 또는 C; Y=T 또는 G를 나타낸다. MP33은 16개의 배열을 가진 14-mer, MP43은 8개의 배열을 가진 MP44는 128개의 배열을 가진 41-mer를 나타낸다.
제4도 : 올리고뉴클레오티드 프로브 MP33과 구아 mRNA의 노던 블롯 혼성화
A선 : 구아종자의 알류론 세포의 폴리 A RNA 5μg
B선 : 구아종자의 알류론 세포의 총 RNA 5μg
엄밀한 세척은 35℃에서 5 X SSC 0.1％ SDS로 수행하였다.
대장균의 리보좀 RNA를 분자량 기준물로 사용하였다.
제5도 : 플리스미드 pUR 2302의 제한지도, 서브클론 및 배열결정방법
A. 플라스미드 UR 2302의 예비제한지도
B. M13벡터 M13 mp18 및 M13 mp19로 서브클론화된 pUR 2302 및 pUR 3214단편
C. pUR 2302 및 pUR 2314의 배열 구성을 위해 이용되는 배열결정 방법.
화살표는 배열화 방향을 나타낸다. 네모표시는 다른 올리고뉴클레오티드와 배열결정반응을 하기위한 프라이밍자리를 나타낸다(U; 공통 N13 프라이머(primer), 숫자 : 배열결정 실험을 위해 합성된 올리고펩티드 프라이머), 아래의 선은 슈퍼-코일드(super- colied) 배열 결정실험을 나타낸다.
P =PstI, K =KpnI, X =XmnI
제6도 : 구아 α- 갈락토시다제 cDNA 클론 pUR 2302의 완전 뉴클에오티드 배열
5'-3' 가닥의 뉴클레오티드 배열을 나타내었다. cDNA 클로닝 과정에서 합성된 폴리 dG/dC 테일은 5'자리(뉴클에오티드 6-20)에 나타나있는 반면 3'자리에서는 폴리 A테일 다음에 dG/dC테일이 배열된다.(나타나 있지 않음)
폴리아데닐와 열속 배열(프로우드푸트 및 브라운리, 1976)은 뉴클레오티드 위에 선으로 그어 표시하였다. 뉴클레오티드 배열로부처 유도된 아미노산 배열은 뉴클레오티드 배열위에 한문자로 표시하였다. 아미노산의 숫자 매기는 것은 성숙 단백질에서부터 +1로 시작하였다. pre-pre-배열이 있는 아미노산은 음수로 매겼다.
제7도 : 플라스미드 pURY 2703 및 pURY 222705의 구성방법
몇몇 단편들의 자세한 설명은 실시예 2에 제시되어 있다.
Figure kpo00011
제8도
합성된 개별 단일가닥 올리고뉴클레오티드 단편은 화살표들 사이에 숫자로서 표시하였다. A(GAPDH 프로모터 - 성숙 α- 갈락토시다제) 및 B(GAPDH 프로모터- 인베르타제 암호배열 - 성숙 α- 갈락토시다제)에서 같은 숫자는 사용된 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드가 동일하다는 것을 말한다.
제한 효소절단 자리는 완전한 이중가닥 단편위에 표시하였다. 해독개시와 완성 α-갈락토시다제의 첫 번째 잔기는 이중가닥 배열 아래에 각각 Met와 Δla¹으로 표시하였다.
제9도 : 플라스미드 pUR 2703의 제한지도
단편에 포함되어 있는 GAPDH 프로모터의BglII 자리는 괄호안의 킬로염기쌍(kb)을 나타내는 뉴클레오티드 숫자를 매기는데 있어 임의의 출발점이다.
Bal I 및 EcoR I를 제외한 제한자리는 소화 및 이중소화에 의해 확인되었다.
기호 : 제7도의 걸명과 같다. 추가적으로 AAA/TTT, GGG/CCC는 각각 dA/dT 및 dG/dC테일을 의미한다.
제10도 : 플라스미드 pUR의 제한지도
GAPDH프로모터의 Bgl II 자리는 괄호안의 뉴클레오티드 킬로염기쌍을 나타내는 뉴클레오티드 숫자를 매기는데 있어 임의의 출발점이다. Sal I 및 EcoR I를 제외한 제한자리는 소화 및 이중소화에 의해 확인 되었다.
기호는 제9도의 설명과 같다.
제11도 : pURY 2703 및 pURY 2705를 가진 맥주효모균의 웨스턴 블롯분석
그 분석방법은 실시예 2에 자세히 설명되어 있다.
1 선 : 구아로부터 정제된 α-갈락토시다제 4ng
2 선 : 1선과 같음 1ng
3 선 : pURY 2705를 가진 세포의 생추출물
4 선 : pURY 2703을 가진 세포의 생추출물
5 선 : 플라스미드를 함유하지 않은 세포의 생추출믈
제12도 : 플라그미드를 pUR 2405의 구성방법
자세한 설명은 실시예 5에 주어져 있다. 사용된 기호는 제7도의 기호설명을 참조한다. 속이 빈 네모(□)는 trp-1 유전자를 의미하며(플라스미드 모식도에 표시되어 있음)또한 효모균 벡터의 2μm 오리진을 의미한다(표시되어 있음). 검은 네모는 suc2(인베르타제) 암호배열 대신에 KARS2 배열을 의미한다(표시되어 있음)
제13도 : 플라스미드 pUR 2601 의 구성방법
자세한 설명은 실시예 6에 주어져 있다. pMS48에 사용된 기호와 pUR 2601에 있믐 일부기호는 제13도에 나타내었다. pUR 2703에 사용된 기호와 pUT 2601에 있는 일부기호는 제7도의 기호설명을 참조한다.
제14도 : 쉐이크 프라스크내에서 증식된 pUR 2601을 가진 고초균에 의해 α-갈라고토시다제의 합성
600nm에서의 광학밀도(OD600)에 의해 결정된 바이오매스의 발생과 pNPG 분석에 의해 측정된 배지에서의 α-갈락토시다세의 생성량(단위/ml)을 제14도에 나타내었다. 도시된 값은 3, 5, 7 및 24기간 증식후 측정된 값이다. 24시간 후에 OD600은 제이스분광광도계(Zeiss photosprctrometer)에 의해 최대치 8단위에 도달하였다. 이와 대조적으로, α-갈락토시다제 함량에 대한 최대치 약 0.1단위/ml(증식배지)는 증식시킨 지 7시간후에 이루어졌고, 24시간 증식후 그 함량은 증식배지 1ml중 단지 0.03단위정도까지 감소되었다.
제15도 : pUR 2601을 가진 고초균의 웨스턴 블롯분석
그 분석방법은 실시예 6에 자세히 설명되어 있다.
1선 : 구아로부터 정제된 α-갈락토시다제
2선 : pUR 2601을 가진 세포의 생추출물
3선 : 2와 같음
4선 : pUR 2601을 가진 세포의 배지
5선 : 4와 같음
제16도(제16-1도-제16-4도) : 플라스미드 pUR 3510의 구성방법
각 단계의 자세한 설명은 실시예 8에 예시되어 있다. 별도의 설명이 없는 한 사용된 기호는 제7도에서 설명한 것과 같다.
제17도 : pUR 3510을 가진 한세눌라 폴리모르파의 웨스턴 블롯분석
자세한 설명은 실시예 8에 예시되어 있다.
A선 : 한세눌라 폴리모르파 L1 세포추출물
B선 : 정제된 구아 α-갈라토시다제 효소(10ng)
C선 : 플라스미드 pUR 3510을 가진 한세눌라 폴리모르파
제18도 (제18-1도-제18-2도) : 플라스미드 pUR 2706 및 pUR 2730의 구성방법
자세한 설명은 실시예 9에 기슬되어 있다.
제19도 : 식물발현벡터 pUR 8001
여러단계에 대한 자세한 설명은 실시예 11에 기술되어 있다. 별도의 설명이 없는한 사용된 기호는 제7도에서 설명한 것과 같다.
제20도 : pUR 8001로 전형된 연초식물 및 조직의 효소분석
여러 식물세포체제(preparation)의 추출물에 대해 인공기질인 4-메틸움벨리페릴-α-D-갈락토피라시드를 사용하여 α-갈락토시다제의 존재를 분석하였다.
그 다음 α-갈락토시다제를 코드하는 플라스미드 pUR 8001로 전형시킨 세포로부터의 제제에 대해서 분석하였다. 비교용으로는 벡터빈 6을 가진 세포를 사용하였다. 자세한 것은 실시예 11에 설명되어 있다.
제21도 : pUR 8001을 가진 연초의 웨스턴 블롯분석
그 분석법은 실시예 11에 자세히 설명되어 있다.
1선 : 발아하는 구아 내배유 추출물
2선 : 빈 6을 가진 칼루스 추출물(비교용)
3선 : pUR 8001을 가진 칼루스 추출물(C1)
4선 : pUR 8001을 가진 칼루스 추출물(F11)
5선 : pUR 8001을 가진 칼루스 추추물(B1)
화살표는 분자량 표식자의 위치를 나타낸다. 위로부터 아래로 : 92kd, 68kd, 43kd 및 25kd.

Claims (15)

1-4결합 β-D-만노피라노실 단위의 주사슬에 결합된 α-D-갈락토피라노실 단위를 절단시킴으로써 갈락토만난의 갈락토즈 함량을감소시킬 수 있는 α-갈락토시다제의 제조방법으로서, 상기와 같이 갈락토만난의 갈락토즈 함량을 감소시킬 수 있는 단백질 또는 그 전구물질에 대한 유전암호를 지정하는 뉴클레오티드 배열을 벡터내로 삽입시키고 이 재조합 벡터를 숙주 유기체로 전이시켜 이 숙주 유기체내에서 뉴클리오티드 배열이 발현되도록 하는 재조합벡터의 제조방법에 의해 제조된 재조합 벡터를 도입함으로써, β-만나나제 없는 α-갈락토시다제를 형성할 수 있는 숙주유기체 및 그 후대의 제조방법에 따른 숙주유기체를 배양중에 또는 배양후 유도중에 α-갈락토시다제가 분비되도록 하는 조건하에 배양하여 그 다음 α-갈락토시다제를 수거하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, 숙주 유기체로부터 α-갈락토시다제가 분비되어진 후, 이 발효액으로부터 세포를 제거시키고 경우에 따라 이 결과 생긴 액을 농축시킴으로써 α-갈락토시다제를 수거하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
갈락토만난의 수성 제제(preparation)를 β-만나나제 없는 α-갈락토시다제로 배양시킴으로써 갈락토만난의 갈락토즈함량을 감소시키는 방법으로서, α-갈락토시다제는 갈락토만난의 갈락토즈 함량을 감소시키는 단백질 또는 그 전구물질에 대한 유전암호를 지정하는 뉴클레오티드 배열을 벡터내로 삽입시키고 이재조합 벡터를 숙주 유기체로 전이시켜 이 숙주유지체 내에서 뉴클레오티드 배열이 발현되도록 하는 재조합벡터의 제조방법에 의해 제조된 재조합 벡터를 도입함으로써, β-만나나제 없는 α-갈락토시다제를 형성할 수 있는 숙주 유기체 및 그 후대의 제조방법에 따른 숙주 유기체를 배양중 또는 배양후 유도중에 α-갈락토시다제가 분비되도록 하는 조건하에 배양하여 그 다음 α-갈락토시다제를 수거하는 제조방법에 의해 제조되는 것을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
갈락토만난의 수성 제제를 β-만나나제 없는 α- 갈락토시다제로 배양시킴으로써 갈락토 만난의 갈락토즈 함량을 감소시키는 방법에 의해 제조된 갈락토즈 함량이 감소된 갈락토만난을 (필요에 따라 1종 이상의 농후화제 또는 겔화제와 혼합하여) 시품, 가축사료 또는 화장품을 제조하는데 사용하는 방법.
단백질 또는 그 전구물질에 대한 유전암호를 지정하는 뉴클레오티드 배열을 벡터내로 삽입시키고 이 재조합 백터를 숙주 유기체(host organism)로 전이시켜 이 숙주 유기체 내에서 뉴클레오티드 배열이 발현 되도록 하는 단계를 포함하는 재조합 벡터의 제조방법으로서, 상기 단백질은 α-갈락토시다제 활성을 가지므로 1-4결합β-D-만노피라노실 단위의 주 사슬에 결합된 1-6결합 α-D-갈락토피라노실 단위를 절단함으로써 갈락토만난의 갈락토즈 함량을 감소시키는 특성을 갖는 것을 특징으로하는 재조합 벡터의 제조방법.
제5항에 있어서, 뉴클레오티드 배열은 다음 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
(a) 제1항에 기재된 특성을 가진 α-갈락토시다제를 코드하는 천연성 뉴클레오티드 배열.
(b) 구아종자의 α-갈락토시다제에 대항하여 생성되는 항체와의 면역교차 반응에서 양성을 나타내는 α-갈락토시다제를 코드하는 뉴클레오티드 배열.
(c) (a) 또는 (b) 와 동일한 α-갈락토시다제 또는 제1항에 기재된 특성을 가지는 상기 α-갈락토시다제의 변이체를 코드하는 유전공학에 의한 뉴클레오티드 배열.
제5 또는 6항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오티드 배열은 다음과 같은 아미노산 배열을 갖는 단백질을 코드하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
Figure kpo00012
제7항에 있어서, 뉴클레오티드 배열은 제6도에 제시된 뉴클레오티드 배열 307-1398이며, 이로인해 유도되는 해당 코돈의 아미노산 배열은 제7항에 제시된 아미노산 배열 l-364인 것을 특징으로하는 제조방법.
제5항에 있어서, 선별된 숙주 유기체에 적합한 재조합 벡터는 다음 요소로 구성되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
(a) α-갈락토시다제 또는 그 전구물질에 대한 유전암호를 지정하는 이중가닥 DNA(ds-DNA)
(b) (a) 의 ds-DNA 의 +가닥의 코드 부분의 3'-말단에 결합되어 있는 해독 정지코돈(경우에 따라 선별된 숙주 유기체에 적합한 전사종결배열이 연결됨).
(c) (a) 의 ds-DNA의 +가닥에 상류에 위치하는 선별된 숙주 유기체에 적합한 발현 레규론.
(d) ds-DNA가 α- 갈락토시다제의 성숙형에 대한 유전암호를 지정하고 이러한 형태가 메티오닌 잔기로 개시되지 않은 경우, (a)의 ds-DNA의 +가닥의 유전암호 지정부분의 5'-말단에 결합되어 있는 해독 개시 콘돈 ATG.
(e) 선별된 숙주 유기체의 개놈중에 (a)의 ds-DNA의 삽입을 용이하게 하는 뉴클레오 티드 배열 및/또는 선별된 숙주 유기체에 적합한 복제오리진과 임의의 선별표식자.
(f) 임의 선택적으로, 전구체 형태의 α-갈락토시다제의 전구부분을 코드하는 ds-DNA.
α-갈락토시다제 활성을 가지므로 1-4결합 β-D-만노피라노실 단위의 주사슬에 결합된 1-6결합 α-D-갈락토피라노실 단위를 절단함으로써 갈락토만난의 갈락토즈 함량을 감소시킬 수 있는 단백질 또는 그 전구물질에 대한 유전 암호를 지정하는 뉴클레오티드 배열을 벡터내로 삽입시키고 재조합 벡터를 숙주 유기체에 전이시켜 이 숙주 유기체 내에서 뉴클레오티드 배열이 발현되도록하는 재조합 벡터의 제조방법에 의해 제조된 재조합 벡터를 도입함으로써 β-만나나제 없는 α-갈락토시다제를 형성할 수 있는 숙주 유기체 및 그 후대(progeny)의 제조방법.
제10항에 있어서, 숙주 유기체는 식물 또는 그 부분인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제10항에 있어서, 숙주 유기체는 미생물인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제12항에 있어서, 숙주 미생물은 박테리아, 사상균 및 호모균으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제10항에 있어서, 숙주 유기체는 사카로미세스, 클로이베로미세스, 바실루스, 한세눌라, 피치아, 아스페르길레스, 솔라나세아 및 니코티아나로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제14항에 있어서, 숙주 유기체는 맥주효모균(사카로미세스 세레비사아에), 사카로미세스 칼스버겐시스, 클루이베로미세스 마르시아누스 베리언트 락티스, 고초균(바실루스 셉틸리스), 한세눌라 폴리모르파, 피치아파스토리스 및 연초(니코티아나 타바쿰)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
KR1019880700119A 1986-06-03 1987-06-02 DNA 재조합법으로 형질 전환시킨 숙주에 의한 구아르 α-갈락토시다제의 제조방법 KR930010770B1 (ko)

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