JPH10502521A - 植物アラビノガラクタン蛋白質（ａｇｐ）遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、植物アラビノガラクタン蛋白質（ＡＧＰ）およびそれらの遺伝子を提供する。ＡＧＰは、ニコチアナ アラタ(Nicotiana alata)、ニコチアナ プラムバギナホリア(Nicotiana plumbaginafolia)およびピルス コムニス（Pyruscommunis）から分離したＡＧＰである。分離ＡＧＰペプチド分子のアミノ酸配列が提示される。分離ＡＧＰペプチド分子をオリゴヌクレオチド プローブの合成に使用して、ニコチアナ アラタ、ニコチアナ プラムバギナホリアおよびピルス コムニスのｃＤＮＡライブラリイのスクリーニング用のＲＮＡプローブを、またはＰＣＲ用のオリゴヌクレオチド プライマーを調製した。分離ＡＧＰ分子のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡクローンが分離された。本発明は、対応するＡＧＰ遺伝子から誘導される完全ＡＧＰアミノ酸配列を初めて提示した発明である。本発明はまた、特別に分離されたヒドロキシプロリン−富裕（ＯＡＳＴ−富裕）配列または特別に分離されたヒドロキシプロリン−貧弱配列を含むＡＧＰペプチドをコードするＡＧＰ遺伝子の獲得に有用な方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 植物アラビノガラクタン蛋白質（ＡＧＰ）遺伝子発明の分野 本発明の主題は、植物、例えばニコチアナ アラタ(Nicotiana alata)、ニコ チアナ プラムバギナホリア(Nicotiana plumbaginafolia)およびピルス コム ニス（Pyrus communis）からのアラビノガラクタン蛋白質（ＡＧＰ）の分離に関 し、およびまたＡＧＰの蛋白質幹鎖をコードする対応する植物遺伝子の分離にお ける各種ＡＧＰ断片のアミノ酸配列の利用に関する。発明の背景 アラビノガラクタン蛋白質（ＡＧＰ）は、試験された各系統樹群からの有花植 物に見出される。これらのプロテオグリカン類は、多くの高級植物に広く分布し ており、葉、茎、根、花部分、種子およびかなりのそれらの分泌物を包含するほ とんど全部の組織に存在する。ＡＧＰの多様な所在場所は、多部位局所限定され ている或る種の動物プロテオグリカン類と類似しているものと見做される。しか しながら、化学構造に関しては、植物ＡＧＰ類と動物プロテオグリカンとの間の 類似性はほとんどないように見える。 ＡＧＰ類は、高割合の炭水化物と通常１０重量パーセントよりも少ない量の蛋 白質とを含有する、構造的に関連したグリコシル化分子の一族である［Clarke等 によるAust．J．Plant Physiol.，５：７０７〜７２２（１９７８）；Fincher等 によるAnn．Rev．Plant Physiol．，３４：４７〜７０（１９８３）］。しかし ながら、約５９％の蛋白質含有量を有するＡＧＰ類も知られている［Fincher等 による上記刊行物（１９８３）；Anderson等によるphytochem.,１８：６０９〜 ６１０（１９７９）］。この炭水化物は、１，３−β−Ｄ−ガラクトピラノシル 幹鎖および（１，３−β−または１，６−β−）Ｄ−ガラクトピラノシル（Ｇａ ｌｐ）残基の側鎖を有し、およびまた多くの場合に、末端にβ−Ｄ−Ｇａｌｐお よびα−Ｌ−アラビノフラノシル（Ａｒａｆ）残基を有する多糖類鎖からなる[F incher等による上記刊行物（１９８３）]。その他の中性糖類および ウロン酸が低レベルではあるが、また検出されている。存在できる単糖類は、Ｌ −ラムノピラノース、Ｄ−マンノピラノース、Ｄ−キシロピラノース、Ｄ−グル コピラノース、Ｄ−グルクロン酸およびその４−Ｏ−メチル誘導体ならびにＤ− ガラクツロン酸およびその４−Ｏ−メチル誘導体である［Fincher等による上記 刊行物（１９８３）］。しかしながら、大部分の場合に、ガラクトース（Ｇａｌ ）およびアラビノース（Ａｒａ）が優勢である。 蛋白質含有量は通常、２〜１０パーセントである［Fincher等による上記刊行 物（１９８３）］。この蛋白質がアラニン（Ａｌａ）、ヒドロキシプロリン（Ｈ ｙｐ）、セリン（Ｓｅｒ）、およびスレオニン（Ｔｈｒ）に富んでいるものと見 做されている以外には、このＡＧＰ類のコア蛋白質の構造および起源については 、ほとんど知られていない［Fincher等による上記刊行物（１９８３）］。本発 明の以前においては、一体として分離されたＡＧＰの完全アミノ酸配列は公的に 利用することはできなかった。ＡＧＰ類の高炭水化物含有量が、配列決定（sequ encing）を困難にしているように見做される；この炭水化物部分を化学的に除去 しようとする試みは通常、不完全な脱グリコシル化および種々のレベルの炭水化 物含有量を有する生成物をもたらした。炭水化物−蛋白質架橋は、小麦およびラ イグラスから分離されたＡＧＰにおいて、β−ガラクトシル−ヒドロキシプロリ ン架橋であるとして同定されている［Gleeson等によるＡＧＰ News，５：３０〜 ３６（１９８５）およびMcNamaraおよびStoneによるLebensum．-Wiss．u-Techno l.，１４：１８２〜１８７（１９８１）］。 ＡＧＰ類は、アカシア（Acacia）樹木から産生されるガム状沁出物であるアラ ビアゴムの構成成分であり、そして熱、乾燥および外傷などのストレス状態で生 産されることが知られている［Clarke等によるPhytochemistry，１８：５２０〜 ５４０（１９７９）］。このガムは、プデイング、デザート、ケーキミックスお よびスープミックスなどのドライミックス製品における風味封入剤として広く使 用されており、またソフトドリンク中の必須油の乳化に、およびまた製菓製品に おける糖結晶化の防止に使用されている［Randall等によるFood Hydrocolloids, ３：６５〜７５（１９８９）］。このガムの総合的構造および機能特性に対する 蛋白質成分の重要性は認識されている［Vandevelde等によるCarbohydr.Polymers , ５：２５１〜２７３（１９８５）；Connolly等によるFood Hydrocolloids，１： ４７７〜４８０（１９８７）およびConnolly等によるCarbohydr．Polymers，８ ：２３〜３２（１９８８）］。このガムの蛋白質に富んだ部分の乳化性に対する 重要性も、証明されている［Randall等によるFood Hydrocolloids，２：１３１ 〜１４０（１９８８）］。 天然の複雑な炭水化物または多糖類の製造には、多くの場合に問題がある。植 物沁出物、種子抽出物または根抽出物の場合には、この生産は、気候および栽培 条件に依存する。例えば、アフリカ（主要原産国）におけるアラビアゴムの生産 は、天候状態、特に旱魃、労働力供給、自然災害、政治状況などの関数として毎 年変化することがある［Meer等によるFood Technology，２９：２２〜３０（１ ９７５）］。この信頼できない供給は、アラビアゴムの価格変化をもたらす。海 草抽出物からの寒天は、栽培経費により高価である。さらにまた、手による寒天 および種子ガム、例えばグアガム、の収穫は純度の問題を導入する。従って、信 頼でき、比較的安価なガムまたは一群のガムが、多くの工業界で明らかに必要と されている。 ＡＧＰを含有する栽培植物細胞ガムが、従来のガム、例えばアラビアゴム、グ アガム、キサンタンガム、アルギン酸ガム、寒天、アルギン酸カルシウム、カラ ゲニン、カラヤ、ロカストビーンガム、アルギン酸カリウムまたはナトリウム、 トラガカントガムまたはその他のガムの代用品として使用されている。例えば、 分離または培養植物細胞ガムは、増粘剤、乳化剤、接着剤、インキ、塗料、練り 歯磨、化粧品、医薬品、布地プリント、サイジングおよびコーティング、油井掘 搾用マッド、コンクリートなどとして使用することができる。多くの場合に、植 物細胞ガムは、従来のガムより少ない量で使用して、均等な機能上の有効性を達 成することができる。 ＡＧＰ類は、植物発芽、細胞−細胞接着、花粉−柱頭識別、および病気抵抗性 を包含する数種の生物学的プロセスで機能する。ＡＧＰ類はまた、グルとして機 能することができ、あるいはまた花粉管成長に関して栄養物を供給することがで きる。ＡＧＰ蛋白質か、細胞外空間でレクチン類またはその他の蛋白質と相互反 応することがあり、およびまた細胞外オリゴ糖類シグナル分子に対する細胞応答 ［NormanらによるPlanta，１８１：３６５〜３７３（１９９０）］に含まれるこ とがあることが示唆されている［Fincher等による上記刊行物（１９８３）］。 ＡＧＰ類はヤリブ(Yariv)抗原およびフラボノールグリコシド類と相互反応する ことから[JermynによるJ．Plant Physiol.，５：５６３〜５７１（１９７８）] 、これらはレクチン様性質を有するものと考えられている。ＡＧＰ類の分子構造 について、炭水化物ブロックが中心ポリペプチド鎖に共有結合しているブロック コポリマーに類似の構造が提案されており［Randall等によるFood Hydrocolloid s,３：６５〜７５（１９８９）］、これはエマルジョンおよび分散液を立体的に 安定化させるその能力を説明している。 従来技術において、植物ＡＧＰ遺伝子は未知であり、本発明の以前においては 、植物ＡＧＰ遺伝子のヌクレオチド配列は公開されたことはない。極めて最近に なって、ＰＣＲ戦略が、ジャガイモ塊茎ｃＤＮＡライブラリイからのＡＧＰ配列 、ジャガイモ塊茎レクチンおよびエクステンシンのクローン化に使用されている 。ニンジンエクステンシンプローブにハイブリッドされたＰＣＲ生成物が、最近 研究されている数種の推定クローンを与えたことが報告された。ＡＧＰ遺伝子に 対応するクローンは記載されていない。 ＡＧＰクローンを得る方法は、複雑で、かつまた問題が多いことが見出されて いる。ＡＧＰおよびそれらの遺伝子が付随する問題点には３点があり、すなわち （１）これらが密接に関連する分子種の一員としてしばしば存在することから単 独ＡＧＰ種の同定が困難である点、（２）ＡＧＰペプチドの特徴的アミノ酸配列 が非常に大きい冗長部分を有する点、すなわち（ａ）高含有量でヒドロキシプロ リンを含有する領域および（ｂ）高含有量でヒドロキシプロリン、アラニン、セ リン、およびスレオニンを含有する領域（ＯＡＳＴ）が存在する点；および（３ ）対応するオリゴヌクレオチドのＧＣ富裕がハイブリド形成の特異性による問題 を導く点がある。例えばＰＣＲ技術における、核酸ハイブリド形成中の明確では ない、不正確な整列は、ＡＧＰクローンを得る能力の欠如をもたらす。この結果 として、起源の鋳型に比較して、不正確な配列の増幅(amplification)が生じる 。植物はまた、ＧＣ−富裕ＤＮＡによりコードされる種々のグリシン−富裕蛋白 質を含有することが知られている。本発明の開示は、上記問題を回避し、Ａ ＧＰ遺伝子の分離を可能性にするものである。 植物抽出物からのＡＧＰ分離に関する従来の研究では、２つの手段が使用され ている。この手段の１つは、植物抽出物の古典的分別からなる［Fincher等によ るAust．J．Biol．Sci.，２７，１１７〜１３２（１９７４）；AspinallによるA dv．Carbohydrate Chem.,２４：３３３〜３７９（１９６９）］。植物抽出物か らのＡＧＰ分離に関するもう一つの手段は、ジアゾ化した４−アミノフェノール グリコシドをフロログルシノールにカプリングさせることにより生成される一群 の染料を用いる沈殿である［Jermyn等による上記刊行物（１９７５）］。これら の染料は、抗体に対するグリコシド抗原決定基に係わる抗原を沈殿させるものと して、ヤリブ(Yariv)等により初めて製造され、β−グリコシル人造炭水化物抗 原が、大豆、ジャック豆およびトウモロコシからのアラビノースおよびガラクト ース含有ポリマーを沈殿させることが示された［Yariv等によるBiochem，J.，１ ０５：１ｃ〜２ｃ（１９６７）］。この時から、この沈殿反応は、ＡＧＰ類の分 離に広く使用されている。 これらの染料はまた、植物組織中のＡＧＰの局所限定に、細胞化学試薬として 使用されている［Clarke等によるJ．Cell Sci.，１９：１５７〜１６７（１９７ ５）；Clarke等によるQ．Rev．Biol.，５３：３〜２８（１９７８）］。ヤリブ 試薬に対するＡＧＰの結合性質は理解されていないが、炭水化物残基と蛋白質残 基との両方を包含するものと見做されている。ＡＧＰのヤリブ試薬に対する結合 は、アラビノース残基の除去により影響を受けないが［Gleeson等による上記刊 行物（１９７９）；Akiyama等による上記刊行物（１９８１）］、ＡＧＰの進行 する酸加水分解により壊滅される［Fincher等による上記刊行物（１９８３）］ 。 高級植物では、ＡＧＰはそれらのヒドロキシプロリンの高含有量によって特徴 付けられる群の蛋白質に属するものとして分類される。これらのヒドロキシプロ リンに富んだ糖蛋白質類（ＨＲＧＰ）は、アラビノースおよびガラクトースを含 有する炭水化物側鎖を有するという特徴を有する。この群は伝統的に、主要３群 に分類されている：細胞壁付随エクステンシン類；可溶性アラビノガラクタン− 蛋白質類（ＡＧＰｓ）；およびナス科レクチン類。これら３群の相違点を、表１ ．０にまとめて示す。ＨＲＧＰ分類における最も重要な因子は、それらの炭水化 物 の量、組成および配列、ポリペプチド幹鎖の配列および組成、炭水化物と蛋白質 との間の結合およびその場所である。 プロリン−富裕蛋白質類（ＰＲＰ）である新規な一群の蛋白質が最近、開示さ れた。ＰＲＰはまた、ヒドロキシプロリン／プロリン−富裕蛋白質または反復性 プロリン−富裕蛋白質と称されている。ＰＲＰのアミノ酸組成のあるものは等量 のプロリンおよびヒドロキシプロリンの存在を示唆した［Averyhart-Fullhard等 によるProc．Nart．Acad.，８５：１０８２〜１０８５（１９８８）；Datta等に よるPlant Cell,１：９４５〜９５２（１９８９）；Kleis-San Francisco等によ るPlant Physiol.,９４：１８９７〜１９０２（１９９０）］。しかしながら、 ＰＲＰ類は、グリコシル化されているようには見えず、この点で、ＨＲＧＰ類（ ヒドロキシプロリン−富裕糖蛋白質）とは相違している。発明の要旨 本発明は、植物アラビノガラクタン蛋白質類（非グリコシル化ＡＧＰ類）の蛋 白質幹鎖をコードするＤＮＡ断片を初めて提供する。本発明の特別の態様により 、ニコチアナ アラタ(Nicotiana alata)（ＮａＡＧＰ１）、ニコチアナ プラ ムバギナホリア(Nicotiana plumbaginafolia)（ＮｐＡＧＰ１）およびピルス コムニス（Pyrus communis）（ＰｃＡＧＰ２３、ＰｃＡＧＰ９およびＰｃＡＧＰ ２）の細胞懸濁培養物からの、およびまたニコチアナ アラタ（Nicotiana alta ）花柱（Ｎａ３５−１およびＡＧＰＮａ１）からの非グリコシル化ＡＧＰをコー ドするｃＤＮＡクローンが提供される。この非グリコシル化ＡＧＰをコードする ｃＤＮＡの完全鎖長および部分鎖長ヌクレオチド配列が開示される。これらのｃ ＤＮＡを含有するＤＮＡ組換えベクターがまた提供される。本発明のもう一つの 態様により、植物非グリコシル化ＡＧＰをコードするゲノムＤＮＡおよびこのゲ ノムＤＮＡを含有する組換えベクターがまた提供される。本発明はまた、植物Ａ ＧＰ遺伝子の分離における、およびまた植物ＡＧＰのアミノ酸配列に基づくオリ ゴヌクレオチドプローブのハイブリド化する配列の検出における使用を包含する 。 本発明はまた、分離されたＡＧＰ蛋白質およびＡＧＰ蛋白質断片のアミノ酸配 列を提供する。ＡＧＰペプチドが、ニコチアナ アラタ、ニコチアナ プラムバ ギナホリアおよびピルス コムニスから分離された。分離されたＡＧＰペプチド 断片から得られたアミノ酸配列は、ヒドロキシプロリンに富んでいるか、または ヒドロキシプロリンに富んでいないかのどちらかである。特に、ヒドロキシプロ リン−富裕配列は、（ｉ）高含有量のヒドロキシプロリンおよび（または）（ii ）ヒドロキシプロリン、アラニン、セリンおよびスレオニンの高含有量（ＯＡＳ Ｔ−富裕）を有することを特徴としている。ＡＧＰ遺伝子の獲得に直ちに有用な 配列は、（ｉ）ヒドロキシプロリンに富んでいない配列、および（または）ヒド ロキシプロリン、アラニン、セリンおよびスレオニンに富んでいない配列（ＯＡ ＳＴが富裕ではない配列）であった。本発明の以前においては、完全植物ＡＧＰ のアミノ酸配列は公的に利用することはできなかった。ＡＧＰをコードするもの と考えられるｃＤＮＡは開示されているが、これらの場合には、これらの配列と 分離ＡＧＰからのアミノ酸配列データとの間の一致の証拠が欠落している。 本発明はまた、ＡＧＰ遺伝子のヌクレオチド配列に由来する必須アミノ酸配列 を有する実質的に純粋なＡＧＰを提供する。本発明の特定の態様によって、ニコ チアナ アラタ、ニコチアナ プラムバギナホリアおよびピルス コムニスから のＡＧＰ遺伝子のヌクレオチド配列から誘導される配列から基本的になるアミノ 酸配列を有するＡＧＰが提供される。 本発明の目的はまた、植物ＡＧＰ遺伝子を得る方法を提供することにある。こ の方法は、ＡＧＰペプチドからヒドロキシプロリンが貧弱な、すなわちＯＡＳＴ 含有量が貧弱である、断片を得る工程を包含する。このヒドロキシプロリンが貧 弱な配列を次いで使用して、例えばハイブリド化するクローンについて植物遺伝 子ライブラリイをスクリーニングするのに有用なＰＣＲ断片を得るために使用す ることができるヌクレオチドプライマーをデザインする。この手段は、一般的使 用とは相違している。通常は、ＡＧＰを特に特徴付ける配列（すなわち、ヒドロ キシプロリン富裕配列またはＯＡＳＴ含有量に富んだ配列）が、ハイブリド化す るクローンを得る手段として使用するためのオリゴヌクレオチドプライマーのデ ザインに利用されている。本発明の手段では、ＡＧＰを特に特徴付けるヒドロキ シプロリン富裕ペプチド配列は利用せず、かつまたその使用を回避し、その代わ りに、ＡＧＰの特徴的配列を含んでいない配列（すなわち、ヒドロキシプロリン −貧弱配列）をＡＧＰ遺伝子の分離に使用された。本発明の特定の態様では、ヒ ドロキシプロリンまたはＯＡＳＴ含有量に富んでいないアミノ酸配列を、Ｎ．ア ラタ、Ｎ．プラムバギナホリアおよびＰ．コムニスの花柱抽出物からまたは懸濁 培養細胞の培養濾液から分離されたＡＧＰからのペプチドから分離された。これ らの配列は、対応するｃＤＮＡクローンの分離を可能にした。 本発明はまた、ヒドロキシプロリン富裕ＡＧＰ配列を利用することによってＡ ＧＰ遺伝子を得る方法を提供する。本発明の開示以前においては、ヒドロキシプ ロリン富裕ＡＧＰ断片に関する公知知見は、対応するＡＧＰ遺伝子の分離を可能 にするものではなかった。この理由は、生成したＧＣ−富裕領域によって問題が 課せられるからである。本発明により提供される方法は、対応する遺伝子の分離 に、特定のヒドロキシプロリン富裕ＡＧＰペプチド配列の使用を可能にする。こ のヒドロキシプロリン富裕配列を使用する方法は、ライブラリイのスクリーニン グ用の一重鎖アンチセンス(antisemse)ＲＮＡプローブと組合わされている長鎖 長ゲスマー(guessmers)の使用を包含する。この長鎖長ゲスマーをＲＮＡプロー ブとともの使用することによって、短鎖長オリゴヌクレオチドプローブの使用に より生じる問題を克服することができる。長鎖長ゲスマーはまた、ミスマッチを より容易に受け入れることができ、かつまたアンチセンスＲＮＡプローブの使用 は、ＡＳＴアミノ酸に係わるアンチコドンの第三位置で使用される「Ｕ」の使用 を可能にし、これによって標的配列へのゲスマーハイブリド化の見込みが増大さ れる。生成したＲＮＡ分子は、重度に標識することができ、これは検出レベルを より大きく増大させ、かつまたＤＮＡプローブよりもその標的配列へのより強力 な結合を可能にする。 本発明はまた、ｃＤＮＡライブラリイをスクリーニングして、特定のＡＧＰ遺 伝子を分離するための、特定のＡＧＰｃＤＮＡ配列および特定のオリゴヌクレオ チドプローブ配列を提供する。一例として、特別の態様において、下記のｃＤＮ Ａクローンが提供される： 供給源 ｃＤＮＡクローン Ｎ．アラタ細胞懸濁培養物 ＮａＡＧＰ１（配列番号：２４） Ｎ．プラムバギナホリア細胞懸濁培養物 ＮｐＡＧＰ１（配列番号：２５） Ｐ．コムニス細胞懸濁培養物 ＰｃＡＧＰ２３（配列番号：４９） Ｐ．コムニス細胞懸濁培養物 ＰｃＡＧＰ９（配列番号：６６） Ｐ．コムニス細胞懸濁培養物 ＰｃＡＧＰ２（配列番号：９１） Ｎ．アラタ花柱 Ｎａ３５−１（配列番号：６３） Ｎ．アラタ花柱 ＡＧＰＮａ１ １（配列番号：７ ２） 以下に示す名称は、これらの態様のクローンに対応する遺伝子に相当する： ｃＤＮＡクローン 遺伝子 ＮａＡＧＰ１ ＡＧＰ Ｎａ１ ＮｐＡＧＰ１ ＡＧＰ Ｎｐ２ ＰｃＡＧＰ９ ＡＧＰ Ｐｃ１ ＰｃＡＧＰ２ ＡＧＰ Ｐｃ２ ＡＧＰＮａ１ １ ＡＧＰ Ｎａ１ 本発明はまた、アンチセンスＲＮＡプローブを提供し、このプローブは同一ま たは相違するＡＧＰを現わすＯＡＳＴ富裕アミノ酸配列をコードする１種または ２種以上のヌクレオチド配列を含有するようにデザインされている。本発明はま た、植物ＡＧＰのＯＡＳＴ富裕コンセンサス(consensus)配列をコードするヌク レオチドを含むＲＮＡプローブを提供する。ゲスマー−アンチセンスＲＮＡプロ ーブを用いる手段はまた、ＯＡＳＴ−貧弱ＡＧＰ配列とともに、対応するＡＧＰ 遺伝子の分離に使用することができる。 本発明の目的はまた、実質的に純粋な植物ＡＧＰまたはその断片に対する抗体 を提供し、この抗体は、植物ＡＧＰ遺伝子から誘導される完全または部分アミノ 酸配列から基本的になるものである。本発明はまた、ヒドロキシプロリンに富ん でいない分離ＡＧＰペプチドに対する抗体を提供する。本発明はまた、合成ＡＧ Ｐペプチドまたはその断片に対する抗体を提供する。 本発明はさらにまた、実質的に純粋なＡＧＰペプチド、ヒドロキシプロリンま たはＯＡＳＴ含有量に富んでいないＡＧＰペプチド断片、あるいは合成ＡＧＰペ プチドに対する抗体の、（ａ）ＡＧＰ含有混合物または組織中のＡＧＰ検出、分 離または診断における使用および（ｂ）天然の生物学的および化学的ＡＧＰ活性 の減少または抑制における使用を包含する。この点に関して、ＡＧＰまたはＡＧ Ｐペプチドに対するポリクローナルあるいはモノクローナル抗体は、脱グリコシ ル化されているか、ＡＧＰの蛋白質幹鎖を露出させるために別様に予め処理され ている、ＡＧＰ含有混合物または組織中のＡＧＰの検出、分離または診断に最も 有効である。 本発明はまた、非グリコシル化ＡＧＰが発現されるように、異種(hetrologous )プロモーターの制御下に、植物ＡＧＰ遺伝子からなる遺伝子工学操作により生 成されるＤＮＡ分子を提供する。本発明の特定の態様においては、Ｎ．アラタ、 Ｎ．プラムバギナホリアおよびＰ．コムニスから得られたＡＧＰ遺伝子を、非グ リコシル化ＡＧＰが発現されるように、宿主細胞中で異種プロモーター（例えば 、細菌、ウイルス、植物などのプロモーター）の背後に挿入する。 本発明の目的はまた、グリコシル化ＡＧＰが発現されるように、異種プロモー ターの制御下に植物ＡＧＰ遺伝子からなる遺伝子工学操作により生成されたＤＮ Ａ分子を提供することにある。例えば、本発明は、発現された非グリコシル化Ａ ＧＰを、グリコシル化性および炭水化物−蛋白質結合性酵素（例えば、プロリル ヒドロキシラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼなど）のための基質として利 用して、グリコシル化ＡＧＰを生成させることを包含する。本発明の目的はまた 、 グリコシル化ＡＧＰが発現されるように、異種プロモーターの制御下に植物ＡＧ Ｐ遺伝子からなる遺伝子工学操作により生成されたＤＮＡにより形質転換された 宿主細胞（例えば、単子葉植物、双子葉植物など）を提供する。本発明のもう一 つの目的は、非グリコシル化ＡＧＰの過剰生産（over-producing）または過少生 産(under-producing)の可能性を有する植物ＡＧＰ遺伝子−形質転換された宿主 細胞を提供することにある。本発明のさらにもう一つの目的は、発現された非グ リコシル化ＡＧＰをさらに代謝処理できる植物ＡＧＰ遺伝子−形質転換された宿 主細胞を提供することにある。 本発明はさらにまた、植物ＡＧＰプロモーターを含有する遺伝子工学操作によ り生成されたＤＮＡを提供する。本発明の特定の態様に従い、このＡＧＰプロモ ーターが、Ｎ．アラタ、Ｎ．プラムバギナホリアおよびＰ．コムニスから分離さ れた。引続いて、組換えＤＮＡ分子を遺伝子工学操作に付して、構造遺伝子が植 物ＡＧＰプロモーターの制御下に発現されるように、異種構造遺伝子に隣接して 配置されている植物ＡＧＰプロモーターを構築する。また、この遺伝子のコード 領域を、組織−特異性プロモーターの背後で（behind）で使用して、完全植物の 特定部位でＡＧＰを発現させることができる。これはまた、例えば害虫抵抗性な どの機能を果たすという観点で、表現型を変えることができる。 本発明はまた、植物沁出物、例えばアラビアゴム、グアガムなどからのその分 離に依存しないＡＧＰ供給源を提供する。ＡＧＰ含有ガムの天然供給源、例えば 樹木、根、種子、海草などの供給源の利用には、収穫量、旱魃、労働力、発酵、 分離、純度、および高価格を伴う問題が存在する。組換え遺伝子工学操作を使用 するＡＧＰの製造は、（ａ）収穫量の問題とは独立しているＡＧＰ供給方法、（ ｂ）高レベルの品質管理の可能性、（ｃ）実質的に純粋なＡＧＰ生成物の供給源 の提供、（ｄ）宿主細胞におけるＡＧＰ過剰生産の可能性、およびまた（ｅ）所 望の性質を有する特別に工作されているＡＧＰの製造に対する適合可能性、を確 実なものとする。従って、本発明は、植物ガムの更新できるが、縮小する供給源 を見出す必要もなく、アラビアゴムなどの植物ガムの機能を供給しおよび利用す る手段を提供する。これらの機能には、増粘剤、ゲル化剤、乳化剤、分散剤、懸 濁剤、安定剤、封入剤、綿状固化剤、フィルム形成剤、サイジング剤、接着剤、 結合剤および（または）コーティング剤としての、および（または）滑剤、保水 剤および凝集剤としての、広い用途が見出される。図面の簡単な説明 図１Ａおよび１Ｂは、オリゴヌクレオチドからの一重鎖アンチセンスＲＮＡプ ローブの調製に関する相違する戦略を示している。図１Ａ：一重鎖オリゴヌクレ オチドプローブ：（図Ａ１−１）２本の相補的ゲスマーが相互にアニーリングし て、Ｔ７プロモーターを含有する二重鎖構築物を形成している。（図１Ａ−２） 短鎖長プライマーがアニーリングされて、二重鎖Ｔ７プロモーター配列を形成し ている。図１Ｂ：二重鎖オリゴヌクレオチドプローブ：（図Ｂ１−１）２本の相 補的ゲスマーが、それらの３″末端部位で相補的アダプター配列を経て相互にア ニーリングされている。（図１Ｂ−２）２本の相補的ゲスマーが、それらのアダ にアニーリングされている。別のプロモーター、例えばＴ３またはＳｐ６ＲＮＡ ポリメラーゼもまた使用できる。 図１Ｃは、コマシーブルー（Coomassie blue）染色した、各種供給源からの脱 グリコシル化および非脱グリコシル化ＡＧＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルブロット分 析を示している。このＡＧＰはヤリブ(Yariv)沈殿およびトリフルオロメタンス ルホン酸（ＴＦＭＳ）による脱グリコシル化により、Ｎ．アラタ、Ｎ．プラムバ ギナホリアおよびセイヨウナシ（ピルス コムニス）の懸濁培養濾液から分離し た。この脱グリコシル化ＡＧＰおよび非脱グリコシル化ＡＧＰを、１７．５％Ｓ ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、次いでＰＶＤＦ膜上にブロットする。コマシー ブルーで染色した後に、脱グリコシル化されたＮ．アラタＡＧＰからの主要バン ド（ＭＷ２０〜３０ｋＤ、矢印で示されている）を削り取り、配列決定する。 図１Ｄは、Ｎ．アラタ細胞懸濁培養物からの脱グリコシル化ＡＧＰ幹鎖のアミ ノ酸配列に対応するＮａＡＧＰ１遺伝子のクローン化のためのＰＣＲ戦略を示し ている。ＮａＡＧＰ１のためのクローンの分離に使用されたＮａＲ１、ＮａＦ１ およびＮａＦ２プライマーの配列は、表１．１および図１Ｅに示されている。 図１Ｅは、１６０−ｂｐプライマー伸長断片のヌクレオチドおよび誘導アミノ 酸配列を示している。蛋白質微小配列決定(microsequencing)によるペプチド配 列に対応する誘導アミノ酸配列には、下線が引かれている。星印（＊）は、誘導 配列と同一である直接微小配列決定により得られたペプチドのアミノ酸を示して いる。ＡＧＰ遺伝子の３′−断片を増幅するためにデザインされている２種のオ リゴヌクレオチド（ＮａＦ１、ＮａＦ２）の配列には、二重下線が引かれている 。プライマー（ＮａＲ１）に対応するヌクレオチド配列には、下線が引かれてい る。 図１Ｆは、Ｎ．アラタ細胞懸濁培養物（ＮａＡＧＰ１）からのＮａＡＧＰ１ｃ ＤＮＡのヌクレオチドおよび予想アミノ酸配列を示している。ＰＣＲにより得ら れた、すなわちｃＤＮＡクローンと重なっていないヌクレオチド配列は、イタリ ック体で書かれている。蛋白質微小配列決定によるペプチド配列に対応する誘導 アミノ酸配列には、下線が引かれている。星印（＊）は、誘導配列と同一である 直接微小配列決定により得られたペプチドのアミノ酸を示している。予想シグナ ル配列は、下方に点下線で示されている。Ｘ＝未決定残基。 図１Ｇは、ＮａＡＧＰ１ｃＤＮＡの誘導アミノ酸配列の鍵となる構造上の特徴 をまとめて示すものである。各アミノ酸の水に対する性質を示す数値は、カイト （Kyte）およびドーリツル(Doolittle)の重量系（１９８２）に従い、９個のア ミノ酸間隔を使用して決定した。点線以上の数値は、疎水性領域を示し、そして 点線以下の数値は、親水性領域を示している。 図１Ｈは、細胞懸濁培養物（ＮｐＡＧＰ１）から誘導されたＮ．プラムバギナ ホリアＡＧＰのヌクレオチド配列および予想アミノ酸配列を示している。蛋白質 微小配列決定によるペプチド配列に対応する誘導アミノ酸配列には、下線が引か れている。星印（＊）は、誘導配列と同一である直接微小配列決定により得られ たペプチドのアミノ酸を示している。Ｏ＝ヒドロキシプロリン。 図１Ｉは、ＮａＡＧＰ１ｃＤＮＡおよびＮｐＡＧＰ１ｃＤＮＡの誘導アミノ酸 配列の配列を示している。ＮａＡＧＰ１ｃＤＮＡの誘導アミノ酸配列は上の方に で示されており、そしてＮｐＡＧＰ１ｃＤＮＡの誘導アミノ酸配列は下の方に示 されている。同一配列の残基は‘｜’で示されている。この配列を最大にする必 要がある場合には、空間を導入した。 図１Ｊは、ＮａＡＧＰ１ｃＤＮＡ配列およびＮｐＡＧＰ１ｃＤＮＡ配列の配列 を示している。ＮａＡＧＰ１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は上の方に示されてお り、そしてＮｐＡＧＰ１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は下の方に示されている。 同一配列の残基は‘｜’で示されている。この配列を最大にする必要がある場合 には、空間を導入した。 図１Ｋは、ＮａＡＧＰ１およびＮｐＡＧＰ１のノザン法分析を示している。 図１Ｋ−１：総合的(total)ＲＮＡは、Ｎ．アラタの（１）葉、（２）花粉、 （３）花柱、（４）茎、（５）花弁、（６）根および（７）懸濁培養した細胞か ら分離した。等量（１０μｇ／レーン）のＲＮＡを、ホルムアルデヒドアガロー スゲル上で分別し、ハイボンド（Hybond）−Ｎ膜に移し、次いで³²Ｐ標識したＮ ａＡＧＰ１ｃＤＮＡの各５′−プローブ（１〜５４０ｂｐ）および３′−プロー ブ（５４１〜１７００ｂｐ）とハイブリド形成した。 図１Ｋ−２：Ｎ．アラタおよびＮ．プラムバギナホリアの懸濁培養した細胞か ら分離した総合的ＲＮＡ（１０μｇ／レーン）をブロットし、次いでＮａＡＧＰ １ｃＤＮＡとハイブリド形成した。 このＲＮＡ転写のサイズは右側に示されている。 図２Ａ〜２Ｄは、ニコチアナ プラムバギナホリアの細胞懸濁培養濾液からの ＡＧＰペプチドの分離および配列決定を説明するフローチャートである。 図３Ａ〜３Ｆは、ピルス コムニスの細胞懸濁培養濾液からのＡＧＰペプチド の分離および配列決定を説明するフローチャートである。 図３Ｇは、３５０ｂｐＰＣＲ断片のヌクレオチド配列および誘導アミノ酸配列 を示している。蛋白質配列決定によるペプチド配列と一致する誘導アミノ酸配列 には、下線が引かれている。ＰｃＡ２３Ｆ２ａプライマーに対応するヌクレオチ ド配列には二重下線が引かれている。 図３Ｈは、セイヨウナシ細胞懸濁培養物からのＡＧＰ幹鎖をコードするＰｃＡ ＧＰ２３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列および予測アミノ酸配列を示している。翻 訳開始部位および停止部位は肉太文字で示されている。予測分泌シグナルには、 点下線が引かれている。２つの潜在的Ｎ−グリコシル化部位には、二重下線が引 かれている。ＡＧＰ蛋白質幹鎖から得られたペプチド配列とマッチする配列には 、下線が引かれている。蛋白質配列決定により同定されたヒドロキシル化される プロリン残基は、下部の“Ｏ”により示されている。 図４Ａ〜４Ｃは、ニコチアナ アラタの花柱抽出物からのＡＧＰペプチドの分 離および配列決定を説明するフローチャートである。 図４Ｄは、Ｎａ３５−１遺伝子のクローン化戦略を示している。 図４Ｅは、ＲＴ３５−特異性プライマーおよび予測アミノ酸配列を使用するこ とによるＰＣＲ断片のヌクレオチド配列を示している。蛋白質微小配列決定によ るペプチド配列に対応する誘導アミノ酸配列には、下線が引かれている。ＲＴ３ ５特異性プライマーには、二重下線が引かれている。 図４Ｆは、ＮＡ３５−１ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列および予測アミ ノ酸配列を示している。蛋白質微小配列決定によるペプチド配列に対応する誘導 アミノ酸配列には、下線が引かれている。 図４Ｇは、Ｎ．アラタの種々の部分におけるＮＡ３５−１遺伝子発現のノザン 法分析結果を示している。Ｎ．アラタ花柱からの（Ｓ₂Ｓ₂、Ｓ₃Ｓ₃、Ｓ₆Ｓ₆：そ れぞれ１０μg）、葉からの（Ｓ₆Ｓ₆、１０μg）、茎からの（Ｓ₆Ｓ₆、１０μg ）および根からの（Ｓ₆Ｓ₆、６．３μg）、総合的ＲＮＡはホルムアルデヒドア ガロースゲル上で分別し、ナイロン膜に移し、次いで³²Ｐ標識したＮＡ３５−１ プローブとハイブリド化した。このＲＮＡ転写産物の大きさは、キロ単位ヌクレ オチドで示されている。 図４Ｈは、各種懸濁培養細胞および植物におけるＮＡ３５−１遺伝子発現のノ ザン法分析結果を示している。Ｎ．アラタおよびＮ．プラムバギナホリアの懸濁 培養細胞、ピルスおよびＮ．アラタ（Ｓ₆Ｓ₆）およびＬ．ペルビアナムの花柱か ら分離した総合的ＲＮＡ（１０μg／レーン）をブロットし、次いでＮＡ３５− １プローブとハイブリド形成した。このＲＮＡ転写産物の大きさは、キロ単位ヌ クレオチドで示されている。 図４Ｉは、ＲＴ２５蛋白質幹鎖のテルモリシン分解生成物の逆相ＨＰＬＣ（Ｒ Ｐ−ＨＰＬＣ）分離を示している。ＲＴ２５蛋白質幹鎖（５〜１０μg）をテル モリシンにより消化し、次いで０．１％ＴＦＡ中において１ml／分で平衡にした ＲＰ−３００カラム（２．１×１００mm、Ｃ８、ＡＢＴ）上に配置した。未結合 物質を採取し、次いで結合物質を直線勾配（０．１％ＴＦＡ中の０〜６０％アセ トニトリル；６０分；１００μl／分）で溶離した。このカラムから溶離された ペプチド（Ｐ１〜６）をＡ_215nmで追跡した。４０分間の保有時間の後に、テル モリシンを溶離した。各ペプチドをアミノ酸配列決定に付した。 図４Ｊは、ＲＴ２５蛋白質幹鎖のエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ分解生成物 の逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）分離を示している。ＲＴ２５蛋白質幹鎖をエ ンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎにより消化した。生成するペプチドを次いで、０ ．１％ＴＦＡ中において１ml／分で平衡にしたＲＰ−３００カラム（２．１×１ ００mm、Ｃ８、ＡＢＩ）上に配置した。未結合物質を採取し、次いで結合物質を 直線勾配（０．１％ＴＦＡ中の０〜６０％アセトニトリル；６０分；１００μl ／分）で溶離した。このカラムから溶離されたペプチドをＡ_215nmで追跡した。 ペプチドＡ１およびＡ２をアミノ酸配列決定に付した。未消化出発材料（ＲＴ２ ５）がまた検出された。 図４Ｋは、ＡＧＰＮａ１ １ｃＤＮＡのヌクレオチド配列および予測アミノ酸 配列（配列番号：７２）を示している。推定分泌シグナル（secretion signal） （点下線）は、ホンヘイジン（Von Heijne）により開示された方法[Nucl．Acids Res.，１４：４６８３〜４６９０（１９８６）]に基づき、ＰＳＩＧＮＡＬプロ グラム(ＰＣ／遺伝子ソフトウエア、IntelliGenetics)を用いて予測した。アミ ノ酸配列からの内部ペプチド配列は、立体下線で示されており、Ｈｙｐは丸囲み により示されている。ダッシュ（−）は、停止コドンを示している。 図４Ｌは、ＡＧＰＮａ１ １ｃＤＮＡからの予測アミノ酸配列の水に対する性 質（hydropathy）のグラフである。この予測アミノ酸配列の疎水度は、カイト（ Kyte）およびドーリツル(Doolittle)により開発された方法［J．Mol．Biol.，１ ５７：１０５〜１３２（１９８２）］に基づき、ＳＯＡＰプログラム(ＰＣ／遺 伝子ソフトウエア、IntelliGenetics)により計算した。推定分泌シグナル（影に より表示）は、ホンヘイジン（Von Heijne）により開示された方法［上記刊行物 （１９８６）］に基づき、ＰＳＩＧＮＡＬプログラム(ＰＣ／遺伝子ソフトウエ ア、IntelliGenetics)を用いて予測した。。 図４Ｍは、Ｎ．アラタおよびその他の植物におけるＡＧＰＮａ１ １の発現の ＲＮＡブロット分析結果を示している。Ｎ．アラタの花柱、子房、花弁、葯、茎 、葉および根の組織（遺伝子型：Ｓ₆Ｓ₆）（図４Ｍ−１）およびＮ．アラタ、 Ｎ．シルベストリス(N．sylvestris)、Ｎ．タバカム（N．tabacum）、Ｎ．グラ ウカ(N．glauca)、Ｌ．ペルビアナム(L．peruvianum)の花柱（図４Ｍ−２）およ びアラビドプシス(Arabidopsis)およびライグラスの葉から分離した総合的ＲＮ Ａ（１０μg／レーン）を、２％アガロースゲル（１５％ホルムアルデヒド；４ ０mM ＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ７．０）上に流し、次いでハイボンド−Ｎナイロン 膜（Amersham）上にブロットした。ＡＧＰＮａ１ １ｃＤＮＡ断片には、³²Ｐ− ｄＣＴＰにより１０⁸cpm／μgまで標識した。ハイブリド形成は、０．２２Ｍ ＮａＣｌ、１５mM ＮａＨ₂ＰＯ₄、１．５mM ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ、１％ Ｂ ＬＯＴＴＯおよび４mg／mlニシン精子ＤＮＡ中で一夜にわたり６０℃で行った。 この膜を室温で、２×１０分間、２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳで；６０℃で２×１０ 分間、２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳで、洗浄した。 図４Ｎは、種々の精製段階におけるＮ．アラタ花柱ＡＧＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥ 分析結果を示している。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ゲル）に引続いて、銀染色（ 図４Ｎ−１）およびβ−グルコシル ヤリブ試薬染色（図４Ｎ−２）を行った。 レーン１：総花柱抽出液（１μg ＡＧＰ）、レーン２：９５％(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄− 上清（４μg ＡＧＰ）、レーン３：モノＱ−結合ＡＧＰ含有フラクション（４μ g ＡＧＰ）、レーン４：セファロース６ＡＧＰ含有フラクション（４μg ＡＧＰ ）、レーン５：レーン３と同様であるが、２０μg ＡＧＰを含有する、レーン６ ：レーン４と同様であるが、２０μg ＡＧＰを含有する。蛋白質分子量マーカー （Ｍ）は、左側に示されている。 図４Ｏは、Ｎ．アラタの花柱からのＡＧＰの、分別処理中の、交差電気泳動の 結果を示している。粗製花柱抽出液からのＡＧＰ（図４Ｏ−１）、９５％(ＮＨ₄ )₂ＳＯ₄−上清（図４Ｏ−２）、モノＱ−結合ＡＧＰ含有フラクション（図４Ｏ −３）およびモノＱ−結合フラクション（図４Ｏ−４）を先ず、１％アガロース ゲル中で平行電気泳動に付し、次いでβ−グルコシル ヤリブ試薬含有ゲル中で 垂直電気泳動に付した。 図５Ａは、ピルス コムニス細胞からのＡＧＰの蛋白質幹鎖をコードするＰｃ ＡＧＰ９のヌクレオチド配列および予測アミノ酸配列を示している。推定分泌ペ プチドには、点下線が引かれている。蛋白質配列決定により得られたペプチ ド配列とマッチする配列には、下線が引かれている。後−翻訳によりヒドロキシ プロリンに変換されるプロリン残基は、下方に“Ｏ”で示されている。Ｘ＝未決 定残基。 図５Ｂは、ＰｃＡＧＰ９遺伝子のノザン法分析結果を示している。（図５Ｂ− １）総合的ＲＮＡは、ピルス コムニスの肉茎（１）および培養細胞（２）；ニ コチアナ プラムバギナホリアの培養細胞（３）；ブラシカ ナプス(Brassica napus）の芽（４）；アラビドプシス タリアナ（Arabidopsis thaliana）の芽 （５）およびリコペルシコン エスクレンタム(Lycopersicon esculentum)の芽 （６）、ならびにロリウム テムレンタム(Lolium temulentum)の葉（７）から 分離した。等量（１０μg／レーン）のＲＮＡをホルムアルデヒドアガロースゲ ル上で分別し、ハイボンド−Ｎ膜上に移し、次いで³²Ｐ−標識したＰｃＡＧＰ９ ｃＤＮＡと５５℃でハイブリド化した。最終洗浄は、５５℃で３０分間、１×Ｓ ＳＣ＋０．１％ＳＤＳにより行った。（図５Ｂ−２）同一ＲＮＡブロットをハイ ブリド化し、次いでより強い緊縮の下に洗浄した（６５℃）。ピルス コムニス 培養細胞におけるＰｃＡＧＰ９ＲＮＡ転写産物のサイズは、左側に示されている 。 図５Ｃは、ＰｃＡＧＰ９の予測アミノ酸配列（配列番号：６６）の水に対する 性質を示すグラフである。各アミノ酸の水に対する性質を示す数値は、カイトお よびドーリツルの方法に従い［KyteおよびDoolittleによる上記刊行物（１９８ ２）］、５〜１５個のアミノ酸間隔を使用して決定した。点線以上の数値は、疎 水性領域を示し、そして点線以下の数値は親水性領域を示している。 図５Ｄは、ピルス コムニス（セイヨウナシ）細胞懸濁培養物からのＡＧＰの 分離およびそれらの蛋白質幹鎖の分離を示すフローチャートである。 Ａ．β−グルコシルヤリブ試薬による沈殿により調製されたＡＧＰのＲＰ−Ｈ ＰＬＣ（ＲＰ−３００カラム、４．６×１００mm）プロフィール。ＡＧＰを付加 し、次いでカラムを溶剤（Ｈ₂Ｏ中０．１％ＴＦＡ）により洗浄した。未結合フ ラクションを採取した（図示されていない）。結合物質を、直線勾配で洗浄した （０〜１００％溶剤Ｂ；流動速度１ml／分；６０分間）（溶剤Ｂ：溶剤Ａ中の６ ０％アセトニトリル）。５回の分離操作からのフラクションを集め、引続いて精 製した。 Ｂ．Ａに示されている主要結合ピークからのＡＧＰのＲＰ−ＨＰＬＣ（ＲＰ− ３００カラム、４．６×１００mm）プロフィール（保有時間：５．０〜１０．５ ７分）。結合した物質を浅い勾配で溶離した（０．１５％溶剤Ｂ；流動速度：１ ml／分；６０分間）。２つのフラクション（１および２）を別々に採取し、次い でサイズ排除ＦＰＬＣに付した。 Ｃ．Ａからの未結合フラクションおよびＢからの２つの溶離フラクション中の ＡＧＰのセファロース−６ＦＰＬＣプロフィール。試料は、２５％アセトニトリ ル、０．２Ｍ ＫＣｌ、５mM ＫＨ₂ＰＯ₄（流動速度：０．４ml／分）中で溶離 した。未結合フラクションおよびフラクション１は単一のピークを示した。フラ クション２は、２つのピークに分離していた（ピーク２Ａおよび２Ｂ）。 Ｄ．ＣのＡＧＰからＨＦ脱グリコシル化により誘導された蛋白質幹鎖のセファ デックス−７５ＦＰＬＣプロフィール。試料は、Ｃで使用された緩衝液と同一の 緩衝液中に溶離した（流動速度：０．８ml／分）。この蛋白質のサイズは、標準 蛋白質マーカー(Pharmacia)から推定した。 ｘ軸は保有時間（分）である。ペプチド配列を得たＡＧＰフラクションの精製 経路は、点画で示されている。 図５Ｅは、Ｐ．コムニスの懸濁培養細胞からの推定ＡＧＰ幹鎖をコードするＰ ｃＡＧＰ２ｃＤＮＡ（配列番号：９１）のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列 を示している。翻訳開始部位および停止部位は、肉太文字で示されている。予測 分泌シグナルは、点下線で示されている。２つの長い直接反復は、二重下線で示 されている。ＡＧＰ蛋白質幹鎖から得られたペプチド配列とマッチする配列には 、下線が引かれている。Ｈｙｐに変換されるプロリン残基は、“Ｏ”で示されて いる。発明の詳細な説明 下記の詳細な説明は、本明細書および請求の範囲におけるそれらの使用の意図 または範囲を明確にするものである。 本明細書で使用されているものとして、「アラビノガラクタン蛋白質」または 「ＡＧＰ」の用語は、ヤリブ試薬−沈殿性のグリコシル化分子であって、その蛋 白質成分が代表的に、この分子の分子量の約２〜１０％に相当し［ただし、この 範囲以外の蛋白質量を有するＡＧＰも公知である（Anderson等による上記刊行物 （１９７９））］、かつまたその炭水化物が通常、分子の大部分を占めている分 子を意味する。ガラクトースおよびアラビノースは、主要炭水化物成分を構成し ており、小割合の成分として、その他の単糖類およびウロン酸を含有する。その ガラクトシル残基は、組織化されてＣ（０）６を経る分枝を有する３−架橋ガラ クトースの幹鎖を形成している；そのアラビノシル残基は主として、末端位置に 存在する。詳細には、ＡＧＰは赤色複合体としてβ−グリコシル−ヤリブ試薬に 結合し、この試薬により沈殿する。ＡＧＰは通常、ヒドロキシプロリン、アラニ ン、セリンおよびスレオニンに富む領域（１ヶ所または数ヶ所）からなる。 本明細書で使用されているものとして、「ヤリブ(Yariv)試薬−沈殿性」の用 語は、β−グリコシル−ヤリブ試薬により沈殿する可能性を有するＡＧＰを意味 する。 本明細書で使用されているものとして、「生のＡＧＰ」（native ＡＧＰ）の 用語は、その天然の状態、すなわちグリコシル化されているＡＧＰを意味する。 本明細書で使用されているものとして、「グリコシル化ＡＧＰ」の用語は、蛋 白質骨格または幹鎖に結合した炭水化物からなるＡＧＰ分子を意味する。 本明細書で使用されているものとして、「脱グリコシル化ＡＧＰ」の用語は、 炭水化物の除去処理に付されており、その結果として、減少しているが、種々の 炭水化物含有量を有する生のＡＧＰまたはグリコシル化ＡＧＰを意味する。 本明細書で使用されているものとして、「非グリコシル化ＡＧＰ」または「非 グリコシル化ＡＧＰ幹鎖」の用語は、グリコシル化されていないＡＧＰ分子の蛋 白質骨格または幹鎖を意味する。 本明細書で使用されているものとして、「合成ＡＧＰ」の用語は、化学的に合 成されたＡＧＰ分子を意味する。 本明細書で使用されているものとして、「合成非グリコシル化ＡＧＰ」の用語 は、化学的に合成されたＡＧＰのペプチド幹鎖を意味する。 本明細書で使用されているものとして、「ヒドロキシプロリンに富んでいる」 または「ヒドロキシプロリンに富んだ」または「ヒドロキシプロリン−富裕」の 用語は、１５％より多い、通常約５０％またはそれ以上のヒドロキシプロリン含 有量を有するアミノ酸配列の領域または区域もしくは区分を意味する。 本明細書で使用されているものとして、「ＯＡＳＴに富んでいる」または「高 含有量のヒドロキシプロリン、アラニン、セリンおよびスレオニン」または「Ｏ ＡＳＴ含有量に富んでいる」の用語は、ヒドロキシプロリン、アラニン、セリン およびスレオニン残基の合計が、総アミノ酸残基の少なくとも約３５％、好まし くは少なくとも約６０％を構成しているアミノ酸配列の領域を意味する。 本明細書で使用されているものとして、「ヒドロキシプロリン−貧弱」または 「ヒドロキシプロリンに富んでいない」の用語は、好ましくは１５％より少ない 、さらに好ましくは１０％より少ない、最も好ましくは５％よりも少ないヒドロ キシプロリン含有量を有するペプチド配列の区域または領域を意味する。「ヒド ロキシプロリン−貧弱」領域はまた、好ましくは５０％より少ない、さらに好ま しくは３５％より少ない、最も好ましくは２０％より少ない、ＯＡＳＴ含有量を 有することができる。 本明細書で使用されているものとして、「特徴付け配列」または「ＡＧＰを特 徴付ける配列」の用語は、ＯＡＳＴ含有量に富んでいる配列および（または）ヒ ドロキシプロリンに富んでいる配列を意味する。 本明細書で使用されているものとして、「ゲスマー」(guessmer)の用語は、各 位置に可能なコドンのサブセットのみを含有するオリゴヌクレオチドを意味する 。ゲスマーの用語は、当業界で慣用であり、Molecular Cloning，A Laboratory Manual，J．Sambrook，E．F．FritshおよびT．Maniatis，２版、Cold Spring Ha rbor Laboratory Press,１９８９，１１．１１〜１１．１６頁に充分に説明され ている。かなりの場合に、ゲスマーは、化学的に合成された一重鎖オリゴヌクレ オチドであり、３０〜７０ヌクレオチド長さを有し、かつまた真性遺伝子にほと んどマッチするコドンの組合わせを含有する。 本明細書で使用されているものとして、「アンチセンスＲＮＡプローブ」（an tisense ＲＮＡ probe）の用語は、所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ鋳型 から生成されたＲＮＡ鎖を意味する。このＲＮＡのヌクレオチド配列は、ＤＮＡ 鋳型配列のコード鎖に対して相補性である。 本明細書で使用されているものとして、「実質的に純粋」の用語は、天然では 付随する別種の蛋白質を実質的に含有していない蛋白質を意味する。 本明細書で説明されている、Ｎ．アラタ、Ｎ．プラムバギナホリアおよびＰ． コムニス懸濁培養物およびＮ．アラタ花柱からのＡＧＰ遺伝子の分離は、本発明 の例であり、本発明はまた、植物細胞からのＡＧＰペプチドの領域のアミノ酸配 列の、対応する植物ＡＧＰ遺伝子の分離における使用を包含する。ＡＧＰペプチ ドの全部の領域または区域が、ＡＧＰ遺伝子の分離に利用できるオリゴヌクレオ チドの生成に使用できるわけではない。ＡＧＰ遺伝子は、２種の相違する戦略を 使用することによって成功裏に分離することができる。 （Ａ）対応するＡＧＰ遺伝子を得るためのプライマー鋳型としてのヒドロキシ プロリン−富裕配列の使用、および （Ｂ）そのゲスマーが、ヒドロキシプロリン−富裕区分をコードするヌクレオ チド配列を含有し、それによってヒドロキシプロリン−富裕区分の配列をコード するＡＧＰ遺伝子を得ることができる、ゲスマー−アンチセンスＲＮＡプローブ 手段の使用。 戦略Ａにおいて、好適配列はヒドロキシプロリン含有量が低いか、またはヒド ロキシプロリンが欠失している配列である。ヒドロキシプロリン−貧弱配列は、 ＡＧＰペプチドの末端領域およびまた先頭領域に見出される。合成オリゴペプチ ドプライマーの合成に選択されるＡＧＰペプチドの配列またはその断片は、低ヒ ドロキシプロリン、アラニン、セリンおよびスレオニン（ＯＡＳＴ）含有量を有 するとまた好ましい。これら４種のアミノ酸残基の合計含有量が、全アミノ酸残 基の５０％より少ない、さらに好ましくは３５％より少ない、最も好ましくは２ ０％より少ないと、特に好ましい。ＰＣＲ技術を使用するＡＧＰ遺伝子の分離に 有用なＡＧＰ配列、すなわちヒドロキシプロリン−貧弱配列、あるいはＯＡＳＴ −貧弱配列は、従来技術では利用することはできない。オリゴヌクレオチドプラ イマー合成用の鋳型として選択されるアミノ酸配列は、濃厚「ＧＣ−富裕」領域 を有するＰＣＲ縮重プライマー(degenerate primer)を与えるものであるべきで はない。濃厚「ＧＣ−富裕」配列を有するプライマーは、ＰＣＲ技術によってｃ ＤＮＡを得ようとする試みを失敗させ、無駄に終らせることがある。例えば、当 業界で公表されているＡＧＰペプチド断片には、下記の断片がある： ニンジンから（Jermynによる上記刊行物、１９８５）^* ライグラス、ロリウム マルチフロラム（Lolium multiflorum）から(Gleeson 等による上記刊行物、１９８９）^* およびバラから（Komalavilas等による上記刊行物、１９９０） カッコ内の残基は、未確認残基を示す。Ｘ＝未決定残基。 ニンジン、ライグラスおよびバラからのＡＧＰペプチド断片のこれらのアミノ 酸配列は当業界で公知であるけれども、これらのペプチド断片に対応するＡＧＰ 遺伝子は当業界でいまだに知られていない。これら従来公知の植物ＡＧＰペプチ ド断片は全部が、高含有量でヒドロキシプロリン、アラニン、セリンおよびスレ オニンを含有することを特徴とするアミノ酸配列を有する。これらのアミノ酸部 分配列は、ＧＣ−富裕オリゴヌクレオチドプライマーをもたらす。この理由から 今日まで、これらの配列から直接に、ＡＧＰｃＤＮＡを得ることは成功していな い。 初期に、分離ＡＧＰ断片から得られたヒドロキシプロリン富裕配列を使用して 植物ＡＧＰ遺伝子を得ようとする試みがなされた。下記の配列が使用されたが、 成功しなかった： Ｎ．アラタＡＧＰおよびＮ．プラムバギナホリアＡＧＰの両方に見出される配 列（ｉ）、（ii）および(iii)をそれぞれ、Ｎ．アラタおよびＮ．プラムバギナ ホリアの両方で使用して、ＡＧＰ遺伝子を分離することができる。配列（iv）は 、Ｐ．コムニスからＡＧＰ遺伝子を得るために使用した。これらの配列の中で、 主としてＤＮＡハイブリド形成に基づく方法による対応する遺伝子の分離を導く ものはなかった。これらの配列は全て、格別に冗長なかつまた非常にＧＣに富ん だ（ある場合には、８０％以上）オリゴヌクレオチドプライマーをもたらす。従 って、格別に厳格にしても、配列決定に際して、アミノ酸配列に無関係のハイブ リド形成バンドが得られるという問題が明らかになった。上記配列を検討すると 、これらの４種の配列の全部が、ＯＡＳＴに富んでいることを見ることができる 、すなわちこれらの含有量は、それぞれ（ｉ）５０％、（ii）８５．７％、(iii )６４．３％および（iv）８４．２％である。（本発明の別の態様において、こ れらの配列は実際に、別のハイブリド形成原理に基づく方法による対応する遺伝 子の検出および分離に利用できることが認められる）。 本発明は、この問題を克服する。従来技術で分離されていた植物ＡＧＰが独占 的に、ヒドロキシプロリンまたはＯＡＳＴを高含有量で有するペプチド断片によ ることを特徴としていたのに対して（すなわち、ヒドロキシプロリンまたはＯＡ ＳＴを低含有量で含有するＡＧＰ配列は利用できなかった）、本発明により分離 され、開示されたＡＧＰは、ヒドロキシプロリンに富んでいるペプチド断片によ るばかりでなく、またヒドロキシプロリンが欠失していない場合には、ヒドロキ シプロリンが貧弱であるペプチド断片によることを特徴とするものである。ヒド ロキシプロリンが富裕ではないＡＧＰペプチド断片が分離され、配列決定された こと、およびまたヒドロキシプロリン、アラニン、セリンおよびスレオニン含有 量がまた低い、この配列が縮重プライマーの合成に利用されたことによって、Ｇ Ｃ−富裕プライマーが付随する問題の解消が可能になり、かつまた対応するＡＧ ＰｃＤＮＡの分離を導いた。 分離された植物ＡＧＰのＮ−末端領域を使用して、対応する植物ＡＧＰ遺伝子 を得ることができる。本発明の特定の態様において、Ｎ．アラタ懸濁培養から得 られたＡＧＰペプチドのＮ−末端領域は、ヒドロキシプロリンが貧弱な領域を包 含していた。このＮ−末端ペプチド配列、Ａ−Ｋ−Ｓ−Ｋ−Ｆ−Ｍ−Ｉ−Ｉ−Ｐ −Ａ−Ｓ−Ｘ−Ｔ−Ｘ−Ａ（配列番号：１１）を、オリゴヌクレオチドプライマ ーの合成に、鋳型として利用した。このプライマーをまた、Ｎ．アラタおよびＮ ．プラムバギナホリアの両方からのハイブリド化するＡＧＰ遺伝子の分離に利用 した。 本発明のもう一つの態様において、Ｐ．コムニス懸濁培養物からのおよびＮ． アラタ花柱からの、ＡＧＰの内部領域からのヒドロキシプロリン−貧弱配列を使 用して、対応するＡＧＰ遺伝子を得た。一例として、Ｐ．コムニスの場合に、Ｐ ｃＡＧＰ２３遺伝子（配列番号：４９）によりコードされるＡＧＰ幹鎖は、その 末端領域でばかりでなく、また内部領域でもヒドロキシプロリンが貧弱である。 この内部配列（配列番号：４１）を使用して、セイヨウナシＡＧＰ遺伝子を得た 。同様に、Ｎａ３５−１ｃＤＮＡクローンによりコードされるＮ．アラタ花柱Ａ ＧＰ幹鎖の場合に（図４Ｆ）、そのＮ−末端領域および内部領域は、低いヒドロ キシプロリン含有量を有し、この内部領域（配列番号：５８）を使用して、Ｎ． アラタ花柱ＡＧＰ遺伝子を得た。 植物ＡＧＰ遺伝子を得るための、この基本手段（戦略Ａ）は、Ｎ．アラタ、Ｎ ．プラムバギナホリアおよびＰ．コムニスの細胞懸濁培養物からの、ならびにＮ ．アラタ花柱からのＡＧＰ遺伝子の分離を成功させることができた。各場合に、 ｃＤＮＡクローンは、ヒドロキシプロリン−貧弱領域およびヒドロキシプロリン −富裕領域（ＯＡＳＴに富んだ領域）を含有する誘導アミノ酸配列からなる。 戦略Ｂにおいて、対応する遺伝子の分離に特定のＯＡＳＴ−富裕ＡＧＰペプチ ド配列の使用を可能にする方法が提供された。この方法は、所望の特定のＯＡＳ Ｔ−富裕ＡＧＰペプチド配列をコードする一重鎖長ゲスマー（single long gues smer）（各位置に可能なコドンのサブセットのみを含有するオリゴヌクレオチド ）から調製されたＲＮＡプローブを用いるライブラリイのスクリーニングを包含 する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドからＲＮＡプローブを調製するためには、バク テリオファージ プロモーター（例えば、Ｔ７またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ プロモーター）を、このオリゴヌクレオチドの５′−末端に結合させる。さらに 、一重鎖である、このオリゴヌクレオチドは、部分的に、または完全に、二重鎖 ＤＮＡ断片に変換しなければならない。この理由は、Ｔ７（またはＴ３）ＲＮＡ ポリメラーゼは、一重鎖プロモーター配列を認識することができないからである 。ＤＮＡ鋳型からＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブのどちらかを得るための 関連方法は、当業界で公知である［BergerおよびKimmelによるMethods in Enzym ology,１５２（１９８７）］。 図１Ａには、一重鎖（図１Ａ）または二重鎖（図１Ｂ）オリゴヌクレオチドプ ローブの使用を包含するＲＮＡプローブ調製のための、数種の経路が模式図とし て示されている。例えば、図１Ａ−１では、所望のＡＧＰペプチドをコードする ゲスマーに対して相補性である第二のオリゴヌクレオチドを合成し、これら２つ のオリゴヌクレオチドをアニーリングして、二重鎖ＤＮＡを形成する。別法とし て、図１Ａ−２に示されているように、短い相補性プライマーをゲスマーのプロ モーター配列にアニーリングして、二重鎖ＲＮＡポリメラーゼ プロモーター配 列を形成する。二重鎖オリゴヌクレオチド プローブ手段を使用し（図１Ｂ−１ ）、このゲスマー（オリゴヌクレオチド１）の３′−末端にアダプター配列（１ ５〜１８ｂｐ長さ）を付加し、次いで相違するＯＡＳＴ−富裕ＡＧＰペプチド配 列をコードし、第一のオリゴヌクレオチドのアダプターに対して相補性のアダプ ター配列を有する、第二のゲスマー（オリゴヌクレオチド２）を合成する。これ ら２種のゲスマーを、それらの相補性アダプター配列を経てアニーリングし、次 いでこの突出している一重鎖領域を、プライマー伸長により満たして、二重鎖Ｄ ＮＡ断片を生成させる。図１Ｂ−２はまた、アダプター配列がメデイエーター ＤＮＡの反対の鎖に結合されるように、このアダプター配列をデザインする。こ れによって、ＰＣＲ反応により、これら２種のゲスマーを一緒に結合させること ができ、二重鎖ＤＮＡ断片を形成することができる。 一重鎖ＲＮＡプローブは、ライブラリイのスクリーニング用のＤＮＡプローブ よりも優れている。ＲＮＡプローブは、特異活性をさらに高めるために、かつま た標的ＤＮＡにさらに緊密に結合させるために、標識することができ、これによ りハイブリド形成反応における強力なシグナルを生じさせることができる。ＲＮ Ａを含有するハイブリドのより大きい安定性は、より高いハイブリド形成緊縮(h igher hybredization stringency)の使用を可能にし、従ってハイブリド形成特 異性を増大させることができる。ハイブリド形成されないＲＮＡプローブは、Ｒ Ｎアーゼにより除去することができ、これにより背景がさらに減少される。 短い縮重オリゴヌクレオチドよりも、一重鎖長ゲスマー（４０〜７０ｂｐ）を 使用することによって、ＯＡＳＴ−富裕ＡＧＰペプチド配列に付随する大きすぎ る縮重を回避することができる。長鎖オリゴヌクレオチドにより形成されるハイ ブリドの安定性を増加するためには、ゲスマーが４０ｂｐよりも長いと好ましく 、これによりミスマッチの有害な作用を補うことができる。Ｐｒｏ（Ｈｙｐ）、 Ａｌａ、Ｔｈｒ、およびＳｅｒには、アンチコドンＧＧＵ、ＣＧＵ、ＵＧＵおよ びＡＧＵをそれぞれ使用すべきである。これは、ヌクレオチド塩基“Ａ”が、Ｐ ｒｏ、ＡｌａおよびＴｈｒのためのコドンの第三の位置で塩基を好むという考察 に基づいている。ヌクレオチド塩基“Ｕ”が“Ａ”と対をなすばかりでなく、ま た“Ｇ”とも同一程度に対をなすという別の考察があり、従って例えば、ＧＧＵ はプロリン残基に係わりＣＣＡまたはＣＣＧと対をなすことができる。従って、 ライブラリイのスクリーニングに、センスＲＮＡプローブよりも、アンチセンス ＲＮＡが使用されるものと考えられる。 ＡＧＰペプチドは、ヤリブ試薬（ヤリブにより１９６７年に開示された赤色染 料、β−グルコシル試薬）による沈殿によって、植物細胞懸濁液から分離した。 この染料は、ジアゾ化した４−アミノフェニルグルコピラノシドをフロログルシ ノールにカプリングさせることによって調製される。この試薬を使用して、ＡＧ Ｐを沈殿させた。懸濁培養細胞からのＡＧＰは、培養培地から、またはバイ オポリマー（Biopolymer）生成物（細胞懸濁培養濾液から４倍量のエタノールを 用いて沈殿させた高分子量物質）から、ＡＧＰを沈殿させることにより製造した 。ヤリブ試薬に依存しない分離方法を使用することにより、植物細胞からまた、 ＡＧＰが得られた。（ヤリブ試薬は、ＡＧＰ含有フラクションを同定するための 後の分離法で使用した）。Ｎ．アラタ花柱からのＡＧＰは、(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄沈殿 およびモノＱ(Pharmacia)アニオン交換クロマトグラフイによるＡＧＰ含有上清 の引続く分別により製造した。別の方法では、ＡＧＰを先ず、Ｊ５３９ミエロー マ抗体（Ｇａｌ１−６βＧａｌ配列に対して特異性）を使用するイムノアフィニ ティクロマトグラフイにより分別した。 当業界で公知であるように、ＡＧＰは、数種の方法により単離することができ 、この方法には、例えばガラクトース結合性蛋白質を用いるアフィニティクロマ トグラフイ、古典的クロマトグラフイ、例えばゲル濾過、イオン−交換など、お よびまた選択的試薬、例えばヤリブ試薬、レクチン（例えば、これらに制限され ないものとして、トリダクニン、落花生アグルチニン、リシヌス コムニス［Ri cinus communis］レクチン（ＲＣＡ₁₂₀）およびミエローマ蛋白質Ｊ５３９［Cla rke等によるPhytochemistry，１８：５２１〜５４０（１９７９）;Fincher等に よるAnn．Rev．Plant Physiol．，３４：５８（１９８３）］を包含するガラク トシル残基に結合するレクチン類）あるいは特定の炭水化物エピトープに対する 抗体［Pennell等によるJ．Cell Biol.，１０８：１９６７〜１９７７（１９８９ ）およびNorman等によるPlanta，１８１：３６５〜３７３（１９９０）］による 沈殿が包含される。 ＡＧＰフラクションは、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳ）で処理す ることによって、または無水フッ化水素（ＨＦ）で処理することによって、脱グ リコシル化した。さらに、公知の蛋白質と炭水化物とを相互に分離する別法も本 発明に包含される［Jermyn等によるAust．J．Plant Physiol.，２：５０１（１ ９７５）参照］。ＡＧＰとＡＧＰ断片、グリコシル化または脱グリコシル化ＡＧ Ｐとグリコシル化または脱グリコシル化ＡＧＰ断片とは、公知の分離技術、例え ばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ逆相クロマトグラフイなどにより分離した。或る 場合には、これらのペプチドをさらに、分離前に、テルモリシン消化により断片 化した。ＨＰＬＣ逆相およびイオン−交換から得られた、分離したペプチドを直 接配列決定に付した。しかしながら、或る場合には、分離したペプチドを、アミ ノ酸配列決定用のＰＶＤＦ膜に移した［Ward等によるElectrophoresis，１１： ８８３〜８９１（１９９０）］。テルモリシンの代わりに、またはテルモリシン に加えて、別の公知プロテアーゼも、本発明に従い使用することができる。同様 に、本発明は、純粋ペプチド試料調製に係わるアミノ酸配列決定用の当業界で公 知のその他の技術の使用も包含する。 試験した各供給源から、多数のＡＧＰ幹鎖が見出された。これらの多数の幹鎖 は、そのＡＧＰが先ず分離され、次いでそれぞれ脱グリコシル化されたものであ るか、あるいは完全ＡＧＰ調製物が先ず脱グリコシル化され、次いで各ペプチド に分離されたものであるかにかかわらず、再現性をもって得られる。 本発明の特定の態様において、生の総合的ＡＧＰを、Ｎ．アラタの懸濁培養濾 液からヤリブ沈殿させ、次いでＴＦＭＳを用いて脱グリコシル化することによっ て分離した。主要バンド（ＭＷ：２０〜３０ｋＤ；図１Ｃ）を削り取り、次いで 配列決定した。Ｎ−末端ペプチド配列Ａ−Ｋ−Ｓ−Ｋ−Ｆ−Ｍ−Ｉ−Ｉ−Ｐ−Ａ −Ｓ−Ｘ−Ｔ−Ｘ−Ａ（配列番号：１１）が得られた。 本発明の特定の態様において、Ｎ．アラタＡＧＰのＮ−末端ペプチド配列（配 列番号：１１）を使用して、Ｎ．アラタおよびＮ．プラムバギナホリア ライブ ラリイからＡＧＰ遺伝子を分離した（図１Ｄ）。ＡＧＰのＮ−末端アミノ酸配列 の一部、すなわちＫ−Ｆ−Ｍ−Ｉ−Ｉ−Ｐに対応する縮重逆向きプライマー(deg enerate raverse primer)を合成し（表１．１）、次いでこれを使用して、１６ ０ｂｐプライマー伸長生成物を得た（図１Ｅ）。このプライマーを次いでＰＣＲ により増幅させた。この１６０ｂｐ伸長断片を、サブクローン化し、次いで配列 決定した。このヌクレオチド配列（配列番号：２１）は、Ｎ．アラタ懸濁培養か ら分離されたペプチド配列（配列番号：１１）にマッチした誘導ペプチドを包含 していた。 配列上で、この１６０ｂｐ断片の一部に対応する、追加のプライマー（例えば 、ＮａＦ１およびＮａＦ２；図１Ｅ）を合成し、この組合わせＰＣＲによりＡＧ Ｐ遺伝子の３′−部分を増幅させた。１．６ｋｂ断片を増幅させ、次いで配列決 定 した。これら２つのＰＣＲ反応から得られた配列の列を１６７９ｂｐのＤＮＡ配 列に高めた（図１Ｆ）。このＰＣＲ断片は、２つのミスマッチ（すなわち、位置 １のＡｌａに対するＡｒｇおよび位置１２のＨｉｓに対するＰｒｏ）を有する分 離ペプチド配列（配列番号：１１）を含有する蛋白質をコードした（図１Ｆ）。 この１．６ｋｂＰＣＲ断片を使用して、Ｎ．アラタ細胞懸濁培養物から分離さ れたＲＮＡから作成されたｃＤＮＡライブラリイをスクリーニングし、３種の陽 性クローンを分離し、次いで配列決定した。ｃＤＮＡ配列を伴う、このＰＣＲ配 列の列を、７ｂｐのポリ（Ａ）テイルを含む１７００ｂｐ配列（配列番号：２４ ）にまで伸長した（図１Ｆ）。 この配列をＮａＡＧＰ１と命名した。引続くプライマー伸長実験が示唆され、 １．７ｋｂＮａＡＧＰ１ｃＤＮＡ（配列番号：２４）は、ＡＧＰ転写産物の完全 長さの配列を示した。 このＮａＡＧＰ１ｃＤＮＡは、読取り枠スパンニング（spanning）１３８３ヌ クレオチドを含有していた。この読取り枠は、５１．８ｋＤの計算分子量および ３．８４の予測ｐＩを有する４６１アミノ酸残基を含有するポリペプチドをコー ドした。この蛋白質は、アスパラギンが高度に富裕であり（２５％）、かつまた セリン（８．９％）、チロシン（７．５％）、プロリン（７．２％）およびグル タミン（７．０％）が比較的富裕であった（表１．２）。この蛋白質は、４領域 に分割することができた（図１Ｇ）。非常に疎水性である推定上のトランスメン ブランヘリックスがＮ−末端に存在していた。 この蛋白質の引続く１／３（残基２６〜１７３）はまた、疎水性であり、かつ また大部分のプロリン残基（９３．８％）、アラニン残基（７６．５％）および スレオニン残基（７６．２％）を含有していた。これら３種のアミノ酸は、この 領域の全アミノ酸の３９．７％を占めていた（Ｐｒｏ、２０．２％；Ｔｈｒ、１ ０．８％およびＡｌａ、８．７％）（図１Ｇ）。この領域は、ヒドロキシプロリ ン残基を経て結合している鎖を含有するＧａｌ／Ａｒａによるグリコシル化部位 であるものと推定される。このプロリン残基（図１Ｆ中の残基３７、３９、４１ および４３）は、ヒドロキシル化されることが知られており、従ってこれらは、 Ｎ．プラムバギナホリアの脱グリコシル化ＡＧＰから得られたペプチド配列にヒ ドロキシプロリン（図１Ｈ中の残基２５、２７、２９および３１）として現れる 。このようなヒドロキシル化およびグリコシル化は、分子をより格別に疎水性に するものと見做される。 この蛋白質のアミノ酸位置１７４〜４３６に相当する部分は、親水性であり、 この領域の全アミノ酸のそれぞれ４４．１％および１２．１％に相当する、アス パラギン残基（９５．１％）およびチロシン残基（９４．１％）の大部分を含有 していた（図１Ｆおよび図１Ｇ）。このアスパラギン残基は、ポリペプチド鎖に 沿ってクラスター（clusters）（残基２〜１０）に分布していた。この領域は、 プロリン残基を含有していなかった。Ｃ−末端の最終２５残基は、親水性であっ た（図１Ｇ）。 Ｎ．プラムバギナホリア細胞懸濁ｃＤＮＡライブラリイをまた、ＰＣＲ断片に よりスクリーニングし、４つのｃＤＮＡクローンを分離し、配列決定した。この ４つのクローンは同一であり、１４３０ｂｐの挿入物を含有していた（配列番号 ：２５；図１Ｈ）。このＡＧＰを、ＮａＡＧＰ１と命名した。これらのｃＤＮＡ は不完全であり、その５′−末端で、その転写産物の完全長配列より約１００ｂ ｐ短いものと推定された。このＮｐＡＧＰ１は、そのヌクレオチド配列レベルお よび誘導アミノ酸配列レベルの両方で、ＮａＡＧＰ１ｓと同一ではないが、非常 に類似していた（それぞれ、８６％および８４．７％の同一性）（図１Ｉ図１Ｊ および表１．２）。トランスメンブランヘリックスは、その不完全配列により、 ＮｐＡＧＰ１では欠失していた。これら２種のＡＧＰ遺伝子間の相違は主として 、中央付近の１／３の配列にあり、他方そのＮ−末端およびＣ−末端部分は高度 に保有していた（図１Ｉおよび図１Ｊ）。ＮａＡＧＰ１ｃＤＮＡを、５′−転写 さ れない部分に相当する５′−半分（残基１〜５４０）、トランスメンブランヘリ ックスおよびプロリン−富裕領域ならびにアスパラギン−富裕領域を包含する３ ′−半分（残基５４０〜１７００）、Ｃ−末端、および３′−転写されない部分 に切断した。これらのｃＤＮＡの２部分を別々に使用して、Ｎ．アラタおよびＮ ．プラムバギナホリアの懸濁培養細胞から、およびまたＮ．アラタ植物の各種組 織から分離されたＲＮＡのノザン法分析により徹底的に検索した［Sambrook等に よる上記刊行物（１９８９）］。これら２種のプローブは、同一のハイブリド形 成パターンを示した。これにより、これら２種の相違する領域が、同一転写産物 の一部であることが証明された（図１Ｋ）。ＮａＡＧＰ１ｃＤＮＡプローブは、 試験されたＮ．アラタの組織の全部からのＲＮＡ試料とハイブリド化した。しか しながら、ハイブリド形成の度合および転写産物のサイズは、組織の相違に従い 相違していた。最高シグナルは、Ｎ．アラタ懸濁培養細胞からのＲＮＡで検出さ れ、他方花弁におけるシグナルはほとんど検出されなかった。花粉および花柱組 織は、約１．０ｋｂの小さい転写産物を有するのに比較して、Ｎ．プラムバギナ ホリア培養細胞では、１．６ｋｂのそしてその他全部の組織では、１．７ｋｂの 転写産物を含有していた（図１Ｋ）。ゲノムサザン法分析は、これらのＡＧＰ遺 伝子がＮ．アラタのゲノムであって、１つのみのコピイ遺伝子であるか、または 少量のコピイ遺伝子であることを示した。 本発明の好適態様において、ｃＤＮＡライブラリイを、ＡＧＰ蛋白質配列のＮ −末端またはヒドロキシプロリン−貧弱部分から誘導された、標識付き合成オリ ゴヌクレオチド プローブを用いてスクリーニングした。本発明の別の態様にお いて、ｃＤＮＡ内の各組換え体を、抗原の発現に係わりスクリーニングすること ができる（抗体認識）。組換え体ｃＤＮＡライブラリイからのクローン形成配列 の選択方法は、キメルにより開示されている［KimmelによるMeth．Enzymol．， １５２：３９３〜３９９（１９８７）］。 本発明はまた、単子葉植物および双子葉植物のＡＧＰ遺伝子のハイブリド化す る配列の検出および分離にオリゴヌクレオチドプローブ、例えばＡＧＰｃＤＮＡ などを使用することを包含す志。セイヨウナシＡＧＰ（ＰｃＡＧＰ９）転写産物 が双子葉植物およびまた単子葉植物から調製されたＲＮＡで検出された。 強力なハイブリド形成シグナルを示すｃＤＮＡクローンの配列を決定して、Ａ ＧＰアミノ酸配列に対する相補性が確認される。さらにまた、このｃＤＮＡによ りコードされる蛋白質は、ＡＧＰ特徴を有することが証明される。この証明は、 例えば適当なＲＮＡポリメラーゼによりクローン配列を転写し、次いで例えば市 販されている小麦遺伝子抽出物インビトロ転写系において、そのｍＲＮＡを翻訳 することによってなされる。従って、クローンの同定は、懸濁培養細胞中への形 質転換、引続くこの生成物の適当なタッグを用いる同定により確認される。 本発明のもう一つの態様において、ＡＧＰ蛋白質の存在が免疫学的に検出され る。一例として、ＡＧＰペプチドに対して生じさせ、精製し、次いでＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥゲルから分離される抗体またはその断片は、精製ＡＧＰペプチドと交差反 応することが証明されている。ＡＧＰ特異性抗体はまた、植物抽出物からのＡＧ Ｐのおよびまたクローン化されているＡＧＰ遺伝子生成物の結合および沈殿に利 用される。ＡＧＰペプチドに対して特異性のポリクローナルおよびモノクローナ ル抗体はまた、当業界の標準的方法により調製される。この種の免疫学的試験は 、例えば受容有機体中のクローン化したＡＧＰの発現を最適にするために使用さ れる。 本発明はまた、ＡＧＰのゲノムクローンの分離を包含する。ゲノムＤＮＡが、 ヘルマンおよびフィシャフにより開示された方法［HerrmannおよびFischaefによ るMethods Enzymol．，１５２：１８０〜１８９（１９８７）］により分離する 。ＰＣＲに基づく方法を使用して、部分蛋白質配列［例えば、Aarts等によるPla nt Mol．Biol.，１６：６４７（１９９１）］を使用して、またはｃＤＮＡ断片 プローブ［例えば、King等によるPlant Mol．Biol．，１０：４０１〜４１２（ １９８８）］を使用して、ゲノムＤＮＡからの遺伝子をクローン化する。このｃ ＤＮＡの代わりにゲノムＡＧＰ遺伝子を使用して、特にその完全発現に天然プロ モーターまたは翻訳後システムが必要であるものと見做される宿主系、例えば植 物細胞においてＡＧＰを発現させることができる。 当業界で充分に知られているように［例えば、GloverによるGene Cloning，Br ammarおよびEdidin編集）、ChapmanおよびHall，N．Y．（１９８４）参照］、ｃ ＤＮＡライブラリイの創作にかかわるおよび相当するＤＮＡ組換え体ベ クター、例えばプラスミドのｐＵＣ一族あるいはλｇｔ１０またはλｇｔ１１フ ァージ ベクター中へのｃＤＮＡのクローン化にかかわる種々の戦略が存在する 。本発明の態様においては、ＤＡＮ組換え体ベクターがクローン化する部位に隣 接する構成プロモーターまたは誘発プロモーターを運搬する。これにより転写産 物は相違するＲＮＡポリメラーゼを用いることにより簡単に、このｃＤＮＡのど ちらかの鎖に対して特異性にされる。この方法で生成されたＲＮＡは、ハイブリ ド形成プローブとして使用することができ、または細胞を含有していない蛋白質 合成系で翻訳することができる。 本明細書に記載の遺伝子工学操作により生成された組換えＤＮＡの構造配列お よび特異要素に対して、遺伝子発現活性を損なうことなく修飾を行うことができ ることは当業界で理解されている。例えば、本発明の組換えＤＮＡ分子の機能に 有意の影響を与えることなく、エンハンサー調節要素および（または）プロモー ター［例えば、好ましくは誘発プロモーター（例えば、ＡｄＨ１）］の選択に置 き換えを使用できることが考えられる。好適コドン、配置、配向、および種々の 調節要素のスペース形成を使用することによって、およびまた相互に関しておよ びまたＴＡＴＡボックスの位置に関して、特定の要素の多重コピイを使用するこ とによって、遺伝子発現が最適化されることはまた理解されていることであり、 本明細書の教示を用いて当業者にとって明白になることである。 本発明のもう一つの態様においては、Ｎ．プラムバギナホリア懸濁培養物から ＡＧＰが分離された。このＮ．プラムバギナホリアの細胞懸濁培養物からの媒質 を、濾過により細胞から分離し、次いで高分子量物質を４倍量のエタノールによ り沈殿させた。ヤリブ沈殿に先立つＣＴＡＢ（ヘキサデシルトリメチルアンモニ ウムブロマイド）によるペクチン出発物質の枯渇化の後に、生の総合的ＡＧＰを バイオポリマー（Biopolymer）生成物から精製した。この生の総合的ＡＧＰは２ 種の経路で処理した。 経路１：脱グリコシル化を行い、次いで逆相ＨＰＬＣを行い、その後に直接配 列決定するか、または酵素による消化（蛋白質分解的消化）の後に配列決定する （この経路は、例２（ｃ）２〜５に詳細に説明されている）。 経路２：逆相ＨＰＬＣを行い、その後に脱グリコシル化を行い、次いで再度逆 相ＨＰＬＣを行う（この経路は、例１（ｃ）６〜８に詳細に説明されている）。 経路１（脱グリコシル化を行い、次いでＡＧＰを分離する）は、逆相ＨＰＬＣ において、未結合ピークおよび、それぞれ２１分および３２分の保有時間で、２ つの主要結合ピーク、ＲＴ２１およびＲＴ３２を生成した。ピークＲＴ２１は、 テルモリシンで消化し、ＲＰ−ＨＰＬＣにより再分別し、次いでアミノ酸配列を 決定した。ピークＲＴ２１から得られた配列（配列番号：２６〜２９）は、ヒド ロキシプロリン、アラニン、セリンおよびスレオニンの高含有量を示した（ＯＡ ＳＴ−富裕配列）。 ピークＲＴ２１は直接配列決定に付し、配列Ｒ−Ｋ−Ｓ−Ｋ−Ｆ−Ｍ−Ｉ−Ｉ −Ｐ−Ａ−Ｓ−Ｏ−Ｔ−Ｏ−Ａ−Ｏ−Ｔ−Ｏ−Ｉ−Ｎ−Ｅ−Ｉ−Ｓ−Ｆ（配列番 号：３０）を示した。この配列は、５′−末端において、Ｎ．アラタ細胞培養物 から得られたＮ−末端配列（配列番号：１１）と非常に密接にマッチしており、 かつまたヒドロキシプロリン高含有量を示さず、またＯＡＳＴ高含有量、すなわ ちヒドロキシプロリン、アラニン、セリンおよびスレオニンの高含有量も示さな かった。ピークＲＴ３２配列（配列番号：３０）は、高いＯＡＳＴ含有量を有す ることを特徴とする領域から構成されていた。 Ｎ．プラムバギナホリアＡＧＰからのクロマトグラフイ フラクションのアミ ノ酸分析の結果が、表２．１に示されている。初期にクロマトグラフイ カラム に結合したＡＧＰは全て、ヒドロキシプロリン、アラニン、セリンおよびスレオ ニン残基に富んでいることを示した。 本発明のもう一つの態様において、生の総合的ＡＧＰを、ピルス コムニス（ セイヨウナシ）バイオポリマーからヤリブ沈殿により分離した。 これらのＡＧＰを、先ず脱グリコシル化し、次いで逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−３０ ０）により分離するか（経路：１）、あるいは別法として、生の総合的ＡＧＰを 先ず、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−３００）により分別し、次いで脱グリコシル化し、 テルモリシンにより消化し、次いで配列決定した（経路：２）。 経路１（脱グリコシル化したＡＧＰのＨＰＬＣ分離）は、図３Ａに示されてい るプロフィールを示した。表３．１にまとめて示されているように、主要ピーク （すなわち、未結合、ピークＲＴ１６．４およびピークＲＴ１８．２）のアミノ 酸分析結果は、全フラクションがヒドロキシプロリン、アラニン、セリンおよび スレオニン残基に富んでいることを示した。 図３ＡからのＲＴ１６．４ピークおよびＲＴ１８．２ピークを、テルモリシン 消化に付し、この消化生成物をＲＰ−３００カラムで分離した。この消化したＲ Ｔ１６．４に係わるＲＰ−３００プロフィールを図３Ｂに示し、そしてＲＴ１８ ．２に係わるＲＰ−３００プロフィールを図３Ｃに示す。 全体として、ピークの１つのみが（テルモリシン消化ＲＴ１６．４のピーク１ ：図３Ｂ）、純粋ペプチドであり、明確な配列、Ｌ−Ｓ−Ｏ−Ｋ−Ｋ−Ｓ−Ｏ− Ｔ−Ａ−Ｏ−Ｓ−Ｏ−Ｓ−（Ｓ）−Ｔ−Ｏ−Ｏ−Ｔ−（Ｔ）（配列番号：３１） を示した。これはヒドロキシプロリン、アラニン、セリンおよびスレオニンの高 含有量も示した。 ＲＴ１６．４のピーク３および５（図３Ｂ）は、ヒドロキシプロリン、アラニ ン、セリンおよびスレオニンの高含有量をまた示す配列からなるものであった（ それぞれ配列番号：１１および配列番号：１２）。 テルモリシン消化したＲＴ１８．２からのピーク（図３Ｃ）は、数個のピーク に分割された（配列番号：３１、３４〜３８）。これらの配列はまた、高ＯＡＳ Ｔ含有量を有することを特徴とするものであった。 経路２（生の総合的ＡＧＰフラクションの逆相ＨＰＬＣによる分別）により、 図３Ｄに示されているプロフィールを得た。ピークＲＴ７．８および未結合フラ クションをアミノ酸組成について分析した。表３．１に示されているように、こ れらの両方がヒドロキシプロリン、アラニン、セリンおよびスレオニンに富んで いることが見出された。ピークＲＴ７．８および未結合フラクションを、脱グリ コシル化し、次いでＨＰＬＣで分別した。この脱グリコシル化ピークＲＴ７．８ に係わるプロフィール（図３Ｅ）は、主要ピーク（ピークＲＴ２３）を示した。 このピークはテルモリシン消化および逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−３００）による精製 の後に、６種のペプチド配列をもたらした。５種の配列（配列番号：３９〜４４ ）は、ＯＡＳＴ−富裕であるのに対して、配列の１種、Ｌ−Ｖ−Ｖ−Ｖ−Ｖ−Ｍ −Ｔ−Ｐ−Ｒ−Ｋ−Ｈ（配列番号：４１）がまた、ＲＴ７．８中に生のＡＧＰの 直接配列から得られた配列中に存在した。 図３Ｄの未結合フラクションは、脱グリコシル化および引続くＨＰＬＣによる 分別（経路２）の後に、図３Ｆに示されているプロフィールを示した。図３Ｆ中 の主要ピークＲＴ１６〜１９［これらのピークは、経路２（分離後の脱グリコシ ル化）で得られた］は、図３Ａ中のピークＲＴ１６〜１９．９［これらのピーク は、経路１（脱グリコシル化後の分離）で得られた］と同様の保有時間を有して いた。 図３Ｄから明白なように、ピークＲＴ７．８は、セイヨウナシからの総合的Ａ ＧＰの約２７％を表わす。多重鎖を示すことがあるフラクションの一つに、少な くとも４個のＮ−末端が見出された。未結合フラクションは、セイヨウナシから の総合的ＡＧＰの約６７％を表わし、数個のＯＡＳＴ−富裕配列を有する図３Ａ のＲＴ１６．４〜１９．９に対応するピークを示した。従って、本発明は、ピル ス コムニスからの２種の主要ＡＧＰのそれぞれからのアミノ酸配列データを提 供する。 本発明の特別の態様において、ＡＧＰ遺伝子がＰ．コムニスから得られた。 ヒドロキシプロリン−貧弱およびＯＡＳＴ−貧弱である、この配列Ｌ−Ｖ−Ｖ −Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｔ−Ｐ−Ｒ−Ｋ−Ｈ（配列番号：４１）を、セイヨウナシ細胞懸 濁培養物からＡＧＰを得るための鋳型として選択した。 Ｌ−Ｖ−Ｖ−Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｔ−Ｐ−Ｒ−Ｋ−Ｈ配列（配列番号：４１）に相当 する多数のプライマーを、ＰＣＲ実験用にデザインし、合成した（表３．２）。 ＮａＡＧＰ１（図１Ｄ）のクローン化に使用された方法と同一の組合わせ（ne sted）ＰＣＲ法を使用して、上記ペプチドをコードする遺伝子をクローン化した 、ただしこの場合のアニーリング温度は５２℃であった。第一プライマーとして ＰｃＡ２３Ｆ１を使用し、かつまた第二プライマーとしてＰｃＡ２３Ｆ２ａを使 用して２つの順次反応を行った後に、３５０−ｂｐ断片を増幅させた。この断片 の配列を決定し、正しいペプチド配列をコードすることが見出された（配列番号 ：４８；図３Ｇ）。 このＰＣＲ断片を使用して、Ｎ．アラタ細胞懸濁培養物について上記したとお りに、セイヨウナシ細胞懸濁培養物からのｍＲＮＡから作成されたｃＤＮＡライ ブラリイをスクリーニングした。一つの陽性クローン（ＰｃＡＧＰ２３）を分離 し、配列決定した。このクローンは、７６０ＢＰの挿入体を含有し、ＰＣＲ配列 にマッチしていた。 このＰｃＡＧＰ２３ｃＤＮＡ（配列番号：４９）は、位置２０の開始コドン（ ＡＴＧ）により始まり、位置５６０の停止コドンにより終了している読取り枠を コードした（図３Ｈ）。この読取り枠は、１９．２ｋＤの計算分子量を有し、か つまた８．４６の推定ｐＩを有する１８０アミノ酸残基を含有するポリペプチド をコードする。予測アミノ酸配列は、ペプチド配列Ｌ−Ｖ−Ｖ−Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｔ −Ｐ−Ｒ−Ｋ−Ｈ（配列番号：４１）を含有し、これをＰＣＲ断片のクローン化 に使用した。さらに、ヌクレオチド４２８〜４７２から予測される、もう１種の ペプチド配列Ｌ−Ｇ−Ｉ−Ｓ−Ｏ−Ａ−Ｏ−Ｓ−Ｏ−Ａ−Ｇ−Ｅ−Ｖ−Ｄ−（Ｇ ）は、ＲＴ１８．２から得られた配列番号：３４にマッチする（図３Ｃ）。しか しながら、ピークＲＴ７．８からの別の配列（配列番号：３９〜４４）は、Ｐｃ ＡＧＰ２３には存在していない。これはこれらが相違するＡＧＰ幹鎖を有するこ とを示している。 予測蛋白質配列中で最も豊富なアミノ酸残基は、Ｓｅｒ（１２．２％）、Ｇｌ ｙ（１０．５％）、Ｌｅｕ（９．４％）、Ｖａｌ（８．８％）、Ａｌａ（７．２ ％）およびＬｙｓ（７．２％）である（表３．３）。 ＰｃＡＧＰ２３は、５．５％のＰｒｏ残基を含有し、ペプチド配列により同定 されているように、そのうちの若干は、後−翻訳によりヒドロキシプロリンに変 換された。相対的に言えば、このＰｒｏ残基およびＡｌａ残基は、この配列の最 後の１／３に濃縮されている（Ｃ−末端の位置で）。 ＰｃＡＧＰ２３ｃＤＮＡの配列（配列番号：４９）では、予測分泌シグナルは Ａｌａ²⁷とＡｒｇ²⁸との間に潜在的分裂部位を有するＮ−末端（１〜２７）に存 在する。また、アミノ酸一３６および８７に、２個の潜在的Ｎ−グリコシル化部 位が存在する（図３Ｈ）。 本発明のもう一つの態様において、図５Ｄのフローチャートに例示されている ように、セイヨウナシ細胞培養濾液をさらに精製した。未結合フラクションおよ び２つの主要結合フラクション（図５Ｄ−Ａ）は、このカラムに装填された総合 的ＡＧＰのそれぞれ７２％、０．９％および０．１％に相当し、これらを上記お よび例３（ａ）に記載のとおりに精製した。 ＡＧＰの約２７％に相当する、図５Ｄ−Ａの主要ピークを採取し、次いで同一 カラムに再度適用した。浅い勾配で溶離すると、２つのピーク（フラクション１ および２）が分割された（図５Ｄ−Ｂ）。フラクション１中のＡＧＰは、上記お よび例３（ａ）に記載されている。 フラクション２はサイズ排除ＦＰＬＣ分別により２成分に分割した（ピーク２ Ａおよび２Ｂ、図５Ｄ−Ｃ３）。各フラクションの主要単糖類は、アラビノース およびガラクトースであった（表３．４）。 アラビノースは主として、少量の３′−結合残基および５′結合残基とともに 、末端位置に存在していた。両方のピークにおいて、ガラクトースは主として、 少割合の３，６−結合残基および末端残基として存在していた。しかしながら、 ６−結合ガラクトシル残基の割合は、ピーク２Ａにおけるよりもピーク２Ｂで大 きく、かつまた両方ともに、３−結合残基は小割合であった。 ピーク２Ａおよび２ＢのＡＧＰのアミノ酸組成分析を表３．５に示す。ピーク ２Ｂの物質のＮ−末端アミノ酸配列は、配列Ａ−Ｅ−Ａ−Ｅ−Ａ−Ｘ−Ｔ−Ｘ− Ａ−Ｌ−Ｑ−Ｖ−Ｖ−Ａ−Ｅ−Ａ−Ｘ−Ｅ−Ｌ（配列番号：７４）を示した。 ピーク２Ａおよび２ＢのＡＧＰを別々に脱グリコシル化し、生成する蛋白質幹 鎖をサイズ排除ＦＰＬＣにより分離した（図５Ｄ−Ｄ１〜４）。各フラクション 毎に、蛋白質の見掛け上のＭは相違していた。ピーク２Ｂは、１つの蛋白質幹鎖 を示し（Ｍｒ：１０ｋ）、ピーク２Ａは、２つの蛋白質ピークを示した（Ｍｒ： １０ｋおよび５４ｋ）。ピーク２Ａの１０ｋ蛋白質幹鎖は、ピーク２Ｂからの夾 雑である。５４ｋ蛋白質幹鎖のＮ−末端アミノ酸配列は、配列Ｔ−Ｏ−Ａ−Ｏ− Ａ（配列番号：７５）を有し、他方ピーク２Ｂの１０ｋ蛋白質幹鎖は、配列Ａ− Ｅ−Ａ−Ｅ−Ａ−Ｏ−Ｔ−Ｏ−Ａ−Ｌ−Ｑ−Ｖ−Ｖ−Ａ−Ｅ−Ａ−Ｏ−Ｅ−Ｌ（ 配列番号：７６）を示した。後者の配列は、脱グリコシル化以前のピーク２Ｂの ＡＧＰから得られたＮ−末端配列と同一であった。この配列において、不明確な 残基「Ｘ」はＨｙｐであると見做される。 ５４ｋ蛋白質幹鎖および１０ｋ蛋白質幹鎖のアミノ酸組成は、それぞれピーク ２Ａおよび２Ｂのそれらの親のＡＧＰの組成と非常に類似していた。 ５４ｋ蛋白質幹鎖は、ピーク２Ｂ中の１０ｋ蛋白質幹鎖（Ｈｙｐ、１９．５％ ；Ｓｅｒ、６．０％）に比較して、高割合で、Ｈｙｐ（２７．５％）、Ｓｅｒ（ １８．４％）を含有していた。他方、１０ｋ蛋白質幹鎖は、ピーク２Ａ中の５４ ｋ蛋白質幹鎖（Ｇｌｘ、６．６％；Ｖａｌ、４．２％）に比較して、高割合で、 Ｇｌｘ（１４．３％）およびＶａｌ（１０．１％）を含有していた（表３．５） 。１０ｋ蛋白質幹鎖および５４ｋ蛋白質幹鎖を別々にテルモリシンにより消化し 、生成するＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、次いでスクリーニングした。 ピーク２Ａ中の５４ｋ蛋白質から８種のペプチドの配列が得られ、そしてピー ク２Ｂ中の１０ｋ蛋白質から３種のペプチド配列が得られた（表３．６）。ピー ク２Ｂ中の１０ｋ蛋白質に係わり、３種の配列のうちの２種とＮ−末端配列と重 なって、配列Ａ−Ｅ−Ａ−Ｅ−Ａ−Ｏ−Ｔ−Ｏ−Ａ−Ｌ−Ｑ−Ｖ−Ｖ−Ａ−Ｅ− Ａ−Ｏ−Ｅ−Ｌ−Ｖ−Ｏ−Ｔ−Ｏ−Ｖ−Ｏ−Ｔ−Ｏ−Ｓ−Ｙ（配列番号：８８） を有していた。 本発明のもう一つの態様において、Ｎ．アラタ花柱からＡＧＰを分離した。こ の例では、生の総合的Ｎ．アラタ花柱ＡＧＰは、ヤリブ試薬沈殿技術により精製 しなかったが、イオン交換クロマトグラフイおよび引続くゲル濾過クロマトグラ フイ（ＧＦＣ）により精製した。カラムフラクション中のＡＧＰの存在は、ヤリ ブ試薬によるＡＧＰ沈殿により証明した。これらのＡＧＰを次いで、ＨＦにより 脱グリコシル化し、次いで逆相ＨＰＬＣにより分別した。 脱グリコシル化およびＨＰＬＣ分別の後に、２つの主要ピーク、ＲＴ２５およ びＲＴ３５（図４Ｃ）が得られた。各フラクションおよびその天然物質のアミノ 酸分析値を表４．１に示す。 ３種のフラクション間のアミノ酸組成の明確な相違は明らかである。未結合フ ラクションは少割合でＨｙｐを含有していたが、Ｇｌｙ、Ｇｌｘ、Ｓｅｒおよび Ａｓｘは豊富である。ＲＴ３５フラクションはまた、Ｈｙｐが貧弱であるが、Ａ ｓｘ、ＧｌｘおよびＡｌａは豊富である。これら２種のフラクションは一緒にな って、生のＡＧＰおよび脱グリコシル化したＡＧＰで検出される一団のＡｓｘお よびＧｌｘの存在を証明している。フラクションＲＴ２５中の物質のアミノ酸組 成は、Ｈｙｐ（１８％）、Ａｌａ（２０％）およびＳｅｒ（１５％）で占められ 、非常に僅かなＴｙｒを付随している。従って、このＲＴ２５蛋白質幹鎖を引続 く分析用に選択した。 ピークＲＴ２５は、４配列を有しており（配列番号：５０〜５３）、そしてこ れらの配列はＯＡＳＴ−富裕である。これらの配列のうちの３つ（配列番号：５ ０、５１および５２）は、Ｎ．プラムバギナホリアからのＲＴ２１の配列（配列 番号：２７〜２９）とそれぞれ緊蜜にマッチしていた。 ＲＴ２５ピークでは、Ｎ−末端配列は得られなかった。次いで、ピログルタメ ートアミノペプチダーゼを使用して、Ｎ−末端ブロックされたピログルタメート 残基を除去し、配列Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙを得た。ＲＴ２５幹鎖をまた、エン ドプロテイナーゼテルモリシンで処理することによって断片を生成させた。生成 するペプチドを分離し、ＲＰ−ＨＰＬＣによりさらに精製した。６種の主要ペプ チドをアミノ酸分析に付し（図４１）、４配列を得た（配列番号：５０、５１、 ５３、６７）。これらの配列は全部が、Ｈｙｐ、ＳｅｒおよびＡｌａに富裕であ った（５２アミノ酸残基のうちの３２）。 エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎをまた使用して、ＲＴ２５蛋白質幹鎖をその Ａｓｐ残基の部位で分裂させた。２つの主要ペプチドが生成された（Ａ１および Ａ２：図４Ｊ）。これらのペプチドは、ＲＴ２５蛋白質中に１個のみのＡｓｐが 存在することを示した。出発物質（ＲＴ２５蛋白質；図４Ｊ）の存在により示唆 されるように、この分裂は不完全であった。Ａ２のペプチド配列を得た（配列番 号：６８）。他のペプチド（Ａ１）からは配列データは得られなかった。このこ とは、ブロックされたＮ−末端残基の存在を示している。Ａ２（配列番号：６８ ）（図４Ｊ）とピーク３（配列番号：５１）（図４１）との間の重複が同定され 、２６残基の連続アミノ酸配列が得られた：ＬＡＳＯＯＡＯＯＴＡＤＴＯＡＦＡ ＯＳＧＧＶＡＬＰＯＳ（配列番号：６９）。 ピークＲＴ３５は４配列を有しており（配列番号：５４〜５７）、低いＯＡＳ Ｔ含有量を有していた。これらの配列のうちの３配列（配列番号：５５〜５７） は、配列Ｔ−Ａ−Ｉ−Ｎ−Ｔ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ｐ（配列番号：５８）を有すること を特徴としていた。 別の調製方法において、バシック等に従い［Bacic等によるPhytochem．，２７ ：６７９〜６８４（１９８８）］、Ｎ．アラタ花柱からＡＧＰ遺伝子を分離した 。配列：Ａ−Ｖ−Ｆ−Ｋ−Ｎ−Ｋ−Ｘ−Ｘ−Ｌ−Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｐ−Ｘ−Ｉ−Ｉ （配列番号：５９）を得た。 本発明の他の態様において、Ｎ．アラタ花柱からのＡＧＰ遺伝子を分離した。 図４Ｄのクローン化戦略を使用して、この遺伝子を得た。Ｎ．アラタ花柱から分 離されたピークＲＴ３５のペプチド配列のうちの数種は、配列Ｔ−Ａ−Ｉ−Ｎ− Ｔ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ｐ（配列番号：５８）を含有していた。特定の態様において、 遺伝子特異性縮重オリゴヌクレオチドプライマーを、配列Ａ−Ｉ−Ｎ−Ｔ−Ｅ− Ｆ−Ｇ（配列番号：６０）に基づきデザインし、ＰＣＲ断片をＮ．アラタの花柱 ＲＮＡからインビトロ増幅させた。３８０−ｂｐＰＣＲ断片（配列番号：６２； 図４Ｅ）を使用して、花柱ｃＤＮＡライブラリイをスクリーニングし、ｃＤＮＡ を分離し、次いで完全配列を決定した。このＮ．アラタ花柱ｃＤＮＡクローンを Ｎａ３５−１と命名した。このｃＤＮＡクローンを挿入して、３′末端にポリ（ Ａ）テイルを有する８００ｂｐ鎖長にした。このｃＤＮＡ配列（配列番号：６３ ）は、その３′末端が３ｂｐ短いことを除いて、ＰＣＲ配列と一致していた（図 ４Ｅおよび図４Ｆ）。 Ｎａ３５−１配列（配列番号：６３）は、２１位置に開始コドン（ＡＴＧ）を 有し、５３０位値の停止コドン（ＴＡＡ）で終結している読取り枠を有していた （図４Ｆ）。この読取り枠は、１９．５ｋＤの計算分子量および８．１の予測ｐ Ｉを有する、１６９アミノ酸を含有するポリペプチドをコードした。この配列中 の最も豊富な残基は、プロリン（１１．２％）、フェニルアラニン（９．５％） 、アラニン（７．７％）、ロイシン（７．７％）およびリジン（７．７％）であ った（表４．２）。 Ｎ．アラタ花柱ｃＤＮＡから誘導されたアミノ酸配列（配列番号：６３）は、 Ｎ．アラタ花柱から分離されたピーク３５のペプチド断片、すなわち配列番号： ５５、配列番号：５６および配列番号：５７とマッチする領域から構成されてい た。Ｎａ３５−１遺伝子のノザン法分析（図４Ｇ）は、Ｎ．アラタに対するおよ び花柱組織に対する遺伝子の特異性を示した。トマト花柱、Ｎ．アラタ細胞懸濁 物、Ｎ．プラムバギナホリア細胞懸濁物およびセイヨウナシ細胞懸濁物からの転 写産物では、シグナルは検出されなかった（図４Ｈ）。このことは、Ｎａ３５− １ＰＣＲ断片が、Ｎ．アラタ花柱ＡＧＰ遺伝子に対して特異性であることを示し ている。 さらにまた、本発明のもう一つの態様は、Ｎ．アラタ花柱ＡＧＰに係わる異な る遺伝子の分離を開示するものである。このＡＧＰ蛋白質幹鎖の断片から分離さ れた５種のペプチド（配列番号：５０、５１、５３、６７および６８）はいずれ も、５２アミノ酸残基を有していた。これらの配列の多くは、Ｈｙｐ、Ｓｅｒお よびＡｌａの隣接残基を含有しており、そのためにこのコドンは格別に冗長であ り、かつまたＧＣ−富裕であった。しかしながら、分離されたペプチドの重複か ら生じる連続アミノ酸配列からの配列ＴＡＤＴＯＡＦは、ＧＣ−富裕ではなく、 ２個のみの縮重コドンを有する２個のアミノ酸を含有していた。このＴＡＤＴＯ ＡＦ配列は、ＰＣＲに適するオリゴヌクレオチドのデザインおよびＡＧＰＮａＬ １ｃＤＮＡの最終的クローン化を可能にした。 遺伝子−特異性オリゴヌクレオチド（２０ヌクレオチド）を、この連続２６ア ミノ酸配列の一つの領域：ＴＡＤＴＯＡＦ（配列番号：７０）からデザインした 。最初の２つのコドンの三番目の部位に、イノシンを使用して、このオリゴヌク レオチドの縮重度（degeneracy）を１２８に減少させた。生成するオリゴヌクレ オチドは、５５％のＧＣを含有していた。アダプター配列と結合させたポリＴを 使用して、総合的花柱ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ３′−末端（３ ′ＲＡＣＥ）の迅速増幅を、この遺伝子特異性プライマーをアダプター配列で３ ′プライマーとともに使用して行った。４００塩基対（ｂｐ）のＰＣＲ断片を生 成した。このＰＣＲ断片をクローン化し、次いで配列決定した。このＰＣＲクロ ーンからの推定アミノ酸配列は、分離されたＡＧＰ配列、すなわち配列番号：５ ０、５１、５３、６７、６８と一致していた。 次いで、このＰＣＲクローンをプローブとして使用して、花柱ｃＤＮＡライブ ラリイ（３００，０００プラーク）をスクリーニングした。３′末端の長さおよ び５′末端の長さのみが相違する２種のｃＤＮＡクローンが得られた。これらの クローンのうちの、ＡＧＰＮａ１ １と命名したクローン（図４Ｋ）を配列分析 の全部に使用した。ＡＧＰＮａ１ １ｃＤＮＡクローンの３′末端は、ＰＣＲク ローンが２０ｂｐ短く、かつまたポリＡテイルを含有していることを除いて、Ｐ ＣＲクローンと同一であった。この７１２−ｂｐＡＧＰＮａ１ １クローンは、 １２．５ｋＤの予測蛋白質をコードした（図４Ｋ）。誘導アミノ酸配列は、分離 ＡＧＰペプチドと同一の配列を包含する（配列番号：５０、５１、５３、６７お よび６８）。アミノ酸配列決定により得られた、このペプチド配列中のプロリン 残基の大部分は、ヒドロキシル化されている。分泌シグナルペプチドが予測され る（図４Ｋおよび４Ｌ）。成熟蛋白質（１０ｋＤ；ｐＩ６．８）の推定Ｎ−末端 は、Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙであり、この配列は得られたＮ−末端配列 データとマッチしている。このＮ−末端中のＰｒｏ残基はまた、ヒドロキシル化 されている。推定成熟蛋白質および分離ＲＴ２５蛋白質幹鎖のアミノ酸組成は一 般的に一致する（表４．１）。この推定蛋白質のＣ−末端は、非常にヒドロキシ ル化されており、トランスメンブラン ヘリックスであると予想される。 得られたｃＤＮＡクローン（図４Ｋ）は、Ｎ−末端およびＣ−末端の両方に存 在する疎水性伸長部分を特徴とする１３２アミノ酸蛋白質を予測させる（図４Ｌ ）。このＮ−末端疎水性配列は、コードされる蛋白質の分泌を導くものと見做さ れるシグナルペプチドに相当する。これは公知分泌および花柱ＡＧＰの細胞外局 限化と一致する［Sedgley等によるMicrom Microscop．Acta,１６：２４７〜２５ ４（１９８５）］。Ｎ−末端残基のＧｌｎを分子内環形成により修飾することに よるピログルタメートの形成は慣用ではない。この環形成は、精製処理中に生じ させることができ、あるいはその場で生じさせることもでき、ＡＧＰ幹鎖の安定 化に包含されることがある。同一のＮ−末端配列：Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇ ｌｙ−Ａｌａはまた、セイヨウナシから分離されたＡＧＰ幹鎖中にも存在する（ 図５Ａ）。そのＣ−末端疎水性配列は、トランスメンブラン ヘリックスである と予想され（図４Ｌ）、そしてこれはプラスマ膜にＡＧＰを固定することができ るものと見做される。この疎水性Ｃ−末端領域はまた、別の蛋白質、例えばＳ− ＲＮアーゼなどとＡＧＰとの相互反応を潜在的に可能にすることができ、このＳ −ＲＮアーゼはまた、非常に疎水性の配列を含有する（この場合には、Ｎ−末端 に；Mau等によるPlanata，１６９：１８４〜１９１（１９８６）］。この蛋白質 は、そのＨｙｐ、Ａｌａ、Ｓｅｒ残基の大部分を、その中央部分に含有する。こ のペプチド配列中のＰｒｏ残基の大部分がヒドロキシル化されているという事実 は、この蛋白質の中央部分における長大なＯ−グリコシル化を示唆している。潜 在的Ｎ−グリコシル化部位は存在していない。豊富な潜在的Ｏ−グリコシル化部 位の存在は、炭水化物の高含有量と一致する（８５重量／重量％）。各ＡＧＰは 、サッカライド鎖の種類および蛋白質幹鎖に沿ったグリコシル化部位の数 および場所の点で相違している。 ＡＧＰＮａ１ １ｃＤＮＡにハイブリド化するｍＲＮＡは、Ｎ．アラタの大部 分の組織および関連ソラナコッカス(Solanaccous)種の花柱に存在する（図４Ｍ ）。このことは、植物発現におけるこの転写産物（または密接に関連した転写産 物）の一般的役割を示唆している。Ｎ．アラタからの各種組織を、ＡＧＰＮａ１ １遺伝子の発現に係わり試験した。図４Ｍ−１に示されているように、約７０ ０〜７５０ヌクレオチドと類似する長さのｍＲＮＡが、全部の試験組織で検出さ れた。このことは、ＡＧＰＮａ１ １遺伝子またはその類縁体が、植物のかなり の部分で発現することを示唆している。花柱、子房、花弁、葉および茎は、同一 レベルの転写産物を有するが、高レベルのｍＲＮＡ発現は根に見出される。 ハイブリド形成性転写産物の或る発現は、Ｎ．シルベストリス(N.sylvestris) およびＮ．タバクム（N．tabacum）の花柱で、およびまたＮ．グラウカ（N.glau ca）およびリコペルシコン ペルビアナム（Lycopersicon peruvirum）に低レベ ルで検出された（図４Ｍ−２）。アラビドプシス(arabidopsis)およびライグラ ス［ロリウム ペレネ（Lolium perenne）、単子葉植物］の葉は、検出可能な転 写産物は有していなかった。 本発明のもう一つの態様において、ＡＧＰ遺伝子を、Ｐ．コムニスからヒドロ キシプロリン−富裕セイヨウナシＡＧＰセグメントをコードするゲスマーオリゴ ヌクレオチド配列を使用して分離し、ＲＮＡポリメラーゼのための二重鎖プロモ ーターに結合させた。これは、アンチセンスＲＮＡプローブの合成を可能にする （図１Ａ参照）（戦略Ｂ）。従って、戦略Ｂは、特別のヒドロキシプロリン−富 裕ペプチド領域を特異的にコードするＡＧＰ遺伝子（配列番号：６６）の分離を 可能にした（図５Ａ参照）。ヒドロキシプロリン−富裕およびＯＡＳＴ−富裕領 域が、ＡＧＰの特徴的特性を示すことは明らかである。 ＡＧＰペプチド断片は、基本的に例３（ａ）に記載のとおりにして、分離し、 配列決定した。分離されたセイヨウナシＡＧＰ断片の配列Ａ−Ｋ−Ｓ−Ｏ−Ｔ− Ａ−Ｔ−Ｏ−Ｏ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｏ−Ｏ−Ｓ−Ａ−Ｖ（配列番号：３７）は、ヒド ロキシプロリン−富裕およびＯＡＳＴ−富裕を示した。この配列を、対応するセ イヨウナシＡＧＰ遺伝子の分離用に選択した。プロリンに対するこのコドンの使 用は、全プロリンコドンの７３．３％に相当するＣＣＡに対して強力にバイアス される；アラニンに係わるコドンは少ない程度ではあるが、ＣＣＴをバイアスす る（４４．８％）；他のアミノ酸に係わるコドンの使用における有意のバイアス は存在しない。 それぞれがヒドロキシプロリン−富裕ＡＧＰ区分をコードするＧＣ−富裕領域 を含むプライマーＡＦ１Ｔ３およびＡＲ２Ｔ７の配列を表５．１に示す。ＡＦ１ Ｔ３（配列番号：６４）は、Ｔ３プロモーター配列、すなわち分離されたＮ．プ ラムバギナホリアＡＧＰペプチド断片に相当する４２ｂｐＧＣ−富裕ヌクレオチ ド配列（配列番号：２７）およびＮａＡＧＰ１から位置１５０〜１６７までに相 当する１８ｂｐ配列（配列番号：２４）を包含する。ＡＲ２Ｔ７プライマー（配 列番号：６５）は、Ｔ７プロモーター、セイヨウナシからのヒドロキシプロリン −富裕（ＯＡＳＴ−富裕）ＡＧＰ配列（配列番号：３７）およびＮａＡＧＰ１ｃ ＤＮＡから位置４４４〜４６１までに相当する１８ｂｐ配列（配列番号：２４） からなる。 Ｔ７ポリメラーゼを使用することによってゲスマーオリゴヌクレオチド鋳型か らアンチセンスＲＮＡプローブを合成し、基本的に例３（ｂ）に記載されている とおりに、セイヨウナシ細胞懸濁培養物から作成されたｃＤＮＡライブラリイの スクリーニングに使用した。３種のｃＤＮＡクローンが分離され、その配列を決 定した。最長のクローンＰｃＡＧＰ９の配列（配列番号：６６）を図５Ａに示す 。このｃＤＮＡクローンは、８９３ｂｐの挿入体を含有し、そして１４５アミノ 酸残基の読取り枠をコードする。Ｎ−末端に推定分泌シグナルペプチドが存在す る。この予測ポリペプチドは、Ｐｒｏ、Ａｌａ、ＳｅｒおよびＴｈｒが格別に豊 富であり（表５．２）、かつまた蛋白質配列決定によりセイヨウナシＡＧＰから 以前に得られた２種のペプチド配列：ＡＫＳＯＴＡＴＯＯＴＡＴＯＯＳＡＶ（配 列番号：３７）およびＶＴＡＯＴＯＳＡＳＯＯＳＳＴＯＡ（Ｓ）ＴＸＡ（配列番 号：３８）と正確にマッチする２種の配列を含有する。このＰｃＡＧＰ９配列（ 包含されている分泌シグナルを含む）は、１０．７９の推定ｐＩおよび１３．６ ２２ｋＤの見掛け分子量を与えた。このＰｃＡＧＰ９配列（分泌シグナルを含ま ない） は、１１．０７の推定ｐＩおよび１１．２３８ｋＤの見掛け分子量を与えた。 図５Ｃの水に対する性質のプロフィールに示されているように、このｃＤＮＡ は３つの領域を有する、すなわち分泌シグナルをコードするＮ−末端疎水性配列 、大部分のプロリン残基を含有する中央親水性領域およびトランスメンブラン ヘリックスであると予測できる末端領域を有する。この成熟蛋白質のＮ−末端は 、分泌シグナルのプロセッシングから予測される配列に相当する。中央領域内の プロリン残基は主としてヒドロキシル化されており、かつまたグリコシル鎖を保 有している。ニコチアナ アラタの花柱からのＡＧＰの蛋白質幹鎖をコードする ｃＤＮＡは、類似の特徴を有する３つの領域を有する。これらの３つのｃＤＮＡ によりコードされる蛋白質のアミノ酸組成は類似しているが、唯一の共通配列は 、成熟蛋白質のＮ−末端配列にある：Ｑ−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ａ−Ａ（配列番号：７３ ）。これらのｃＤＮＡは、これらのプロテオグリカン類の量的主要部分である植 物抽出物中に存在する数種からの単一ＡＧＰの蛋白質幹鎖をコードする。 この配列の中央部分（アミノ酸２４〜１２３）は、４種のアミノ酸（Ｐｒｏ、 ２９％；Ａｌａ、１９％；Ｓｅｒ、２３％およびＴｈｒ、１５％）により占めら れている。この配列の当該部分の主要特徴は、これら４種の残基が相互に散在し ていることにある；ここには、明白なモチーフは存在せず、およびまたどのアミ ノ酸についても数個の連続は存在していない。Ｎ−グリコシル化部位も予測され ない。 ２２アミノ酸残基のＣ−末端領域は、非常に疎水性であり、かつまたトランス メンブラン ヘリックスであるものと予測される［Eisenberg等によるJ．Mol．B iol.,１７９：１２５〜１４２（１９８４）；Klein等によるBiochem.Biophyl．A cta，８１５：４６８〜４７６（１９８５）；Rao等によるBiochem．Biophyl．Ac ta，８６９：１９７〜２１４（１９８６）］。Ｃ−末端トランスメンブランヘリ ックスと細胞外領域との間の境界付近に、数個の潜在的分裂部位が存在する［エ ンドプロテアーゼＡｓｐ−Ｎ、Ａｌａ¹¹⁴／Ａｓｐ¹¹⁵、Ｖ８プロテアーゼ、Ａｓ ｐ¹¹⁵／Ａｌａ¹¹⁶、クロストリパイン(Clostripain)およびトリプシン(Trypsin) 、Ａｒｇ¹²⁷／Ｖａｌ¹²⁸）［Allen等によるSequencing of Proteins and Peptid es（第二版）（１９８９）；DrapeauによるCan.J.Chem.，５６：５３４〜５４４ （１９７８）；J．Biol．Chem.，２５５：８３９〜８４０（１９８０）］。数個 の分裂部位が存在するトリプシンの場合を除いて、これらは当該配列内の一つの 分裂部位を表わす。 ＰｃＡＧＰ９ｃＤＮＡをプローブとして使用して、双子葉植物［ピルス(Pyrus )、ニコチアナ(nicotiana)、ブラシカ（Brassica）、アラビドプシス(Arabidops is)およびリコペルシコン（Lycopersicon）］および単子葉植物［ロリウム（Lol ium）］の両方を代表する６種の植物からのＲＮＡを含有するノザン法分析を行 った（図５Ｂ）。強い緊縮の下に（６５℃）、ピルス コムニスの懸濁培養細胞 からのＲＮＡ試料で、０．９ｋｂ転写産物が検出された。Ｎ．プラムバギナホリ ア懸濁培養細胞におけるより大型の転写産物とともに同一植物の小花柄で、より 小型の転写産物が検出された（図５Ｂ−２）。減じられた緊縮の下に（５５℃） 、被験単子葉植物および双子葉植物の両方のＰｃＡＧＰ９に対して相同性のＡＧ Ｐ遺伝子の発現を指令する、その他全部の被験ＲＮＡ試料でまた、ＲＮＡ転写産 物が検出された（図５Ｂ−１）。 このＰｃＡＧＰ９ｃＤＮＡはまた、Ｎ．アラタ花柱ｃＤＮＡ（ＡＧＰＮａＬ １クローン）に対して類似性を有する。両方の場合に、これらのｃＤＮＡクロー ンは、Ｐｒｏ、Ａｌａ、ＳｅｒおよびＴｈｒから主として構成される蛋白質配列 を予測させる。アミノ酸組成の類似性を除いて、これらのｃＤＮＡクローンの配 列同一性は僅かである。実際に、ＡＧＰＮａＬ ｌｃＤＮＡとＰｃＡＧＰ９ｃＤ ＮＡとは、ＲＮＡブロット分析において、中程度ないし強度の緊縮の下に、交差 ハイブリド化しなかった。ＡＧＰＮａＬ １は、試験した組織の大部分でシング ル７００〜７５０ｎｔ転写産物を検出し、他方ＰｃＡＧＰ９は８００〜９００ｎ ｔのｍＲＮＡを検出した。別のＡＧＰ類似ペプチドは配列が、Ｎ．プラムバギナ ホリア、セイヨウナシ、Ｌ．マルチフロラム（L．multiflorum）およびトウモロ コシ懸濁細胞培養濾液からのヒスチジン−富裕ＨＲＧＰから報告されている［Ki eliszewski等によるPlant Physiol.,９９：５３８〜５４７（１９９２）］。さ らにまた、これらのペプチドは、正確な配列は相違しているが、主としてＨｙｐ 、ＡｌａおよびＳｅｒからなる。例えば、Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ反復 はＬ．マルチフロラムには存在するが、ＡＧＰＮａＬ １およびＰｃＡＧＰ９ｃ ＤＮＡからの予測アミノ酸配列中には存在しない。 本発明のもう一つの態様において、もう１種のＰ．コムニスｃＤＮＡ（ＰｃＡ ＧＰ２；配列番号：９１）が分離され、ＰｃＡＧＰ９（配列番号：６６）および ＰｃＡＧＰ２３（配列番号：４９）クローンの両方から相違していることが示さ れた。このＰｃＡＧＰ２ｃＤＮＡをクローン化する方法は、ＰｃＡＧＰ９ｃＤＮ Ａの場合と基本的に同一であった（例５）。 ＦＰＬＣでピーク２Ｂとして精製され、ＡＥＡＥＡＯＴＯＡＬＱＶＶＡＥＡＯ ＥＬＶＯＴＯＶＯＴＯＳＹ（配列番号：８８）のアミノ酸配列を有する１０ｋ蛋 白質を、対応するセイヨウナシＡＧＰ遺伝子の分離に選択した。２つの逆向きお よび部分相補的長鎖「ゲスマー」［ＡｃＦ１（配列番号：８９）およびＡｃＲ２ （配列番号：９０）、表５．３］を合成した。 この「ゲスマー」においては、全アミノ酸について第三コドンの位置で、ヌク レオチドＡを使用して、ＣＴＡおよびＴＣＡはＬｅｕ残基およびＳｅｒ残基が予 測された。これら２種の「ゲスマー」の３′の最後の１８ｂｐは、逆向き−相補 的であり、これらをＰＣＲで相互にアニーリングして、アミノ酸配列Ａ−Ｅ−Ａ −Ｅ−Ａ−Ｏ−Ｔ−Ｏ−Ａ−Ｌ−Ｑ−Ｖ−Ｖ−Ａ−Ｅ−Ａ−Ｏ−Ｅ−Ｌ−Ｖ−Ｏ −Ｔ−Ｏ−Ｖ−Ｏ−Ｔ−Ｏ−Ｓ−Ｙ（配列番号：８８）のアミノ酸配列をコード する１０１ｂｐの二重鎖ＤＮＡ断片を生成した。このＰＣＲ断片をpBluescript II（Ｋｓ）ベクター中にサブクローン化した。この１０１ｂｐＤＮＡ断片から、 Ｔ３ＲＮＡを使用して、³²Ｐ−標識したアンチセンスＲＮＡプローブを合成し、 セイヨウナシｃＤＮＡライブラリイのスクリーニングに使用した。５つのｃＤＮ Ａクローンを分離し、配列決定した。１０４０ｂｐのコンセンサス配列を図５Ｅ に示す。このｃＤＮＡを、ＰｃＡＧＰ２と命名する（配列番号：９１）。 このＰｃＡＧＰ２ｃＤＮＡ配列は、２９４残基のポリペプチドをコードし、４ 領域に分割することができる（図５Ｅ）。最初の２０アミノ酸配列は、疎水性で あり、Ｓｅｒ²⁰とＰｈｅ²¹との間に潜在的分裂部位を有する分泌シグナルである と予測される。第二の領域（残基２１〜５１）は、Ａｓｎが富裕であり、５個の Ａｓｎ残基の伸長部分を含有する。第三の領域（残基５２〜１３５）は、Ｐｒｏ 、Ａｌａ、ＴｈｒおよびＧｌｕが富裕である。これら４種の残基の大部分は、こ の 領域に位置している。この領域はまた、蛋白質配列決定により得られるペプチド 配列の全部を包含している。第四の領域（残基１３６〜２９４）は、Ａｓｎおよ びＧｌｙが富裕であり、３４残基の２つの直接反復配列を含有する。この予測蛋 白質のアミノ酸組成は、シグナル配列を除いて、ピーク２Ｂ［これは、Ａｓｎ（ １４．２％）、Ｇｌｕ（８．０％）、Ｇｌｙ（１０．５％）およびＳｅｒ（９． １％）が富裕である（表３．５）］中のグリコシル化ＡＧＰまたは脱グリコシル 化ＡＧＰから得られたものとは相違していた。しかしながら、残基５３〜８８か らの配列は、ピーク２Ｂ中のＡＧＰから得られたアミノ酸組成と密接に一致する アミノ酸組成を有する。 以下に記載するように、蛋白質および蛋白質断片の分離および精製のための標 準的技法、配列決定、クロマトグラフイ、クローニング、ＤＮＡ分離、増幅およ び精製、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどを 包含する酵素を用いる反応、ＰＣＲ技法および種々の蛋白質分離および精製技法 は、公知の技術であり、当業界で一般的に採用されている。多くの標準技法は下 記の刊行物に記載されている：DeutscherによるMethods in Enzymology，１８２ ：３０９〜５３９（１９９０）；Maniatis等によるMolecular Clorning，Cold S pring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York（１９８２）；Wu（ 編集）によるMeth．Enzymol.,６８（１９７９）；Sambrook等による上記刊行物 （１９８９）；Wu等によるMeth．Enzymol.,１００および１０１(１９８３)；Gro ssmanおよびMoldave（編集）によるMeth．Enzymol.,６５（１９８０）；Miller （編集）によるExperiments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Labo ratory，Cold Sping Harbor，New York（１９７２）；OldおよびPrimroseによる Principles of Gene Manipulation，University of California Press，Berkele y(１９８１)；SchleifおよびWensinkによるPractical Mehtod of Molecular Bio logy（１９８２）；Glover（編集）によるDNA Cloning．Vol ＩおよびII，IRL P ress，Oxford，UK（１９８５）；HamesおよびHiggins（編集）によるNucleic Ac id Hybridization，IRL Press，Oxford,UK（１９８５）；Setlow，Hollaenderに よるGenetic Engineering：Principles and Methods，Vol.１〜４，Plenum Pres s，New York（１９７９）；およびDeutscher（編集） によるGuide to Protein Purification，Academic Press，New York(１９９０) 。ここで使用されている略語および命名は、当業界で標準であると見做し、本明 細書で引用されているような専門誌でも慣用されている。 本発明の目的が、ここに開示されている方法および技術の周知の変法、修飾ま たは均等物を使用して、高額な独特の実験を必要とすることなく達成することが できることは当業者にとって明白である。当業者はまた、本明細書に特別に記載 されている手段以外の別の手段を、意図する蛋白質精製におよびまた本明細書に 記載されている分子のフラクション特徴の入手に利用できること、さらにまた本 発明の分子の機能上の均等物を得るための別法を如何に使用するかについては、 当業者の認識できることである。本発明は、当業者に認識されるており、かつま た本発明の精神および範囲に包含される、これらの変法、修飾、代用および均等 物を包含するものとする。 下記の例は、本発明をより充分に明確にするために提供するものであって、本 発明の範囲を制限するものではない。本発明の精神および範囲から逸脱すること なく、本明細書に記載の方法および遺伝子に関して種々の修飾をなしうることは 、当業者に認識されることである。 例１ ＡＧＰ含有植物細胞からＡＧＰペプチドを分離および精製するための一般方法 １．細胞懸濁培養物の調製 ＡＧＰ含有植物細胞の懸濁培養は、細胞増殖の品質を増強および改善するため に当業界で慣用されているように、植物ホルモン類、因子、緩衝剤、塩類などが 補給されている、ムラシゲ(Murashige)およびスコーグ(Skoog)の培地［Physiol ．Plant，１５：４７３〜４９７（１９７７）］で発芽させた実生の子葉から開 始した。 ２．植物組織抽出物の調製 植物を、市販の種子から成長させ、標準ガラス温室条件の下に維持した。 ３．総合的ＡＧＰの分離 総合的ＡＧＰは、その培養培地からヤリブ試薬［Yariv等によるBiochem．J.， １０５：１Ｃ（１９６７）］によりＡＧＰを沈殿させ、次いでこのヤリブ試薬複 合体を解離させ、次いでＡＧＰを採取することによって、調製した。別法として 、総合的ＡＧＰは、(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄沈殿、アニオン交換クロマトグラフイおよび （または）イムノアフィニティクロマトグラフイ（例えば、Ｇａｌ１−６−Ｂ− Ｇａｌ配列に特異性の抗体を使用する）、引続くゲル濾過クロマトグラフイ（例 えば、スペロース［superose］マトリックスを使用する）によって、植物組織抽 出物から調製した。 この総合的ＡＧＰプラクションのＡＧＰを、イオン交換または逆相ＨＰＬＣの どちらかを使用して分離した。各ＡＧＰを次いで、アミノ酸配列決定に付した。 別法として、総合的ＡＧＰフラクションを、例えばＴＦＭＳまたはＨＦを用いて 脱グリコシル化し、この脱グリコシル化ＡＧＰをＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは逆相Ｈ ＰＬＣで分離し、次いでアミノ酸配列決定用に調製した。いくつかの場合に、こ のペプチドを、蛋白質分解酵素で処理することによって消化し、その後に相違し て脱グリコシル化されているペプチドを分離した。 ヒドロキシプロリン−富裕ＡＧＰ断片を、各種の特徴、例えば極性、免疫原性 などに基づくクロマトグラフ法により、ヒドロキシプロリン−貧弱断片から分離 した。例えば、アミノ酸Ｒ−基ヒドロキシルまたは抗体に対して特異性のリガン ドをＯＡＳＴ−富裕であるヒドロキシプロリン−富裕ペプチド断片に結合させる アフィニティクロマトグラフイ支持体を使用して、ヒドロキシプロリン−富裕ペ プチドを優先的に保有させた。ヒドロキシプロリン−富裕断片とヒドロキシプロ リン−貧弱断片との分離に有用な他の蛋白質精製技術は、DeutscherによるGuide to Protein Purification Methods in Enzymology,１８２（１９９０）に見出 される。 例２ ニコチアナ アラタ(Nicotiana alata)およびＮ，プラムバ ギナホリア(N．p lumbaginafolia)からのＡＧＰの蛋白質幹鎖をコードする遺伝子のクローン化 （ａ）ニコチアナ アラタの懸濁培養物からのＡＧＰペプチドの分離および精製 １．懸濁培養物の調製 Ｎ．アラタ細胞の懸濁培養を、１g／リットルのｍｙｏ−イノシトール、２g／ リットルのＭｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ５．７）、４％（重量／容量）のスクロース、 ０．１mg／リットルのギベレル酸（gibberellic acid）および５mg／リットルの α−ナフタレン−酢酸が補給されているムラシゲおよびスコーグの培地［上記刊 行物（１９７７）］で発芽させた実生の単子葉植物から開始した。これらの細胞 を、ギベレル酸を含有していない以外は同一の培地で毎週継代培養した。 ２．ＡＧＰの精製および脱グリコシル化および配列決定 Ｎ．アラタの細胞を、２層のミラクロス(Miracloth)に通す濾過により培養培 地から分離した。この上清を遠心処理して（１０，０００ｘｇ；５０分間）、す べての細胞残査を除去した。この上清に、ＮａＣｌおよびβ−グルコシルヤリブ 試薬（Yariv等による、１９６７）をそれぞれ１％および０．２％の最終濃度ま で添加した。このＡＧＰ−ヤリブ複合体を遠心処理（１０，０００ｘｇ；５０分 間）によりペレット化し、１％ＮａＣｌにより２回洗浄し、次いで上記のとおり に遠心処理した。このペレットをＨ₂Ｏ中に溶解し、未溶解物質を遠心処理（１ ０，０００ｘｇ；２０分間）により除去した。このＡＧＰ−ヤリブ複合体を、１ ％までのＮａＣｌの添加により再沈殿させ、この沈殿を洗浄し、次いでＨ₂Ｏ中 に再溶解した。このヤリブ沈殿およびＮａＣｌ洗浄工程を２回反復した。このＡ ＧＰ−ヤリブ沈殿を、最終的にＨ₂Ｏ中に溶解し、次いで亜二チオン酸ナトリウ ム（３０％）を添加して、ＡＧＰ−ヤリブ複合体を分解させた。この試料の容積 をジアフロ（Diaflo）（ＹＭ３０膜；Ｍｒ３０，０００ダルトン排除）濾過によ り減少させ、次いでこの溶液を、１０mM ＮＨ₄ＨＣＯ₃で平衡にしたＰＤ１０カ ラム(Pharmacia)に通すことによって脱塩した。 Ｎ．アラタからのＡＧＰを、エッジ（Edge）等の方法（１９８１）の変法を用 いて、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳ）により脱グリコシル化した。 この脱グリコシル化ＡＧＰをラエミリ(Laemmli)（１９７０）に従い、１７．５ ％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。１７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを２００Ｖで 、上部貯蔵槽中のチオグリコール酸（１mM）を用いて操作し、前後に移動する染 料をゲルの底部に到達させた。このペプチドを、ブロッティング用緩衝液［１０ mM３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）緩衝液 （ｐＨ１１）、１５％メタノール、チオグリコール酸（７０μl／リットル）］ によりＰＶＤＦ膜上にトランスブロッティングした。このブロッティングは、冷 却しながら９０Ｖで１．５時間行った。このブロットを、５０％メタノール、１ ０％酢酸中の０．１％コマシーブルーにより５分間染色し、次いで５０％メタノ ール、１０％酢酸中で５分間脱塩させた。このブロットを蒸留水により一夜にわ たり洗浄し、次いでバンドを削り取り、次いで配列決定した。約２０〜３０ｋＤ の分子量を有する主要バンドが、脱グリコシル化Ｎ．アラタＡＧＰから得られた 。 ３．配列決定 精製した蛋白質を、逆相ＨＰＬＣ微孔質カラムでクロマトグラフイに付し、次 いで気相セークエンサー(sequencer)で自動式エドマン(Edman)分解に付した［Ma u等によるPlanta,１６９：１８４〜１９１（１９８６）］。グレゴ等により開示 されたＨＰＬＣにより［Grego等によるEur．J．Biochem．，２６４：８５７〜８ ６２（１９８５）］、フェニルチオヒダントインアミノ酸を分析した。Ｎ−末端 アミノ酸配列：Ａ−Ｋ−Ｓ−Ｋ−Ｆ−Ｍ−Ｉ−Ｉ−Ｐ−Ａ−Ｓ−Ｘ−Ｔ−Ｘ−Ａ （配列番号：１１）が得られた。 （ｂ）Ｎ．アラタおよびＮ．プラムバギナホリア細胞培養物からの遺伝子のクロ ーン化 １．ｃＤＮＡの５′−末端のインビトロ増幅 Ｎ．アラタ懸濁培養細胞からの総合的ＲＮＡ（１０μg）を、４０mM ＰＩＰ Ｅ Ｓ（ｐＨ６．０）、１mM ＥＤＴＡおよび０．４Ｍ ＮａＣｌの１０μl中 で、１．０pmolの遺伝子特異性放射性プライマーと混合した。この混合物を、８ ０℃で５分間加熱し、次いで３７°で一夜にわたりインキュベートした。このＲ ＮＡ／プライマー混合物を、エタノールにより沈殿させ、次いで５０mMトリス− ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、６０mM ＫＣｌ、１０mM ＭｇＣｌ₂、１mM ＤＴＴ、 ２０ＵのＲＮアーゼ阻害剤および５０ＵのＡＭＮ逆転写酵素を含有する逆転写緩 衝液中に再懸濁した。１時間のインキュベーションの後に、この反応をＥＤＴＡ の添加により停止させた。このＲＮＡを、ＲＮアーゼで処理することによって分 離し、このプライマー伸長生成物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精 製した。 このプライマー伸長生成物に、ターミナルトランスフェラーゼによってｄＧＴ Ｐにより尾部を付け（tailed）、次いで（ｄＣ）₁₅アダプター プライマーおよ び遺伝子特異性プライマーを用いるＰＣＲによって増幅させた。このＰＣＲは、 次の成分を含有する溶液１００μl中で行った：１×ＰＣＲ緩衝液［１００mMト リス−ＨＣｌ（Ｈ８．３）、５００mM ＫＣｌ］、２mM ＭｇＣｌ₂、２００μM ｄＮＴＰｓ、１００mgのポリｄＣプライマー、１００〜２００ngの遺伝子特異 性プライマーおよび２．５ＵのＴａｇＤＮＡポリメラーゼ。試料を、５分間沸騰 させることによって変質させ、次いで８０°に冷却し、次いでＴａｇＤＮＡポリ メラーゼを添加した。このＰＣＲサイクルは次のとおりであった：２５Ｘ：９３ °、３０秒；４２°、３０秒；７２℃、２分；４Ｘ：９３°、３０秒；４２°、 ３０秒；７２°、５分および１Ｘ：９３°、３０秒；４２°、３０秒；７２°、 １０分。このＰＣＲ生成物をサブクローン化し、次いで配列決定した。 ２．ｃＤＮＡの３′−末端のインビトロ増幅 １０μgの総合的ＲＮＡ、１×ＰＣＲ緩衝液、５０mM ＭｇＣｌ₂、１０mM ｄ ＮＴＰｓ、５μMのｄＴ（₁₇）＋アダプター、３０ＵのＲＮアシンおよび５０Ｕ のＡＭＶ逆転写酵素を含有する溶液２０μl容積中で、４２°において１時間で ｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡ（２μl）を、この場合のアニーリング温度 が６０°であることを除いて、上記のとおりにＰＣＲ反応に付した。 ３．ｃＤＮＡライブラリイのＰＣＲ断片によるスクリーニング 約５×１０⁴ｐｆｕファージ／プレート（λｚａｐ単位）のｃＤＮＡライブラ リイを採取した。３７°で一夜にわたり増殖させた後に、ファージを、ニトロセ ルロース膜上にブロッティングし、次いで２×ＳＳＰＥ、１％ＳＤＳ、０．５％ ＢＬＯＴＴＯ、１％ＰＥＧおよび０．５mg／mlキャリヤＤＮＡを含有するハイブ リド形成用緩衝液中で６８°において一夜にわたり³²Ｐ−標識したＤＮＡ断片と ハイブリド化した[Sambrook等による上記刊行物（１９８９）]。この膜を６８° において３０分間、１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中で洗浄し、次いでＸ−線フィ ルムにさらした。陽性のλｚａｐクローンを、配列分析に係わるストレータゲン （Stratagene）の指示マニュアルに記載のとおりのインビボ切り出しによりプラ スミドＤＮＡに変換した。 ４．細胞懸濁培養物からのＡＧＰの精製およびＮ−末端配列決定 精製したＡＧＰを、ＴＦＭＳにより脱グリコシル化し、生成するペプチドを、 １７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、次いでＰＶＤＦ膜上にブロッティ ングした。主要バンド（ＭＷ：２０〜３０ｋＤ）（図１Ｃ）を切り出し、次いで 配列決定に付した。Ｎ−末端ペプチド配列：Ａ−Ｋ−Ｓ−Ｋ−Ｆ−Ｍ−Ｉ−Ｉ− Ｐ−Ａ−Ｓ−Ｘ−Ｔ−Ｘ−Ａ（配列番号：１１）が得られた。 ５．Ｎ．アラタｃＤＮＡからのＡＧＰ遺伝子のＰＣＲによるインビトロ増幅 ペプチド配列に対応する遺伝子のクローン化戦略は、図１Ｄに例示されている 。当該ＡＧＰアミノ酸配列の一部に対応する１７ｂｐの２群の縮重逆向きプライ マー(degenerate reverse primer)を合成した（表１．１）。群１プライマーを プライマー伸長実験で使用した場合には（図１Ｄ−１）、一重鎖１６０ｂｐｃＤ ＮＡ断片が得られた（図１Ｅ）。群１のプライマーを、それぞれが３つの１７− マーを含有するように、６種の付属群に分けた（表１．１）。このプライマー伸 長実験は、群ＮａＲ１が１６０ｂｐ断片の最高収量をもたらすことを示した。従 って、これをプライマー伸長生成物の引続く大規模調製およびＰＣＲ実験におけ る遺伝子−特異性プライマーとして使用した。この１６０ｂｐプライマー伸長生 成物を精製し、次いでｄＧＴＰにより尾部を付けた。この尾部を付けた一重鎖ｃ ＤＮＡを次いで、オリゴＮａＲ１およびプライマーとして（ｄＣ）₁₅−アダプタ ーを用いるＰＣＲにより増幅させた（図１Ｄ−１）。このＰＣＲ断片を、サブク ローン化し、次いで配列決定した（配列番号：２１；図１Ｅ）。この配列は、分 離ＡＧＰペプチドから得られた配列（配列番号：１１）とマッチする誘導ペプチ ドを包含していた。この配列には、１つのミスマッチが存在していた。すなわち 、ペプチド配列決定から得られたＡｌａの代わりに、ｃＤＮＡ誘導配列にはＡｒ ｇが存在していた。この密接なマッチ（８／９アミノ酸）に基づいて、この１６ ０ｂｐ断片は、当該遺伝子の一部に対して正確な配列を示しているものと結論し た。 位置５６〜７８および１０１〜１２３（図１Ｅ）に対応する配列：５′ＣＡＴ ＴＡＴＧＧＧＴＣＡＴＴＴＣＡＣＴＡＡＧＣ３′（配列番号：２２）（ＮａＦ１ ）；５′ＧＧＴＧＡＴＣＴＣＡＡＣＴＣＣＡＴＴＧＧＴＧＣ３′（配列番号：２ ３）（ＮａＦ２）を有する２種の特異性プライマーを次いで、デザインし、２種 の３′−末端非特異性プライマー（Ａｄ１およびＡｄ２）と組合わせて使用し て、紙合わせＰＣＲによるＡＧＰ遺伝子の３′一部分を増幅させた（図１Ｄ−２ ）。１．６ｋｂ断片を増幅させ、次いで配列決定した。これらの２種のＰＣＲ反 応から得られた配列の整列は、１６７９ｂｐのＤＮＡ配列をもたらした（図１Ｆ ）。この１６０ｂｐ断片は、２つのミスマッチ、すなわち１位置Ａｒｇの代わり にＡｌａおよび１２位置のＰｒｏの代わりにＨｉｓを有する蛋白質配列決定によ り得られたペプチドを含有する蛋白質をコードする（図１Ｆ）。 ６．Ｎ．アラタおよびＮ．プラムバギナホリアｃＤＮＡライブラリからのｃＤＮ Ａクローンの分離および配列分析 １．６ｋｂＰＣＲ断片を使用して、懸濁培養中のＮ．アラタ細胞から分離され たＲＮＡから作成されたｃＤＮＡライブラリイをスクリーニングし、３種の陽性 クローンを分離し、次いで配列決定した。このＰＣＲ配列をｃＤＮＡにより整列 させて、７ｂｐのポリ（Ａ）尾部を有する１７００ｂｐ配列を生成させた（図１ Ｆ）。この配列をＮａＡＧＰ１（配列番号：２４）と命名する。引続く伸長実験 は、この１．７ｋｂＮａＡＧＰ１ｃＤＮＡがＡＧＰ転写産物の完全鎖配列を示す ことを示唆した。 このＮａＡＧＰ１ｃＤＮＡは、読取り枠をコードする。この読取り枠は、６０ 位置の開始コドン（ＡＴＧ）から始まり、１４４３位置の末端コドン（ＴＡＡ） で終了する（図１Ｆ）。 ７．予測ＡＧＰ遺伝子のノザン法分析およびサザン法分析 このＮａＡＧＰ１を、翻訳されない部分に相当する５′半分（１〜５４０）、 トランスメンブラン ヘリックスおよびプロリン−富裕領域、およびアスパラギ ン富裕領城、Ｃ−末端および３′翻訳されない部分を包含する３′半分（５４１ 〜１７００ｂｐ）に切断した。このｃＤＮＡのこれらの２部分を別々にプローブ として使用して、Ｎ．アラタおよびＮ．プラムバギナホリアの懸濁培養細胞およ びＮ．アラタ植物の各種組織から分離されたＲＮＡのノザン法分析を行った［Sa mbrook等による上記刊行物(１９８９)］。 （ｃ）ニコチアナ プラムバギナホリアの懸濁培養物からのＡＧＰペプチドの分 離および精製 １．Ｎ．プラムバギナホリア バイオポリマーからの生の総合的ＡＧＰの分離 生の総合的ＡＧＰを、ヤリブ沈殿に先立ち、ＣＴＡＢ（ヘキサデシルトリメチ ルアンモニウムブロマイド）沈殿に付して出発物質のペクチン類を除去した後に 、ヤリブ試薬を用いる沈殿により、バオポリマー生成物から生の総合的ＡＧＰを 精製した。細胞懸濁培養物からの培地を濾過により細胞から分離し、次いで高分 子量物質を４倍量のエタノールにより沈殿させた。これをバイオポリマー生成物 と称する。 このバイオポリマー生成物（１g）を、１％ＮａＣｌ溶液（１００ml）中に溶 解し、次いで２層のミラクロスに通して濾過した。濾液を遠心処理し（１０，０ ００ｘｇ、１０分間）、上清を採取した。等量のＣＴＡＢ溶液（２０mM Ｎａ₂ ＳＯ₄中の２％ＣＴＡＢ）を添加した。３７°で１時間のインキュベーション後 に、この溶液を２層のミラクロスに通して濾過し、次いで遠心処理（１０，００ ０ｘｇ、２０分間）して、全ての残留沈殿を除去した。この上清に４倍量のエタ ノールを添加し、次いで遠心処理（１０，０００ｘｇ、２０分間）した。このペ レットを１％ＮａＣｌ溶液１００ml中に溶解し、次いで例２（ａ）２に記載のと おりに、ヤリブ試薬によりＡＧＰを沈殿させた。この脱塩したＡＧＰ試料を、６ Ｍグアニジニウム−ＨＣｌ中に溶解し、次いで５０°で１５分間インキュベート した。この試料を次いで、６Ｍ尿素および２０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８） により平衡にしたＦＰＬＣ スペルデックス(Superdex)７５（登録商品名）カラ ムでクロマトグラフイに付した。ボイド（Ｖｏ）フラクションを採取し、蒸留水 に対して透析し、次いで凍結乾燥させた。この試料は生の総合的ＡＧＰである。 この生の総合的ＡＧＰを、２経路のうちの１経路により処理した： 経路１：脱グリコシル化し、次いで逆相ＨＰＬＣに付し、次いで直接配列決定 するか、または酵素による消化（蛋白質分解）の後に配列決定する。 経路２：逆相ＨＰＬＣ分別に付し、次いで脱グリコシル化し、次いで逆相ＨＰ ＬＣ分別に付して、さらに分離する。 経路１［この経路は、工程（２）〜（５）からなる］ （２）無水ＨＦを用いる生の総合的ＡＧＰの脱グリコシル化 ＡＧＰ試料を減圧オーブン中で４０°においてＰ₂Ｏ₅の存在の下に乾燥させた ；無水ＭｅＯＨ ０．２mlおよび無水ＨＦ １ml［MortおよびLamportによる Anal．Biochem.，８２：２８９〜３０９（１９７７）］を添加し、次いで充分に 混合して、試料の全部を溶解した。この混合物を、室温でアルゴン雰囲気の下に ３時間インキュベートし、次いで減圧吸引によりＨＦを除去した。氷冷ＴＦＡ（ ０．５ml）を添加し、次いでこの試料を０．１％ＴＦＡにより平衡にしたＰＤ１ ０カラムで脱塩し、次いで凍結乾燥させた。この試料を、総合的脱グリコシル化 ＡＧＰと称する。 （３）総合的脱グリコシル化ＡＧＰ試料の還元およびカルボキシメチル化 総合的脱グリコシル化ＡＧＰ試料を、６Ｍグアニジニウム−ＨＣｌ（０．２Ｍ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５および２０mM ＤＴＴ；６００μl中）に溶解し、 次いでアルゴン雰囲気の下に２時間、２５°でインキュベートした。新しく調製 したヨウド酢酸（１００μl）を添加した。この混合物を、２５°で３時間イン キュベートし、次いでＤＴＴを１００mMまで添加して停止させ、次いで希釈後に 、上記のとおりにクロマトグラフイに付した。 （４）総合的脱グリコシル化ＡＧＰのＨＰＬＣ分離 還元およびカルボキシメチル化の後に、この総合的脱グリコシル化ＡＧＰを、 ＲＰ−３００ＨＰＬＣカラムにおいて直線勾配（６０ml）（０〜１００％溶剤Ｂ ；流動速度：１ml／分）（溶剤Ａ：水中０．１％ＴＦＡ、溶剤Ｂ：溶剤Ａ中６０ ％アセトニトリル）を用いて分離した。このプロフィールを図２Ａに示す。２つ の主要ピークＲＴ２１およびＲＴ３２（保有時間：ぞれぞれ２１分および３２分 ）を採取し、さらに分析する。両ピークについてアミノ酸分析を行った（表２． １参照）。このＲＴ３２ピークは、さらに処理することなく、配列決定に付した 。ＲＴ２１ピークは、テルモリシン消化した後に、配列決定に付した。 （５）ＲＴ２１のテルモリシン消化 ＲＴ２１試料（１２μg）を濃縮し、次いでツイーン２０を添加して、０．０ １％のツイーン２０最終濃度を有する最終容積を１００μlにした。ＮＨ₄ＨＣＯ₃ （０．０１％ツイーン２０中の１％；５００μl）、ＣａＣｌ₂（０．１Ｍ：７ μl）およびテルモリシン（１mg／ml；７μl）を添加し、この混合物を５５°に おいて３時間インキュベートした。この生成物を逆相ＨＰＬＣで精製し、次いで 配列決定に付した。得られたペプチド配列を図２Ａに示す。こ の配列を使用して、クローン化用のプライマーを構築した。ＲＴ２１からの配列 Ｌ−Ａ−Ｓ−Ｏ−Ｏ−Ａ−Ｏ−Ｏ−Ｔ−Ａ（配列番号：２６）、Ｌ−Ａ−Ｓ−Ｏ −Ｏ−Ａ−Ｏ−Ｏ−Ｔ−Ａ−Ｄ−Ｔ−Ｏ−Ａ（配列番号：２７）、Ｆ−Ａ−Ｏ− Ｓ／Ｎ−Ｇ−Ｇ−Ｖ−Ａ−Ｌ−Ｐ−Ｏ−Ｓ（配列番号：２８）、およびＩ−Ｇ− Ａ−Ａ−Ｏ−Ａ−Ｇ−Ｓ−Ｏ−Ｔ−Ｓ−Ｓ−Ｐ−Ｎ（配列番号：２９）は、Ｎ． アラタ花柱のフラクションＲＴ２５から得られた配列と同一であるか、または類 似しており（図４Ｃ）、保存されていた組織−非特異性Ｎ．アラタ断片を表わし た。 ピーク３２は、配列Ｒ−Ｋ−Ｓ−Ｋ−Ｆ−Ｍ−Ｉ−Ｉ−Ｐ−Ａ−Ｓ−Ｏ−Ｔ− Ｏ−Ａ−Ｏ−Ｔ−Ｏ−Ｉ−Ｎ−Ｅ−Ｉ−Ｓ−Ｆ（配列番号：３０）を有し、その ５′−末端がＮ．アラタ懸濁培養物から得られたＮ−末端配列（配列番号：１） と非常に密接にマッチしていた。 経路２［この経路は、工程（６）〜（８）からなる］ （６）生の総合的ＡＧＰのＨＰＬＣ分別 生の総合的ＡＧＰ試料を、６Ｍグアニジニウム−ＨＣｌ中に溶解し、５０°で １５分間放置した。この試料を次いで、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−３００；４．６mm ×１０cmカラム）において直線勾配（６０ml）（０〜１００％溶剤Ｂ；流動速度 ：１ml／分）（溶剤Ａ：水中０．１％ＴＦＡ、溶剤Ｂ：溶剤Ａ中６０％アセトニ トリル）を用いて、分別した。この分離から多くの主要ピークが得られた。これ らのピークはいずれも、ゲル拡散試験でヤリブ試薬と反応した（van Holstおよ びClarke、１９８５）（未結合、ＲＴ５、ＲＴ６、ＲＴ１０、ＲＴ２１〜２３お よびＲＴ３４）（図２．２）。各フラクションを、バンホルストおよびクラーク （１９８５）により開示されたとおりにして［van HolstおよびClarke、１９８ ５］、ＡＧＰ含有量について定量した。生のＡＧＰの各フラクションのアミノ酸 分析を表２．１に示す。 （７）ＨＰＬＣからの生のＡＧＰフラクションの脱グリコシル化 逆相ＨＰＬＣからの生のＡＧＰフラクション（図２Ｂ）をそれぞれ、上記した とおりに、無水ＨＦを用いて脱グリコシル化した。 （８）脱グリコシル化ＡＧＰのＨＰＬＣ分離 脱グリコシル化の後に、各試料を還元し、次いでカルボキシメチル化し、引続 いて逆相ＨＰＬＣ分離に付した（図２Ｃおよび２Ｄ）。得られたフラクションを 保存し、引続いて配列決定に付した。 例３ Ｐ．コムニス懸濁培養細胞からのＡＧＰの蛋白質幹鎖をコードする遺伝子のク ローン化（ＰｃＡＧＰ２３クローン） （ａ）ピルス コムニス（セイヨウナシ）細胞培養物からのＡＧＰペプチドの分 離および精製 １．ピルス コムニス（セイヨウナシ）バイオポリマーからの生の総合的ＡＧＰ の分離および精製 総合的ＡＧＰを、例２（ｃ）１にニコチアナ プラムバギナホリアのＡＧＰに 関して記載されているとおりに、セイヨウナシ バイオポリマーからのヤリブ沈 殿により精製した。このＡＧＰを脱グリコシル化し、生成するペプチドを逆相Ｈ ＰＬＣ（ＲＴ−３００）（経路１）により分離した。別法として、この生の総合 的ＡＧＰを、逆相ＨＰＬＣ（ＲＴ−３００）（経路１）により分離し、脱グリコ シル化し、テルモリシンにより消化し、次いでこのペプチドを配列決定用に精製 した。 経路１［この経路は、工程（２）および（３）からなる］ （２）配列決定用総合的脱グリコシル化ＡＧＰのＨＰＬＣ分離 生の総合的ＡＧＰを、ＨＦを用いて脱グリコシル化した。この試料を、例２（ ｃ）２に記載のとおりに、還元し、カルボキシメチル化し、次いで逆相ＨＰＬＣ （ＲＴ−３００）により分離した。このプロフィールを図３Ａに示す。主要ピー クのアミノ酸分析を表３．１にまとめて示す。 （３）Ｃ１８微孔質カラムにおけるテルモリシン消化ピークの分離 脱グリコシル化したＡＧＰフラクション（図３Ａからの未結合、ＲＴ１６．４ およびＲＴ１８．２）を、テルモリシン消化に付した。この生成物をＲＰ−３０ ０カラムにおいて、直線勾配（６ml）（０〜１００％Ｂ；流動速度：０．１ml／ 分）（溶剤Ａ：水中０．１％ＴＦＡ、溶剤Ｂ：溶剤Ａ中６０％アセトニトリル） を用いて、分離した。未結合フラクションは、消化後も未結合のままであった、 すなわちＲＰ−３００カラムに結合したペプチドは得られなかった。この消化Ｒ Ｔ１６．４に係わるＲＴ−３００プロフィールを図３Ｂに、そしてＲＴ１８．２ に係わるＲＴ−３００プロフィールを図３Ｃに示す。 テルモリシン消化したＲＴ１６．４（図３Ａ）からの各ピーク（ピーク１〜５ 、図３Ｂ）を、Ｃ１８微孔質カラム（２．１mm×１０cm）で分離し、直線勾配（ ５０ml、０〜１００％Ｂ；流動速度：０．１ml／分）（溶剤Ａ：１％ＮａＣｌ、 溶剤Ｂ：１００％アセトニトリル）を用いて溶離した。これらのピークを、同一 カラムにおいてＴＦＡ−アセトニトリル系（溶剤Ａ：０．１％ＴＦＡ、溶剤Ｂ： 溶剤Ａ中６０％メタノール；０．１ml／分で６０分間で０〜１００％Ｂ）を用い てさらに分離した。これらのピークをさらに分離させる溶剤系はなかった。これ らのピークのうちの３ピーク（ピーク１、３および５）は、アミノ酸配列決定に 付した。ピーク１は、純粋ペプチドであり、明確な配列Ｌ−Ｓ−Ｏ−Ｋ−Ｋ−Ｓ −Ｏ−Ｔ−Ａ−Ｏ−Ｓ−Ｏ−Ｓ−（Ｓ）−Ｔ−Ｏ−Ｏ−Ｔ−（Ｔ）（配列番号： ３１）を有していた。ピーク３および５は、単一のペプチドではなく、少なくと も２列の配列が、未確実なこれらの２ピークのそれぞれから得られた。ピーク３ は、配列：Ｖ／Ａ−Ａ／Ｔ−Ａ−Ｏ−Ｓ／Ｏ−Ｏ／Ｙ−Ｓ−Ｓ−Ｔ／Ａ−Ｘ−Ｏ −Ｓ−Ａ−Ｔ−Ｘ−Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｖ−Ａ（配列番号：３２）を有し、一方ピーク ５は、配列：Ｖ／Ａ−Ａ−Ｄ／Ａ／Ｏ−Ｓ／Ｏ−Ｔ／Ｏ／Ｋ−Ｏ−Ｓ／Ｏ−Ｐ− Ｑ−Ｓ（配列番号：３３）を有していた。 テルモリシン消化ＲＴ１８．２からの各ピーク（ピーク１〜５、図３Ｃ）を、 ＲＴ１６．４について上記したとおりにして分離した。一連のペプチドが得られ 、これらペプチドの配列を決定した： 最後の配列は、ＲＴ１６．４のピーク１から得られた配列と同一である。 経路２［この経路は、工程（４）〜（７）からなる］ （４）逆相ＨＰＬＣによる生の総合的ＡＧＰの分別 生の総合的ＡＧＰ試料を、基本的に例２（ｃ）２〜４に記載のとおりにして、 逆相ＨＰＬＣにより分離した。この分離から、多数の主要ピークが得られた。こ れらのピークは全て、ゲル拡散試験でヤリブ試薬と反応した（van HolstおよびC larke、１９８５）（未結合、ＲＴ７．８、ＲＴ１７．２およびＲＴ１９．１） （図３Ｄ）。未結合フラクションおよびＲＴ７．８フラクションのアミノ酸分析 を表３．１に示す。 （５）ＨＰＬＣからの生のＡＧＰフラクションの脱グリコシル化 逆相ＨＰＬＣからの生のＡＧＰフラクションのそれぞれを、例２（ｃ）（７） と同様に、無水ＨＦを用いて脱グリコシル化した。 （６）脱グリコシル化ＡＧＰのＨＰＬＣ分離 脱グリコシル化後に、各試料を前記のとおりに還元し、カルボキシメチル化し 、次いで逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−３００）で分離した。各試料のプロフィールを図 ３Ｅおよび図３Ｆに示す。図３Ｆの主要ピークＲＴ−１６〜１９は、図３Ｆのピ ークＲＴ１６〜１９．９の群と同様の保有時間を有する。これらのピークは、一 成分からあるいは密接に関連する一群の成分から生じることがある。 （７）脱グリコシル化セイヨウナシＡＧＰのテルモリシン消化 図３ＥからのピークＲＴ２３を、テルモリシンで消化し、生成するペプチドを 逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−３００）で精製した。６種のペプチドを選択し、配列決定 し、下記のアミノ酸配列を得た（これは、図３にも示されている）： （ｂ）Ｐ．コムニス細胞懸濁培養物からの遺伝子のクローン化 Ｎ．アラタおよびＮ．プラムバギナホリアからの遺伝子のクローン化に関して 記載の方法と基本的に同様の方法および処理に従い、Ｐ．コムニスからのＡＧＰ 遺伝子を得た。 Ｌ−Ｖ−Ｖ−Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｔ−Ｐ−Ｒ−Ｋ−Ｈ（配列番号：４１）配列（図３ Ｄおよび３Ｅ）に対応する一連のプライマーを、ＰＣＲ実験用にデザインし、合 成した（表３．２）。ＮａＡＧＰ１遺伝子のクローン化に使用された方法と同一 の組合わせＰＣＲ方法を使用して、上記ペプチドをコードする遺伝子をクローン 化する。ただし、この場合のアニーリング温度は、５２℃であった。第一プライ マーとしてＰｃＡ２３Ｆ１を、そして第二プライマーとしてＰｃＡ２３Ｆ２ａを 使用する２回のＰＣＲ反応の後に、３５０−ｂｐ断片を増幅させた。この断片を 配列決定に付し、正確なペプチド配列をコードすることが見出された（配列番号 ：４８；図３Ｇ）。 このＰＣＲ断片を使用して、Ｎ．アラタ細胞懸濁物に関して上記されていると おりに、セイヨウナシ細胞懸濁培養物からのｍＲＮＡから作成されたｃＤＮＡラ イブラリイをスクリーニングした。１つの陽性クローン（ＰｃＡＧＰ２３）を分 離し、配列決定した（配列番号：４９；図３Ｈ）。このクローンは、７６０ｂｐ の挿入体を含有しており、かつまたＰＣＲ配列とマッチしていた。 例４ ニコチアナ アラタの花柱からのＡＧＰペプチドをコードする遺伝子のクロー ン化 （ａ）ニコチアナ アラタの花柱からのＡＧＰペプチドの分離および精製 Ｎ．アラタの生の総合的ＡＧＰを、イオン交換クロマトグラフイ（ＩＥＣ）お よびゲル濾過クロマトグラフイ（ＧＦＣ）により精製した。これらのＡＧＰを次 いで、ＨＦにより脱グリコシル化し、次いで逆相ＨＰＬＣにより分別した。これ らの脱グリコシル化フラクションをテルモリシン消化した後に、ペプチド配列デ ータを得た。 １．生の総合的ＡＧＰの精製 花柱（柱頭を含む花柱５００〜１０００）を、新鮮なまま採取するか、または −７０℃で貯蔵した。この花柱を液体窒素の存在の下に、ポリビニルピロリドン （１％重量／容量）とともに粉砕し、次いで抽出緩衝液（５０〜１００ml；１０ ０mMトリス、ｐＨ８．１、１mM ＥＤＴＡ、１mM β−メルカプトエタノール） を添加した。この混合物を遠心処理し（１０，０００ｘｇ、２０分間）、細胞残 査を廃棄した。この抽出物を４°で９５％硫酸アンモニウムに取り、遠心処理し （１０，０００ｘｇ、２０分間）、次いで上清を採取し、ジアフロ（Diaflo）系 （ＹＭ−３０膜、Ｍｒ３０ｋＤ排除）を使用する限外濾過により約１０〜２０ml にまで濃縮した。この溶液を１０mMトリス（ｐＨ８）で平衡にしたＰＤ−１０カ ラム(Pharmacia)で脱塩した。この試料をＦＰＬＣモノ（Mono）Ｑカラムに適用 した（Pharmacia；緩衝液Ａ：１０mMトリスｐＨ８；緩衝液Ｂ：１０mMトリスｐ Ｈ８、１Ｍ ＮａＣｌ；勾配：０〜３０％Ｂ、１５分間、３０〜１００％Ｂ、０ ．１分間）。結合したＡＧＰフラクションを各試料に対するヤリブ試薬ゲル拡散 試験により検出した；ＡＧＰ含有フラクションは約５〜１５％緩衝液Ｂにより溶 離した（図４Ａ）。ＡＧＰフラクションを集め、ＰＤ−１０脱塩カラムを用いて １０mM ＮＨ₄ＨＣＯ₃中に平衡化し、凍結乾燥させ、次いで６Ｍ尿素、１０mMト リスｐＨ８中のスペロース６βカラム(Pharmacia)でさらに精製した（図４Ｂ） 。ＡＧＰ含有フラクションを上記と同様に、１０mM ＮＨ₄ＨＣＯ₃中に交換し、 次いで凍結乾燥させた。 この精製操作中の花柱ＡＧＰの回収は次のとおりである：粗製花柱抽出物（花 柱１０００）、１００％；９５％(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄−上清、６８．２％；モノＱア ニオン交換カラム、未結合ＡＧＰ５．４％、結合ＡＧＰ４４．５％、スペロース ６ゲル濾過カラム、２５．４％。相違する精製段階で、ＡＧＰの存在が、ＳＤＳ −ＰＡＧＥゲルで証明される（図４Ｎ）。この分別中の、Ｎ．アラタの花柱から の交差−電気泳動を図４Ｏに示す。 ２．生の総合的ＡＧＰの脱グリコシル化およびペプチドの配列決定 脱グリコシル化、ペプチド分裂および配列決定は、例２（ｃ）２に記載のとお りに行った。脱グリコシル化の後に、２つの主要ピーク、ＲＴ２５およびＲＴ３ ５（図４Ｃ）および未結合フラクションが得られた。各フラクションおよび生の 物質のアミノ酸分析を表４．１に示す。各フラクションを、テルモリシンにより 消化した。未結合フラクションから、ＲＰ−３００カラム（２．１×１００mm） に結合したペプチドは得られなかった。ＲＴ２５からの３つの配列、Ｆ−Ａ−Ｏ −Ｓ−Ｇ−Ｇ−Ｖ−Ａ−Ｌ−Ｐ−Ｏ−Ｓ（配列番号：５０）、Ｌ−Ａ−Ｓ−Ｏ− Ｏ−Ａ−Ｏ−Ｏ−Ｔ−Ａ−Ｄ−Ｔ−Ｏ−Ａ（配列番号：５１）およびＩ−Ｇ−Ｓ −Ａ−Ｏ−Ａ−Ｇ−Ｓ−Ｏ−Ｔ−Ｓ−Ｓ−Ｐ−Ｎ（配列番号：５３）は、Ｎ．プ ラムバギナホリアからのＲＴ２１について得られた配列（それぞれ配列番号：２ ７〜２９）と密接にマッチしていた。四番目のフラクションは、配列Ｉ／Ｖ−Ｇ ／Ｓ−Ａ／Ｓ−Ａ／Ｏ−Ｏ／Ｓ−Ａ／Ｑ−Ｇ／Ｓ−Ｓ／Ｏ−Ｏ／Ｓ−Ｔ／Ａ−Ｓ ／Ａ−Ｓ／Ａ−Ｐ−Ｏ（配列番号：５２）を示した。 このＲＴ２５蛋白質幹鎖でＮ−末端配列は得られなかったことから、ピログル タメートアミノペプチダーゼを使用して、Ｎ−末端ブロック ピログルタメート 残基を分離し［１００mMリン酸カリウム緩衝液ｐＨ８、１０mM ＥＤＴＡ、５mM ＤＴＴ、５％グリセロール中で、３７℃において一夜にわたり２０μgピログル タメートアミノペプチダーゼ(Boehringer Mannheim)を使用した；脱ブロック蛋 白質はＲＰ−ＨＰＬＣにより分離し、次いでアミノ酸配列決定を行った］、配列 Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙを得た。このＲＴ２５幹鎖はまた、テルモリシンで処理 することによっても分裂させた［テルモリシン(Boehringer Mannheim)を０．２ μｇ／μｇ蛋白質の量でＲＴ２５蛋白質幹鎖（２〜１０μg）に添加し、次いで １％重炭酸アンモニウム、ｐＨ７．８、１mM ＣａＣｌ₂および０．０１％ツイ ーン２０の５００μl中で５５℃において２時間インキュベートした］。生成す るペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣにより分離した。６つの主要ペプチドが得られた（ 図４Ｉ）。ピーク２は、アミノ酸配列ＶＳＡＯＳＱＳＯＳＴＡＡ（配列番号：６ ７）、ならびにＩＧＳＡＯＡＧＳＯＴＳＳＰＮ（配列番号：５３）およびＩＧＳ ＡＯＡＧＳＯ（配列番号：５３を含有）を示した。ピーク３は、配列ＬＡＳＯＯ ＡＯＯＴＡＤＴＯＡ（配列番号：５１）を与え、およびまたピーク５は、配列Ｆ ＡＯＳＧＧＶＡＬＰＯＳ（配列番号：５０）を与えた。これらの配列は両方とも に、Ｈｙｐ、ＳｅｒおよびＡｌａに富裕であった（５３アミノ酸残基の３３）。 エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ（Sigma；０．１μg／μg蛋白質）をまた使 用して、ＲＴ２５蛋白質幹鎖を、そのＡｓｐ残基の部位で分裂させ［１％重炭 酸アンモニウム、ｐＨ７．８、および０．０１％ツイーン２０の５００μg中で ３０℃において一夜］、次いでＲＰ−ＨＰＬＣにより分離した。２つの主要ペプ チドが生成された（ピークＡ１、Ａ２；図４Ｊ）。これらのピークはＲＴ２５蛋 白質中には１個のみのＡｓｐが存在することを示した。この分裂は、出発物質の 存在により示されるように、不完全であった。最初に溶離されたペプチド（ピー クＡ１）はブロックされたＮ−末端残基を示唆する配列データを与えなかった。 Ａ２ピークは、配列ＤＴＯＡＦＡＯＳＧＧＶＡＬ（配列番号：６８）を与えた。 Ａ２のペプチド配列（図４Ｊ）は、ピーク３の配列（図４Ｉ）の配列（配列番号 ：５１）と重なっており（図４Ｊ）、２６残基の連続アミノ酸配列ＬＡＳＯＯＡ ＯＯＴＡＤＴＯＡＦＡＯＳＧＧＶＡＬＰＯＳ（配列番号：６９）を生成した。Ｎ ．アラタ花柱のＲＴ３５ピークから下記の４配列が得られた： これらの配列のうちの３つは、配列Ｔ−Ａ−Ｉ−Ｎ−Ｔ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ｐ（配 列番号：５８）を有することを特徴としていた。 ３．Ｊ５３９アフィニティクロマトグラフイによる花柱ＡＧＰの精製 ＡＧＰは、バシック等に従い［Bacic等によるPhytochem.，２７：６７９〜６ ８４（１９８８）］、花柱から調製した。試料を、例１（ｂ）に記載のとおりに 、ＴＦＭＳにより脱グリコシル化し、分離し、次いでＰＶＤＦ膜上にブロッティ ングした。Ｎ．アラタ懸濁培養細胞からのヤリブ沈殿により調製された主要バン ドと同一位置に現れる３０ｋＤバンドを配列決定に付した。配列Ａ−Ｖ−Ｆ−Ｋ −Ｎ−Ｋ−Ｘ−Ｘ−Ｌ−Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｐ−Ｘ−Ｉ−Ｉ（配列番号：５９）が得ら れた。 （ｂ）Ｎ．アラタ花柱からの遺伝子のクローン化 １．ｃＤＮＡの３′−末端のインビトロ増幅 ｃＤＮＡは、Ｎ．アラタからの総合的花柱ＲＮＡを含有する溶液２０μl、１ ×ＰＣＲ緩衝液［１０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０mM ＫＣｌ］、５ mM ＭｇＣｌ₂、１mM ｄＮＴＰｓ、５μMのｄＴ₍₁₇₎＋アダプター、３０ＵのＲ Ｎアシンおよび５０ＵのＡＭＶ逆転写酵素中で、４２°において１時間で合成し た。このｃＤＮＡ（２μl）を、ポリメラーゼ鎖形成反応に付した。１×ＰＣＲ 緩衝液、１．５mM ＭｇＣｌ₂、２００μM ｄＮＴＰｓ、３０pmolの遺伝子−特 異性プライマー（図１．２）、３０pmolのアダプタープライマーおよび２．５Ｕ のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含有する溶液１００μl中で行った。試料を、９ ４°で２分間変性させ、次いで８０°に冷却し、次いでＴａｑＤＮＡポリメラー ゼを添加した。このＰＣＲサイクルは次のとおりであった：３５Ｘ：９４°、３ ０秒；５２°、３０秒；７２°、１分３０秒。このＰＣＲ生成物をサブクローン 化し、次いで配列決定に付した。 ２．ＰＣＲ断片によるｃＤＮＡライブラリイのスクリーニング 約５×１０⁴ｐｆｕファージ／プレート（λｚａｐ単位）のｃＤＮＡを取出し た。３７℃で一夜の後に、ファージをニトロセルロース上にブロッティングし、 次いで０．２２Ｍ ＮａＣｌ、１５mM ＮａＨ₂ＰＯ₄、１．５mM ＥＤＴＡ、１ ％ＳＤＳ、１％ＢＬＯＴＴＯおよび４mg／mlキャリアＤＮＡを含有するハイブリ ド形成用緩衝液［Sambrook等による上記刊行物（１９８９）］中で、６５°にお いて一夜にわたり、³²Ｐ−標識したＰＣＲ断片とハイブリド形成させた。この膜 を、６５°において０．２×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳにより洗浄し、次いでＸ− 線フィルムにさらした。陽性のλｚａｐクローンを、Stratageneの指示マニュア ルに記載のとおりのインビボ切り出しによりプラスミドＤＮＡに変換し、次いで 配列決定に付した。 ３．ＡＩＮＴＥＦＧ配列に基づく遺伝子特異性プライマーのデザイン 例２（ｃ）２、３７〜３８頁に記載されているように、この精製ＡＧＰをＨＦ により脱グリコシル化し、生成するＡＧＰ幹鎖を、逆相ＨＰＬＣにより分離した 。２つの主要ピーク、すなわち脱グリコシル化後に得られたＲＴ２５およびＲＴ ３５、ならびに未結合フラクションが得られた。プロテアーゼ消化の後に、両ピ ークからアミノ酸配列が得られた。ピークＲＴ３５からの４つのペプチド配列の うちの３つは、配列：ＴＡＩＮＴＥＦＧＰ（配列番号：５８）を含有する。配列 ： ＡＩＮＴＥＦＧ（配列番号：６０）に基づき、縮重オリゴヌクレオチドを合成し た。合成されたＲＴ−特異性プライマーは、次の配列を有していた： ここで、Ｉはイノシン残基である。 （ａ）Ｎ．アラタｃＤＮＡからのＡＧＰ遺伝子のＰＣＲによるインビトロ増幅 ＲＴ３５ペプチド配列をコードする遺伝子のクローン化戦略は、図４Ｄに例示 されている。ＲＴ３５−特異性プライマーを、ポリメラーゼ連鎖反応でアダプタ ー プライマーと組合せて使用し、一重鎖３８０ｂｐＤＮＡ断片を得た。このＰ ＣＲ断片をサブクローン化し、次いで配列決定した（配列番号：６２、図４Ｅ） 。この配列は分離ＡＧＰペプチドから得られた配列とマッチする誘導ペプチドを 包含していた。 （ｂ）Ｎ．アラタからのｃＤＮＡクローンの分離および配列決定 ３８０ｂｐＰＣＲ断片（配列番号：６２、図４Ｅ）を使用して、Ｎ．アラタ花 柱から分離されたＲＮＡから作成されたｃＤＮＡライブラリイをスクリーニング し、１つの陽性クローンを分離し、次いで配列決定に付した（配列番号：６３、 図４Ｆ）。 （ｃ）Ｎａ３５−１遺伝子のノザン法分析 Ｎａ３５−１ＰＣＲ断片をプローブとして使用して、Ｎ．アラタ植物の各種部 分（図４Ｇ）、Ｌ．ペルビアナム(L.pleuvianum)（トマト）花柱およびＮ．アラ タ、Ｎ．プラムバギナホリアおよびセイヨウナシの懸濁培養細胞（図４Ｈ）から 分離したＲＮＡのノザン法分析を行った［Sambrook等による上記刊行物（１９８ ９）］。Ｎａ３５−１プローブを、Ｎａ３５−１ｃＤＮＡの鎖長に対応する８０ ０ヌクレオチドの花柱転写産物にハイブリド化した。ノザン法分析のより長い露 出は、この植物の別の部分（すなわち、葉、茎、根）における如何なるシグナル も現わさなかった。このシグナルの強度は、Ｎ．アラタの表現型の相違により異 なっていた。最強のシグナルは、Ｓ₆Ｓ₆花柱からのＲＮＡで検出された。ト マト花柱または懸濁培養細胞からは、同一ペプチドは検出されなかった（図４Ｈ ）。 ４．ＴＡＤＴＯＡＦ配列に基づく遺伝子−特異性プライマーのデザイン （ａ）オリゴヌクレオチドのデザインおよび合成 ２０ヌクレオチド長さの遺伝子−特異性プライマーを、配列番号：５０、５１ 、５３、６７および６８の重複ペプチド配列に従いデザインした。以下に示すよ うに、縮重度を減少させるために、イノシンを使用した： このオリゴヌクレオチドは、アプライド バイオシステムス ＤＮＡ シンテ サイザー（Applied Biosystems DNA synthesizer）（モデル３９１、ＡＢＩ）で 合成した。 （ｂ）ｃＤＮＡの３′−末端の迅速増幅（３′ＲＡＣＥ） 総合的ＡＧＰを、マックレア等により開示されたとおりにして［McClure等に よるNature，３４２：９５５〜９５７（１９９０）］、Ｎ．アラタ花柱から分離 した。１０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０mM ＫＣｌ、５mM ＭｇＣｌ₂ 、１mM ｄＮＴＰｓ、５μMのｄＴ₍₁₇₎＋アダプター、３０ＵのＲＮアシンおよ び５０ＵのＡＭＴ逆転写酵素(Promega)を含有する溶液２０μl中で、４２℃にお いて１時間で、相補性ＤＮＡを総合的花柱ＲＮＡ（５μg）から合成した。ｃＤ ＮＡ（２μl）を、１０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０mM ＫＣｌ、１． ５mM ＭｇＣｌ₂、２００μM ｄＮＴＰｓ、３０pmolの遺伝子特異性プライマー 、３０pmolのアダプタープライマーおよび２．５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ （Perkin Elmer-Cetus）を含有する溶液１００μl中でポリメラーゼ連鎖反応（ ＰＣＲ）に付した。試料を、９６℃で２時間変性させ、次いで８０℃に冷却し、 次いでＴａｇＤＮＡポリメラーゼを添加した。このＰＣＲサイクルは次のとおり であった：３５ｘ：９６℃、４５秒；５５℃、４５秒；７２℃、１分。このＰＣ Ｒ生成物（４００ｂｐ）をクローン化し、次いでアプライド バイオシステ ムス ＤＮＡ セークエンサー（Applied Biosystems DNA sequencer）（モデル ３７３Ａ、ＡＢＩ）で配列決定した。このＰＣＲクローンからの推定アミノ酸配 列は、分離ＡＧＰ配列、すなわち配列番号：５０、５１、５３、６７、６８にマ ッチしていた。 （ｃ）ｃＤＮＡライブラリイのスクリーニング 花柱ｃＤＮＡライブラリイ（λＺＡＰ II：Stratagene）は、Ｎ．アラタの花 柱（接触後の６週間）からのｍＲＮＡ（Ｓ₆Ｓ₆）を使用して、ジョウキン ロヨ 博士（Dr．Joaquin Royo）により構築された［Plant Cell Biology Research Ce nter，School of Botany，The University of Melbourne，Parkvill，Australia （ＰＣＢＲＣ）］。このｃＤＮＡライブラリイ（３００，０００ｐｆｕ）を取り 出し、製造業者の指示に従い、ハイボンド−Ｎ（Hybond−Ｎ）ナイロン膜（Amer sham）上にブロッティングした。ＰＣＲ断片を、³²Ｐ−ｄＣＴＰで１０８ｃｐｍ ／μgまで標識した。ハイブリド形成は、０．２２Ｍ ＮａＣｌ、１５mM Ｎａ Ｈ₂ＰＯ₄、１．５mM ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ、１％ＢＬＯＴＴＯおよび４mg／ml ニシン精子ＤＮＡ中で、５５℃で一夜にわたり行った。この膜を室温において２ ×ＳＤＳ、１％ＳＤＳ中で２×１０分間、次いで５５℃において０．２×ＳＤＳ 、１％ＳＤＳ中で２×１０分間、洗浄した。陽性のλＺＡＰクローンを、インビ ボで切り出し（Stratagene）、次いでＤＮＡ配列を分析した。このＲＴ２５蛋白 質幹鎖をコードするクローンを、ＡＧＰＮａ１ １ｃＤＮＡと命名した。このヌ クレオチド配列および推定蛋白質配列を、ＰＣ／遺伝子ソフトウエアー(Intelli Genetics)を用いて分析した。 （ｄ）ＲＮＡブロット分析 ＲＮＡブロット分析(Blot analysis)を、サムブロック等により開示されたと おりに行った［Sambrook等による上記刊行物（１９８９）］。ハイブリド形成お よび洗浄条件は、ＡＧＰＮａ１ １ｃＤＮＡをプローブとして使用し、かつまた ハイブリド形成を６０℃において行う以外は、前記と同一であった。 例５ アンチセンスＲＮＡプローブを使用するＰ．コムニスからのＡＧＰ遺伝子のク ローン化 ［１．］ＰｃＡＧＰ９ｃＤＮＡクローン（配列番号：６６） （ａ）ピルス コムニス（Pyrus communis）（セイヨウナシ）の細胞培養物から のＡＧＰペプチドの分離および精製 例３（ａ）に記載の方法と基本的に同一の方法に従い、ＡＧＰペプチド断片の アミノ酸配列を得た。この配列：Ａ−Ｋ−Ｓ−Ｏ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｏ−Ｏ−Ｔ−Ａ −Ｔ−Ｏ−Ｏ−Ｓ−Ａ−Ｖ（配列番号：３７）を対応するＡＧＰ遺伝子の分離の 対象として選択した。 （ｂ）配列番号：３７をコードするセイヨウナシＡＧＰ遺伝子のクローン化 本発明の前記例（例２、３および４）では、分離ＡＧＰペプチド断片のヒドロ キシプロリン−貧弱配列を利用して、ＧＣに富んでいないオリゴヌクレオチドプ ライマーを合成することによって、ＡＧＰ遺伝子を分離した。これに対して、こ の例（例５）では、ヒドロキシプロリン−富裕ペプチド配列を利用して、アンチ センスＲＮＡプローブを構築した。 ２種のオリゴヌクレオチド（ＡＦ１Ｔ３）および（ＡＲ２Ｔ７）の配列を使用 して、表５．１に示されているＧＣ−富裕プローブを構築した。 アンチセンスＲＮＡプローブは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ(Promega)を使用す ることによってＰＣＲ断片から合成し、セイヨウナシ細胞懸濁物から調製された ｃＤＮＡライブラリイのスクリーニングに使用した。ハイブリド形成は、２×Ｓ ＳＰＥ、１％ＳＤＳ、０．５％ＢＬＯＴＴＯ、５０％ホルムアミドおよび０．５ mg／ml変性ニシン精子ＤＮＡ中で、４０℃で行った。一夜にわたるハイブリド形 成の後に、このリフトを、先ず室温において２×ＳＤＳ、１％ＳＤＳ中で２×１ ０分間、次いで５５℃において２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにより、次いで５０ ℃で３０分間、同一緩衝液により洗浄した。このリフトをさらに、５０℃におい てさらに３０分間、１×ＳＳＣ、１％で洗浄した。３種のＤＮＡクローンを分離 し、次いで配列決定した。最長ｃＤＮＡクローンの配列（配列番号：６６）を、 図５Ａに示す。 ［２．］ＰｃＡＧＰ２ｃＤＮＡクローン（配列番号：９１） （ａ）ピルス コムニス（セイヨウナシ）の細胞培養物からのＡＧＰペプチドの 追加の精製 セイヨウナシ細胞培養物中のＡＧＰを、例３（ａ）に記載のとおりのβ−グル コシルヤリブ試薬による沈殿およびＨＰＬＣによる分別により精製した。この精 製生成物の流動様相を、図５Ｄに示す。図５Ｄ−Ａの主要ピークは、カラムに装 填されたＡＧＰの約２７％に相当する。この主要ピークを採取し、同一カラムに 再適用した。浅い勾配で溶離すると、２つのピーク（フラクション１および２） に分割された（図５Ｄ−Ｂ）。フラクション１中のＡＧＰは、例３および例５［ １］に記載されている。 フラクション２（図５Ｄ−Ｂ）を、スペロース−６ＦＰＬＣでサイズ排除分別 に付し、２成分、ピーク２Ａおよび２Ｂに分割した（図５Ｄ−Ｃ３）。ピーク２ 中の物質のＮ−末端配列は、配列ＡＥＡＥＡＸＴＸＡＬＱＶＶＡＥＡＸＥＬ（配 列番号：７４）を与えた。 ピーク２Ａおよび２Ｂ中のＡＧＰは、別々に脱グリコシル化し、生成する蛋白 質幹鎖を、サイズ排除ＦＰＬＣにより分離した（図５Ｄ−Ｄ１〜４）。ピーク２ Ｂは、１０ｋの分子量を有する１つの蛋白質幹鎖をもたらした。ピーク２Ａは、 ５４ｋおよび１０ｋの分子量を有する２つの蛋白質ピークをもたらした。この５ ４ｋ蛋白質幹鎖のＮ−末端アミノ酸配列は、配列ＴＯＡＯＡ（配列番号：７５） を与え、他方ピーク２Ｂ中の１０ｋ蛋白質幹鎖は、配列ＡＥＡＥＡＯＴＯＡＬＱ ＶＶＡＥＡＯＥＬ（配列番号：７６）を与えた。 １０ｋおよび５４ｋ蛋白質幹鎖を別々に、テルモリシンにより消化し、生成す るペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、次いで配列決定に付した。ピーク２ Ａの５４ｋ蛋白質からは８種のペプチド配列が得られ、そしてピーク２Ｂ中の１ ０ｋ蛋白質からは３種のペプチド配列が得られた（表３．６）。ピーク２Ｂ中の １０ｋ蛋白質に係わり、これら３種の配列のうちの２種とＮ−末端配列は重なっ ており、配列ＡＥＡＥＡＯＴＯＡＬＱＶＶＡＥＡＯＥＬＶＯＴＯＶＯＴＯＳＹ（ 配列番号：８８）を与えた。 （ｂ）１０ｋ蛋白質幹鎖をコードするｃＤＮＡの分離 １０ｋ蛋白質幹鎖をコードするｃＤＮＡのクローン化操作は、ＰｃＡＧＰ９ｃ ＤＮＡのクローン化に使用された操作と基本的に同一であった。この１０４０ｂ ｐのコンセンサス配列を図５Ｅに示す。このｃＤＮＡをＰｃＡＧＰ２と称する。 例６ ゲノムＡＧＰ遺伝子のクローン化および発現 （ａ）ゲノムＡＧＰ遺伝子のクローン化およびＡＧＰプロモーター領域の同定 基本的に、ｃＤＮＡクローンの分離に用いた方法を使用して、植物ＡＧＰのゲ ノムクローンを得た。可能な場合には、ＡＧＰｃＤＮＡを使用して、ゲノムライ ブラリイをスクリーニングする。Ｎ．アラタおよびＮ．プラムバギナホリアの懸 濁培養細胞からのゲノムＡＧＰクローンの分離を説明する下記の方法は、所望の 植物細胞からのゲノムＡＧＰ遺伝子の分離に適応できる一般的方法である。 ＡＧＰゲノムクローンを分離するためには、Ｎ．アラタおよびＮ．プラムバギ ナホリアの懸濁培養細胞からゲノムＤＮＡを分離し、次いでＳａｕ３ＡＩにより 部分的に消化する。グリセロール勾配の下での超遠心分離によるサイズ選別の後 に、サイズ１０〜２３ｋｂのＤＮＡ断片を、λＤａｓｈ（Stratagene）のような ベクター中にリゲートして、ゲノムライブラリイを作成する。このライブラリイ を次いで、ＮａＡＧＰ１ｃＤＮＡおよびＮｐＡＧＰ１ｃＤＮＡによりそれぞれス クリーニングして、相当するゲノムクローンを分離する。生成するゲノムクロー ンを、サザン法により分析し、若干のクローンを配列決定に付す。このＡＧＰ遺 伝子のプロモーター領域を次いで、ＤＮＡ配列から同定する。 （ｂ）組換え遺伝子構築 二重鎖ＤＮＡ型に存在する植物遺伝子の発現は、ＲＮＡポリメラーゼ酵素によ るＤＮＡの一本鎖からのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の転写を包含し、こ のｍＲＮＡの引続く処理は主として、その核の内部を転写する。この処理には、 ＲＮＡの３′−末端にポリアデニレートヌクレオチドを付加する３′−転写され ない領域が包含される。ＤＮＡのｍＲＮＡ中への転写は、プロモーターにより調 節される。このプロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼを発信して、ＤＮＡと 会合し、ＲＮＡの対応する鎖を形成するための鋳型としてＤＮＡ鎖の１本を使用 するｍＲＮＡの転写を開始させる塩基配列を含有する。 植物細胞で活性である多くのプロモーターが、刊行物に記載されている。これ らには、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）およびオクトピンシンターゼ（ＯＣＳ） プロモーター［これらのプロモーターは、アグロバクテリウム ツメファシエン ス(Agrobacterium tumefaciens)の腫瘍−誘発性プラスミド上に担持させる］、 カリフラワー モザイク ウイルス（Cauliflower Mosaic Virus）（ＣａＭＶ） １９Ｓおよび３５Ｓプロモーター、リボース ビス−ホスフェート カルボキシ ラーゼ（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ）の小型サブユニットからの光−誘発性プロモータ ーおよびマンノピン シンターゼ（ＭＡＳ）プロモーターが包含される［Velten & SchellによるNoul．Acids Res.,１３：６９８１〜６９９８（１９８５）］。 これらのプロモーターは全部が、植物において発現される各種のＤＮＡ構築物の 創造に使用されている（例えばＰＣＴ公開ＷＯ８４／０２９１３参照）。 公知の、あるいは植物細胞においてＲＮＡを転写することが見出されているプ ロモーターを、本発明で使用することができる。このようなプロモーターは、植 物または植物ウイルスから得ることができ、これらに制限されないものとして、 ＣＡＭＶ３５Ｓプロモーターおよび植物遺伝子、例えばｓｓＲＵＢＩＳＣＯ遺伝 子から分離されるプロモーターが包含される。選択された特定のプロモーターは 好ましくは、有効量の蛋白質を生産する結果をもたらすのに充分の発現を生じさ せることが可能であるべきである。 本発明のＤＮＡ構築（すなわち、キメラ植物遺伝子）に使用されるプロモータ ーは、所望により、修飾して、それらの制御特性に影響を与えることができる。 例えば、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターは、光の不存在の下にｓｓＲＵＢＩＳＣＯ の発現を示すｓｓＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子の部分にリゲートして、葉では活性であ るが、根では活性ではない、プロモーターを生成させることができる。生成する キメラプロモーターは、本発明で使用することができる。これを説明するために 、「ＣａＭＶ３５Ｓ」プロモーターの用語には、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの 変種、例えばオペレーター領域、無作為または制御変異誘発物質などとのリゲー ションにより誘導されるプロモーターが包含される。さらにまた、これらのプロ モーターは、遺伝子発現を高めるために、多数の「エンハサー配列」を含有する ように変えることもできる。 本発明のＤＮＡ構築物により生成されるＲＮＡはまた、５′−翻訳されないリ ーダー配列を含有する。この配列は、当該遺伝子が発現されるように選択された プロモーターから誘導することができ、そしてｍＲＮＡの翻訳が増大されるよう に特別に修飾することができる。この５′−翻訳されない領域はまた、ウイルス ＲＮＡから、適当な真核遺伝子から、あるいは合成遺伝子配列から得ることがで きる。本発明は、例に従って説明されている構築物に制限されるものではない。 むしろ、翻訳されないリーダー配列は、ウイルスコート蛋白質に対するコード配 列の翻訳されない領域の５′−末端の一部、あるいはプロモーター配列の一部で あることができ、あるいはいずれかの場合の無関係プロモーターまたはコード配 列から誘導することもできる。好ましくは、翻訳コンセンサス配列と一致する開 始部位の側面に位置する配列は、コザック(Kozak)により報告されている翻訳開 始を強化する役割を果たす［Nature，３０８：２４１〜２４６（１９８４）］。 本発明のＤＮＡ構築物はまた、植物における遺伝子の性能を強化するために、 変えられている修飾構造コード配列または完全合成構造コード配列を含有する。 例えば、この強化方法を適用して、植物ＡＧＰ蛋白質をコードする修飾遺伝子お よび完全合成遺伝子をデザインすることができる。本発明の構造遺伝子は場合に より、アミノ−末端クロロプラスト変異ペプチド(chloroplast transit peptide )または分泌シグナル配列などを含む融合蛋白質をコードすることができる。 本発明のＤＮＡ構築物はまた、３′−翻訳されない領域を含有する。この３′ −翻訳されない領域は、植物においてウイルスＲＮＡの３′−末端にポリアデニ レートヌクレオチドを付加させる機能を果たすポリアデニレート化シグナルを含 有する。適当な３′−領域の例には、（１）アグロバクテリウム腫瘍−誘発性（ Ｔｉ）プラスミド遺伝子、例えばノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子のポリア デニル化シグナルを含有する３′−転写され、翻訳されない領域、および（２） 大豆貯蔵蛋白質（７Ｓ）遺伝子およびＲｕＢＰカルボキシラーゼ（Ｅ９）遺伝子 の小型サブユニットがある。好適な３′−領域は、７Ｓ遺伝子からのものである 。 （ｃ）植物形質転換 本発明の構造コード配列を含有するキメラ植物遺伝子は、いずれか適当な方法 により植物のゲノム中に挿入することができる。本発明の実施に使用するのに適 する植物には、これらに制限されないものとして、大豆、綿、アルファルファ、 脂肪種子セイヨウアブラナ、γｌａｘ、トマト、サトウダイコン、ヒマワリ、ジ ャガイモ、タバコ、トウモロコシ、米および小麦が包含される。適当な植物形質 転換ベクターには、アグロバクテリウム ツメファシエンスのＴｉプラスミドか ら誘導されるもの、および例えば次の刊行物に記載されているものが包含される ：Herrera-Estrella等によるNature，３０３：２０９（１９８３）；Bevan等に よるNature，３０４：１８４（１９８３）；Klee等によるBio／Technology，３ ：６３７〜６４２（１９８５）およびＥＰＯ公開１２０，５１６。アグロバクテ リウムの根−誘発（Ｒｉ）プラスミドまたはＴｉから誘導される植物形質転換ベ クターに加えて、別の方法を使用して、本発明のＤＮＡ構築物を植物細胞に挿入 することができる。このような方法には、例えばリポソーム、エレクトロポレー ション(electroporation)、遊離ＤＮＡの取り込みを増加させる化学物質、微小 物質拡大性ボンバードによる遊離ＤＮＡの供給、およびウイルスまたは花粉を用 いる形質転換の使用が包含される。 例えば、双子葉植物の形質転換に慣用のＴｉプラスミド カセット ベクター は、強化ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターおよびベータ−コングリシニンのアルファ −プライムサブユニットをコードする大豆遺伝子からのポリアデニル化シグナル を包含する３′−末端からなることができる。遺伝子挿入のための、多数の制限 部位を有するマルチリンカーを、これら２つの要素の間に配置させることができ る。 （ｄ）形質転換された細胞系によるＡＧＰの過剰生産および過少生産 植物細胞系は全部が、多分、総構造複合炭水化物の約２〜１０％（重量／重量 ）のレベルで、いくらかのＡＧＰを生産することは一般に認識されている［Show alterによるPlant Cell，５：９〜２３（１９９３）］。これらの天然植物細胞 は全部が、転写、翻訳およびグリコシル化ＡＧＰを天然産物として生産する翻訳 後処理に関係する調節因子（プロモーター、エンハサー、酵素など）を含有する 。グリコシル化は、（ａ）プロリンをプロリルヒドロキシラーゼによりヒドロキ シル化する工程、（ｂ）独特のβ−Ｈｙｐ−ガラクトシルトランスフェラーゼを 用いるガラクトシル化工程、（ｃ）各結合タイプに対して別々のガラクトシルト ランスフェラーゼによるガラクトース鎖の付加工程、および（ｄ）アラ ビノシルトランスフェラーゼによるアラビノースの付加工程からなる。従って、 培養植物細胞（例えば、双子葉植物または単子葉植物）を、異種組換え遺伝子断 片により形質転換させることができ、そして非グリコシル化ＡＧＰの過剰生産ま たは過少生産に使用することができる。或る場合には、双子葉植物宿主を単子葉 植物遺伝子により形質転換させることができ、あるいは別法として、単子葉植物 宿主を、双子葉植物遺伝子により形質転換させることができる。別法として、正 常ではグリコシル化ＡＧＰを生産しない宿主細胞［例えば、イー．コリ(E．coli )］を形質転換させることができ、そしてそのプロリン残基がヒドロキシル化さ れていない非グリコシル化ＡＧＰペプチド幹鎖の過剰生産または過少生産に使用 することができる。 宿主細胞をＡＧＰ過剰生産性に形質転換させるためには、ＡＧＰｃＤＮＡ（例 えば、ＮａＡＧＰ１またはＮｐＡＧＰ１）を、異種プロモーターにより５′−末 端に、かつまたターミネーター（例えば、ＮＯＳ−ターミネーター）により３′ −末端に、結合させることができる。この場合には、このＡＧＰ遺伝子は、強力 なプロモーターであることが知られているＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下 にある。この発現カセットは次いで、Ａ．ツメファシエンスＴｉプラスミドから 誘導される二元ベクター中にサブクローン化して、Ｎ．アラタおよびＮ．プラム バギナホリアのどちらかの培養細胞を形質転換させ、ＡＧＰを過剰生産する細胞 系を生じさせる。このＡＧＰはまた、そのＡＧＰｃＤＮＡ中に、６−ヒスチジン をコードするＤＮＡ断片を導入することによって、そのＣ−末端位置でヒスチジ ンを付加することができる。この６−ヒスチジン付加したＡＧＰは次いで、ニッ ケル−ニトロロトリ酢酸セファロースカラムを用いることによって容易に分離す ることができる［Hochuli等によるBio／Technology，６：１３２１〜１３２５（ １９８８）］。別の手段には、タッグ、フラグ（Flag）（登録商品名）を使用す る手段があり［Hopp，T．P．等によるBiotechnology，６：１２０４〜１２１０ （１９８８）］、このタッグはＡＧＰ配列中に導入することによって、抗−フラ グ（登録商品名）モノクローナル抗体による精製を可能にすることができる。 宿主細胞を、ＡＧＰを過少生産するように形質転換させるためには、アンチセ ンス構築物を利用する。この構築物では、このＡＧＰｃＤＮＡをＣａＭＶ３５Ｓ プロモーターの反対方向に配置させて、アンチセンス転写産物を生成させる。こ の転写産物を、その対応するセンスｍＲＮＡにハイブリド化すると、その結果と して遺伝子発現の抑制が導かれる。

【手続補正書】特許法第１８４条の７第１項 【提出日】１９９５年５月２２日 【補正内容】 請求の範囲 １．補正）誘導ノデュリン(nodulin)蛋白質ではない、植物アラビノガラクタ ン蛋白質（ＡＧＰ）の蛋白質幹鎖をコードするクローン化したＤＮＡ分子。 ２．ソラナセアエ（Solanaceae）またはロサセアエ（Rosaceae）植物科からの アラビノガラクタン蛋白質の蛋白質幹鎖をコードするクローン化したＤＮＡ分子 。 ３．上記アラビノガラクタン蛋白質がニコチアナ(Nicotiana)またはピルス(Py rus)からのアラビノガラクタン蛋白質である、請求項２に記載のクローン化した ＤＮＡ分子。 ４．上記アラビノガラクタン蛋白質がニコチアナ アラタ(Nicotiana alata) またはニコチアナ プラムバギナホリア(Nicotiana plumbaginafolia)からのア ラビノガラクタン蛋白質である、請求項３に記載のクローン化したＤＮＡ分子。 ５．上記アラビノガラクタン蛋白質がピルス コムニス（Pyrus communis）か らのアラビノガラクタン蛋白質である、請求項３に記載のクローン化したＤＮＡ 分子。 ６．上記アラビノガラクタン蛋白質がニコチアナ(Nicotiana)の花柱からのア ラビノガラクタン蛋白質である、請求項３に記載のクローン化したＤＮＡ分子。 ７．上記クローン化したＤＮＡ分子がソラナセアエ（Solanaceae）からのＤＮ Ａ分子であって、基本的に配列番号：１１および配列番号：２６〜３０のアミノ 酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に ハイブリド化するか、あるいは基本的に配列番号：１３、配列番号：１４および 配列番号：２１〜２５のヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチ ド配列にハイブリド化する、請求項２に記載のクローン化したＤＮＡ分子。 ８．上記クローン化したＤＮＡ分子が基本的に配列番号：２４または配列番号 ：２５のヌクレオチド配列からなる、請求項２に記載のクローン化したＤＮＡ分 子。 ９．上記クローン化したＤＮＡ分子がゲノムＡＧＰ遺伝子である、請求項７に 記載のクローン化したＤＮＡ分子。 10．上記クローン化したＤＮＡ分子が基本的に配列番号：５０〜６０のアミノ 酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に ハイブリド化するか、あるいは基本的に配列番号：６１〜６３のヌクレオチド配 列からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリド化する、請求項６に 記載のクローン化したＤＮＡ分子。 11．上記クローン化したＤＮＡ分子が基本的に配列番号：５０〜６０および配 列番号：６７〜７０のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコ ードするＤＮＡ配列から、あるいは基本的に配列番号：７１〜７２からなる群か ら選択されるＤＮＡ配列から転写されるＲＮＡ配列にハイブリド化する、請求項 ６に記載のクローン化したＤＮＡ分子。 24．（補正）誘導ノデュリン(nodulin)蛋白質ではない、実質的に純粋な植物 アラビノガラクタン蛋白質。 25．上記植物がソラナセアエ（Solanaceae）科またはロサセアエ（Rosaceae） 科からの植物である、請求項２４に記載の植物アラビノガラクタン蛋白質。 26．基本的に配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：４９、配列番号： ６３、配列番号：６６、配列番号：７２および配列番号：９１からなる群から選 択されるヌクレオチド配列から誘導されるアミノ酸配列から基本的になる、請求 項２４に記載の実質的に純粋な植物アラビノガラクタン蛋白質。 27．請求項２４に記載の実質的に純粋な植物アラビノガラクタン蛋白質に対す る抗体。 28．植物アラビノガラクタン遺伝子を得る方法であって、分離ＡＧＰペプチド またはその分子からのアミノ酸配列を使用して、植物遺伝子ライブラリイをハイ ブリド形成性クローンについてスクリーニングするのに有用であるヌクレオチド 配列をデザインする工程を包含する方法。 29．植物アラビノガラクタン遺伝子を得る方法であって、分離ＡＧＰペプチド またはその分子からのヒドロキシプロリン−富裕アミノ酸配列を使用して、植物 遺伝子ライブラリイをハイブリド形成性クローンについてスクリーニングするの に有用であるＲＮＡプローブをデザインする工程を包含し、ここで上記ヒドロキ シプロリン−富裕アミノ酸配列はヒドロキシプロリン、アラニン、セリンおよび スレオニン（ＯＡＳＴ）含有量に富んでいる配列であり、かつまた当該ＲＮＡプ ローブは上記ヒドロキシプロリン−富裕アミノ酸配列のコード配列を含有するヌ クレオチド配列を含むものである方法。 30．植物アラビノガラクタン蛋白質の蛋白質幹鎖をコードするクローン化した ＤＮＡ分子から生成される植物ＡＧＰを含有する化学製剤または医薬製剤であっ て、この製剤は、乳化剤、エマルジョン安定剤、増粘剤、ゲル化剤、テキスチャ ー改良剤、サイズ剤、結合剤、コーティング剤、接着剤、分散剤、封入剤、懸濁 剤、滑剤、凝集剤およびその組合わせからなる群から選択される製剤として有用 である化学製剤または医薬製剤。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/16 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｎ 5/10 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｑ 1/68 9735−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ // Ｃ１２Ｐ 21/02 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＦＩ，ＪＰ，Ｎ Ｚ (72)発明者 ドウ，ヘ オーストラリア国 3051 ビクトリア，ノ ース メルボルン，キャンニング ストリ ート 11 (72)発明者 ゲイン，アリソン エム. オーストラリア国 3054 ビクトリア，ノ ース カールトン，ウィルソン ストリー ト 36 (72)発明者 バシック，アントニー オーストラリア国 3095 ビクトリア，エ ルサム，フランク ストリート 80 (72)発明者 クラーク，エイドリアン イー. オーストラリア国 3052 ビクトリア，パ ークビル，パーク ドライブ 35

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．植物アラビノガラクタン蛋白質（ＡＧＰ）の蛋白質幹鎖をコードするクロ ーン化したＤＮＡ分子。 ２．ソラナセアエ（Solanaceae）またはロサセアエ（Rosaceae）植物科からの アラビノガラクタン蛋白質の蛋白質幹鎖をコードするクローン化したＤＮＡ分子 。 ３．上記アラビノガラクタン蛋白質がニコチアナ(Nicotiana)またはピルス(Py rus)からのアラビノガラクタン蛋白質である、請求項２に記載のクローン化した ＤＮＡ分子。 ４．上記アラビノガラクタン蛋白質がニコチアナ アラタ(Nicotiana alata) またはニコチアナ プラムバギナホリア(Nicotiana plumbaginafolia)からのア ラビノガラクタン蛋白質である、請求項３に記載のクローン化したＤＮＡ分子。 ５．上記アラビノガラクタン蛋白質がピルス コムニス（Pyrus communis）か らのアラビノガラクタン蛋白質である、請求項３に記載のクローン化したＤＮＡ 分子。 ６．上記アラビノガラクタン蛋白質がニコチアナ(Nicotiana)の花柱からのア ラビノガラクタン蛋白質である、請求項３に記載のクローン化したＤＮＡ分子。 ７．上記クローン化したＤＮＡ分子がソラナセアエ（Solanaceae）からのＤＮ Ａ分子であって、基本的に配列番号：１１および配列番号：２６〜３０のアミノ 酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に ハイブリド化するか、あるいは基本的に配列番号：１３、配列番号：１４および 配列番号：２１〜２５のヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチ ド配列にハイブリド化する、請求項２に記載のクローン化したＤＮＡ分子。 ８．上記クローン化したＤＮＡ分子が基本的に配列番号：２４または配列番号 ：２５のヌクレオチド配列からなる、請求項２に記載のクローン化したＤＮＡ分 子。 ９．上記クローン化したＤＮＡ分子がゲノムＡＧＰ遺伝子である、請求項７に 記載のクローン化したＤＮＡ分子。 10．上記クローン化したＤＮＡ分子が基本的に配列番号：５０〜６０のアミノ 酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に ハイブリド化するか、あるいは基本的に配列番号：６１〜６３のヌクレオチド配 列からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリド化する、請求項６に 記載のクローン化したＤＮＡ分子。 11．上記クローン化したＤＮＡ分子が基本的に配列番号：５０〜６０および配 列番号：６７〜７０のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコ ードするＤＮＡ配列から、あるいは基本的に配列番号：７１〜７２からなる群か ら選択されるＤＮＡ配列から転写されるＲＮＡ配列にハイブリド化する、請求項 ６に記載のクローン化したＤＮＡ分子。 12．上記クローン化したＤＮＡ分子が基本的に配列番号：６３または配列番号 ：７２のヌクレオチド配列からなる、請求項６に記載のクローン化したＤＮＡ分 子。 13．上記ＤＮＡ分子がゲノムＡＧＰ遺伝子である、請求項１０または１１に記 載のクローン化したＤＮＡ分子。 14．上記クローン化したＤＮＡ分子がピルス(Pyrus)からのＤＮＡ分子であっ て、基本的に配列番号：３１〜４４のアミノ酸配列からなる群から選択されるア ミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に、あるいは基本的に配列番号：４５ 〜４９からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリド化する、請求項 ２に記載のクローン化したＤＮＡ分子。 15．上記クローン化したＤＮＡ分子がピルス(Pyrus)からのＤＮＡ分子であっ て、基本的に配列番号：３１〜４４および配列番号：７３〜８８のアミノ酸配列 からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列から、あるいは 基本的に配列番号：６４〜６６および配列番号：８９〜９１からなる群から選択 されるＤＮＡ配列から転写されるＲＮＡ配列にハイブリド化する、請求項２に記 載のクローン化したＤＮＡ分子。 16．上記クローン化したＤＮＡ分子が基本的に配列番号：４９、配列番号：６ ６および配列番号：９１からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる、 請求項２に記載のクローン化したＤＮＡ分子。 17．上記ＤＮＡ分子がゲノムＡＧＰ遺伝子である、請求項１４または１５に記 載のクローン化したＤＮＡ分子。 18．請求項１または２に記載のクローン化したＤＮＡ分子を含むＤＮＡ組換え ベクター。 19．グリコシル化アラビノガラクタン蛋白質または非グリコシル化アラビノガ ラクタン蛋白質が発現されるように、請求項１８に記載のクローン化したＤＮＡ 分子により形質転換された宿主細胞。 20．上記宿主細胞が細菌細胞または植物細胞である、請求項１９に記載の宿主 細胞。 21．請求項１または２に記載の植物アラビノガラクタン蛋白質遺伝子を、グリ コシル化アラビノガラクタン蛋白質または非グリコシル化アラビノガラクタン蛋 白質が発現されるように、異種プロモーターの制御下に含有する遺伝子工学操作 されたＤＮＡ分子。 22．上記アラビノガラクタン蛋白質遺伝子が、基本的に配列番号：２４、配列 番号：２５、配列番号：４９、配列番号：６３、配列番号：６６、配列番号：７ ２および配列番号：９１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含有する 、請求項２１に記載の遺伝子工学操作されたＤＮＡ分子。 23．植物ＡＧＰプロモーターが異種構造遺伝子に隣接して配置されており、こ れにより上記構造遺伝子が上記植物ＡＧＰプロモーターの制御下に発現される、 遺伝子工学操作されたＤＮＡ分子。 24．実質的に純粋な植物アラビノガラクタン蛋白質。 25．上記植物がソラナセアエ（Solanaceae）科またはロサセアエ（Rosaceae） 科からの植物である、請求項２４に記載の植物アラビノガラクタン蛋白質。 26．基本的に配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：４９、配列番号： ６３、配列番号：６６、配列番号：７２および配列番号：９１からなる群から選 択されるヌクレオチド配列から誘導されるアミノ酸配列から基本的になる、請求 項２４に記載の実質的に純粋な植物アラビノガラクタン蛋白質。 27．請求項２４に記載の実質的に純粋な植物アラビノガラクタン蛋白質に対す る抗体。 28．植物アラビノガラクタン遺伝子を得る方法であって、分離ＡＧＰペプチド またはその分子からのアミノ酸配列を使用して、植物遺伝子ライブラリイをハイ ブリド形成性クローンについてスクリーニングするのに有用であるヌクレオチド 配列をデザインする工程を包含する方法。 29．植物アラビノガラクタン遺伝子を得る方法であって、分離ＡＧＰペプチド またはその分子からのヒドロキシプロリン−富裕アミノ酸配列を使用して、植物 遺伝子ライブラリイをハイブリド形成性クローンについてスクリーニングするの に有用であるＲＮＡプローブをデザインする工程を包含し、ここで上記ヒドロキ シプロリン−富裕アミノ酸配列はヒドロキシプロリン、アラニン、セリンおよび スレオニン（ＯＡＳＴ）含有量に富んでいる配列であり、かつまた当該ＲＮＡプ ローブは上記ヒドロキシプロリン−富裕アミノ酸配列のコード配列を含有するヌ クレオチド配列を含むものである方法。 30．植物アラビノガラクタン蛋白質の蛋白質幹鎖をコードするクローン化した ＤＮＡ分子から生成される植物ＡＧＰを含有する化学製剤または医薬製剤であっ て、この製剤は、乳化剤、エマルジョン安定剤、増粘剤、ゲル化剤、テキスチャ ー改良剤、サイズ剤、結合剤、コーティング剤、接着剤、分散剤、封入剤、懸濁 剤、滑剤、凝集剤およびその組合わせからなる群から選択される製剤として有用 である化学製剤または医薬製剤。