JPH01500242A - 組換えＤＮＡ法により形質転換された宿主生物及び前記形質転換宿主生物からα―ガラクトシダーゼを製造する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組換えＤＮＡ法によって形質転換δれた宿主生物によるグアーα−ガラクトシダ ーゼおよび免疫学的に関連あるα−ガラクトシダーゼの製造本発明は、α−ガラ クトシダーゼ酵素の群からの特定の種類の酵素の新規な製造方法に関する。α− ガラクトシダーゼ酵素は、サツカライドの他の部分にα＝結合したガラクトース を含有するサツカライドからガラクトースを分離する能力を有する。α−ガラク トシダーゼ酵素は広範囲の生物（微生物からヒトまで）にその存在が知られてい るが、その一部についてのみ、最近その構造が明らかにちれたにすぎない。たと えば、３ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ　（ＩＪ１ ｊｅ１８℃ｒｔｓｅｍ　。

１９８５　；　Ｓｕｍｎｅｒ−３ｍｉｔｈほか、１９８５）、ヒト酵素（Ｂ１５ ｈｏｐほか、１９８６）およびＥ、　ｃｏｌｉからのｍｅｎ遺伝子（Ｉ、ｉｌｊ ｅｓｔｒ６ｅｍ　ｇｒ、　Ｌｉｌｊｅｓｔｒ６ｅｍ　、１９８７　）である。後 二者は、本出願の最初の優先権主張日以後に刊行されたものである。

本発明の原因となった研究中に、旦、ｃａｒｌΩ＄酵素およびＥ、　Ｃ０１１酵 素１ａ１以下に述べる特定の使用に適していないことが明らかにちれた。ヒトα −ガラクトシダーゼは入手できないので試験できなかったが、以下に記載した実 験（本明細書中の例４および表参照）から考慮して、このヒト酵素もその特定な 使用には適していないと考えて間違いないものと思われる。

すなわち、きわめて限られた数のα−ガラクトシダーゼ酵素プレバレージョンし か、１−４結合β−Ｄ−マンノピラノシル単位の主鎖に付滑した１−６結合α− Ｄ−ガラクトピラノシル単位を含有するガラクトマンナンのガラクトース含量を 低下嘔セる方法に使用するのに適していない（ＭｃＣｌｅａｒｙほか、１９８４ 　；ＥＰ−Ａ−０１２１９６０）。この方法においては、ガラクトマンナンは、 ガラクトマンナン２〜７０チを含有スる不和プレバレージョンの形でインキュベ ートてれる。本明細書において％は、とくに指示のない限り重量憾である。この 方法で、ガラクトース含量が低下し、ヒトおよび動物の食料品および化粧用プン パレーションに使用できるガラクトマンナンが得られる。

しかしながら、これらのきわめて特異的なα−ガラクトシダーゼ酵素の化学構造 は未知である。

とくにＥＰ−Ａ−０１２１９６０号に記載式れた方法では、ガラクトース含量が 好ましくは２７チから１０チの間に低下したガラクトマンナンが生成する。

この場合、ガラクトマンナンの相互作用性はかなり改善される。ガラクトースを 高含量に含有するグアー（（ｙａｍｏｐ６１８　ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂａ　 ）、ルソ、ｌｎ　ルア（Ｍｅｄｉｃａｇｏ　５ａｔｉｖａ　）および：］　Ｏハ （ｒｆｙ山ト胛工阻ｆｏｅｎｕｍｇｒａθｃｕｍ　）から得られるガラクトマン ナンがＥＰ−Ａ−０１２１９６０号に記載された方法における出発原料として使 用できる例に挙げられている。

これらは改良された性質を有するガラクトマンナンを生成し、非処置グアーガム に比べてとくに他の、ｌ（ＩＪサツカライドとグル化する性質など、より好まし い性質を有するたとえばイナゴマメ（ｃａｒｏｂ　）ガムの代用どして使用でき る。産出の少ない穀物であり、またイナゴマメは一般に再植嘔れることがない九 め、イナゴマメガムは価格が上昇し、欠乏してきていることから、イナゴマメガ ムを使用する工業においては、その代用品の導入は歓迎嘔れるところである。

Ｅ’Ｐ−Ａ−０１２１９６［］号に記載された方法では、特異的なα−ガラクト シダーゼ活性を有し、高々弱いβ−マンナナーゼ活性を有する酵素プレハレーシ ョンが用いられる。適当な酵素は植物起源のもの（たトエばルツエルン、コロハ 、コーヒー豆マたＵグアーの種子）であり、また細菌（たとえば１３ａｃｉｌｌ ｕｓｃｅｒｅｕｓ　、ｌ：５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　匹且）　９たは菌（たとえば Ａ、ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｑたはＳａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　）培養物から 得られるが、そのすべてが同等に有効ではない。ガラクトマンナンを適当な酵素 プレバレージョンと、そのガラクトース含量が低下するまでインキュベーション したのち、得られた生成物は、そのままとくにアガール、カラｒ−ナンおよびキ サンタンのような他のポリサッカライドと配合石れこれらの材料との相剰的相互 作用の利点を生かして使用されるか、またはそのように使用する前に精製しても よい。

ＥＰ−Ａ−０１２１９６０号には、以下のα−ガラクトシダーゼが実施例中に記 載されている。

−グアーの種子のα−ガラクトシダーゼ川用　Ｍｃｃｌｅａｒｙ　、１９８３参 照）−Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇａｒからのα−ガラクトシダーゼ（Ｂａ ｈｌ＆　Ａｇｒａｗａｌ　、１９６９参照）−Ａ／　ッｓ　ルｙ　（Ｍｅｄｉｃ ａｇｏ　５ａｔｉＶａ　）の発芽種子からのα−ガラクトシダーゼ（例１６参照 ）−Ｄ　ｏ　ハ（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ　ｆｏｅｎｕｍ−ｇｒａｅｃｕｍ　）の 発芽種子からのα−ガラクトシダーゼ（例１３参照）ｇｐ−Ａ−０１２１９６０ 号に記載されたα−ガラクトシダーゼによる処理により、グアーからのグアラン や他のガラクトース含量の高いガラクトマンナンに比べ改良嘔れたガラクトマン ナンが得られるが、α−ガラクトシダーゼの利用性は埃在のところかなり限られ ていて、したがってその価格はかなり高い。

嘔らに、好ましいグアーのα−ガラクトシダーゼ酵素がグアーの発芽種子から単 離芒れても、望ましくないβ−マンナナーゼ（ガラクトマンナンのマンナン鎖な 切断する；　Ｍｃｃｌｅａｒｙ、１９８３参照）を完全に除去しなければならな いため、繁雑な操作による注意深いｎ製が必要である。

したがって、ガラクトマンナンのガラクトース含量を低下嘔セ、シかもガラクト マンナンのマンナン骨格を切断しすぎることがないα−ガラクトシダーゼプレバ レージョンを製造する方法が望まれている。

α−ガラクトシダーゼによってガラクトマンナンのガラクトース含量を低下させ る他の従来技術〉こついてはＥＰ−Ａ、−０１２１９６０号の第２頁および第６ 頁に記載されている。０の記載を本明細書に参考として導入する。

本発明１ｃ、１−４結合β−Ｄ−マンノピラノシル単位の主鎖にα−Ｄ−ガラク トピラノシル単位が結合したガラクトマンナンから、１−６結合α−Ｄ−ガラク トピラノシル単位を切り離す能力をもつα−ガラクトシダーゼの製造方法を提供 する。

本発明によれば、α−ガラクトシダーゼは組換えＤＮＡ法によって裂造嘔れる。

すなわち、所望のα−ガラクトシダーゼの性質を有する蛋白質をコードする遺伝 子を宿主生物中にクローニングし、形質転換宿主生物またはその子孫にその遺伝 子を発現さゼ、生成した蛋白質を所望により嘔らに処理したのち、所望のα−ガ ラクトシダーゼ特性を有する＆’Ｊペプチドを得る。

発現を微生物中で行う場合には、天然材料から、β−マンナナーゼを含まないα −ガラクトシダーゼを回収するために困難な単離方法を用いることなく、新しい 発酵法でα−ガラクトシダーゼを製造できる。

実質的にβ−マンナナーゼを含まないα−ガラクトシダーゼの製造は、天然の植 物を用いるよＶ微生物を用いることにより著しく容易になる。培養条件をβ−マ ンナナーゼの産生が完全に抑制ちれるように選んだり、β−マンナナーゼを全く 産生できない微生物（突然変異体）を使用することが可能だからである。

しかしながら、別法として組換えＤＮＡ技術によって形質転換ちれた植物もしく は植物組織培養体、またはその子孫中でグアーα−ガラクトシダーゼまたは類似 の活性を示すα−ガラクトシダーゼの製造の可能性はある。

現在までのところ、所望のα−ガラクトシダーゼ特性を有する蛋白質のアミノ酸 配列も、そのような蛋白質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列もわかってい ない。

本発明者らは、以下に例示するような、所望のα−ガラクトシダーゼの特性を有 する蛋白質をコードする遺伝子の単離に成功した。また、本発明者らは、この遺 伝子をクローニングベクター、いわゆる組換え発現プラスミドに導入することが できた。そしてそれを使用して、その遺伝子を微生物３ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｓｃｅｒｅｖｉｅｉａｅ　、以前にはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　１ａｃｔｉ ｓとして知られてい［Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｍａｒｘｉａｎｕＳｖａｒ 、　１ａｃｔｉｓ。

ＢａｃｉｌｌｕＢｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＨａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒ ｐｈａ　。

ならびに植物Ｎ１ｃｏｔ％ａｎａ　ｔａｂａｃｕｍおよびそのプレバレージョン 中で発現チセることに成功した。合成された生成物が細胞内に留まるか、あるい は細胞外に存在するかは、使用した発現プラスミドに依存する。

α−ガラクトシダーゼ酵素の活性は、最初、Ｍｅｃｌｅａｒｙ　（１９’８３　 ）によって述べられているようＫｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノ シド（ＰＮＰＧ　）　トのインキュベーションによって、また植物もしくは組織 については以下の例１１に述べるように４−メチルウムベリフエリル＝α−Ｄ− ガラクトぎラノシドとのインキュベーションによって明らかにでれた。さらに、 生成し友製品も、天然のグアー植物からの酵素の場合と実質的に同様にグアーガ ムのガラクトース含量を低下させる活性を示すことを証明した。

したがって、本発明の一態様は、蛋白質またはその前駆体をコードするヌクレオ チド配列が挿入されている組換えベクターであって、宿主生物を形質転換すると その宿主生物中でそのヌクレオチド配列の発現が可能になる組換えベクターに関 する。この場合の蛋白質はα−ガラクトシダーゼ活性を有し、１−４結合β−〇 −マンノピラノシル単位の主鎖に付加した１−６結合α−Ｄ−ガラク）ｆラノシ ル単位を切断してガラクトマンナンのガラクトース含量を低下芒セるＯとができ る蛋白質である。この場合の前駆体は、その蛋白質のたとえば移転を容易にする ような１個もしくは２個以上のオリゴペグチドもしくはポリペプチドを備えた蛋 白質である。

グア一種子からのα−ガラクトシダーゼに対して産生ずる抗体と陽性免疫交差反 応を示す数種のα−ガラクトシダーゼも１−４結合β−Ｄ−マンノピラノシル単 位の主鎖に付加した１−６結合α−Ｄ−ガラクトピラノシル単位を切断してガラ クトマンナンのガラクトース含量を低下できること、しかしながら、グアール種 子からのα−ガラクトシダーゼに対して産生じた抗体に陰性免疫交差反応を与え る他のα−ガラクトシダーゼは所望の能力をもたないことが明らかにちれた。

名らに、α−ガラクトシダーゼをコードするヌクレオチド配列は、生成したα− ガラクトシダーゼが所望の能力を失うことなく、遺伝子操作によって修飾できる ことが明らかにδれた。

したがって、ヌクレオチド配列は、 ｆａｌ　上述の特異的能力な頁するα−ガラクトシダーゼをコードする天然のヌ クレオチド配列、ｔｂｌ　グア一種子からのα−ガラクトシダーゼに対して産生 される抗体と陽性免疫交差反応を示すα−ガラクトシダーゼをコードするヌクレ オチド配列（Ｃ１（ａ）もしくは＋１）ｌと同一または上述の特異的能力をなお 保持しているその修飾体のいずれかでらるα−ガラクトシダーゼをコードする遺 伝子操作ヌクレオチド配列 からなる群より選ぶことができる。

たとえば、遺伝子は、α−ガラクトシダーゼを産生嘔セる微生物により適合する コドンを用いて作成することができる。その場合、α−ガラクトシダーゼをコー ドするヌクレオチド配列であるいわゆるα−ガラクトシダーゼ遺伝子は、天然の α−ガラクトシダーゼと同じα−ガラクトシダーゼをコードする。両酵素は同じ アミノ酸組成を有するからである。しかし、特異的α−ガラクトシダーゼ活性を なお保持する修飾酵素であるその修飾体をコードする遺伝子を作成するＣとも可 能である。組換えＤＮＡ技術を応用して、たとえば熱安定性および／または比活 性等の性質が改良ちれたα−ガラクトシダーゼの修飾体をコードする遺伝子操作 遺伝子を製造することも可能である。

本発明はとくに、以下のアミノ酸配列 ＤＤＣＶｉ’ＡＥＬＮＲＤＳＥＧ藺ＰＮ、〜υＪＰＳＯＩ覗万゛ハ引５ＫｆｌＬ ＫＬＧ買ＳＤＡαｉＱＴＬＳＳＧＲＰＸＦＦＳＭＣ調箋ＤＰＱＩＷ■５ＩＧＮ瀾 ＦｆｆＴＧＤＩＥＤ謹ＳＭＴＳＩルＳＮＲＡＭＤＤＴＴＨ肚ＩＳＮＡｇＶＩＡ■ ＱＤＫＬＧＶＱＯＫＫ■５ＴＮＤＬＥＶＷＡ、（）ＰＬＳＩ］叱ＶＡＶＩＬＷＮ Ｒ３ＳＳＲＡ’ＮＴＡＳＷＳＤＩＣ）ＬＱＱＣ）ＴＴＶＤＡＲＤＬＷＥ）１３Ｔ ＱＳＬＶＳＯＥＩ　５ＡＥＩＤＳＨＡＣＫＭＹＶＬＴＰＲ８ からなる蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを提供するもので ある。

グア一種子のα−ガラクトシダーゼをコードする天然の遺伝子の使用を望む場合 は、本明細書に示す操作によって見出された二本鎖相補性ＤＮＡ　（ｄＢ−ＣＤ ＮＡ　）を用いるのが好ましい。このａｓ　−ＣＤＮＡのプラス鎖に第６図に示 したヌクレオチド配列６０７〜１６９８を有し、上に示したアミノ酸配列１〜３ ６４のコドンに相当する。

選ばれた宿主生物に適当なベクターは、（ａ）　α−ガラクトシダーゼまたはそ の前駆体をコードする二本鎖ＤＮＡ　（ａθ−ＤＮＡ、　）ｔｂ）　ｔａ）のａ ８−　ＤＮＡのプラス鎖の暗号領域の３′末端に結合し、所望により選ばれた宿 主生物に適当な転写終結配列に続く翻訳停止コドン （Ｃ１ｔａ）のａｓ　−ＤＮＡのプラス鎖の上流に位置する、選択された宿主生 物に適当な発現レギユロン［ｄ）　ｄｓ　−ＤＮＡがα−ガラクトシダーゼの成 熟型なコードし、その型がメチニン残基で開始しない場合、（ａ）のａｓ　−Ｄ ＮＡのプラス鎖の暗号領域の５′末端に結合する翻訳開始ＡＴ（）　）リプレッ ト ｔｅ＋　（ａ＋の（ｉｓ　−ＤＮＡを、選ばれた宿主生物のデノムおよび／また は選ばれた宿主生物に適当な複製のオリジンおよび所望−より選択マーカーへの 挿入を容易にするヌクレオチド配列、ならびに ＋ｆ＋　所望によりα−ガラクトシダーゼの前駆体型の前駆体部分をコードする ａｓ　−ＤＮＡから構成されることが好ましい。

本発明の他の態様は、前述の組換えベクターの導入により、好ましくはβ−マン ナナーゼを実質的に含まないα−ガラクトシダーゼの産生能ヲ有している形質転 換宿主生物、およびその子孫に関する。宿主生物は、植物またはその部分たとえ ば５ｏｌａｎａｃｅａとくにＮ１ｃｏｔｉａｎａ　Ｘ　または動物もしくはヒト 細胞であってもよいが、細菌たとえばＢａｃｉｌｌｕｓ　、かびたとえばＡ、ｓ ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　、酵母たとえばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　。

Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　、　ＨａｎｓｅｎｕｌａおよびＰｉｃｈｉａのよ うな微生物も使用できる。本発明に以下の宿主生物、ついて実施された。遺伝子 は、これまで多数の異なる宿主生物中で発現ちれてきたことから、それが他の各 種宿主生物中でも発現すると期待することは現実に即している。文とえは、Ｐｉ ｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ　。

３ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｌｅｂｅｒｇｅｎｓｉｓ　、　ＡＥ３ｐｅ ｒ　１ｌｌｕｓ　ｎｉ　ｅｒおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓ などの例を挙げルコとができる。

しかしながら、本発明の主便な態様は１−４結合β−Ｄ−マンノピラノシル単位 の玉鎖に付加した１−６結合α−Ｄ−ガラクトピラノシル単位を切断することに よりガラクトマンナンのガラクトース含量を低下さセることができるα−ガラク トシダーゼを製造する方法において、前述の形質転換宿主生物を、培養中または 培養後の誘導に際してα−ガラクトシダーゼ乞産生するような条件下に培養し、 ついでα−ガラクトシダーゼを集めることを特徴とする方法に関する。ごの態様 の場合、α−ガラクトシダーゼは宿主生物から分泌てれ、ついでα−ガラクトシ ダーゼの捕集は発酵液からの細胞の除去、次に所望により得られ７′ｉ：溶液の 濃縮によって行われることが好ましい。

本発明はまた、ガラクトマンナンの水性プレバレージョンを、β−マンナナーゼ を実質的に含まないα−ガラクトシダーゼとインキュベーションすることにより 、ガラクトマンナンのガラクトース含量乞低下させる方法な提供する。このよう な方法は、たとえばＥＰ−Ａ−［）１２１　９６０によって公知である。しかし ながら、本発明の方法は、前段に述べた方法によって製造場れたα−ガラクトシ ダーゼを使用することを特徴とするものでちる。本発明は、ガラクトマンナン！ 改良するための公知方法を経済的により魅力があるものとするような価格および 量でα−がラクトシダーゼを提供するものでおる。

最後に、本発明は、前述の方法によって製造場れたガラクトース含量の低いガラ クトマンナンを用い、所望によりこれを１種または２種以上の他の増粘剤または デル化剤、たとえばアラビアゴム、トラガカント、アガール、アルギン、カラデ ナン、ファーセララン、ペクチン、ゼラチン、デンプンおよび改良ガムたとえば カルざキシメチルセルロースと混合する食品、動物用飼料または化粧品の製造方 法に関する。

最後に挙げた２つの態様は、 （１）　α−ガラクトシダーゼを生成できる形質転換宿主生物を使用する本発明 の方法によって製造ちれたα−ガラクトシダーゼの、ガラクトマンナンのガラク トース含量低下のための使用 （２）　ガラクトース含量の高いガラクトマンナンを本発明の方法によって製造 されたα−ガラクトシダーゼで処理して得られるガラクトース含量低下ガラクト マンナンの、食品、動物用飼料または化粧品の製造のための使用、 と表現することもできる。

本発明の要約および技術的記述の概略 本発明の様々な態様（ζ広範な研究の結果である。これらを以下に概括し、詳細 は実施例で述べる。

本発明の一態様は、ガラクトマンナンのたとえば１−４結合β−Ｄ−マンノピラ ノシル単位の主鎖に付加された１−６結合α−Ｄ−ガラクトピラノシル単位を切 断することにより、ガラクトマンナンのガラクトース含量を実質的に低下できる α−ガラクトシダーゼ酵素のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の解明に関す る（例１参照）。

この酵素活性が発芽グア一種子の内乳中に存在することは知られていた。しかし ながら、グア一種子中のどの細胞がこのα−ガラクトシダーゼ酵素の産生に関与 しているのかは明らかではなかった。

グア一種子の発芽に関する頭微鏡的研究と、種皮および／または胚除去後の内乳 分解の観察が相まって、酵素は内乳自身の中で製造てれるという仮説が導かれた 。粕粉細胞が最も有力な候補とちれた（例１のセツション１．１）。

この仮説は確紹されねばならなかった。したがって、ｍＲＮＡが粕粉細胞から精 製てれた。発芽した種子から２０時間にわたって分泌嘔れた内乳はそのままでは ＲＮＡの精製に使用できなかった。＆　ＩＪサツカライドがゲル形成により、著 しくカオトロｔツタな試薬を用いてもＲＮＡの抽出を妨害した。この問題を解決 するために、本発明者らは、内乳＆　ＩＪサツカライドを分解するために外から 加えた酵素を使用した。条件を注意深く訓整しないと、粕粉細胞中のＲＮＡが操 作中に分解することが明らかに嘔れ、Ｃ１’Ｌは粕粉細胞自体の中に産生するＲ Ｎ［Ｌ８６１酵素によるものと考えられた。精製ＲＮＡについてα−ガラクトシ ダーゼをコードするｍＲＮＡの存在を、 一α−ガラクトシダーゼ特異性抗体と反応する蛋白質についてｉｎ　ｖｉｔｒｏ 翻訳および分析−ｍＲＮＡと、α−ガラクトシダーゼに特異的なオリビヌクレオ チド混合グローブとのハイブリダイゼーション（これらの特異的グローブの構築 には、精製蛋白質の小部分のアミノ酸配列を決定した）によって解析した。

両解析の結果、α−ガラクトシダーゼをコードするｍＲＮＡが粕粉細胞中に存在 することが明らかにてれた（例１、セツション１．２）。

ｍＲＮＡは、α−ガラクトシダーゼ特異的オリゴヌクレオチド混合プローゾを用 い、標準方法によってグアーα−ガラクトシダーセｃＤＮＡクローンをクローニ ングするために使用した（例１、セツション１．３および１．４）。

グアーα−ガラクトシダーゼＣＤＮＡクローンのヌクレオチド配列を決定し、ア ミノ酸配列を誘導した。精製蛋白質について決定したＮＨ２末端アミノ酸配列は ヌクレオチド配列から誘導したアミノ酸配列と同一であることが明らかに嘔れ、 嘔らにα−ガラクトシダーゼは成熟蛋白質の前に４７個のアミノ酸残基をもつ前 駆体として合成されることが示された（例１、セツション１．５）。

本発明の他の態様は、各種宿主によるグアーα−ガラクトシダーゼの新規製造経 路の可能性に関する。本発明は前述のような特異的能力を有するα−ガラクトシ ダーゼ酵素の新規製造方法を提供する。２桟の微生物宿主についての実験で、経 済的に興味あるレベルがすでに達成逼れることが示され、数種の他の宿主生物（ 微生物および植物の両者）でも可能性が明らかにされている。

例示の念めに、本発明者らはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　。

２７０６というプラスミドで、酵母ＧＡＰＤＨプロモーターを成熟α−ガラクト シダーゼのみをコードする遺伝情報に融合させた。他のプラスミドＰＵＲＹ　２ ７０５は、ＧＡＰＤＨプロモーターを、インベルターゼシグナル配列ユニ成熟α −がラクトシダーゼからなるハイブリッド遺伝子に融合さセた。両プラスミドと も、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドに対して活性な３．Ｃｅ ｒｅＶｉｅｉａｅ中で酵素の産生が起こった。しかしながら、ｐｕＲｙ　２７　 Ｃ１５の生成物は１）ＵＲＹ　２７０３の生成物と異なり、酵母細胞の外部に出 現できた。石らに、ウェスターン法での解析により、ｐｕＲＹ２７０５からの生 成物は植物酵素と同じ分子量を有していたのに対し、ｐＵＲＹ２７０３の生成物 はわずかに低い分子量を示した（例２診照）。

プラスミドｐｔＪＲＹ　２７０５を係留した酵母細胞から、１ｍｌ中α−ガラク トシダーゼたとえば１０単位が存在する粗抽出液を調製した。このような粗プレ バレージョンはグアーガムのガラクトース含量を低下嘔セることか可能であった （例６参照）。

３ａＣＣｈａｒＯｍ７ＣｅＢについての他の例としては、酵母細胞の炭素源とし てのガラクトース上での生育により誘導ちれるＧＡＬ　７プロモーターを、イン ベルターゼシグナル配列ユニ　成熟α−ガラクトシダーゼからなるハイブリッド 遺伝子に融合してプラスミドｐＵＲ２７０６およびｐＵＲ２７３０を構築した。

両プラスミド間の差は、ｐＵＲ２７０６が、２７１ｂｐのクローン化ＧＡＬ　７ 　ＤＮＡフラグメントを使用したのに、ｐＵＲ２７３０では（）ＡＬ　７プロモ ーターをｉｎ、　ＶｉｔｒＯＴ合成したオリゴヌクレオチドから得た点である。

プラスミドｐＵＲ２７０６はガラクトース上での生育により誘導すると、酵素の 酵母細胞による産生が起こった。

酵素に生育培地中に５，０００　Ｕ／ｌ　＝！で分泌嘔セ、正しく処理し、グリ コジル化する（例９参照）。

発酵培地から酵母細胞を濾去し、培地を１０倍に濃縮した。このような粗濃縮液 は、グア一種子から精製した酵素と比較して全く同じに、グアーガムのガラクト ース含量を低下名ゼることができた（例１０参照）。

グア一種子からのα−ガラクトシダーゼに対して産生される抗体との陽性免疫交 差反応とガラクトマンナンのガラクトース含量低下能との間に関係が存在すると の所見については例４に説明する。

α−ガラクトシダーゼ遺伝子がＳ、ＣθｒｅＶｉ８１ａθ中のみでなく、他の微 生物中でも発現できることを例示するため、各１微生物、すなわち、 中で酵素を産生できるプラスミドを構築した。

（ａ）　［ｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｍａｒｘｉａｎｕｓ　ｖａｒ、　１ａｃｔ ｉｅ中でのα−ガラクトシダーゼの製造 Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｅｉａｅプラスミド１）ＵＲＹ　２７０５中にＫｌｕｙｖｅｒ ｏｍｙｃｅｓ自動複製システム（すなわちＫＡＲ３２）と選訳マーカー（ｔｒｐ 　−１遺伝子）の両者を導入することによりｐＵＲ２４０５と呼ばれるプラスミ ドを調製した。株に、　ｍａｒｘｉａｕｓ　ｖａｒ、　１ａｃｔ４ｓ株ＳＤ　− ｉ　ｉ　（ｌａｃ−４、ｔｒｐ　−１）の酵母細胞をプラスミドＰＵＲ２４０５ で形質転換した。生育後、形質転換株の細胞抽出液は、このプラスミドをもたな い同−株と異なり、人工基質ｐＮＰＧを加水分解できる蛋白質を含有していた。

名らに、粗細胞抽出液のウェスターン法解析でグアーα−ガラクトシダーゼ抗血 清と特異的反応を示し、グアーα−ガラクトシダーゼ酵素の存在が明らかであっ た（例５参照）。これらの実験から、形質転換Ｋｌｕｙｖｅ　ｒｏｍｙｃｅ　ｓ がグアーα−ガラクトシダーゼ酵素ヲ産生ずることが示される。

（ｂｌ　Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏ’ｉｙｍｏｒｐｈａ中でのα−ガラクトシダ ーゼの製造 Ｈ，ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａが、たとえばＭＯＸプロモーターまたはＤＨＡＳプロ モーターのような誘導可能なプロモーターを特異的に用いて外来性生成物を産生 ずる可能性についてはすでに確認されている。Ｈ９ｐ０１７ｍｏｒｐｈａ中で複 製可能で１ｅｕ−突然変異を補充できるベクターＹＥｐ１６に基づいてｐＵＲ３ ５１０と呼ばれるプラスミドが構築された。このベクター中には以下の構築体二 ＭＯＸプロモーターーインベルターゼシグナル配列−成熟α−ガラクトシダーゼ ーＭＯχターミネータ−が配置された。株Ｈ，ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ　Ｌ　１　 （ｌｅｕ　１−１）の酵母細胞がプラスミド：［）ＵＲ３５１Ｄで形質転換でれ 几。ＭＭアガール板上、グリセロールを炭素源として生育嘔セたのち、細胞を破 壊し、細胞抽出液を調製した。形質転換株の細胞抽出液は人、工基質ｐＮＰＧを 加水分解できる蛋白質乞含有したが、このプラスミドをもたない同−株にはその 蛋白質は認められなかっ友。ちらに粗細胞抽出液のウェスターン法での解析で、 グアーα−ガラクトシダーゼ抗血清と特異的反応を示し、グアーα−ガラクトシ ダーゼの存在が明らかであった（例８参照）。

これらの実験は、形質転換Ｈａｎｓｅｎｕｌａがグアーα−ガラクトシダーゼ酵 素を産生ずること７示している。

ＦＣ）　α−ガラクトシダーゼ遺伝子が真核微生物中のみでなく、原核微生物中 でも発現できることを示すために、１３ａｃｉｌｌｕｓ　ｅｕｂｔｌｉｓ中で酵 素を産生できるプラスミドを構築した。

α−アミラーゼシグナル配列二ユニ熟α−ガラクトシダーゼからなるハイブリッ ド遺伝子の前にｓｐｏ　２グロモーターを配置したｐＵＲ２６０１と呼ばれるプ ラスミドを調製し九（第６図）。

このプラスミドを係留したＢ、θｕｌ）ｔｉｌｉＦｌ細胞を培養したところ、培 養メジウム中に特定の生育期に、Ｉ）ＮＰＧに対する活性を有する蛋白質が存在 した。至適生育メジウムおよび生育条件を選んでファーメンタ−中で培養すると 、生育メジウム１１中に１７６０単位が認められた。ウェスターン法で解析する と、グアーα−ガラクトシダーゼ抗血清と特異的に反応し、生育培地中にグアー α−ガラクトシダーゼの存在が示芒れた。しかしながら、分子量（グ植物酵素の 場合より少し小石がった。ＮＨ２末端の配列決定から、α−アミラーゼシグナル 配列（一完全に正しく除去されていて、この差はＢａＣ１１ｌｕ８酵素がグリコ ジル化されないという事実によるものである。

これらの実験から、形質転換Ｂａｃｉｌｌｕｅはグアーα−ガラクトシダーゼｆ ｔ産生するのみでなく、それを生育培地中に分泌することが明らかである。芒ら にＢａＣ１１ｌｕεによって製造芒れた酵素がグアーガムのガラクトース含量を 低下芒セることも見出ちれた（例７）。

α−ガラクトシダーゼ遺伝子が微生物内のみでなく、植物内でも発現できること を例示するため、この酵素をＮ１ｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ　、すなわち 偶成培養物、根培養物、懸濁培養物および全植物中で産生できるプラスミドを構 築した。すなわち、全グアープレープローα−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有す る植物発現ベクター乞構築した（１：１ＵＲ８００１）。このベクターをＮ１Ｃ Ｏｔｉａｎ＆植物マタはそのプレバレージョン中にＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ 　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ誘導ベクターを介して挿入した。その結果、偶成培養 物、毛根培養物、葉および懸濁組織培養物中に、活性なα−ガラクトシダーゼ酵 素が産生された。嘔らにウェスターン法解析により、タバコ組織中に産生嘔れた α−ガラクトシダーゼ酵素がグアー粕粉細胞中に産生名した酵素と同じ分子量乞 もつことが明らかにちれｆｃ（例１１参照）。

本発明の各種態様を以下の実施例に例示するが、これは本発明を限定するもので はない。実施例は以下の主題に関するものであり、例１および４はδらに項目に 分かれている。

例１ ガラクトマンナンのガラクトース含量を低下でさるα−ガラクトシダーゼ酵素を コードする遺伝情報の単離および特性 １．１．グア一種子中のα−ガラクトシダーゼ産生細胞の同定 １．２．粗粉細胞からのｍＲＮＡの精製および解析１・６・　グア一種子からの 粗粉細胞のｍＲＩＶＡ７！Ｊ・らｃＤＮＡライブラリーの構築 １・４．グアーα−ガラクトシダーゼ遺伝情報を含有するクローンの選択 １・５．グアーα−ガラクトシダーゼｃ　ＤＮＡクローンのヌクレオチド配列の 決定およびα−ガラクトシタ−−ゼ酵素のアミノ酸配列の誘導 例２ 遺伝子操作肪五坪月巴止肥」田工法吐駐ニヨルクアーα−ガラクトシダーゼの製 造 例６ 遺伝子操作Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｅｉａｅによジ製造嘔れたα−ガラクトシダーゼ によるガラクトマンナンのガラクトース含量の低下 例４ 各塩α−ガラクトシダーゼ酵素の免疫学的関係とガム修飾能 ４．１．α−ガラクトシダーゼ酵素源 ４．２．遺伝子操作微生物：　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓジ製造ちれた酵素 ４．６．アウチェロニー二重拡張法で解析した免疫学的関係 ４．４．ウェスターン法で解析した免疫学的関係４．５．α−ガラクトシダーゼ 酵素のガラクトマンナン中ガラクトース含量低下能 例５ 遺伝子操作に、１ｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｍａｒｘｉａｎ、ｕｓ　ｖａ、ｒ、 　１ａＣｔｉｅによるグアーα−ガラクトシダーゼの製造例６ 遺伝子操作Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓによルク７−Ｃ１−ｄラクトシ ダーゼの製造 遺伝子操作Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓによＶ製造したα−ガラクトシダーゼ酵素に よるガラクトマンナ、中ガラク）　−ス含量の低下 例８ 遺伝子操作Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａにょるグアーα−ガラク トシダーゼの製造 例９ ＯＡ、Ｌ　７プロモーターを用いた遺伝子操作３ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃ ｅｒｅｖｉｓｉａｅによるグアーα−ガラクトシダーゼの製造 例１０ （）ＡＬ　７プロモーターを用い之遺伝子操作Ｓ、ＣθｒｅｌＶｉｓｉａ８によ り製造したα−ガラクトシダーゼ酵素によるガラクトマンナン中ガラクトース含 量の低下 特定のＮｌｃｏｔｉａｎａ種における遺伝子操作植物および植物組織による、ジ アールα−ガラクトシダーゼの製造 本明細書はさらに、表、文献一覧表、使用した略号の一覧弄、図面の説明および 第１図〜第２１図を包含グアーガムの修飾に好ましい酵素は、グアーの種子の内 乳から精製されるα−ガラクトシダーゼ酵素であることは明らかに石れている（ 　ｕｃｃ１ｅａｒ７ほか、１９８４；ＥＰ−Ａ−０１２１９６０号）ので、ここ ではこの特異的酵素の説明に重点を債く。

グアーは内乳７もつマメ類である。種子内乳は、細胞層、粕粉、および王として ガラクトマンナンからなる貯蔵物質から構成されている。ガラクトマンナンは最 初、紀胞壁ポリサッカライドとして蓄槓石れるが、種子の発芽の際に分解する。

他のマメ類と同様、貯蔵蛋白質は、種子に子葉を付与し、これが内乳内に包まれ る。内乳乞もつマメ類の発芽および貯蔵部の動員に関する研究は、類縁のマメ類 のコロハおよびルノエルンについて行われている（総説はＭｅｉｅｒ　＆　Ｒｅ １ｄ。

１９８２がある）。膨化させると（水に浸漬δセる）、酵素はｅｎ　Ｏ８ｐＱｒ ｍ中に放出され、２つの王な酵素活性はα−ガラクトシダーゼとβ−マンナナー ゼであることが明らかに嘔れている。これらの結果は、酵素がコロハ糧子の発芽 の際に粕粉細胞中で合成中で合成ちれることを示唆しているが、本発明者らの知 る限りでは、結論的な証拠は今日まで得られていない。

グアーとコロハの類似性から、本発明者らはグアーの種子もこれらの酵素を粕粉 細胞で合成しているとして間違いないものと考えた。

まず、本発明者ら（２、グア一種子の発芽を顕微鏡的方法で研究した。

種子を鋭いカミソリでｉ　ｍｍのディスクにスライスしＮ＋７）ち０．１Ｍカコ ジル酸ナトリウム緩衝液（ｐ）１７．４）中２．５％グルタルアルデヒドに、６ ℃で６時間固定した。この物質を次に同じ緩１衝液を用い数回取りかえて洗浄し たのち、０．１Ｍカコジル酸塩緩衝液中１係四酸化オスミウムにより室温で４時 間、固定後処理を行つ九。組織はエタノールによって脱水し、３ｐｕｒｒ８エポ キシ樹脂中に包埋した。重合は７０°Ｃで２４時間実施した。薄片化はＲｅ１ｃ ｈｅｒｔ　ＵｌｔｒａＣｕｔ　フィクロドーム上、ガラスナイフを用いて実施し 友。薄片は１〜２ミクロンの浮石に切断し、きれいなガラススライド上の蒸留水 の水滴上に浮かべ、熱板上に置いて６０°Ｃで乾燥した。染色は１％トルイジン ブルーＯを用いて行い、薄片にＤＰＸマウンタント（ＢＤＨから）上に据えた。

Ｌｅｉｔｚ　ＱｒｔｈＯｌｕＸ　ｓ倣鏡上、相および干渉コントラストレンズの 両者を用いて顕微鏡写真を撮影した。厚い種皮の強い複屈折を強調するために偏 光を用い文。

発芽していないグア一種子の断面図を第１図に示した。グアーでは一部の内乳種 子にみられるような、粕粉による細胞の単一密着層の形成は認められなかった。

層に種々の点に示てれているように、２．３．４’！たはさらに多数の細胞から なっている。発芽が進むと、内乳は次第に軟くなって切断は困難になる。種子が 発芽して４８時間後には、内乳の構造はすつかり破壊されてしまうが、粕粉細胞 の外層は安定な細胞間マトリックス内に破壊されないで残っている。しかし、細 胞の内容（グ欠失しているようにみえる。この段階で、糊粉層と残りの内乳の間 に明らかな破壊があって、内乳の分解は粕粉の付近で最も強かつ念ことが示唆嘔 れる。

これは、内乳消化の酵素は糊粉層から放出嘔れたＯとを示すものであろう。内乳 分解の進行（２、発芽時の種皮の欠卯によって変化しなかった。また、膨化後に 胚を除去しても、同様な内乳の軟化が観察嘔れた。これは、種皮も胚も内乳の破 壊には関与していないことを示唆している。これは、それらが内乳の分解に関わ る酵素、α−ガラクトシダーゼおよびβ−マンナナーゼの産生にも関与していな いと考えてよいど思われる。

これらの結果は、グア一種子中でも、α−ガラクトシダーゼまたはその前駆体が 粕粉細胞中で産生され、ついでこれらの細胞から貯＊、ｉ？ｌＪサツカライド層 に分泌されるとする仮説と一致する。しかしながら、この仮説の結論的証拠（（ 、α−ガラクトシダーゼ酵素またはα−ガラクトシダーゼをコードするｍＲＮＡ のいずれかが、粕粉細胞中に存在することを示すことによってのみ得られる。蛋 白質の存在を明らかにすることには問題が考えられたので（急速な分泌、同定で きない前駆体型）、本発明者らは、粕粉細胞中におけるα−ガラクトシダーゼコ ードｍ　ＲＮＡの存在を分析しなければならなかった。

１．２．粕粉細胞からのｍＲＮＡのｎ！ａおよび解析α−ガラクトシダーゼをコ ードするｍＲＮＡの存在を調べるため、粕粉細胞のｍＲＮＡ含量の解析に以下の 計画乞採用した。

一内乳中に存在する大部分のポリサッカライドを含まない粕粉細胞の単離 一粕粉細胞からｍＲＮＡの精製 −ｍＲＮＡのｉｎ　ｖｉ℃ｒＯ紬訳、精製α−ガラクトシダーゼに対して産生じ た抗体とともに蛋白質生成物の単離、メリアクリルアミドデル電気泳動による解 析一部分的に確立したアミノ酸配列に基づくα−ガラクトシダーゼ特異的オリゴ ヌクレオチドプローゾによるｍ　ＲＮＡのノサン法ハイブリダイゼーション１． ２．１　、粕粉細胞の単離 グア一種子（市販の変種Ｋｉｎｇ　Ｇｕａｒ　ｖａｒ　５ｅａｈ　９　［］；殺 黴剤処理、Ｃｒｏｗｎ　Ｑｕａｌｉｔｙ　５ｅｅａ　Ｃｏ、　、　Ｔｅｘ＆ｓか ら購入）を１０　％　Ｃ１１１０ｒ０８　（源白粉、有効塩素４％）で１時間殺 菌した。次に、種子を滅菌水道水で洗浄し、頻回に水を取りかえて５時間膨化嘔 セ（種皮からの色素が遊出する結果、水は褐色になる）、透明なマーガリンチュ ーブ内に含まれる水道水／１チアガロースのデルの界面に置いて発芽ちセる。発 芽は２０時時間性嘔セる。

ついで種子を個々に解体した。まず、種皮を、マイクロパイルの領域に孔をあけ てはいだ。次に内乳を、２個の子葉の縁に広がる内乳の薄い部分を穏やかに６い て胚から分離した。ついで内乳乞半分に分けた。

これらの発芽内乳から直接ＲＮＡを精製する試みは、最も強力なカオトロピンク 試薬（たとえばグアニジニウムチオシアネート）ヲ用いた場合でも、内乳は全く 加工できないデルを生じるため、失敗した。

したがって、ポリサッカライド物質から粒粉細胞ｔさらに分離することが必螢で あった。

そこで、外部から加えた酵素プレバレージョンによってポリサンカライドの分解 を試みることに決定した。

半分ずつに分けた内乳乞、Ｏａｍｂｏｒｇ　ｆ３５メジウム（Ｇｉｂｃｏ　）に 溶解し、１２係シユクロースを補光した酵素溶液に浮遊嘔セた。インキュベーシ ョンは２２６Ｃで実施した。

内乳の内容の完全な消化は肉眼的にモニタリングが可能で、使用した酵素および その濃度の両者に依存した。消化が進ひに従って、内乳は次第にその半球型の形 状を失い、軟く、可撓性になった。多数の市販酵素を様々な濃度で試験した。０ ｎａｚｕｋａ　Ｒ１Ｑ　（ＫｉｎｋｉＨｏｎｅｈａ　ｃｏ＋Ｌｔａ　）、Ｇａｍ ｍａｎａｓｅ　（ＮＯＶ○）およびＤｒｉθｅｌａｓｅ　（Ｆｌｕｋａ　）であ る。初期の研究によって濃厚な市販酵素プレバレージョンに暴露すると、粕粉細 胞はプラズマ分離を起こして死亡することがわかっていたので、酵素プレバレー ジョンを高濃度で使用できるように清浄化した。これはベンゾイル化透析チュー ブ（Ｓｉｇｍａ　）を用いた透析によって実施した。酵素（ζ１２チシユクロー ス含有Ｂ５メジウム中に溶解しく１０％）、使用前に１８〜２４時間、同一メジ ウムに対して４°Ｃで透析した。次に酵素を用いて内乳を消化した。

これらの中、１０チの濃度ではＤｒｉｌｌｌθ１ａｓ６が最も有効でちるように 思われた。７〜８時間インキュベーション後、内乳は丸まって、支持ポリサンカ ライド組織はすべて消化ちれてしまった。粕粉が丸くなった点が消化の終点とし た。丸くなった粕粉のサンプルを顕微鏡で調べ（壊死）、またＤＮＡ染色を用い てその生存能乞チェックした（フロレスセインジアセテート染料、１（、ｏｅｃ ｈｓｔ　、アセトン中５　ｍ９　／　５　ｍｔ　ｔａｇ（使用直前にメジウムで １１５ｏに希釈した）。至適酵素処理（１０チ酵素、７〜８時間インキュベーシ ョン）で、非生存、壊死細胞はわずか（２０％未満）であった。これらの細胞か らのＲＮＡプレバレージョンは、りざシームＲＮＡの統合性から判断して、ＲＮ Ａはよく保存されていたことを示していた。

所望の外観（白色、円形）の糊粉層を個々に消化メジウムから採取し、同じ浸透 圧で５回洗浄して、残ったポリサッカライドを除去した。最後に液体窒素中に落 として保存した。顕微鏡用に調製したこの物質の薄片は、粕粉２〜５個の細胞厚 で、細胞は酵素プレバレージョンによる消化に抵抗したマトリックス中に包埋凍 結粕粉物質なドライアイスの温度に維持した乳鉢と乳棒で粉砕した。粉砕物質を 、分解緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｏ　−Ｈ＋：ｌ　ｐＨ８，０，２チザルコシル） １容十フエノール（１ＭＴｒｔｓ　−ＨＣｌＰＨ８，０と平衡化）２容中で解凍 させた。混合し、遠心分離した（１０分、５、Ｃ１００ｒｐｍ　）のち、このフ ェノール抽出な水相上で２回反復した。最後に、６Ｍ酢酸ナトリウム（ＮａＡＣ ）ｐ［（５，４’！”／１０容とエタノール２．５容暑加えたのち、−２０’Ｃ で核酸を一夜沈殿畑セた。

定性分析には、ＲＮＡを沈殿石セ、ｓＴＥ緩衝液（１ＤＯｍＭ　ＮａＣ１，１［ ］　ｍＭＴｒｉｓ　−ＨＣＩ　ｐＪ（７，５，１ｍＭＥＤＴＡ）に溶解し、１分 間煮沸し、直ちに氷上で冷却した。等容のサンプル緩Ｓ液〔１０Ｍ尿素、１０係 シユクコース、Ｅ緩衝液（４［］　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌＨ８，６，２［１ ｍＭｉ′ ＮａＡＣ、２０ｍＭ　ＥＤＴＡ　）中０．０２　％ブロモフェノールブルー〕を 加えた。サンプル（３〜１０μｓ）をアがロース−尿素ゲル（１，８％アガロー ス、Ｅ緩衝液中５Ｍ尿素）上電気泳動に付した。ＲＮＡバンドはエチジウムプロ ミド（０，５μＦ／ｍ／Ｖ）で１５分間染色し、長波長紫外線に暴露して可視化 した。

嘔らに絹製するためには、ＳＴＥ緩衝液に溶解したＲＮＡを１容の８　Ｍ　Ｌｉ Ｃ１？：加えて好ましくは沈殿δセ、氷上で一夜インキュベーションＬｉ。１０ 分ＭＩＯ，０００ｒｐｍで遠心分離して沈殿を集めた（この工程は、ＤＮＡとま だプレバレージョン中に存在するポリサッカライドの大部分を除去する）。ＲＮ Ａベレツ）　’ｋ　０．１４す゛ルコシルを含ひＳＴＥ緩衝液に溶解し、２６０ ｎｍの吸収ｋ　測定Ｌ　テ濃度ヲ決定し、１／、。容の３　Ｍ　ＮａＡｃ　ｐＨ ５，４および２，５容のエタノールを添加したのち、一部を一２０°Ｃで保存し た。

ポリアデニル化ｍＲＮＡ　（ボＩＪ　−Ａ　ＲＮＡ、　）の精製には、２．５ｍ ９のＲＮＡ　’ｆ　Ｂｐｐｅｎｄｏｒｆ管中に沈殿６セ、３００μＡのＨ２Ｏに 溶解し、５分間６５°Ｃに加熱し、氷水上で冷却し、ついで１Ｑ　ｍＭＴｒｉｓ 　−ＨＣＩ　ＰＨ７，５、ｉ　Ｍ　ＮａＣ１乞含有する混合物３００μｌビ加え 、Ｄ、１係ヂルコシルを加えた。

予め６回○緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ、　ｐＨ７，５゜ｉ　ｍＭ　 ＥＤＴＡ　、０．５　Ｍ　ＮａＣ１、０，１％デルコシルンで洗浄したオリゴ− ａＴセルロース（Ｔ２型、ｆ：ｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｈｅ５ｅａｒｃｂ、 　）　５　Ｑ　ｍ９にＲＮＡ　ｔ、）加えた。

少々くとも４時間、室温で上下回転させてインキュベーションしたのち、混合物 を、シリコン処置グラスウールのプラグを含む青色Ｅｐｐｅｎａｏｒｆ　１ｍｉ 　ｔ　ペットチップ上に層にした。流出液中のＲＮＡ濃度を測定し、カラム乞０ Ｄ２６０の吸光が０．０５未満になるまで０緩衝液で洗浄した。

カラムに結合したポリ−Ａ、　ＲＮＡ　暑最後に１０ｍＭＴｒ１ｓ　−ＨＣＩ　 Ｐ）（７，５，１ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．１％＋’ルコシルを含有する混合物 ６×１０口μｌを加えて溶出した。ポリ−Ａ　ＲＮＡ０量は通常、総Ｒ）ＪＡの １チで、２６０ｎｍにおける吸光を測定して定量嘔れた。

１．２．３．　ｚリーＡ　ＲＮＡのｉｎ　ｖｉｔｒｏ　翻訳Ｗｈｅａｔ　Ｇｅｒ ｍ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　システムｆ　Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅ ａｒから入手し、その指示書に従って、放射性プレカーサーとして３５Ｓ−メチ オニン（１０６６Ｃ１／ｍｍｏｌ　）２用いて操作を行った。翻訳生成物は、Ｅ ｄｅｎｓほか（１９８２）の記載のように、ポリアクリルアミドデル上で分離し たのちオートラジオグラフィーで分析した。

翻訳生成物はその一！ま、またはＭｅ（：１ｅａｒ７　（１９８３）の記載のよ うにしてａｈしたα−ガラクトシダーゼ蛋白質でウサギを免疫処置して産生さセ たα−ガラクトシダーゼ特異的抗血清とインキュベーションｔ、４のち適用した 。抗血清と反応した蛋白質をプロティンＡ−セファロース（ｐｈａｒｍａｃｉａ 　）との沈殿により、Ｅａｅｎｓほか（１９８２）の記載のようにして分離した 。

粕粉細胞から精製したｍＲＮＡによってコードされる種々の蛋白質のうち、α− ガラクトシダーゼ荷異的抗体と反応する蛋白質の存在が示された（第２図）。こ の蛋白質の見掛けの分子量は４４　ｋｄである。

１．２．４．１　、オリゴヌクレオチドプローブα−ガラクトシダーゼ！フード するｍ　ＲＮＡのグローブとして、本発明者らはＮＨ２−末端の一部および内部 ペプチド（第３図参照）について確立嘔１シたアミノ酸配列に基づくオリゴヌク レオチドを使用した。Ｎ製嘔れた蛋白質から、Ｎ末端アミノ酸配列解析でに、Ｂ ｆｌｌｃｋ−ｍａｎ８９Ｑｃスピニングカップ里白質シクエンサーを用い、Ｅａ ｍａｎ分％（Ｅａｍａｎ　＆　Ｂｅｇｇ、　１９６７　）によって直接決定する 。内部ペプチドは精製蛋白質をシアノデンブロミドとトリプシンで分解したのち 同様に配列を決定し、ついでそのペプチドをカラムクロマトグラフィーにより他 のペプチドから均一に精製した。

確立ちれたアミノ酸配列に基づき、そのアミノ酸をフードする丁べての可能なヌ クレオチド配列が誘導ちれた。可能なヌクレオチド配列のすべてｉｆは一部を含 むデオキシ−オリゴヌクレオチド（いわゆる混合グローブ）ヲＤＮＡシンセサイ ザー（Ａ、ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　）上、ホスファイト法（Ｍａ ｔｔｅｕｃｉ　＆　Ｃａｒｕｔｈｅｒ８．１９８１）を用いて合成した。オリゴ ヌクレオチドは１６チまたは２０％メリアクリルアミドデル上で精製した（　Ｍ ａｎｉａｔｉＳほか、１９８２）。

通常、精製オリゴヌクレオチドの０．１〜０．３μ９乞、５　Ｑ　ｍＭ　Ｔｒｉ ８−　Ｂ（Ｃ１ｐ）１．７．５．１０　ｍＭ　ＭｇＣｌ２．０．１　ｍＭＥＤＴ Ａ　、　１０　ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ　）、７０／ＪＣ１γ−”２Ｐ 　−Ａ、ＴＰ　（３０００ｃｉ　／　ｍ＋ｎｏ１゜Ａｍｅｒｓｈａｍ　）　、１ ０単位のポリヌクレオチドキナーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　）中、最終容量１５μ １１６７°Ｃで３０分間インキュベーションして標識し友。１０μｌの０．５Ｍ 　ＥＤＴＡ、　ｐＨ３，［］で反応を終結ちセ、フェノール／クロロホルム（１ ：１）で抽出した。水相Ｙ、ＴＥ緩衝液（１［１ｍＭＴｒｉｓ　−ＨＣＩ　ｐＨ ８，０および１　ｍＭＥＤＴＡ　）で平衡化した２、５ｍｌの３ｅｐｈａａｅｘ 　Ｇ　２５カラム（使い捨てシリンジ）を通した。２５０μｌのフラクションを 集め、これから最初の２個の放射性フラクション、通常フラクション４および５ を集めた。

１．２．４．２．　ノザン法ハイブリダイゼーション精製ＲＮＡをホルムアルデ ヒドの存在下に報告嘔れたようにして（Ｌｅｈｒａｃｈほか、１９７７）電気泳 動によッテ分離Ｌ４゜１０　ｍｕ　Ｔｒｌｓ　−ＨＣＩ　ＰＨ７，５，１ｍＭＥ ＤＴＡＸＤ、１　Ｍ　ＮａＣ１および［１，１％　ＳＤＳの混合物１μｌに１μ 、！ｉｌ溶解したＲＮＡの５μｌに、ホルムアルデヒド（ＢＤＨＣｈｅｍｉｃａ ｌｓ　）　１Ｑ　μｌ　、濾過ホルムアルデヒド（Ｍｅｒｃｌｃ　）　３．３１ １１１と１０ＸＭＯＰＳ緩衝液（０，２Ｍ　ＭＯＰＳｐＨ７，０，１［１ｍＭ　 ＥＤＴＡ　）　２μｌ？：加え友。サンプル乞７０°Ｃに１５分間加熱し、氷上 で冷却し、１ｑｂアガロースゲルに適用した（１チアガロースを水７５ｒｎＡ中 に煮沸溶解芒セ、６５°Ｃに冷却したのち１０　Ｘ　ＭＯＰＳ緩衝液１０ｍ１お よびホルムアルデヒド１６．５ｍｔを加えｆｃ）。

を気泳動はＩ　Ｘ　ＭＯＰＳ緩（資）液中、３０３０−４Ｏ？３〜５時間実施し た。ＲＮＡはエチジウムゾロミド（０，１Ｍ酢酸アンモニア中１μ＆／ｌ１ｌ） で６０分間染色して可視化し、蒸留水中で６０〜６０分間脱色し、長波長紫外光 に暴露した。

次に、ＲＮＡを、Ｑｅｎｅ　３ｃｒｅｅｎ　ｐｌｕｓ　（ｐｕＰｏｎｔ　ＮＥＮ 　）に、製造者の指示書に従い１０　Ｘ　ＳＳＣ（１，５Ｍ　Ｎａｃｌ、０．１ ５Ｍクエン酸ナトリウム）とともに毛細管プロットによって移した。移動は２０ 時間続けた。２　Ｘ　ＳＳＣで洗浄したのち、膜乞真仝下８０°Ｃで２時間焼い た。

ハイブリダイゼーションに先立って、膜ｔｉ　５　Ｘ　ｓｓｃ。

２×デンハルト（１０Ｘデンハルト：０．１係ＦｉｃＯ１’ｌ、０．１％＆リビ ニルビロリドン、（３，１％ウシ血清アルブミン）、１％ＳＤＳオよひ１００４ 　／ｍｔ剪断（超晋波処理）および変性（２分間煮沸）ウシ胸腺ＤＮＡの混合物 中、６５°Ｃで４〜５時間時間グイハイブリダイズ。

ハイブリダイゼーションは、３２Ｐ標識オリゴヌクレオチドグローブ乞補充した 同一緩衝液中、たえず撹拌しながら３０°Ｃで実施した。

このハイブリダイゼーション後に、膜を、５ｘｓｓｃ（室温で１５分間、６回） で、ついで０．１係ＳＤＳ含有５　Ｘ　ＳＳＣで、３０℃で３０分間洗浄した。

もつと高い温度でおよび／ま友は低い塩濃度でのちらに緊縮条件での洗浄を指示 に従って実施した。

結果は、プローブＭＰ３３が約１．６［：ｌ［）ヌクレオチドのｍ　ＲＮＡと特 異的にハイブリダイズした。この太き芒のｍＲＮＡは４５１ｃｔ１までの蛋白質 をコードできることｔ示している（第４図）。

これらの実験、ｉｎ　ＶｉｔｒＯ翻訳およびノずン法ハイブリダイゼーションか ら、本発明者らは自分達の仮説が正しく、α−ガラクトシダーゼは発芽時にグア 一種子の内乳の粕粉細胞中で合成されると結論した。

１．６．グア一種子の粕粉細胞のｍＲＮＡからのＣＤＮＡライブラリーの構築 ＣＤＮＡ合成の方法は、ａｕｂｘｅｒ　＆　ＨＯｆｆｍａｎ　（１９８３）によ って報告嘔れた方法に基づくもの２用いた。１０μｌの水に溶解したボ＋）　− ＡＲＮＡ、　３μｇを１０μｌの水中２．５μ夕のオリゴ−ｄＴ　１２−　ｉ　 ８（（ｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅＨｅｓｅａｒｃｈ　）と、１００°Ｃに６０分 間加熱し、ついで６０分間氷水で冷却してアニーリングした。相補的鎖？、３０ μｌのＭｉｘ　Ｉ　［使用直前に２５μｌの祈念に調設した２ＸＲＴ緩衝液（０ ，１Ｍ　Ｔｒｉ８−　ＨＣＩ　４３°ＣでｐＨ８，３、１０ｍＭＭｇＣｌ、２、 １　５０　ｍｕ　Ｋｃｘ、２０　ｍＭＤＴＴ、１　ｍＡｄＡ、ＴＰ、１　ｍＭｄ （）ＴＰ、１　ｍＭｄｃＴＰ、０．２ｍＭ　ＴＴＰ　）、４０−５０単位逆転写 酵素（ＡｎｇｌｉａｎＢｉＯ℃ｅｃｈｎｏ１０ｇ７　）および蒸留水で６０μｌ に調製〕　を添加後、４３°Ｃで４５分間インキュベーションして合成重れた。

反応は氷水中に２分間置いて停止した。

ついで直ちに、第−鎖１５０μｌ　Ｍｉｘ　ｌ　Ｃ使用直前に０°Ｃで、４　［ １ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩ　ｐＨ７，５，１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．７５　ｍＭ 　ＫＣＩ、２５μｌ７ｍ１ウシ血清アルブミン（ＤｎａｓｅおよびａＮａｓｅ　 ？含まない、１３ｅｔｈｅｓａａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 　）、２μｌｌα−３２Ｐ　−ＴＴＰ（３Ｄ　［３０Ｃ１／　ｍｍｏｌ、Ａ、ｍ ｅｒｓｈａｍ　）、４０単位ＤＮＡ？リメラーゼエおよび８単位ｌＮａ５ｅ　（ 両者ともＡｎｇｌｉａｎ　１３１０ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　）を含有する混合物 に加えることにより第二鎖乞合成した。反応灯１１℃で６０分間行った。リゾ− ジョンはついで、直接２μｌの２ＤｍＭ　ＡＴＰおよび４００単位のＴ　４−　 ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ　）　１．（加え、１８°Ｃで２時間インキュ ベーションすることにより行われた。反応は２０μｌの０．４Ｍ　ＥＤＴＡおよ び１μｌの２０％ＳＤＳ乞加て停止名セた。

得られ７’ｚ　ａ８−　ＣＤＮＡ乞、Ｉ　Ｑ　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−Ｈ（Ｊ　ｐＨ ７，５，０，３Ｍ　Ｎａｃｌおよび１ｍＭ　ＥＤＴＡで平衡化した６ｅｐｈａａ ｅｘＧ−５０（１０彪カラム）でデル濾過して精製した。

１５０μｌのフラクション２集め、放射能はシンナレーション液体を加えないで 直接各フラクションについて測定しくいわゆる（：ｅｒｅｎｋＯＶカウンティン グ）　、ＤＮＡ含有フラクションを集めた。ａｓ　−ＣＤＮＡ　７．＜アルコー ルで沈殿’ａ−ｔｒ、１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌｐＨ７，５、Ｑ、３　Ｍ 　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１　％　ＳＤＳの混合物に溶解し、同じ緩 衝液で平衡化し−２３８ｐｈａａｅＸ　ＣＬ　−４Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　 ）カラム（パスツールピペット中２１）上サイズにより分画した。約１００μｌ のフラクションを集め、アガロースデル上電気泳動によりついでオートラジオグ ラフィーによりＣＤＮＡの長石ヲ解析した。５００　ｂｐ以上の太き芒のｄｅ− ＣＤＮＡ　’！’もつフラクションを集め、アルコールで沈殿δセた。ｄｓ　− ＣＤＮＡは水１０μＡＫ浴解嘔ゼた。

ホモポリマーｄＣ−ティリングは、１０μｌのｄｓ　−ＣＤＮＡに、４μ１５× ＴｄＴ緩衝液（ＩＭカコジル酸ナトリウムＰＩ″Ｉ７．０．１　Ｄ　ｍＭ　ＣＯ Ｃｌ□、０．５２ＩＩＭ　ｄＣＴＰ　）、３．４　ｐｌ！水、Ｄ−６Ａｉｌ　５ 　ｍＭ　ＤＴＴ　ｇ加、ｔてることに！、り実施ちれた。サンプルを３７°Ｃで ２分間、２μｌターミナルトランスフエラーゼ（２０単位／μｌ：Ｂｅｔｈｅｅ ａａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）　ｆ補光してインキュ ベーション２行い、６７℃で８分間インキュベーションした。反応は１μｌの０ ．５　Ｍ　ＥＤＴＡ、　ｉ−よび２０μでフェノールを加えて停止ちセた。混合 後、クロロホルム１０μｌン加え、混合し、２分間遠心分離した。

フェノール層を再抽出し、水相を集め、エーテルで２回抽出して＼フェノールを 除去し、新しいＢｐｐｅｎａＯｒｆ管（ジクロロジメチルヒドロキシシランでコ ーティング）に移し、ＤＮＡｆｊｒ：エタノールで沈殿させた。

ｄｃ−ティ＃　ｄｓ　−ｃＤＮＡを１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩ　ＰＨ７， ５，１ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．Ｉ　Ｍ　Ｎａｃｌ（アニーリング緩衝液）混合 物２０μβ中に浴膳した。ａｓ　−ｃＤＮＡ　１ｔＧ−テイルベクター（ｐｓｔ 　ｌで切断したｐＢＲ，３２２とホーｅｉリーｚ−ｄＱ−テイル、’ｐｕｐｏｎ ｔ　ＮＥＮから購入）と、約４　ｎＦのａｓ　−ｃＤＮＡに２５ｎ９ベクターの 割合で用い、最終容量２５μｌとし、６５℃に１０分間加熱し、ついで４°Ｃに 徐々に冷却してアニーリングし文。これらのアニーリングサンプルを用いてＥ、 　ｃｏｌｌ　２９４株（ｅ’ｎｄｏド、Ｂ１Ｂ１−１ｒｋ−１”　；　Ｂｅｃｋ ｍａｎほか、１９７６）Ｍａｎ　ｉ　ａ　Ｚ　ｉ　８はか（１９８２）の記載し たＨａｎａｈａｎ法で形質転換した。これにより３Ｘ１０’クローンのクローン バンクが得られた。

１．４．グアーα−ガラクトシダーゼ遺伝情報を含有するクローンの選択 形質転換Ｅ、　Ｃｏ１１細胞のサンプル乞、テトラサイクリン（１０μｓ／ｍＡ ）を含むアガール板上に置いた二）　０　セｋ　Ｏ−ス濾紙（ＭｉｌｌｉｐＯｒ ｅ　ＨＡＴＦ型、３．４５　μｒｎ）に直接広げ、−夜６７℃でインキュベーシ ョンしたのち、１紙１枚あたり（３〜５）Ｘ１０３コロニーが存在するようにし た。

１枚のマスター濾紙から以下のように２個の同一なレプリカが得られた。マスタ ー濾紙を乾燥濾紙上に置キ、マークした。第一のニトロセルロースレフリカ濾紙 を新鮮なＬ−培地アガール板上で湿潤させ、マスター濾紙の最上部に置いた。４ 枚の濾紙をレプリカ濾紙上に置き、注意深くガラススパーチルを用いて下に押し つけた。４枚の濾紙を除去し、方向標識は正確にレプリカ上にコピーし、レプリ カ濾紙をＬ−培地アガール板上に置き、これを第２の１７プリカについてもくり 返した。レプリカ濾紙を６７℃で、コロニーが肉！で見えてくるまで３〜５時間 生育ちセ、クロラムフェニコール（１５０μ、９／ｍＺ）を含有するＬ−培地ア ガール板に移し、３７°Ｃで一夜インキユベートした。マスター濾紙をテトラサ イクリンを含むアガール根上に置き、４℃に保存した。

レプリカ濾紙上の細菌は１５分間、Ｑ、５　Ｍ　ＮａＯＨと１．５　Ｍ　Ｎａｃ ｌで飽和した’ｗｈａｔｍａｎｎ　３　四濾紙多数の上に置き溶菌した。乾燥濾 紙の上に置いて過剰の液体を濾紙から除去したのち、ついでｊ紙’（Ｉ　Ｍ　Ｔ ｒｉｓ　−ＨＣｌｐＨ７，０および１．５　Ｍ　ＮａＣ１で飽和した濾紙上に２ 〜６分間直いて中和２行った。最後に濾紙ｙ　Ｂ　ｘ　ｓｓｃ中に１５〜２０秒 間浸漬し、風乾し、真空中８０’Ｃで２時間焼いた。

（プレ）ハイブリダイゼーションの前に、濾紙を、３　Ｘ　ｓｓｃ　Ｏ，１％Ｓ ＤＳ中、数回緩衝液を交換して、６５°Ｃで１６〜２４時間、完全に洗浄した。

洗浄が完了すると、コロニー−プリンとは肉眼では見えなくなった。

ブ１／ハイブリダイゼーションは、プレミックスＡ［５ｘ　ｓｓｃ、５×デンハ ルト、０．１　％　ＳＤＳ、５０　ｍＭリン酸ナナトリウムＰＨ７５，１％グリ シン、２５　μ９　／　ｍｔウシ胸腺ＤＮＡ、７５μｇ／ｍｌ　Ｅ、　ｃｏｌｌ 　ＤＮＡ　（Ｓｉｇｍａ　ｍ型、両ＤＮＡプレバレージョンは剪断し、変性芒セ た）、５００　ｆｉｊｉ　／ｍｌ　ｔＲＮＡ、　５０　％脱イオンホルムアミド 〕中、３７８Ｃで２時間実施した。ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼ ーションミックスＡ（５ｘｓｓｃ。

１×デンハルト、０．１チＳＤＳ、２ｉ］ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７、５，２ ５μｌｌ　／ｍＡ　ウシ胸腺ＤＮＡ、７５μ９７ｍ１Ｅ、　ｃｏｌｌＤＮＡ　、 　５００μ９／ゴｔＲＮＡ、５０係脱イオンホルムアミド）中、グローブＭＰ　 ３３について上述したとほぼ同様にγ−３２Ｐ　−Ａ、ＴＰで標識したオリゴヌ クレオチドグローブＭＰ　４４　（第３図）とともに実施した。ハイブリダイゼ ーションは一夜６０°Ｃで行ツタ。

次に、１紙を、６×ＳＳＣにより呈温で３×１５分間、２　Ｘ　５ＳＣ１０，１ ％ＳＤＳで１×１５分間、セして最後に予め加温した０、１悌ＳＤＳ含有０．Ｉ 　Ｘ　ＳＳＣ中６７°Ｃで１５分間、洗浄した。濾紙を乾燥し、−７０００で一 夜、Ｘ線フィルムに暴露した。両レプリカに対して陽性シグナルを与えたコロニ ーをマスター淳紙から採取し友。

８個の陽性コロニーから、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　＆　ＤＯ１７（１９７９）の報告 したアルカリ分解法を用いてプラスミドＤＮＡを精製し、Ｐｓｔ　ｌ　（Ａｍｅ ｒｓｈａｍ　）で消化し、１％アガロ−スケ９ル上電気泳動後解析した（　Ｍａ ｎｉａｔｉｓほか、１９８２）。すべて８個の例で、プラスミドＤＮＡ　ｈベク ターフラグメント（４，３ｋｂ　）を含有し、その７個は、同じ１２５０　ｂｐ 　ＤＮＡフラグメントと大きさ６００〜５００　ｂｐの範囲の小フラグメントの 両者を含有していた。２個の独立に単離芒れたクローン２選び、ｐＵＲ２３０２ 、約１７５０　ｂｐのクローン化挿入体を有するプラスミド、および約１５５０ ｂｐの挿入体を有するｐＵＲ２３１４が得られた。

ｌで消化すると、ベクターフラグメントのほかに１２５０　ｂｐ　＋　５００　 ｂｐおよび１２５０ｂｐ＋３００ｂｐのフラグメントがそれぞれ得られた。これ ら４種のフラグメントを１％アガロースデルから切取って別個に精製し、電気泳 動後、透析バッグに電気溶出した（　Ｍａｎｉａｔｉｓほか、１９８２）。楕類 フラグメント乞ベクｐ　Ｍ　１３　ｍｐｌ　３　（Ｂ６ｔｂ、ｅｓｄａ　ｐｅｓ ｅａｒｃｈ　ＩｎＣ，から購入、Ｎｏｒｒａｎｄｅｒほか、１９８６の記載があ る）とリゾ−ジョンさせ、ｐｓｔＩで切断し、リゾ−ジョンし７’ｃ　ｔ　７　 フルヲ用イＥ、　ｃｏｌｉ株ＪＭ　１０３　（Ｍｅｓｓｉｇほか、１９８１）’ ｋ、ＣａＣ１□で形質転換し、）Ｃ−ｇａｌおよびＩＰＴＧを補充したＬ−培地 上平板培養した（Ｍａｎｉａｔｉ８ほか、１９８２）。

得られた無色のプラークから、一本領ファージＤＮＡを単離し、Ｓａｎｇｅｒジ デオキシ鎖ターミネーション法の１３１ｇｇ１ｎほか（１９８３）（７）改良法 ニヨリ、（１−３５８−ｄＡＴＰ　（２，０００Ｃ１／　ｍｍｏｌ　）およびり Ｌ／／つ酵素（Ａｍｅｒ８ｈａｍ　）、ｄｄＮＴＰ’ｓ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ 　−ＰＬＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　）、および＋１ＮＴＰ’＋３　（Ｂｏｅｂ ｒｉｎｇｅｒ　）　ｆ用いて、ヌクレオチド配列を確立するために使用した。

配列決定反応生成物は、変性＆　ＩＪアクリルアミドデル上、Ｂｉｇｇｉｎはか （１９８３）の報告した緩衝液勾配を用いて分離した。

ヌクレオチド配列はカスケード様のアプローチを用いて決定した（第５図参照） 。サブクローン化フラグメントの境界におけるヌクレオチド配列は、最初ユニバ ーサルＭ１３配列決定プライマー　（ＡＸｎｅｒ８ｈａｍ　）　Ｙ：用いて決定 した。配列データがまだ信頼できる最も遠位では、上述のようにしてとくに合成 した２個の新規な、ひとつは６′〜５′方向におけるヌクレオチド配列の連続の ための、他のひとつは相補鎖の配列決定のためのプライマーを用いて、配列決定 を継続した。０のカスケード様アプローチにより、両クローンｐＵＲ２３０２お よびｐＵＲ２３１４のサブクローンの全ヌクレオチド配列が確立した。内部Ｐ６ ℃Ｉ部位周辺のヌクレオナト配列は、Ｃｈｅｎ、　＆　Ｓｅｅｂｕｒｇ　（１９ ３５）の報告した超コイル配列決定操作によって決定した。結果（グ両Ｐａｔｌ −フラグメントが１接結合している０とを示した。

グアーα−ガラクトシダーゼｃ　ＤＮＡクローンの全ヌクレオチド配列は第６図 に示す。プラスミドｐＵＲ２３０２中ヌクレオチド２７３に始まクボリーへ尾部 までのヌクレオチド配列（第６図参照）はプラスミドＩ）ＵＲ２３１４の挿入体 のヌクレオチド配列と同一である。

ヌクレオチド配列の解析（第６図）により、４１１個のアミノ酸残基をコードす る翻訳読み取り枠と、ヌクレオチド位置１６６の最初のメチオニンおよびヌクレ オチド１３９９〜１４０４の２個連続した翻訳停止コドンが明らかに嘔れた。０ れから帰納ちれたアミノ酸配列を、ＩＵＰＡ、Ｃの一文字記号で第６図のヌクレ オチド配列の上部に示す。

グアー糧子から精製したα−ガラクトシダーゼ酵素のＮＨ２末端アミノ酸配列は 、 ＡＥＮＧＬＧＱＴＰＰ・・・・・・ であった（前段および第６図参照）。このアミノ酸配列は、ヌクレオチド３０７ 〜６６６でコード嘔れる（第６図）。第一に、Ｏれらの所見から、成熟α−ガラ クトシダーゼ酵素は３６４個のアミノ酸残基から構成ちれ、分子量の計算値は３ ９．７７７ダルトンと結論できる。これは５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動 によって評価てれた分子量４０，５００ダルトン（Ｍｃｃｌｅａｒｙ　、Ｉ　９ ８３　）とよく一致する。

第二に、天然の酵素は４７個のアミノ酸残基で延長された（第６図の番号−４７ 〜−１）前駆体の型で合成されるものと思われる。

内部ペプチドＤＹＬＫＹＤＮ　（第６図参照）が、ＮＨ２末端ペプチドに加えて 、ヌクレオチド配列中に見出ちれた（ヌクレオチド６８０〜７０１　）ことから 、グアーからのα−ガラクトシダーゼはクローン化てれたと明瞭に結論できる。

微生物によるグアーα−ガラクトシダーゼの産生を例示するため、Ｓａｃｃｈａ ｒｏｍｙｃｅａ　ｃｅｒｅｖｉｅｉａｅ中でグアーα−ガラクトシダーゼを発現 嘔セるのに適当なベクターを、ＧＡＰＤＨプロモーター構造を用いて構築した。

ＣｉらのベクターのベースとしてＥ、　ｃｏｌｉ　−３ユｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ 　’、ｉヤトルベクター１）ＵＲＹ　５２８−０６を用いｆ４　（ＥｄｅｎＦ３ はか、１９８４、ＥＰＯ０１２９２６８号、第１４図；プラスミドｐＵＲＹ　５ ２８−０３乞含有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｅｉａｅ　Ａ 　Ｈ２２は、１９８６年５月１９日、Ｃｅｎｔｒａａｌ−ｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏ ｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｐ、Ｏ，Ｅｉｏｘ　２７　！ｚ　３７ ４　［１）ＡＧＢａａｒｎ。

’ｐｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ　Ｉｃ　ＣＢＳ第８１５５号として寄託てれて いる）。これは、３．　ｃｅｒｅｖｉｅｉａｅ中での発現のために、ＧＡＰＤＨ プロモーターの制御下にプレグロタウマチン遺伝子を含有している。策略は次の とおりである（第７図参照）。すなわち、ベクターＰＵＲＹ　５２８−０３から 、完全プレグロタウマチン遺伝子およびプレグロタウマチンＡＴＯ翻訳開始コド ンの２３塩基対上流を含むＳａＣｌ　−Ｈｌｎｄ　ｌフラグメントを欠失芒セた 。

次に、合成フラグメントを加えた。Ｉ）ＵＲＹ　２７０３の場合は（第７図参照 ）、それは上述の２６塩基対、翻訳開始コドンとしてＡＴＧ、付加的ａｌ＆ｌツ ーンおよび、ａｌａｌに始まり成熟蛋白質（第６図）のアミノ酸残基６１の近く にあるｐｖｕ　１１部位までの成熟α−ガラクトシダーゼ遺伝子のＮＨ２末端部 分を含有する。これらのアミノ酸残基をコードするＤＮＡは酵母の好ひコド７　 （Ｔｕｉｔｅはか、１９８２）で合成した。ｐＵＲＹ　２７０５の場合は（第７ 図参照）、それは上述の２３個の塩基対、５ＵＣ２（インベルターゼ）シグナル 配列（’Ｉ’ａｕｓ６１ｎｇ　＆　Ｃａｒｌｓｏｎ、　、ｉ　９３３によって報 告ちれている）、およびａ　１．ａ　１残基からｐｖｕ　ｎｉで酵母の好むコド ンでの成熟α−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する。ヌクレオチド配列とこれら の合成フラグメントの構築は第８図に示す。

合成オリゴヌクレオチドは上述のようにして（例１）ＤＮＡシンセサイザー（Ａ ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　）上で作成し、ポリアクリルアミドデル 上電気泳動によって精製した。溶出しｉ　ＤＮＡ　ｔｔ　５０　μｌｌのＴ　Ｅ 　（１０１１１ＭＴｒｉｓ　−Ｈｃｌｐｌ（７，６，１ｍＭ　ＥＤＴＡ　）中に 溶解し、ついで２６０　ｎｍにおける光学密度を測定して濃度乞決定した。遊離 ５′末端７もつ境界フラグメントは例外として、各フラグメン）　０．５μｇビ プールし、最終容量１００μｌで酵素〆リヌクレオチドキナーゼによりリン酸化 した。フェノール抽出後アルコールで沈殿嘔セ、ベレツトを溶解し、境界フラグ メント各０．５μｓを加え、ＤＴＴおよびＡＴＰを含まないリゾ−ジョン緩衝液 中でアニーリングを行った。アニーリングは７０°Ｃに１０分間加熱し、ついで 徐々に（２時間）６０°Ｃに冷却して行った。ＤＴＴおよびＡＴＰ　（最終濃度 それぞれ１０ｍＭおよび０．５１１ＩＭ　）ならびにＴ４リガーゼ酵素を加えた のち、１５°Ｃで１８時間リゾ−ジョンを実施した。次に合成フラグメントを２ チアガロ−スプル上で電気泳動し、所望の長石をもつバンドを切り取り、電気溶 出によってゲルから単離した。精製したフラグメｙ　）　ｔｔ適当ナヘクｐ　− （ｐＥｔｖＢｂ　９　：　ｐｅｎｔｅほか、１９８３）にリゾ−ジョンし、ＩＪ Ｆ”−ジョン混合物を用いて二〇〇’ｌｉ株ＪＭ１０３細胞を形質転換した。こ れらの形質転換体からプラスミドを精製し、合成フラグメントをＤＮＡ配列決定 によって解析した。

最後に、成熟α−ガラクトシダーゼ遺伝子の残りの６６３個の残基な加えた。プ ラスミドｐＵＲ２３０２か参照）。最後のリゾ−ジョン混合物を用いて、Ｅ、ｃ ｏｌｉ２９４株を形質転換した。形質転換体からプラスミド？：精製し、正しい 制限薄紫パターン乞もつプラスミドを選択したところ、プラスミドｐＵＲＹ　２ ７０３　（第９必）およびｐＵＲＹ　２７０５　（第１０図）が得られた。

ｐｔＪＲＹ　２７０３およびｐＵＲＹ　２７０５によるＳ。

Ｈｌｎ、ｎｅｎほか、１９７８参照）の酵母細胞を、Ｂｅｇｇｓ（１９７８）の 報告した操作に従い、スフェロプラスト法によって、プラスミドＰＵＲＹ　２７ ０３およびｐＵＲＹ２７０５で形質転換した。得られた１ｃ１ｕ＋形質転換酵母 コロニーをアガール板上で直接、ＢｕｃｋｈＯｌ、ｚ　＆Ａａａｍｓ　（１９８ １）の報告しているように、基質ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノ シド（ＰＮＰＧ。

３ｉｇｍａ　）を加えた溶融アガールで上張りして、α−ガラクトシダーゼ酵素 の存在なスクリーニングした。

これは、プラスミドｐＵＲＹ　２７０３　ｆｔもつ酵母細胞の周囲には検知でき るレベルのα−ガラクトシダーゼ酵素は存在しないことを示した。しかしながら 、プラスミドｐＵＲＹ　２７０５’ｔもつ細胞の周囲の黄色の１色は、このプラ スミドの場合、細胞の外部に生物学的に活性な酵素が存在することを示した。

無傷細胞の解決に続いて、粗細胞抽出液についても解析した。プラスミドｐＵＲ ２７［：ｌ　３およびｐＵＲ，２７０５をもつ酵母細胞を、ヒスチジン（２０μ ｇｉｍｔ＞を補充した３母最小培地（アミノ酸を含まない０．６７　％酵母窒素 ベース、ＤｉｆｃＯ；　２％グルコ−ス）上で６ｏ。

ｎ、ｍにおける光学密度が１．０になるまで生育てセた。

酵母細胞を収穫し、抽出緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉ８−　ＨＣＩｐ）（８，０、 口、’Ｉ　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　１　ｍ１ｖｉ　ＤＴＴ　）中に１ｍｌあたり細 胞１０１°個の濃度に再懸濁し、凍結−解凍７３回反復するか、またはフレンチ プレッシャーセルを通して破壊した。

粗細胞抽出液を抽出緩衝液で適轟に希釈し、ｏ、ｉＭ酢酸ナトリウムＰＨ４，５ 中ｉ　ｏ　ｍＭｌ）ＮＰＣ）と、３７℃で５分間インキュベーションした。２チ 炭酸ナトリウム１ｍｌを加えて反応を停止嘔セた。祷られた混合物をＥｐｐｅｎ ｄｏｒｆ遠沈管中で５分ド」遠心分離して細胞および細胞層を除いたのち４　ｉ 　Ｑ　ｎｍでの吸光度を測定した。

ｐ−ニトロフェノールの４１００ｍにおける吸光係数はｉ３．４ｃｍ２／μｍｏ ｌｅである。α−ガラクトシダーゼ１単位は、３７°ＣＸｐ）１．４．５におい て１分間に基質１μｍ０１０を加水分解する酵素の量と定義てれる。

結果は、プラスミドｐＵＲＹ　２７０３をもつ酵母細胞１０８個中には約（１〜 ２．５　）　Ｘ　１０−”単位が存在し、プラスミド１）ＵＲＹ　２７０５をも つ酵母細胞１０８個中には約（６〜５）×１０−３単位が存在することを示した 。

免疫学的定量には、いわゆるウェスターン法解析を用いた。サンプル緩衝液（Ｂ ；ａｅｎｓほか、１９８２）を粗細胞抽出液に添加後、５分間煮沸した。

精製蛋白質は２分間のみ加熱したのち、ゲルサンプル緩衝液に適用した。蛋白質 は１０チビリアクリルアミドデル上、ＷｙｃｋＯｆｆはか（１９７７）に従い、 電気泳動によって分離した。

次に蛋白質をデルからニトロセルロース上に、電気泳動移動により移した（　Ｂ ｕｒｎｅｔｔｅ、１９７９参照）。

ニトロセルロースをインキュベーション（１）ｔｕｆｆ（１５０ｍＭＮａｃｌ、 ５　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　、　５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩｐ！−１７，０、 ０，［］　５　％　）　リ　ト　ｙＸ−１００、Ｏ−２５％　ゼ　５テン）で洗 浄し、ｌ−緩衝液中、０．１　％　ＢＳＡおよびグアーからａｈしたα−ガラク トシダーゼでウサギを免疫処置して産生チセた抗血清とインキュベーションした 。

インキュベーションは室温で４時間、撹拌下に行った。Ｉ緩衝液で２回、リン酸 緩衝食塩溶液…７．０ＣＰＢＳ　）で洗浄して、吸着ちれなかった抗体を除去し た。抗原に貼合した抗体は１２５ニブロチインＡ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　）ど１時 間反応芒セて恢出した。ｌ−緩衝液で２回、ＰＢＳで６回洗浄したのち、ニトロ セルロース乞乾燥し、−７０°Ｃでχ線フィルムに暴露した。

結果は、プラスミドｐＵＲＹ　２７０５　ンもっ細胞（し　〜−７３）が、グア ーα−ガラクトシダーゼ吾異的抗体と陽性反応を示し、植物酵素（レーン１およ び２）と同じ分子量をもつα−ガラクトシダーゼ酵素を産生することを示した。

プラスミド：９ＵＲＹ　２７０３乞もっ醪母細胞（レーン４）は陽性免疫反応を 示すα−ガラクトシダーゼ酵酵素量産生るが、分子量はわずかながら低い。プラ スミドをもたない酵母細胞（レーン５）はグアーα−ガラクトシダーゼと免疫学 的に関連ある酵素を産生じない。

プラスミドｐＵＲＹ　２７０３およびｐＵＲＹ　２７０５はいずれも、グアーか ら精製したα−ガラクトシダーゼに対して産生ちれた抗体と陽性反応を示す酵素 的に活性な生成物を産生すると結論できる。第一の場合、酵素は、植物酵素より も分子量がわずかに低く、細胞の細胞質よ中に存在する。第二の場合は、酵素は 植物酵素と同じ分子量馨有し、酵素は細胞の外側に存在する（後者の場合は、グ リコジル化と分泌を行うことができる小胞体に蛋白質が標的をもつ結果と考えら れる）。

ラクトシダーゼ酵素によるガラクトマンナンのガラクトース含量低下 プラスミド１）ＵＲＹ　２７０５　Ｙ係留するＳ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＡ、 　Ｈ２２株は、醪母最小珊地（葭、例２参照）上で生育石セると細胞１０８個あ たり（６〜５　）　Ｘ　１０”−３単位のα−ガラクトシダーゼ酵素を産生ずる 。この産生レベルは、後対数期までＹＭＭ上で生育芒セた酵母細胞を豊かなＹＰ Ｄ培地（２％グルコース；２チパクトペプトン、Ｄｉｆｃｏ　；　１％酵母エキ ス、Ｄｉｒｃｏ　）に移し、約４時間生育させると０．１単位／１０８個細胞ま で上昇さセるＯとができた。

他の実験では、酵母細胞を２００ｍＡｙｗ中、６００ｎｍの光学密度が１．５に なるまで生育ちセ、１１のＹＰＤ培地に移し、芒らに３０℃で４時間生育さ＋ｔ た。

細胞を収穫し、抽出緩衝液４　ｍｌに再懸濁し、フレンチプレッシャーセル（５ 回）ｆｊ！：通過芒セた。得られた懸濁液を超遠心（３ｏｒｖａｘｘ　ｓｗ　６ ０．３０，０００　ｒｐｍ。

１時間、４℃）によって澄明化した。酵素活性の９０チ以上が澄明な上清に存在 した。最後に澄明な上清を４０　ｔｔｌＪのＲＮａｓｅ　（１０ｍｇ　／！ｎｔ 、　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　）およびｉｏｏμｌのＤＮａｓｅ　（２単位／　Ａ ｌ　、　Ａｍｅｒｓｈａｍ　）と３７℃で１５分間インキュベーションし、粗酵 母細胞抽出液を得た。これは約１０単位／　ｍｔのα−ガラクトシダーゼ乞金含 有た。この抽出液をグアーガムのガラクトース含ｉを低下嘔セる実験に用いた。

ＭｃＣ１ｅａｒ７ほか、１９８４；ＥＰ−Ａ−０１２１９６０号の記載とはは同 様に操作した。

使用した酵素はニ ー粗酵母抽出液（例として上述） −３ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓα−ガラクトシ ダーゼ（比較用） である。後者は次のようにして精製した。

Ｓ、　ｃａｒｘｅｂｅｒｇｅｎｓ１日（ＡＴＣＣ９０８０）乞、グルコースをガ ラクトース（，２０＆／ｌ）で置換し几改良ＹＭＩＡ中、２６℃で培養した。静 止期に細胞を遠心分離で収穫し、上清を濃縮し、酢酸塩緩衝液（０，１Ｍ、ｐＨ ４，５）に対して透析した。最初Ｂ　Ａｍ１ｃｏｎ　ＤＣ−２ｉ１縮器で、次は ＰＥＧ　（ｅｘ　Ｓｉｇｍａ　）に対して行った。このプレバレージョンを芒ら に精製することなくそのまま使用した。

グアー粉（ＨｅｒｃｕｌｅｇからのグアーガムＴＨＩ　；　１　ｇ　）および酵 素（０，Ｉ　Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４，５，１，５ｍＪ中１中年０単を、混合物 を微細なパン屑に似た混合物が得られるまで混合した。これを密閉容器にと９． ５５９Ｃでインキュベーションした。サンプル（，１００ｍ９）”ｋ指定時間に 採取し、反応はｉｏｏ’ｃに加熱して停止し、ポリサッカライドのガラクトース 含ｉを測定した。

ガラクトマンナン中ガラクトースチ 酵　素　源　０　１．５　３．５　６ 時間　時間　時間　時間 酵　母　（例）　３８　３５　３４　３２これらの結果は、３ａｃｃｈａｒｏｍ ｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｅｉａｅによって産生芒れた異種グアーα−ガラクトシ ダーゼがガラクトマンナンのガラクトース含量を低下嘔セることが可能であり、 一方、３ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｅｉｓによって産 生嘔れた同種酵母α−ガラクトシダーゼが好条件にもガラクトース含量を低下し 得ないことを明瞭に示している。

上述の実験（例２および３）は、β−マンナナーゼを含まず、ガラクトマンナン のガラクトース含量を低下させることができるα−ガラクトシダーゼ酵素が、た とえば例乙に使用した酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｅｉａｅ のような形質転換微生物によって製造可能なことを示各種α−ガラクトシダーゼ 酵素の免疫学的関係とが４．１．α−ガラクトシダーゼ酵素源 酵素活性は、至適温度およびＰｌ（（ｆ（おいて、４５μｌの反応容量で、１［ ］ＩＩＩＭのｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｐＮＰ（）　 ）を作用名セ、ｐＮＰ（）の加水分解によって定量した。反応は２％炭酸ナトリ ウムｉ　ｍＡを加えて停止δセた。得られた混合物の吸光度を、必要に応じてＥ ｐｐｅｎｄＯｒｆ遠沈管中５分間遠心分離して細胞および細胞層を除去したのち 、４ｉｏｎｍで測定した。ｐ−ニトロンエノールの４１０ｎｍＫおける吸光係数 は１８．４の２７μｍｏｌｅである。α〜ガラクトシダーゼ１単位は、６７℃、 ｐＨ４−５において１分間に基質１μｍｏｌｅを加水分解する酵素の量と定義さ れる。

Ｅ、　ｅｏｌｉ　α−ガラクトシダーゼはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒがら（ｃａｔＮ ０６６２０３８．１ｏｔＮ０１５０３４０１　）凍結乾燥粉末として（１８■中 ５０Ｕ）得られた。Ａ。

ｎｉｇｅｒ　α−ガラクトシダーゼｆｌ　Ｓｉｇｍａがら（ｃａｔ　Ｎ０Ｇ９０ ０７．１ｏｔＮ’　１０５Ｃ／８６４［］）３３．５Ｍ硫酸アンモニウム５０ｍ Ｍ酢酸ナトリウム…５．５中懸濁液（２，７ｍｂ中４８Ｕ）として得られた。緑 コーヒー品α−ガラクトシダーゼはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒがら（ｃａｔ　Ｎ０１ ０５　０２３．１ｏｚＮ０１０１１８７２２−２０）、６．２Ｍ硫酸アンモニウ ム−約６中懸濁液（１，ｏｍｔ中ミノ酸を含まない酵母窒素ベース、Ｄｉｆｃｏ 　（６，７ｊｉ／１　）オ！ヒカラクト−ス（２Ｄ　９／　ｌ　）中２６°ｃで 培養した。静止期に細胞を遠心分離で収穫した。上清乞Ｊ［Ｌ、酢酸緩衝Ｗ　（ ０，１Ｍ、　ｐＨ４，５）　Ｋ透析ｔ、＊。

最初は釦１ＱＯｎ　ＤＣ−２＠縮器を用い、ついでポリエチレングリコール（ｅ ｘ　ｓｉｇｍａ　）に対して行った。このプレバレージョンは培養上清１１あた り約２０Ｕを含有していた。

グアーα−ガラクトシダーゼＢ　ｙｃ（１ｅａｒｙ　（１９８３）によって記載 てれたようにして調製した。ルツェルンおよびコロハ酵素は、２．５日間（コロ ハの種子は約１００係が、ルツェルンの種子は約５０％が発芽した）の発芽に関 係してほぼ同じ経路で製造芒れた。丁なゎち、酢酸緩衝液中でホモケ９ナイズし 、遠心分離し、ナイロンメツシュを通して濾過し、５０　％　ｖ／ｖ硫酸アンモ ニウムで沈殿嘔せた。沈殿を約２０ｍ１の０．１Ｍ酢酸塩緩衝液（ｐｉ（４，５ ）に溶解し、さらに精製することなくそのまま使用した。このプロトロールによ れば種子２０　Ｑ　ｊｉカラ：１７　ｏハ酵素ＦＸ、　Ｉ　Ｄ　５　Ｄ　Ｕ、ル ツエルン酵素は６５Ｕ生成した。

イナゴマメの種子にＳθｉ１θｒ（１９７７）の方法を用いて発芽嘔セた。種子 に粗いサンドペーパーで傷をつけて堅い福皮の一部を除去し、７０チエタノール ／水中で５分間殺菌し、脱イオン水に４８時間浸漬し、湿った濾紙上、２６°Ｃ に９日装置いて発芽芒セた。発芽した種子を上述のようにして抽出すると、９個 のイナゴマメの種子から７Ｕのα−ガラクトシダーゼが生成した。

４．２．遺伝子操作微生物：　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａ ｅ　、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｍａｒｘｉａｎｕｓ　ｖａｒ、１ａｃｔｉ ｅ、１ａｎ６８ｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａおよびＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｕ ｂｔｉｌｉｓから製造ちれた酵素 グアーα−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子情報を各種ベクター（例２．５ ．６．８および９参照）に挿入し、各種微生物の細胞外または細胞内に発現δセ た。

Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび’ｉ３．５ｕｂｔｉｌｉｌｌｌについては精 製酵素プレバレージョンを使用した。ベクターをもつ細胞は、生育メジウム中に 酵素の分泌を生じるものを用いた。

発酵培地からマイクロ濾過（０，２２μｒｒＬ）で細胞を除去したのち、低分子 量物質を０．０３　Ｍ　Ｔｒｉｅ　−ＨＣｌｐＨ８，０で平衡化しｆｃＰＤ−１ ０カラム（ｐｌ’ｌａｒｍａｃｉａ　）馨用い脱塩によジ除去した。α−ガラク トシダーゼは、Ｃのフラクションから、ＭＯＮ〇−Ｑカラム（ＨＲ５１５、Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ　）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーによって単離した 。溶出Ｉ’ｍ　Ｏｏｏ　３　Ｍ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩ　ｐ）１８．０中Ｎａ（Ｊ 勾配（Ｏ〜１１ｖｉ　）によって行った。検出はｐｈａｒｍａｃｉａ　ＦＰＬＣ システムケ用い２１４／２８０ｎｍで実施した。

α−ガラクトシダーゼ活性乞乞食フラクション（約０．３　Ｍ　Ｎａｃｌで浴出 ）をプールし、脱塩（，４（ＦＤ−１０カラム、０．０１　Ｍ酢酸ナトリウムｐ Ｈ４，５で浴出）。

０の酵素プレバレージョンを真仝乾燥により芒らに約１０倍に濃縮した。

Ｋ、　ｍａｒｘｉａｎｕｅ　ｖａｒ、　１ａｃｔｉｓおよびＨ，ｐｏｌｙｍｏｒ ｐｈａについては、粗細胞抽出液を用いた。細胞を適当な条件下にアガール板上 で生育嘔セ、収穫し、抽出緩衝液＜、　１０　ｍＭＴｒｌｓ　ｐＨ３，０，０， １ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　１ｍＭ　ＤＴＴ　）に＠濁し、凍結−解凍を６回反復し て破壊した。

酢酸バルビタール緩圓’ＷＬ　（Ｎａ−バルビタール８．９３９、酢酸ナトリウ ム・５　Ｈ２Ｏ５，８７９；　ＨＣＩで−８，２）中１係アガロースＡ　（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ　）および６％ポリエチレングリコール６０００の溶液乞マイク ロウェーブオーブン中で加熱して調製した。この溶液を６０°Ｃに冷却し、１４ ｍ１ｔ（ガラススライド（８，３Ｘ９．４ｃｍ）上に注いだ。型（ＬＫＢ　）を 用い、ゲルに径４串の孔をあけた。抗血清１０μｌおよび精製酵素溶液（リン酸 緩衝食塩溶液…７．０中約１［ＩＵ／ｍＡの濃度）を適用したのち、湿ったティ シュペーパーを入れた密閉した相中、室温で一夜拡散妊セた。免疫沈殿体を直接 測定するか、またはケ９ルを数回０．９チＮａＣ１で洗浄したのち水−酢酸−エ タノール（４，５：　１　：　４．５　）中０．５　％クーマツジーブリリアン トゾルーＲ−２５０（１３１０ｒａｄ　）の溶液で染色した。ケゞルは水−酢酸 −エタノール（９：２：５）で脱色した。

結果（第１表）は、同種グアー酵素とまたコロハおよびルツエルンからの酵素と 陽性反応乞示した。遺伝子操作３．　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによって製造したグ アー薄紫も陽性反応を示した。コーヒー豆から、まｆ４　Ａ、　ｎｉｇｅｒ、Ｓ 、　ｃａｒｌｓｂｅｒ　ｅｎｅｉｓおよびＥ、Ｃ０１１からの酵素では反応は認 められなかった。

この方法の利点は、感受性（０，０１Ｕ　／ｍＡの酵素溶液で分析できる）およ び粗ブレバレージョンに使用できる可能性である。

粗抽出液にサンプル緩衝液（Ｅｄｅｎｓほか、１９８２）乞添加後、５分間煮沸 した。わずか２分間加熱したのち、ケ゛ルサンプル緩衝液中に精製蛋白質を適用 した。

蛋白質をＷｙｃｋｏｆｆはか（１９７７）に従って１０％ポリアクリルアミドゲ ル上電気泳動によって分離した。

蛋白質を次にケ９ルからニトロセルロース上に電気泳動移動により移した（　Ｂ ｕｒｎｅｔｔｅ　、　１９７９参照）。

ニトロセルロースをインキュベーション（１）　緩衝液（１５０ｍＭＮａｃｘ、 ５　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　５　Ｑ　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌｐＨ７，０，０， ０５％　）　リ　ト　７Ｘ−１００、０，２５％　ゼ　ラチゾ）で洗浄し、ｌ− 緩衛液中、Ｑ、１　％　ＢＳＡおよびグアーから精製したα−ガラクトシダーゼ でウサギを免疫処置して産生さセた抗血清とインキュベーションした。インキュ ベーションは室温で４時間、撹拌下に行った。

ｌ−緩衝液で２回、リン酸緩衝食塩溶液ＰＩ（７，０（ＢＰＳ　）で洗浄して、 吸着てれなかった抗体を除去し文。抗原に結合した抗体は１２５１−プロテイン Ａ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　）と１時間反え、芒セで検出した。ｌ−緩衝液で２回、 ＰＢＳで６回洗浄したのち、ニトロセルロースを乾燥し、−７０°ＣでＸ線フィ ルムに暴露した。

Ｃの方法（１１２種の異なる原料のα−ガラクトシダーゼグレバレーションに適 用した（第１衣参照）。結果は、植物性からのすべてのα−ガラクトシダーゼ酵 素で陽性反応ン示した。

ＩＬグアーα−ガラクトシダーゼをコードする遺伝情報で遺伝子操作した微生物 からのすべての酵素も陽性反応を与えた。一方、Ａ、　ｎｉｇｅｒ　、Ｓ。

ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓおよびＥ、　ｃｏｌｉからの微生物酵素は、グア ーα−ガラクトシダーゼに対して産生じた抗血清と反応しなかった。

これらの結果は、コーヒー豆からの酵素の例外を除きアウチテロニー法の結果を 確認するものでめった。

密接な関連がある植物種からの酵素であるグアーα−ガラクトシダーゼと何らか の関係がおるものと結論で酵素プレバレージョン（１５〜６０Ｕ）を１０３ｍＭ 酢酸ナトリウムｐＨ４，５（１，５ｍｔ）中に溶解した。これ乞グアーガム１ｇ に加えた。混合物が微細なパン屑の感触になるまで少なくとも１分間激しく混合 し、５５°Ｃでインキュベートした。

この酵素のガラクトマンナンに対する活性を解析するため、サンプルを採取し、 以下のようにして解析した。

約１５０〜のパン屑様混合物のサンプルを採取し、秤量した。酵素乞１０分間沸 騰水浴上に置いて不活性化し友。

次に１０％水叛化ナトＩＪウム５　ｍｌを加え、小さなホモブナイブ−を用いて サンプルを分散させた。溶液を２５ｍｊとし、６０分間振盪し、再びホモゲナイ ズし、１５分間放置した。この処置後、ポリサンカライドを完全に溶解δゼると 、遊離ガラクトース（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒの酵素試験キット乞使用）および総 炭水化物乞定量した。総炭水化物の定量にはアンスロン法（ＭＯｒｒｉｓ、１９ ４８）Ｙ用いた。その改良法（Ｌｏｅｗｕｓ、１９５２）は次のとおりである。

アンスロンの酢酸エチル飽和溶液を調製し、少なくとも１時間静置した。試験溶 液２５μｌをピペットで試験管に取り、蒸留脱イオン水で１　ｍｌとした（水は ブランクに、８０μｇのガラクトースを様準に使用した）。

アンスロン飽和酢酸エチル０．２ｍＡを加え、ついで濃硫酸２．５ｍＡを加えた 。激しく混合し、放冷した。吸光度は約３０分後に６　ｉ　Ｄ　ｎｍで読んだ。

結果は本明細誉末尾の第１衣にまとめる。衣から明らかなように、植物酵素はす べて、ガラクトマンナン中のガラクトース含量乞有意に（存在するガラクトース の２５チ以上が１８時間後に放出され７′ｃ）低下嘔セることができた。グアー α−ガラクトシド遺伝情報で遺伝子操作石れた微生物が産生じた酵素も同じ能力 ２示した。

これらの結果は、グアーからのα−ガラクトシダーゼ酵素についで、他のα−ガ ラクトシダーゼ酵素もガラクトマンナンの修飾に適していることｔ示している。

免疫学的関係はある示唆を与えるが、グアー酵素と無関係な酵素がガラクトマン ナンを修飾できる可能性は、なお排除できない。

例　５ ４築計画は第１２図に概略を示した。

このベクターＯベースはに１ｕ７１；１６ｒｏｍ７ｃｅ日複衷オリジンＫＡＲ８ ２とその選択マーカーｔｒｐ　１である。シラスミドｐ＋７ＲＪＣ５２８−０３ （Ｅｄｅｎｓほか、１．９８３　）　’！ｒスプル上′シ気原動、ついで透析バ ッグへの電気浴出により（Ｍａｎｉａｔｉｓほか、１９８２）単離した。

この揖裂フラグメ／ト全、３ｇ１■で線状にしたプラスミドｐＵＲＹ　２７０５ 　（第１０図）とリゾ−ジョンした。リグ−ジョンしたサンプル？用いて、Ｅ、 　ｃｏｄユ休Ｊ体　１０３　（Ｍｅｓｓｉｎｇほか、１９８１　）とＣａＣ６ｚ 法で形質転換し、アンピシリン１００／４／ＩＬｌ’を補給したＬ−培地上で平 板培養した（　Ｍａｎｉａｔｉｓほか、１９８２）。

得ら几た＝＋ｏニーから、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　ｋ　Ｄｏｌｙ　Ｃ１９７９）の報 告したアルカリ分解法を用いて、プラスミドＤＮＡスミドを選訳し、プラスミド ｐＵＲ２４０５が帰らｎた（第１２図）。

Ｋ、ｍａｒｘｉａｎｕｓ　ｖａｒ、１ａｃｔｉｓ　ｆａ胞：つ　ｐＵＲ２４Ｄ　 ５　による形質転換 ｔｒｐ　−ｉ休（Ｅｄｅｎｓは；０３，１９８３）の酵母細胞全１工ｔｏほか（ １９８３）の記載ＶＣ匠いＬｉＯ２法を用いて、プラスミド１）ＵＲ２４０５で 形質転俣した。得らｎたｔｒｐ＋形質転換体について、グアー〇−ガラクトシダ ーセ゛酵素の存在と解析した。

ＹＭｉＪ上で生育させたのち、？Ｉｍ胞と収復し、抽出緩衝’ｆ４　（ｉ　Ｏ＆ Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｔｐＨ３，Ｑ、０．１　ｍ１Ｍ　ＦＤＴＡ、１　ｍＭＤＴＴ 　）に再懸濁し、凍結−解凍を６回反復して破壊した。こｎらの粗細胞抽出液中 の活性α−がラクトシダーゼ酵素は人工基質ｐＮＰＧで、または免疫学的定量法 （ウェスターン法）で足建した〇 粗細飽抽出液金抽出稜衝孜で過当に希釈し、０．１Ｍ酢酸ナトリウムｒ８４．５ 甲ｉ　Ｑ　ｍＡ　ｐＮＰＧと、６７−Ｃで５分間インキュベーションした。２％ 炭酸ナトリウム１ｄを加えて反応を浄土させた。得られた混合物をＥｐｐｅｎｄ Ｏｒｆ遠心分離器１（より５分間遣口・分離して、細胞およびｇ１胞屑を除去し たのち、４１０ｎｍで奴光度ｔ　ｆｉｌｌ　ｉした。ｐ−ニトロフェノール０４ １０ｎ工における吸光係数は１８．４ｃ１ｒＬ２／μｍｏｂθである。α−がラ クトシダービ１単位は、６７℃、Ｐａ−１４，５において１分間（・二基質１μ ｍｏ１６１と・几水分屏する酵素ｌ〕列と定量ざｎる。

シラスミドｐＵＲ２４Ｄ　５をもつ細胞の細胞う伯出孜は、この定量で、このシ ラスミドをもたない酵母細胞つ対照プレバレージョンとは異なり、陽性シグナル を与えたＯ 免疫学的足置ｖＣは、いわゆるウェスターン解析法を用いた。？７プ”　ｆｉ　 Ｚ　ｉ　（Ｊｉｌｄｅ　ｎｓほか、１９８２）ｋ粗細胞抽出液に添７ｘＪ後、５ 分間煮梯した。

精製蛋白賃金わずか２分間２１１０熱したのちデルサンプル緩衝液に通用した。

蛋白質を、Ｗｙｃｋｏｆｆほか（１９７７）の方法によって１０％ポリアクリル アミドゲル上成気泳動によって分離した。

ついで蛋白質ｒデルからニトロセルロース上に、電気泳＠移動によシ移した（　 Ｂｕｒｎｅｔｔｅ　、１９７９参ｆｉ）。

ニトロセルロース金インキュベーション（１）　緩ｉｌｌ　液（１５０工ＭＮａ Ｃ１、５４１１１Ｍ　ＥＤＴＡ　、５０１ｎＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣ２ｐＨ７，０ ，Ｏ，０５％　ト　リ　ト　／Ｘ−Ｉ　Ｄｏ、０．２５％ゼラチン）Ｔ：洗浄し 、■−緩側腹中、０．１％ＢＳＡ　２よびグアーから精製したα−がラクトシダ ーゼでウサギを免役処置して産生させた抗血清とインキュベーションした。

インキュベーションは室温で４時間、攪拌下（で行った。■−緩衝液で２回、リ ン酸緩衝食塩溶液−７，０（ＢＰＳ　）で売浄して、吸Ｎさｎなかった抗体と猷 六した。抗原に結合した抗体は　１２ＪプロテインＡ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　）と １４１−８１反ｊ５させて検出した。■−緩Ｓ液で２回、ＰＢＳで３回已浄した のち、ニトロセルロースを乾燥し、−７０℃でＸＮフィルムＶＣ暴露した。

結果は、Ｋ］、ｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅＳｆ！＃Ｅ胞抽出液中に、植物酵素の蛋白 質と類似の分子量をもつ蛋白質が存在し、筐たそれはＳ、　ｃｅｒａｖｉｓｉａ ｅ中シラスミドＩ）ＵＲＹ　２７０５によって産生：８ｎた蛋白質とも類似する ことを示した〇α−がラクトシダーゼ逍云子が真核細胞中の４でなく原核＠生動 中でも発成できること金例示するため、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ中 で＃累ｋｆｌ生できるプラスミドを講築した。

構築■ベースとしてプラスミドｐＭｓ　４３　（Ｋｏｋ、　Ｊ。

ほか、１９８５；舒−Ａ−０１５７４４１号５１〜５７貞）（ｉ−用いた。プラ スミドｐＵｎＹ２７０６ＩＩＰＫ４’在ｆるグアー成熱α−がラクトシダーゼ遺 伝子全α−アミラーゼシグナル配列ＶＣ、＠合した。この融合蛋白賃金コードす る遺伝子は、５ＰＯ２プロモーターの支配下（Ｃろアミラーゼシグナル配列を含 有する大ベクターフラグメントを精製した。α−ガラクトシダーゼ遺云子（第タ ーンラグメントとリゾ−ジョンさせ念。この際、α−アミラーゼシグナル配列は 成熟α−がラクトシダーゼ遺伝子と正確に融合して、ＰＵＲ２６０１と呼ばｎる プラスミドｒ生成した。リゾ−ジョンサンプルを用いてＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ 株ＤＢ　１０４　（Ｋａｗ！１ｍｕｒａ　＆　Ｄｏｉ　。

１９８４）ｔ−、プロトプラスト法（Ｋｏｋ、　、ｒ、　ｖｉか。

１９８５．５２頁）を用い、選択Ｖ′Ｃはネオマイシンをオリ用して形質転換し た。

ネオマイシン抵仇注コロニーを採取し、分解工程は４℃の代わりに３７゛Ｃで３ ０分間行うほかｙ３．　Ｂｉｒｎｂｏｉｍ＆　Ｄｏｌｙ　（１９７９）の方法ｉ ｃ従ってＤＮＡを精表し、適当なδ」限酵素と用”ハで消化した。正しくプラス ミドｐ［７Ｒ２６０１を係角する形質転換体を、ｐＮ？Ｇ分析およびウェスター ン法の両者で、ざらにα−がラクトシダーゼの産生について解析した。

Ｅ、　５ｕｂｔｉユ１θによるグアーα−ガラクトシダーゼ産生２）解析 異種蛋白を検知でさると報告されて匹る（　Ｇｒａｎｄｉ、　Ｇ。

ほか、１９８６）。したがって、−夜培養物を１＝５０に希釈したネオマイシン （２Ｏ４ｇ／−ｄ）を含むＬ−培地上で生育させ、数回、生育メジウム千のα− がラクトシダーゼ■存在全ｐＮ？Ｇで定量した。結果（第１４図）は、生育７時 間後の生首メソラム干、細胞の外′ｌ１ＡＩＩＣ最大約０．Ｉ　Ｕ／ｌｉｔのα −ガラクトシダーゼ弾素の存在が認めらｎだ。長期培養では酵素濃又は最小３０ 倍まで低下し、これはプロテアーゼ活性によるものと思われた。

プラスミドｐＵＲ２６０１ｋもつＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ　株Ｄ　Ｂ１０４によ るグアーα−ガラクトシダーゼの産生を、適当な生育メジウムおよび夢」御メゾ ウム両＠金用いてプロテアーゼの産生を抑制しながら１０１７）ファーメンタ− 中でさらに研死した。

ｐＵＲ２６０１をもり休ＤＢ１０４の前培養体を振盪フラスコ中、ネオマイシン （２０μ！　／：ＩＬｌ　）　’に補光した培地５００！ｊｃＰで１６時間生育 させた。培地Ｏ組成は次のとおりとした（＆／ｌ）。

ＮＨ４ＣＺ　Ｔ　８　ｚ　ＫＨ２ＳＯ４＋　４　ｐシュクロース、４０；ＮａＣ １＋　２　ｔ　酵母エキス（ＤｉｆＣＯ）　（別個に滅菌）。

１０　ｐ　Ｍｇ”Ｏａ　・７Ｈ２０，１；ビタミン浴液、１；倣量金属俗夜、１ 微量台属浴ン没の組成（、ｉ／ｌ）”。

ＣａＣｌ２・２Ｈ２０５，５ ＦｅＳＯ４・　７　Ｆ（２ｏ　３・７５１ＡｎＳＯａ　・Ｈ２Ｏ１，４ ＺｎＳＯ４・７　Ｈ２Ｏ２−２ ＣｕＳＯ４’　５　Ｈ２ＯＣＬ４ ＣｏＣ６２・　６Ｈ２００，４５ １”Ｊａ２ＭＯＯ４”　２　Ｈ２Ｏ０，２６Ｈ８ＥＯ３０，４ ＫＩ　Ｏ，２６ 塩は弓解し、絹は４．０に珠付した。

ビタミン浴液の組灰（夕／ｌ’）： Ｄ−パントテン酸　２６．０ メソラム８１（抗生物質は＠筐ない）を１０１の７アーメンター中、１２０′Ｃ で２０分間戚回し九〇５００ｍ７）＠培餐不全受種して発酵七開妬した。温！、 ｄ３０±ｏ、ｉ”ｃｖｃ保持した。絹は１２．５％ＮＨ，’ＯＨｋ添加して６． ５に調整した。浴屏戚累張力は気流上１．５〜５．５１１／分に割ばして２５チ 窒気飽和以上に床付した。、８枚プロペラＯＬｇ］転速度：は５００１回／分ｌ こ課った。

発酵はオンラインＯ叶吸藺到足（酸素り消費と二酸化炭素の発生）、６１０闘ｍ の光学密度、Ｑ測定によって追跡した。α−ガラクトシダーゼ活活性３０分ごと に測定した。

α−がラクトシダーゼ活性、儂バイオマス■生成と密接に相関した。１２時間俊 （ＩＣ１役犬α−がラクトンダーゼ酵素１７６００／ｌが得らｎｌこｔ″′Ｌは 対数生育相り末期に相当した。バイオマス（度は１［］、２．９でめった。

この最大活性に到達したのち、培養液／、ｒ　＋８°ＶＣ冷却して細胞と遠心分 離した。

このように、特足の生育条件を適用することにより、Ｂａｃｉｌｌｕｓは大量の グアーα−がラクトンダーゼ酵素を産生じ、分泌する。

免役学的定量にはいわゆるウェスターン法解析金用いた。珊養メゾウム１ｃサン プル緩ｍ液を加えたのち、サンプルと５分関蕉沸した。

構製蛋白質は、２分間のみ加熱したのち、グルテンプル緩衝順中に適用した。蛋 白′ＸはＷｙｃｋｏｆｆはが（１９７７）ｉＣ従い、１０％ポリアクリルアミド ｒル上或気原動によって分離した。

次に蛋白質ｔデルからニトロセルロース上に鑞気泳＠移動によシ移した（　Ｂｕ ｒｎｅｔｔｅ、ｉ　９７９参照）。

ニトロセルロースをインキュベーション（１）　ｔ’（Ｊ［（１５０ｒｘ；Ｍ　 ＮａＣ１，５ｍＭ　ＥＤＴＡ、５０　ｍＭ　Ｔｒｉｏ　−ＨＣｌｐＨ７，［ｌ、 ０．０　５％　Ｉ−！Ｊ　トンＸ−Ｉ　Ｄ　Ｏ，０，２５％−ｅ７チン〕で洗浄 し、Ｔ−緩衝液中、肌１％ＢＳＡおよびグアーから精製したα−が２クトシダー ゼでつ？ギを免役処置して産生させた抗血清とインキュベーションした。

インキュベーションは室温で４時間、攪拌下に行った。■緩衝液で２回、リン酸 緩衝食塩溶液声７．０（ＰＢＳ　）で凭浄して、液層されなかった抗体を除去し た。抗原に結合した抗体は１Ｊ５１プロテインＡ　（Ａｍｅｒ−ｓｈａｍ　）と １時間反応させて検出した。■−援衛液で２回、ＰＢＳで６回呪浄したのち、ニ トロセルローステ乾燥し、−７０℃でＸ耀フィルムｉＣ暴露した。

ウェスターン法解析（第１５図）では、グアーα−ガラクトシダーゼ抗血清の特 異的反応を示し、グアーα−がラクトシト＃素の存在が証明された。しかしなが ら、メジウムｑ：Ｉに存在する酵素（レーン５）（７）分子量は、ＰＪｉ物起源 の酵素（レーン１）の分子量よりもわずかに低かった。しかし、プラスミドＰＵ ＲＹ　２７０３金もつ酵母細胞が産生した酵素（例２．第１１図参照）と同一で あった。細胞梱出液（レーン６〕は、メジウム中の酵素と同じ分子量をもつ主バ ンドを示した。さらに、低分量■バンド％１ｌ−ＺＡられ、こ往は蛋白分解らで よるものと考えろｎ、る。また、わずかに分子ｉつ高ハバンドも認められた。こ ｔ″Ｌはシグナル自己剃刀：処理ざｎなかった形が最も考えられる。

Ｎ末４配列解析Ｏためのα−がラクトンダーゼの単発酵暗地からマイクロＪ過（ Ｃ１，２２に）で細胞と除去したのち、低分子量物質を、Ｑ、Ｑ　３　Ｍ　Ｔｒ ｉ８−　ＨＣ６ｐｉ−１８，０で平衡化したＦＤ−ｉ［］カラム（ｐｈａｒｍａ ｃｉ＆　）を用いて脱塩によシ除去した。α−がラクトンダーゼは、ＭＯＮＯ− Ｑカラム（ＨＲ５／　５　、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）　ｆ用い、陰イオン交換ク ロマトグラフィーによってさらに単離した。溶出ハ０．０３　Ｍ　Ｔｒｉｓ　− ＨＣｔ声８．０中ＩＪｆｉｃｔ勾配（０〜ＩＭ）で行われた。検出、ｈ、Ｐｎａ ｒｒｎａｃｉａＦＰ　ＬＣシステムを用い２１４．／２８０で行った。α−ガラ クトシダーゼの活性（約０．３　Ｍ　ＮａＣ４で浴出）と含むフラクションｔプ ールし、脱塩した（ＦＤ−１０カラム、０．０１Ｍ酢酸ナトリウム絹４．５で浴 出）。最後の精製は、広孔ｃ−４カラム（Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ、４．６”２５０ 闘）ど弔い、勾閂己沼液：緩衝・浅ＡＯ１１チＴＦＡ（Ｖ／Ｖ）　、緩衝？Ｉ　 Ｂ　０．１％ＴＥＡ　＋６０％　ＣＦ（３ＯＮ　（Ｖ７’す。

２５分で、逆相クロマトグラフィーを行った。検出はＷＨｔｅｒ　ＨＰＬＣシス テムを用い２１４／２５４で行った。

α−がラクトンダーゼのピーク（５５％ＣＥ（３ＣＮ′ｃ浴出）ｆ　５ｐｅｅｄ 　Ｖａｃ　Ｃｏｚｃｅａｔｒａｔｏｒ　（５ＡＶＡＮＴ　）で屓縮し、Ｎ末端配 列の解析に夏用した。こｎは、オンラインＰＴＨ−アナライず−（１２０Ａ　） 　’に用いＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔ−ｅｍｓ　気相シクエンサー（４７Ｄ Ａ型）で実画した。

結果は、Ｂ、　５ｕｂｔｉ：Ｌｉ８７ｊｌｚ生酵素の最初０７個のＮ′Ｈ２末宿 残基・ま、グア一種子力１ら構製したｎ素′７）配列（しＵｌ、２．４．第３Ｂ 図参照）と同一で、らりた。

したがって、本発明者らは、グアーα〜がラクトンダーゼ酵素！・ま分泌され、 正しく処理されていると結論した。この酵素は、原核生物にその能力がないため 、グリコジル化されない。

ドース含量の低下 プラスミドｐ［ＪＲ２６０１を係留する体ＤＢＯ１Ｄ細胞で産生さ八たグアーα −ガラクトシダーゼ（例６参照）について、がラクトマンナン中がラクトース含 量の低下活性を試験した。

プレバレージョンは、発酵培地からＭＯＮＯ−Ｑカラムを用いて構製した（例６ 参照）。

α−がラクトシダーゼ活はを含むフラクション（約０、３　Ｍ　ＮａＣｔで浴出 ）全プールシ、脱４　Ｌ７’Ｃ（ＰＤ−ｉＱカラム、０．０１Ｍ酢虐ナトリウム ー４．５で浴出〕。

酵素プレバレージョンを真空乾燥によジ、さらに約１０倍濃縮した。

ＭｃＣｌｅａｒｙ　（１９８５）の記載Ｖて従い、グア一種子から精製したα− ガラクトシダーゼ酵酵素対照として使用した。

こｎらのα−がラクトシダーゼ酵素がグアーガムＤガラ、クトース含量を低下さ せる能力を以下りようにして解析した。

Ｈｚプンパレーション（グアー酵素Ｖζついては２５Ｕ　、Ｂ、　５ｕｂｔｉｌ ｉｓ産生酵素については１５Ｕ）と１０コｍＭ酢酸ナトリウム緩＠ＩＪ（４，５ （１，５ｒ＝ｌ　）　：ｃｉ＋＋ｌｌＦした。これをグアーガム１ｙに添工し、 混合物が微細なパン屑の感ＭＫなる１で少なくとも１分間激しく攪拌し、５５℃ でインキュベーションした。

酵素のがラクトマンナンに対する活性を解析するため、次のようにサンプルを採 取し分析した。

ついで、１０チ水酸化ナトｖウム５プとコえ、小型ホモジナイヂーを用いてサン プルを分散させた。溶液を水で２５ａｌとし、３０分間振盪し、再びホモｒナイ ズし、１５分間放置した。この処置後、ポリサンカライドｒ完全にイ谷解し、遊 離ガラクトースと総炭水化祷の足置の準備とした。遊離がラクトースは定量溶液 （口、１　ｔ、Ｊ　＋０．１　’１１水）　ｆ　０．２　Ｍ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣ ６ｐＨ８−６（２，７ｒｎｌ　）　ｉ・てｍ、ｔ、ついで０，２１ｖｉ　Ｔｒｉ ｓ　−ＨＣ６ｐ）１　Ｂ−６（０，０５ｍ）中０−２５Ｕβ−がラクトースデヒ ドロゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ　）　ｔ−加えて定量した。上述の＝ａからβ−がラ クトースデヒドロゲナーゼと除いた液とブランクとして、８０４がラクトースを 標準として用いた。溶液を３７”Ｃで１時間インキュベーションし、インキュベ ーション直後ｖｃ３４０ｎｍの吸光度金幽足した。総炙水化物の定量にはアンス ロン法（ＭＯｒｒｉＳ　＋１９４８）ｔ−用いた。改良操作（Ｌｏｅｗｕａ、１ ９５２　）は次のとおりである。

アンスロンＤ酢はエチルｌ：Ｐ飽和浴液を調製し、少くとも１時間静置した。試 験溶液２５μｌをピペットで試験管に取り、蒸留脱イオン水で１．ｄとした（水 ？ブランクに、８０ムｙのがラクトースを標準に使用した〕。

アンスロン飽和酸はエチル０．２ハを加え、ついで濃硫酸２．５ｍＡ！’ｉ加え た。激しく混合し、放冷した。吸光度は約３０分後に６１０　ｎｍで読んだ。

これらの結果から、ポリサンカライドに対する存在がラクトース％を計算した。

これらの結果は、グアーからＱ酵素と遺伝子操作グアーガム中ガラクトース官量 を低下させること金示している。

ざら（Ｃ−くべきことに、グリコジル化の欠如はゴラクトマンナンに対する酵素 つ挙動に悪形ｑｌを与えないことが明らかＶＣさｎた。

例　８ 遺伝子操作Ｉ（ａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｐｌｙｍｏｒｐｈａによるグアーαこの構 築の策略は第１６図１１Ｃ概略を示す。

このベクター■ペース（儂酵母ＹＥｐ　１３ベクター（Ｂｒｏａｃｈほか、１９ ７９）でらり、選沢マーカー、１１ｅｕ　２である。このベクター中に、上述の ＭＯＸ７’ロモータ−（Ｌｅｄｅｂｏｅｒほか＋　１９８４　）　、Ｓ、　ｃｅ ｒｓｖｉｓｉａｅからのインベルターゼシグナル配列（Ｔａｕｓｓｉｇ＆Ｃａｒ ｌｓｏｎ、１９’８３　）　ｙ成熟ａ−がラクトシダーゼ遺伝子（第６図）訃よ びＭＯＸターミネータ−（Ｌｅｄｅｂｏｅｒほか、１９８４）の間の融合を行わ せた。

このシラスミドｐＵＲ，３５１０ｆ作成する各工程は、以下に詳述するが、次の とお９でおる。

ａ）翻訳停止後■非翻訳配列の除去（ｐＵＲ２３口３を生成、第１６−１図） ｂ）　ＭＯＸプロモーターのインベルターゼシグナル配列および成熟α−がラク トシダーゼとの融合（１）ＵＲ３５０１■生成、第１６−２図） ｃ）　ＭＯＸターミネータ−の付加（ｐ［［ｔ、　３５０５の生成、第１６−３ 図） ａ）ｎｃｐ１３ベクター中への導入（ｐ［ｙＲ３５１０の生成、第１６−４図） ヌクレオチド１４ＤＯＣ＋翻訳停止後のｍＲＮＡの非翻訳部分（第６図）、なら びにポリＡ、　／　Ｔ　ｉ−よびＧ　／　Ｃ尾部を除去するために、ヌクレオチ ド１２２６〜１２６３のＸｍｎ　１部位から（第６図）翻訳停止１で０遺伝子部 分をｉｎ　Ｖｉｔｒｏ合成７ラグメントで置換した。

このフラグメントは、二重醐訳停止金含むα−がラクトンダーゼ遺伝子つ配列き 正確：ζコードする１ろＤオリゴヌクレオチドからＩＭＨされた。クローニング ′Ｄ便宜上、さらにμｈｌｆｓｐよびＨｌｎｄ　１都立を翻訳停止の直後に導入 した。

操作は次のとおりである。オリゴヌクレオチド全精製後、１および１６を除すて すべてをリン酸化した。

アニーリングとリグ−７３７２行ったのち、正しい大きさの７ラグメントｔアが ロース電気泳動によりａ襄プラスミドＤＮＡを横裂した。ｉ、ｌ３ｋｂの期待さ れたシ、ｍ　ＨＩ　−Ｈｌｎｄ　［１フラグメント金もつシラスミドについてヌ クレオチド配列を解析した。正しい配列を有するクローンから、Ｘｍｎ　Ｉ−Ｈ ｉｎｄ　ＩＩＩフラグメントｋｍ製し、プレーゾロ−α−がラクトンダーゼ２１ ！云子にコードするプラスミドｐＵＲ２５０２（第７図）からの１．２　ｋｂ　 Ｂａ：ｎ　！（Ｉ　−Ｘｍｎ　ｌフラグメントおよびＢａｍＨｌとＴ（ｉｎｄ　 ｍで消化したベクターＴＩＢＲ３２２と、モル比約４：２：１でリゾ−ジョンし た。

リゾ−ジョン混合物でＥ、　ｃｏｌｉ細胞を形質転換し、アンピシリン抵抗性、 テトラサイクリン感受性形質転換体からプラスミドＤＮＡ　ｆｃ精製した。精製 プラスミドＤＮＡを制限酵素で解析した。これにより翻訳停止後の非翻訳配列が 除去された完全グアープレープローα−ガラクトシダーゼ遺トンでコードするプ ラスミドｐＵＲ２３０３刀：生成した。

ｐＵＲ３５０１の構築（第１６−２ｌｐＭＯＸプロモーターとインベルターゼシ グナル配列−成熟α−ガラクトシダーゼの間の正確な融合を実現するために、６ ″ｌ：Ａのオリゴヌクレオチドから構成される合ｆｆ、　ｄｓ　ＤＮＡフラグメ ントを使用した。この合成フラカラのインベルターゼシグナル配列（Ｔａｕｓｓ ｉｇ　＆ｃａｒ１８０ｎ　、１９８３　）および成熟α−ガラクトシダー（Ｌｅ ｄｅｂｏｓｒほか、１９８５）。

６個のオリゴヌクレオチドから、１，２．３および４全リン酸化し、ついでオリ ゴヌクレオチドロおよび５を加えたのちアニーリング、リゾ−ジョンを行った。

次の工程は、合成７ラグメントと、ｐＵＲ３１０２からのＳａｌ　ｌ　−Ｈｇｉ 　ＡＩＭＯＸプロモーター７ラグメント（Ｌｅｄｅｂｏｅｒほか、１９８４；１ １２Ａ図）＞よびλイ１３ベクター（多■■およびＥＣＯＲ１で消１七し、つい で、悦リン酸化）とのりケ゛−ジョンであった。このリゾ−ジョン混合物でＥ、 　ｃｏ１ｉ細胞を形質転換し、白色プラークを採取した。一本領ファージＤＮＡ 、と二本鎖型を精製した。正しい市・１限溶累パターン？もつクローンおよび合 成フラグメントリ正確なヌクレオチド配列から、Ｓａｌ　ｌ−Ｎ：ｏ　ｌフラグ メントど精製し、さら：ｆＣクローニング茫性行た。

この５ｃ１１１−　Ｎｃｏ　ｌフラグメントを、成熟α−がうで消化したベクタ ーｐＥλ（ＢＬ　９とり・グージョンし、脱リン酸化した。Ｋ、　Ｃ０ＩＩ　細 胞ｆ　ＩＪダグ−ョン混合物で形質転換し、正しい制限酵素パターンをもつプラ スミド全解析し、シラスミドｐσＲ３５［］１を得た。

ｐＵＲ３５０５の構築（第１６−３図〕プラスミドｐＯ’Ｒ３５０１の２．６　 ｋｂ　Ｓａｌ　Ｉ　７ラグメント’ｉ＃壊し、ＭＯＸターミネータ−フラグメン トを含有するプラスミドｐＵＲ３１０４甲にリゾ−ジョンした（　Ｌ’ｅｄｅｂ ｏｅｒほか、１９８４．　第１４Ａ図）。生成した形質転換体からのプラスミド を制限酵素で、７ラグメント■適当なオリエンテーション（ＭＯＸ　ｙｏｌ：２ モーター−インベルターゼシングル配列−α−がラクトシダーゼーＭＯＸターミ ネータ−）！′Ｃついて解析し、シラスミドｐＵＲ３５０５ｋ得た。このシラス ミドはすでに、Ｈ，ｐｏ１７ｍｏｒｐｈａデノム中への（部位指定）挿入に適し ている。形質転換体は、活性α−がラクトシダーゼ酵素の存在（Ｃより炭素源と してメリビオースで生育する能力を取得していることが期待される。しかしなが ら、水元ら１＠らは、１ｅｕ−２栄養要求性選択マーカーをもち、Ｈ，ｐｏｌｙ ｍｏｒｐｈａ　ｌ１ｌｐで自動複製できるＹＥｐｌ　３ベクター　Ｃ７）ｆ　用 ｋ　Ｒ初１ｃ選択した（　ｏｌｅｅｓｏｎほか、１９８６）。

プラスミドｐＯＲ３５１０の構築（第１６−４図）ＦＥ　全７’ロモーターー遺 伝子−ターミネータ−配列をプラスミドｐＵＲ３５０５から５．２　ｋｌ　Ｈｌ ｎｄ　ｆｆ１−Ｅｃｏ　Ｒ１フラグメントとして精製した。このフラグメントを ｔｅｔ−遺伝子−？ＶＣ装置するＹＥｐ　１３の唯−ＱＢａｍ　Ｈ１部位にクロ ーニングするため、不発明者らはＢａｍ　Ｈ７〜た。リン酸化アダプターとりグ ージョンしたのち、混た。リゾ−ジョン混合りでＥ、　ｃｏｌｉ測胞を形質転換 し、プラスミドＤＮＡはアンピシリン抵抗性、テトラサイクリン感受性クローン から横裂した。こｎらから、正しい制限酵素パターンをもつシラスミド、ｐａｕ ５５１０が選択された。

ｏｌｅｅｓｏｎほか（１９８６）　ｊ’こよって報告された操作を用い、Ｌｉｃ ｋおよび環状プラスミドＤＮＡで形質転換した。形質転換体はＭ　１．Ａ上グル コースを炭素源とし、ロイシンを用いな贋で主ａさせ選択した。得られたｌｅｕ ”形質転換体りζついてグアーα−がラクトシダーゼ扉素の存在を解析した。

Ｙ辺Ｚ７ガール板上、炭素源と（−でグリセロール金用゛ハで生育させ、細胞を 収横し、抽出緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ　−ＨＣｔ　ｐ）１８．口、　Ｑ、１　 ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　ｉ　ｍＭ　ＤＴＴ　）ｆて懸濁し、凍結−解凍を６回反復 して波壊した。こｎらの粗細胞抽出液（てついて、活性α−ガラクトシダーゼ酵 素を人工基質ｐＮＰＧで、また免役学的定量法（ウェスターン法）で定量した。

粗細胞佃出久全抽出緩Ｉ＃液で適当Ｖζ希釈し、０’ＩＭ酢酸ナトリウムＰＩ（ ４，５中１０　ｍｌＡ　ｐＮＰＧと、６７′Ｃで５時間インキュベーションした 。２％尖醒すトリウム１Ｍを加えて反応を停止させた。侍らｎた混合物全、Ｅｐ ｐｅｎｄＯｒｆ遠心分離器により５分間遠心分陥して細胞および細胞７時−と除 去したのち４１０ｎｍにかける吸光度全項り定した。ｐ−ニトロフェノールの４ １０ｎｍＫｐげる吸光係数は１８．４α２／μｍｏｌｅである。α−がラクトン ダーゼ１単位は、３７　”Ｏ，ｐ＋（４，５におＩＡて１分間に４質１μコｏｌ ｅを加水分解する酵素の蓋と定義ざＣる。

プラスミドｐＯＲ３５１口をもつ細、抱の細胞１由出複はこの定量で陽：王シグ ナルを与えた。−万、このプラスミドを含普ない酵＠、ｆ１１砲の対照プレバレ ージョン、は反応を示さなかった。

免役学的定量には、いわゆるウェスターン解析法を用いた。サンプル緩衝液（Ｅ ｄｅｐｓほか、１９８２）を粗細胞抽出液に添加後、５分間煮沸した。

精製蛋白質を、わず７３≧２分間加熱したのちケ゛ルサンゾル緩衝液中に通用し た。蛋白質ｆｃＷｙＣｋＯｆｆほか（１９７７）の方法によって１０％ポリアク リルアミドデル上電気泳動によって分離した。

ついで蛋白質をグルからニトロセルロース上に、電気泳動移動により移した（　 Ｂｕｒｎｅｔｔｅ　Ｉ　１９７９参照）、。

ニトロセルロースをインキュベーション（１）緩ｉｔ（１５０ＩｎＭＮａＣＺ　 、５　ｍＭＥＤＴＡ　＋　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣ４ｐ）（７，０、０，０ ５％　ト　リ　ト　ン　Ｘ−１００，０，２５％　ゼラチン〕で況浄し、■−緩 衝液中、０．１％ＢＳＡおよびグアーから構製したα−がラクトシダーゼでウサ イを免役処置した産生させた抗血清とインキュベーションした。

インキュベーションは呈温で４時間、攪拌下に行った。■−緩衝液で２回、リン 酸緩衝食塩溶液ｐｉ４７．０（ＢＰＳ　）で洗浄して、吸Ｍざｎなかった抗体を 除去した。抗原ＶＣ結合した抗体は　１２５ＪプロテインＡ（Ａｍｓｒｓｈａｍ 　）と１時間反応させて検出した。■−緩衝液で２１回、ＰＢＳで３回氏浄した のち、ニトロセルロースを乾燥し、−７０’Ｃｔｌ’　Ｘ線フィルムに暴露した 。

結果（第１７図）は、プラスミド金もつＨａｎｓｅｎｕｌａ細胞抽出ｇ、（レー ンＣ）には、植物酵素の蛋白質（レーンＢ）と分子量が同一な蛋白質が存在し、 これにまたＳ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中プラスミドｐＵＲＹ　２７０５によっ て産生きれた蛋白質とも同一であることを示した。このプラスミドをもたないＨ ａｎｓｅｎｕｌａ細胞は蛋白質を示さなかった（レーンＡ）。

例　９ 微生物によるグアーａ−がラクトシダーゼの製造金さらに例示するために、ＧＡ Ｌプロモーターを用い、Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中でこの酵素の発現を誘導 できるベクターを画集した。このプロモーターのヌクレオチド配列なすでに報告 さｎている（　Ｎｏｇｉ　＆　Ｆｕｋａｓａｗａ　。

１９８３）。

このプロモーター配列は、誘導条件下すなわち単独炭素源としてガラクトースを 加えたメジウム上Ｃ生育させると、ＧＡＬ７コード酵素の産生が起こる（　Ｈｏ ｐｐｅｒ＆　Ｒｏｗｅ　、１９７８　）　ｏ　さらに、このプロモーターの、異 種遺伝子の発現誘導のための使用（たとえばｉ　ｃｏｌｉからの公知１ａｃＺ遺 伝子）についても報告かある（　Ｔａｊｉｍａほか＋　１９８５　；Ｙａｒｇｅ ｒほか、１９８５）。

したがって、ＧＡＬ　７プロモーターを用い、ハイグリッド遺伝子インベルター ゼシグナル配列：：成熟α−ガラクトシダーゼの発現を分析した。

こ扛らのベクターのベースは、ＧＡＰＤＨフロモーター−インベルターゼシグナ ル配列：：ｇ熟α−ガラクトシダーゼを含宥するシャトルベクターｐＵＲＹ　２ ７０５である（例２．　第１０図参照）。このベクターから、ＯＡ、ＰＤＨプロ モーターはほとんど完全に除去さＣ１Ｔ＋ＦｕｋａＳａｗａ博士（Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔ−１ｃｓ　、Ｋｅｉｏ　σｎ ｉ’ｖｅｒｓｉｔｙ　５ｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｘｃ１ｎｅ＋　Ｔｏｋｙｏ。

Ｊａｐａｎ　）から入手したクローン化２７１　ｂｐ　ＧＡＬ　７プ０％−ター フラグメント（Ｔａｊｉｍａほか、１９８５）で置換されてベクターｐＵＲ２７ ０６を得るか、あるいはｉｎ　ｖｉｔｒｏ合成りＮＡプロモーターフラグメント で置換さｎて、ｐｏｕ２７３０に得た。

プラスミド１）ＵＲ２７０６は次のようにして画集した（Ｍ２Ｓ−１図参ｊ’４ 　）　Ｏ’Ｊず、ベク”　＝　１）ＵＲ２７０５に変換した。したがって、ベク ターｐＵＲＹ　２７０５をＳａｃ　Ｉで消化し、Ｓ１エキノヌクレアーゼとイン キュベーションするとプラント末端が斤」製され、ついでこに使用した。

得られた形質転換体からシラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素で解析した。Ｓａ ｃ　１部位を欠くがＢａｎ　Ｈ１部位を有するプラスミドと選択した（　ＰＵＲ Ｙ　２７０５’　）。

いることが明らかＩｃされた。しかしながら、インベルターゼシグナル配列の翻 訳開始”Ａ、ＴＧ″は影響を受σていなかった。結果は以下の配列であった。

ペルターゼシグナル配列は大文字で、ＧＡ、ＰＤＨプロモーター（グ小文字で、 ＢａｍＴ（ｉリンカ−は下ａｔ付して示す） 除去し、大ベクターフラグメントをアがロースグル電気原動で＋Ｒ襄した。ＧＡ Ｌ　７プロモーターは、プラスミド上に２７１　ｂｐ　Ｂａｍ　Ｈｌ　−Ｂｇｌ 　ＩＩ　７ラグメントとして存在する（　Ｔａｊｉｍａほか、１９８５）、こＤ フラグメントも、消化後アガロースゲル電気泳動で精製した。

精製した２イ固のフラグメントをリゾ−ジョンし、すｒ２７１’ｂｐプロモータ ーフラグメント１１２種の方向しζリフ９−ジョンできる。しかしながら、シ＞ ｍ　Ｈｌ　ｖｉ層冶る。したがってＢａｍ　ＨｌおよびＢｇｌ　１部位の存否が その筐１１プロモーターの方向性の情報を与える。

したがって、プラスミドＤＮＡを形質転換体から屑褒し、とｎらのδυ限＃素で 解析した。正しい方向にプロこれはＧＡＬ　７　ｆロモーター（小文字）、μ旺 ■−と呪Ｈ７’）：ｙカーＣ下りおよびインベルターゼシグナル配列（大文字） の融合した以下のヌクレオチド配列ｔ−ｉじた。

ｇａａｔａｔｔｃｃｃｃａ６ａｔｃｃｇＡＴＧＡＴＧＣＴＴプラスミドｐＵＲ２ ７３０は次のようンてして溝築した（第１８−２図診照）。１ず、１６個のオリ ゴヌクレオチドからなるｄｓ　ＤＮＡ配列としてＧＡＬ　７プロモ一ター配列を 合成し、これを会し、ざらに例２に他のグループのオリゴヌクレオチド番（つい て記載したと同様に操作した。最初の５個はｐＥＭＢＬ　９中のＥｃｏ　Ｒ１− Ｂａｍ　ＨＩ７ラグメントとしてクローン比し、最後の１１１固はｐＥＭＢＬ　 ９中のＢａｎ　Ｈｌ　−Ｈｌｎｄ　ｌ［フラグメントとしてクローン化した。プ ラスミドＤＮ、Ａは形質転換体がら猜製し、制限＃素で解析した。期待さｎた犬 ＠さの挿入体を有するプラスミドの配列を決定し、正しいヌクレオチド配列をも つクローンを以後の操作に友用した。

ＧＡＰＤＨプロモーター全除去するため／（は、プラスミドをデル電気泳動によ って構製した。ＧＡＬ　７プロモーターをコードする２種の７ラグメントは、上 述の２種＋７）　ｐＦｉＭＢＬクローンｆ　ＢａｍＴ（ｌ消化によって消化し、 脱ベクター７ラグメントは２種のＧＡＬ　７プロモーターフラグメントとリグ− ジョンし、このリグージョン混合物を用いてＥ、　ｃｏユ１細胞を形質転換した 。プラスミドＤＮＡは形質転換体から精製し、制限酵素で解析した。

適当な制限酵素パターンをもつプラスミドを選択すると、プラスミドｐＵＲ２７ ５０が得らｎた。

Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐ　Ｓ　Ｕ　ｉ　Ｑ　（α＋　１ｅｕ２＋　ｕｒ ａ　３＋ｈｉｓ　５．　ｃｉｒ”　；　Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒａａｕ　ｖｏｒ ｒ　Ｓｃｈｉｍ　、ｘｅｌｃｕｌ−ｔｕｒｅｓ、Ｐ、Ｏ，ＢＯＸ　２７６＋　３ ７４０ＡＧＢａａｒｎ＋　ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄにＣＢＳＪ３２３．８７ 号として弁託さｎている）の酵母細胞をスフエロゾラスト法（”ｅｇｇ８＋１９ ’７８）ｉでより、プラスミドｐＵＲＹ　２７０６で形質転換した。

生成したｌＪｕ＋形質転換酵母細胞をα−ガラクトシダーゼ酵素の存在について 解析した。次に、酵母細胞を１０Ｘ大答黛ＹＰＧメゾウムに移し、静止期讐で生 育させた。細胞と発酵培地から遠心分離または濾過（０，２２４ｍ　＋　Ｍｉｌ ｌｉｐＯｒ１９　）　７）いず几かによって分署した。発酵培地および粗細胞抽 出液の両者につθて、例２に記載したと同様にしてα−がラクトシダー！０：Ｑ 存在？分祈１−た。

結果は、発酵培地１ｍｌ中に約５単位が存在し、−万、この濃度の１０条未満が 粗細胞抽出液中に存在した。

したがって、α−ガラクトシダーゼ酵素はかなり高レベルで分泌される。

産生きれた酵素全さらに詳細に解析するため、α−がラクトシダーゼを以下Ｏよ うにして精製した。

プラスミドｐＵＲ，２７０６を係留する株５Ｕ１０の酵母細胞と上述のようにし て培養した。発酵培地から細胞をマイクロ濾過（０，２２μｍ〕で除去したのち 、０．０３　Ｍ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｊ　ｐＪ（８，Ｑで平衡化したＰＤ−ｉＱカ ラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）を用いて脱塩によジ、低分子量物質を除去した。

α−ガラクトシダーゼ会よさらに、述ＮＯ−Ｑカラム（ＨＲ５／　５　、Ｐｈａ 、ｒｍａｃｉａ　）　ｆ用＾、陰イオン交換クロマトグラフィーによって単離し た。

溶出は０．０３Ｍ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣ６ＰＨ８，０中、ＮａＣ１勾配（０〜ＩＭ ）によって行った。検出は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＦＰＬＣシステム金用い２１ ４／２８０ｎｍ′″Ｃ夷画した。α−がラクトシダーゼ活惟金含む７ラクシヨン （約０．３　ＭＮａＣｌで浴出）と集め、脱塩した（ＰＤ−１０カラム、０．０ １Ｍ酢酸ナトリウムｐ）１４．５で溶出）。

このプレパレーシミン金グアーガムのがラクトース含量低下のための精袈ゾレパ レーションとして用いた（例１０参照〕。Ｎ末端配列解析のための最後の精製は 、広孔ｃ−４カラム（ＢａＣｋｅｒｂＯｎｄ　、　４．６”　２５０　Ｂ）？用 い、勾配溶出：緩１ｉＡ０．１％Ｔ１１’Ａ、　（Ｖ／Ｖ）　、　ａｍｉＢｏ、 １％ＴＦＡ　＋　６０％ＣＨ３ＣＮ　（ｖ／ｖ）　、２５分による逆相クロマト グラフィーで実施した。検出はＷａｔｅｒＨＰＬＣシステムｉ用゛ハて２１４／ ２５４ｎｍで行った。

α−がラクトシダーでのピーク（５５％ＣＨ３ＣＮ″ｒｇ出〕ｆ　５ｐｅｅｄ　 Ｖａｃ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ　（５ＡＶＡＮＴ　）で濃縮し、Ｎ末端配列 解析に用いた。これは、Ａｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏθｙｓｔｅｍＳの気相シクエン サー（４７０Ａ型〕によって実厖し、オンラインＰＴＨ−アナライデー（１２０ Ａ）を用いた。

粕釆（儂、ｌ丑１２末端から配列決定した１２個Ｏ残丞７り：グアーα−ガラク トシダーゼのＮＨ２末端末端アミノ列配列全に一紋すること金示した。インベル ターゼシグナル配列は正しく処理さｎでいて、グアーα−がラクトシダーゼのア ミノ酸配列が正確に生成した。

によジ製造したα−ガラクトシダーゼ酵素によるがラクトマンナン中ガラクトー ス含量の低下シラスミドｐＵＲ’ｌ　７０６を糸質した酵母細胞体５ＵＩＤＶＣ よって＃造さｎたグアーα−がラクトシダーゼ酵素（例９Σ照）、でついて、が ラクトマンナンのがラクトース含譬低下活性金試験した。

２種のプレバレージョンを１用した。すなわち、ひとつは発酵培地からＭＯＮＯ −Ｑカラムを用いて構製したプレバレージョンである（例９８照）。

α−がラクトシダーゼ活１′４：に含有するフラクション（約Ｑ、３　Ｍ　Ｎａ Ｃ１で浴出）ヲ集め、脱塩した（ＰＤ−１０カラム、溶出液０．０１　Ｍ酢酸ナ トリウムｐ）（４，５）。

酵素プレバレージョンを真空乾燥によりさらに約１０倍に濃縮した。

他は、ｉｏ、ｏｏｏダル）・ン以上の分子量を保時するＡｍ１ｃｏｎ　ａ縮器を 用い、澄明な発酵培地を１０倍に濃縮して得られた粗濃縮プレバレージョンであ る。

対照としては、ＭｃＣｌｅａｒｙ　（１９８３）　’／Ｃよって記述さｎている グア一種子から梢製したα−ガラクトシダーゼ酵素を用いた。

こわらのα−がラクトシダーゼｒ＃累のグアーガム中ガラクトース含量の低下能 は以下のようにして分析した。

＃素プレバレージョン（２５０）ｋｌ　００式酢酸ナトリウム緩衡孜（ｐｉ（４ ，５）　１．５Ｍに俗解した。こｎをグアーがム１ｉｔで調え、混合物が微細な パン粉のような感触になる葦で少なくとも１分間激しく混合し、５５℃でインキ ュベーションした。

この酵素のガラクトマンナンに対する活性ＱＰｓ析には、七６つサンプルを＄９ 、次のようンこして分析した。

パン粉慨混合物約１５０Ｉｎ９のサンノルを取逆、秤量した。酵素を沸騰水浴ｔ ｐに１０分分間−て不活性化１〜だ。

次に１０％水酸化ナトリウム５ゴ？加え、サンノルを小型ホモジナイザーを用い て分散させた。この溶液を水で２５ｔｎｌにし、３［］分間秦盪し、再びホモジ ナイズし、１５分間放置りまた。この処置ののち、ポリサッカライドを完全に溶 解させると、遊点がラフ）−−ス（例７診照）および総炭水化物が定量できる。

総炭水化物のだ警にはアンスロン５ｆｉ　量（Ｍｏｒｒｉｓ　、１９４８　）ヲ 使用した。改良操作（Ｌｏｅｗｕｓ　、１９５２　）は次のとｐりでろる。

アンスロンの酢目づエチル中飽和溶液を調製し、少くとも１時間装置した。試験 俗液２５μｔをピペットで試験管に取ジ、蒸留脱イオン水で１・ｎｔとした（水 ｔブランクに、８０４Ｏがラクトースを標準に開用した）。

アンスロン飽和酢酸エチルＱ、２ｇＬｔｆ加え、ついで−硫り浚２．５．７１１ と加えた。激しく混会し、放冷した。吸光【は約３０分後Ｖｃ　６１０　ｎｍ　 ｔ’胱んだ。

こｎらの結果から、ポリサッカライドに対するがラクト−スＯ存′ｆＥ％全計算 した。

坪＃：粗４媚液　３８　３Ｌ］　２８　１６精裂酵母　３８　３１　２６　１８ グアー　３８　３０　２７　１７ こｎらの結果（は、グアーからの酵素と、遺伝子操作酵母細胞によって産生さｎ たｉ＃素■グアーがムーＰゴラクトース含を低下能には差がないことと示してい る。

る製造：　Ｎ１ｅｏｔｉａｈａ　ｔａｂａｃｕｍによる製造遺伝子操作微生物に よるグアー酵素の製造についで、植物細胞による製造も経済的に興味のある可能 ａを掠供する。しかしながら、β−マンナナービが存在しないという当然の要求 Ｖこ加えて、検切が遺トン技術法をでよって操作できるものでなけｔ′Ｌｄなら ない。この例ではその例として、Ｎ、　ｔａｂａｃｕｍ　ＶＣ黒点をらてた。こ の植物種は、こｎｌで広＜ｉＫ云トン学実験に使用さ１ｔできたからである。技 術が他の植物種（ても利用ｉｒ能になれば、グアーα−がラクトシダーゼの製造 も容易＋Ｃ＝の種に移すことができる。

グアーα−ガラクトシダーゼの植物による製造全例示するため１で、本発明者ら はそ○ためＪ９ベクターｒ構成熟酵素Ｖこ先立つプレーゾロ部分をコードする配 列を含む全α−がラクトシダーゼ遺トン（第６図参照）を導入することに決定し た。ざらにＡ　／　Ｔおよび０７０尾部を含む翻択停止後の非翻訳ＤＮＡ配列は 除去した。

最後に全遺伝子をＢａｍＨ１部位の側方に置き、植物発現ベクター中カリフラワ ーモデイクウイルス３５Ｓプロモーターとツバリンシンテターゼ終結配列の間に クローニングした。これらの遺トン操作工程を以下ｌこ詳述する。

ヌクレオチド１４０ＯＫおける翻訳停止後の工ＲＮＡの非翻訳部分（第６図〕な らびにポＩＪ　Ａ　／　Ｔおよび０／Ｃ尾部全除去するために、ヌクレオチド１ ２２６〜俟した。このフラグメントは、二重翻訳停止金倉むａ−ガラクトシダー ゼ遺伝子の配列を正確にコードする１３のオリゴヌクレオチドから構成された。

ざらにり操作は次のと−りでめった。オリゴスクレオチド全２ｒｐＪ製後、１お よび１３′Ｊ＆：除いてすべてをリン酸化した。

アニーリング３よびりｒ−ジョン麦、正しい大きさの７ラグメントをアガロース デル電気泳動によって楢ゴス、予めＢａｎ　ＨＩ　Ｊ？よびＨｉｎｄ　１１で消 化したベクターｐＥＭＢＬ　９とリゾートとした。株、７Ｂ１０３からのメント ？もつシラスミドをヌクレオチド配列決定法によって解析した。正しＡ配列をも つクローンから一α−ガラクトシダーゼをコードするプラスミドｐＵＲを、モル 比約４：２：１で一緒にリゾートした。

Ｅ、　ｃｏｌｉ細胞金ＩＪ　ｒ−ジョン混合物で形質転換し、シラスミドＤＮＡ ’（＋−アンピシリン抵抗性、テトラサイクリン感受性形質転換体から精製した 。精製シラスミドの非柚訳配列が除去さｎｆＣ全グアープレープａ−α−ガラク トシダーゼ邂云トンコードするプラスミドｐＵＲ２３０６が侍らｎた。

た一本領粘層端ｆ　ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウフラグメントとデオキシヌ クレオチドトリホスフェートと処理して光填（−た（二本鎖とした）。合ｆｉ　 Ｂａｎ　ＨＩ　りンカー配列（５’　ＣＣＧＧＡ、ＴＣＣＧＧ　、：ｌ　（ｉ− 予めリン教化したリメント（ｉｌ−デル電気泳動で精製１−、ベクターｐＵＣ９ ＱＢａｍＨ１部泣ｖこリグ−ジョンした（　Ｖｉｅｉｒａほか９１９８２）。リ グ−ジョン混合物を用いてＥ、　（！Ｏ’ｌｉＪＭｉ口１を形質転換しく　Ｙａ ｎｉＳＣｈ−ＰｅｒｒＯｎほか。

１９８５）、白色のアンピシリン抵抗性コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡ は形質転換クローンから調製し、制限酵素解析に付した。さらに使用するために 正し・ハブラスミドを選択し％ＰＵＲ２３０４と命名した。

このプラスミドｆ、１．２　ｋｂ　Ｂａｍ　Ｈｌフラグメント上に存在するα− がラクトシダーゼコード配列の源として（Ｂｅｖａｎ、１９８４　）の成分を形 成し、Ｅ、　ｃｏ：Ｌｉ　１　ｆｃはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中での安定な 維付注を付与する広範な宿主範囲レプリコン；細菌中で機能するカナマイシン抵 抗性逍トン；　ＴＤＮＡの２５塩丞対リピートが測面に位置するＤＮＡ領域で、 植物中において機能する刀ナマイシン抵抗性遺トンおよびカリフラワーモデイク ウイルス−’）　３５　Ｓ　ＦｔＮＡ、　７’ロモーターとツバリンシンテター ゼ遺伝子の転写ターミネータ−からなる発現力セツ￥Ｃ対して移動可能にする動 員部位から構成されている。

発現部位内Ｖζα−がラクトシダーゼ遺トンを挿入するために、こりベクター２ 　Ｂａｎ　Ｈｌで消化し、脱リン酸化し、デル電気原動により積装した。

１．２ｋｂα−がラクトシダーゼＢａｌ１［ｌＨｌフラグメントをｐＵＲ２３０ ４から精製し、厘１線化脱リン酸化ベクターと混合し、二者全たかいにリグ−ジ ョンした。リゾ−ジョンした混合物音用いてＥ、　ｃｏｌｉ　Ｊ　Ｍ　１０１を 形質転換しく　Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎほか、１９８５）、陽性クローン をカナマーイシン抵抗性によって選択した。プラスミドＤＮＡは数種のクローン から調製し、制限酵素解析を介して１）　１．２　ｋｂα−ガラクトシダーゼ遺 伝子フラグメントの存在および２）このフラグメントの正しい方向性、すなわち 、３１！、伝子ＯＮ末端コード部分が発現カセット■プロモーター遺トンに隣接 することｔチェックした。佼者の特徴はＰｓｔ　ｌの非対称に配置された切断部 位上使用することによって決定された。正しい方向性をもつプラスミドが選択さ ｎた（　ＰｔＴＲ８００１；第１９図診照、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｊ　Ｍ　１０１中 、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅ ｓ、　Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ２７３　ｐ　Ｎ　１−３７４０　ＡＧ　Ｂａａｒｎ、　Ｔ ｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄに寄託番号ＣＢＳ　３３７．８７号にて寄託さｎた ）。

ＬＢＡ　４４０４　（Ｈｏｅｋｅｍａほか、１９８３）と三者間交配に用いＰＵ Ｒ８Ｑ　Ｑ　ｌ　ｆ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　休に移した〇この休はりフ ァンビシン［Ｆ］抵抗性な■で、この抗生物質をカナマ・イシンと組み合わせて 、交配時ドナー（（対する逆選択に使用した。

■本来のＴ１プラスミドとｐＵＲ８００ｉ　Ｚ）両者？もつＡ、　ｔｕｍｅｆａ ｃｉｅｎＢＬＢＡ　４４０４の誘導体と単点し、Ｈｏｒｓｃｈ　ｌｔか（１９８ ５）７）葉ディスク法の誘導体を用いて植物組織中のその発現カセット内にα− がラクトシダーゼ遺伝子を移送するために使用した。径８ｎの葉ディスクを、無 菌的に（ｌａ菌等を含まない純粋培（種子はＲ，５ｈｉｅｌｄｓ、σｎ１ｌｅｖ ｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＣｏｌｗｏｒｔｈ　Ｈｏｕｓｅ 、　ＵＫから入手できる）の新たニ開イた葉から切シ取りた。このディスクを無 菌条件下に、Ｌｅｎｎｏｘ培地干上記Ａ、　ｔｕｍａｆａｃｉｅｎｓ誘導体（細 胞１０９個／ａｌ）の−夜培養液中に移した。これｔ−ｉｏ分間インキユベート シ、取シ出し、吸い取って乾かし、Ｎ１ｃｏｔｉａｎａ　ｐｌｕｍｂａｇｉｎａ ｆｏｌｉａ　！ｆ！Ａ濁培養−！２Ｍｋ接種したアガール培地（発芽または仮皮 形成培地）の表面の無菌フィルター上に軸面を下に貼りつけた。接極した葉ディ スクを２６゛Ｃで２日間光線内で培養し、ついで１００μｇ／ｄカナマイシンお よび５００μｍ７／ＩＲ１セフオタキシム（Ｃ１ａｆｏｒａｎ■、Ｒｏｕｅｓｅ ｌ１社製）含有選択培地に移した。仮皮培養は維持し、適当な培地中３週縦代間 隔で増殖させ、カナマイシンおよびセ７オタキシムの両者で連続選択した。

発芽が促進された培養の場合（発芽培地）は、発芽がＡ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅ ｎｓ感染２〜４週ｆ！ｋＩ感染２ウ４セフオタキシムを含有する培地＄ＣＪＪし た。芽に根が生じたとき、再び芽を切断して、セ７オタキシムトカナマイシンを 含有するが、植物ホルモンを含１ない培地に移した。カナマイシン選択下に緑を 維持し、さらに根を生じた芽は、さらにベクター上にあるマー刀−の存在を試験 して形質転濃さｎていることが明らかにされた。

α−がラクトシダーゼ配列はｔまないが、４［物にツバリン産生能を付与するベ クターＢｉｎ　６（　ＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ工ｎ５ｔｉｔｕｔｅ，　Ｍａ ｒｉｓ　Ｌａｎ４１，　ＴｒｕｍｐｉｎｇｔＯｎｅＣａｍｂｒｉｄｇｅ　ＣＢ　 ２　２ＩＪＱ，ＵＫ　ＣＤ　Ｍ．　Ｂｅｖａｎ博士から目虫に入手できる〕を用 いた対照形質転換も上記操作に平行して央厖した。

カナマイシン（１００μｌ／ｄ）およびセ７オタキシム（５００μＩ／４１）ざ 有仮皮形ＦｉＣ培地（固体）上で生育した形質転換植物の小切片（２００〜）を 上記抗生物質を含む液体板皮形成培地（５０ａＪ）Ｃ０ｐＫ戒り、暗所、軌道振 盪機上で培養した。培養液が粘稠Ｖ′こなりたらば、無菌条件下に篩過して均一 な細胞懸濁液を調製した。懸濁培養液は１４日間隔で二次培養した。

カナマイシン１００μｊｌ　／　ｍｌ上で生育した形質転換植物の葉から葉ディ スクを切断した。切断したディスクをＡｇｒＯｂａＣｔ６ｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏ ｇｅｎｅｓ　Ｒ　１　０　０　０　（　ＩｍｐｅｒｉａｌＣｏｌｌｅｇｅ，　Ｌ Ｏｎ（ｌｏｎｊＣｏｎｒａｄ　Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ博士から入手した）の −夜培養物と１０分間インキュベートした。

ディスクを細菌培養液から回収し、吸い取って乾燥ムいて上述したと同様にして ）。２〜３日後、ディスクをカナマイシン（　１　０　０　ｍ１ｌｄ）およびセ ７オタキシム（５００μ！／ＩＩ））含有毛−培養培地（固体）上、細面を下に して置いた。１０〜１５日後、生じた伐を切断し、１００μ’Ｊ／ｄのカナマイ シンを含有する上板培養培地（液体〕上に置き、軌道振盪機上で培養した。根は 約１０日ごとに二次培養した。

培°地 仮皮形成： Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　＆　Ｓｋｏｏｇ　４ｉ礎培地（　Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｉｅｓ　）３％シュクロース ２ダ／ｊす７チル酢酸（オーキシン） ０、５１Ｒ９／ｌベンツルアミノゾリン（サイトキニン）（固体培地では必要に 応じてアガール）発芽： Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　＆　Ｓｋｏｏｇ　４　確培地（　Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｉｅｓ　）３％シュクロース ０、０２！ｎ９／ｌインドール酢酸（オーキシン）１１１／ｌベンジルアミノゾ リン（サイトキニン）（固体培地では必要に応じてアガール）毛伏培養培地 Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　＆　Ｓｋｏｏｇ基礎培地（　Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ　）３チシユクロース ０・１１９／ｌす２チル酢酸 タバコ植物、たとえば仮皮、葉または毛根から、水冷抽出緩衝液（１ｄ）中ホモ ジナイズした組織１００〜３００９を用いて抽出液ｔ−調調設た。別に、懸濁培 養液の上浸を使用した。抽出液または上澄液５０μｊを２ゴのアッセイＭ衝液〔 抽出緩衝液中４−メチルラムベリフェリルーα−Ｄ−がラクトシト（　Ｓｉｇｍ ａ　）　１麿〕ととも．Ｃ３７℃でインキユベートし、５　０　０　ｍｌのサン プルを、ｏ，　ｓ，　ｉ　ｏおよび１５分間隔で採取し、０−２　Ｍ　Ｎａ２Ｃ Ｏ３　３　ｄ　ｔ−加えて停止した。　遊ＡＩＬ１４−メチルウムベリ７エロン の螢光ｆ、Ｂａ１ｒｄ　Ｎ０Ｖａ２スペトロフルオロメーターを用い、スリット 幅セツ）　１　０　ｎｍにおいて３　６　５　ｎｍの励起光と、４　５　５　ｎ ｍの放射光を測定し、新たに調製した４−メチルウムベリ７エロンの溶液で検量 した。

抽出緩衝液 酢酸ナトリウム（　５　０　ｒｒＭ＃　ＰＨ５　）ＥＤＴＡ二ナトリウム（　１ 　ｍＭ　）ジチオスレイトール（　ｌ　Ｑ　ｍＭ　）ト　リ　ト　ン　Ｘ−１０ ０（０．１％）この定量法で測定さｎた値を第２０図にプロットした。この図か ら、形質転換細胞プレバレージョンは、対照プレバレージョンに比べてはるかに 高いα−がラクトシダーゼ活性を与えることが容易にわかる。対照はグアーα− がラクトシダーゼ遺伝子を含んでいなか（ｉ）　サンプル調製 形質転挨橿物組織（仮皮または葉）の小片金１．８ｄノエツヘンドルフ管中、先 端が円錐状のテフロン乳棒を用い、液体窒素の中で粉砕した。この粉末に２Ｘ襟 準濃度ＳＤＳケ９ルサンプル緩賃液（Ｌａｅｍｘｌｉ　、１９７０）２００μｍ ７）存在下、穏やかにホモｒナイズしながら解凍した。標品ａ−がラクトシダー ゼを含有するグアー内乳のサンプル？、例１に記載したと同様に制御された同期 発芽によって調製した。２４時間発芽内乳（抽出液あたり４１固）を上述したと 同様（／（液体窒素中で粉砕し、６×標準磯曵サンプル緩衝液２００μｅ中ンこ 穏やかにホモグナイズしながら、！凍した。ホモジネート？蒸留水で６００すに 希釈した。全抽出１ｔ−５分間煮沸し、ついでｉｏ、ｏｏｏｙで５分間遠心分離 した。上澄全１０Ｏ％ＳＤＳ　）ｆル上にロードし、３００Ｖで３時間、ついで １ｏｏｖで２時間電気泳りに付した（ロードＶこりいては相当する図の説ＥＡシ 照）。ついでデルをニトロセルロースフィルター上、電気プロット操作に付した 。ついでフィルター金以下のよ５１で処理した。

ｉ）　ＴＢＳ　（［］、５ＭＮａＣｔ、２［］　ｒｒａＡ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ、 　ＰＨ７，５）　＋　１％ヘモグロビン９１６時間インキュベージのアフィニテ ィー梢製抗α−がラクトシダーゼの１：１００希釈！２５ｍＪ中で、３時間イン キュベーション（第一抗体） ３）ＴＢＳ＋１％ヘモグロビン＋０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０（２×５０ｔｎｌ　 ）中ついでｉ　Ｍ　）ＪａＣｌ　、２　Ｑ　ｍＭ　Ｔｒｉａ　−ＨＯ２，ＰＨ７ −５，０・１％Ｔｗａｅｎ２０（４Ｘ１　０Ｃｌ’Ｍ）中、２時間にわたって洗 浄 ４）　ＴＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ　２　ＬＬ　１％ヘモグ０ビア中＼ヤヤ抗ウ サギワサビペルオキシダーゼ展合体の１＝２．０００希釈液と、２時間インキュ ベーション（第二抗体） ５）　１Ｍ　ＮａＣ１，２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−Ｈ（：ｔ、Ｑ、ｉ％’ｒｗｅｓ ｎＣ４Ｘ１００１ｄ）９．１４間にわたって死浄６）蒸留水中で最終リンス ７）標準ワサビペルオキシダーゼ発色試薬と（Ｔ（ＲＰキットの販売先−Ｂｉｏ ｒａｄ　Ｄ説ＥＪ１１Ｃ従って）２分間インキュベーション 上述の電気免疫プロット法（ウェスターン法）Ｋよシ、形質＠換仮皮ＣＩ、’Ｆ １１およびＢ１は対照ノラスミドＢｉｎ　６で形質転換さｊ、た仮皮には仔在し な１ハ、抗α−がラクトシダーゼと交差反応できる蛋白質材料を含有することを 明らかにできた。さらに、交差反応種は、発芽グアー内乳の抽出液中に認められ る標品α−がラクトシダーゼと同じ移動就（分子量）を示す。

こ扛は、移入された逍トンがコードするα−がラクトシダーゼのプレープロ型が タバコ仮皮で発現された場合、成熟型に正しく処理ざｎることを示役してお広こ れは、Ｃ１ｔＦ１１およびＢ１■悲濁培養液・Ｄ上澄Ｖこα−がラクトシダーゼ 活性が認められたことｉＣ４づき、α−ガラクトシダーゼは形質転換タバコ細胞 だよって分泌されるとした水元ＢＡ＃らの結論と支Ｒするものである。

α−がラクトシダーゼ遺トンを含有する形ＪＸ転換タバコ葉（ｐＵＲ８００１で 形質転換）の電気免疫プロット法Ｖこよる検討でも、この酵素のＦｆ、熱処理型 ：′こ相当する大きさＯα−がンクトシダーゼ型の発現が同４ｉ！に認められた 。

第１表 イナゴマメ　ＮＤ　＋　ＮＤ １２種の起源のα−がラクトシダー＋：酵素についてアウチェルロニー法、ウェ スターン法による免疫学的関係ならびにガラクトマンナンのガラクトース含量金 低下させる能力について検定した。

アウチェルロ二−法では、＃民約１０Ｕ／ｌｎｌの酵素プレバレージョンを使用 した。ウェスターン法では０、ＩＵ／ゴ〜０．５Ｕ／辺ｌの溶液ｔ−５μｌを使 用した。

ＮＤ：測定せず 参考文献 ＢａＣｋｌｌｌｌａｌｌ　Ｋ、、　Ｐｔａｓｂｎｅ、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｇ１１ｂ ｅｒｔ、　ｗｔ　（１９７６）。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７３：　４１ ７４−４１７８−Ｂａｈｌ　、○、Ｐ、　ａｎｄ　Ａｑｒａｗａｌ、　Ｋ、Ｍ、 Ｌ、　（１９６９Ｌ　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｂｉｇｇｉｎ、　Ｍ、Ｄ、、　Ｇｉｂｓｏｎ、　Ｔ、Ｊ、　ａｎｄ　ＨＯｎｇ＋ 　Ｇ、Ｆ、（１９８３ＬＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、 Ｓ、Ａ、　８０：　３９６３−３９６５゜Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、　Ｈ，Ｃ，ａｎｄ 　Ｄｏｌｙ、　Ｊ、　（１９７９）、　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　 ７：　１５１３１５２３゜Ｂ１５ｈｏｐ、　Ｄ、Ｆ、、　Ｃａ１ｈｏｕｎ、　Ｄ 、Ｈ，、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ、　Ｈ，Ｓ、。

Ｈａｎｔｚｏｐｏｕｌ、ｏｓ、　ｐａｌ　Ｑｕｉｎｎ、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｄｅｓ ｎ、ｉｃｋ＋　ＲＪ。

（１９８６）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ 、　３３：４８５９−４８６３　。

Ｂｏｙｅｒ＋　Ｈ，Ｗ、　ａｎｄ　Ｒｏｕｌｌａｎｄ−Ｄｕｓｓｏｉｘ、　Ｄ、 　（１９６９Ｌ　Ｊ。

Ｍｏ１．　ＢＩＯｌ、　、４１：　４５９−４７２゜Ｂｒ０ａｃｈ＋　Ｊ　、＋ 　５ｔｒａｔｈｅｒｎＴ　Ｊ−ａｎｄ　ＨＩＣｋＳ＋　Ｊ−（１９７９）ｒＢｕ ｃｋｈｏｌｚ、Ｒ，Ｇ、ａｎｄ　Ａｄａｎｓ、Ｂ、Ｇ、（１９８１Ｌ　Ｍｏ１． Ｇｅｎ。

２０３゜ Ｃｈ、ｅｎ＋　Ｅ、Ｊ、ａｎ、ｄ　５ｅｅｂｕｒ、ｇ＋　Ｐ、Ｈｏ（１９８５） ＋　ＤＮＡ　４：　１６５−１７０゜ Ｄｅｎｔｅ＋　Ｌ＋、Ｃｅ５ａｒｅｎｉ、Ｇ、ａｎｄ　Ｃｏｒｔｅｓｅ＋　Ｒ， （１９８３）＋Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１Ｃ１６４５１６５５− Ｅｄｅｎｓ、Ｌ、、Ｈｅｓｌｉｎｇａ、Ｌ、、Ｋｌｏｋ、Ｒ，、Ｌｅｄｅｂｏｅ ｒ。

Ａ、、ＩＪ、、１Ｊａａｔｌ　Ｊ、、Ｔｏｏｎｅｎ、Ｍ、Ｙ、、Ｖｉｓｓｅｒ、 Ｃ，ａｎｄＶｅｒｒｉｐｓ、Ｃ，Ｔ、（１９８２）、（）ｅｎｅ　１８：　１− １２゜Ｅｄｅｎｓ＋　Ｌ、、Ｌｅｄｅｂｏｅｒ、Ａ、Ｍ、、Ｖ１９ｒｒｊｐＳ＋ 　Ｃ，Ｔ、ａｎｄｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｅｒｇ、Ｊ　、Ａ、、（１９８３）、ＥＰ −Ａ−００９６９１０−Ｅｄｅｎｓ、Ｌ、、Ｒｕ５ｓｅｌｌ、Ｓ、Ｗ’、、Ｖｉ ｓｓｅｒ、Ｃ，ａｎｄＶｅｒｒｉｐｓ、Ｃ，Ｔ、（１９８４）、ＥＰ−Ａ−０１ ２９２６８゜Ｅｄｍａｎ、Ｐ、ａｎｄ　Ｂｅｇｇ＋　Ｃ）、（１９６７）、Ｅｕ ｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍｌ　：　８０−９１　。

Ｇｌｅｅｓｏｎ、Ｍ、Ａ、、０ｒｔｏｒｉ、Ｇ、Ｓ、ａｎｄ　５ｕｄｂｅｒｙ、 Ｐ、Ｅ。

（１９８６）、Ｊ、Ｏｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、ｉｍ２：　３４５９−３４（ ５５゜Ｇｒａｎｄｉ、Ｇ、、Ｄｅｌ　Ｂｕｅ、Ｍ、、Ｐａ１ｌａ＋　Ｌ＋　Ｍｅ ｌｅ、Ａ、。

Ｃｏ１ｅｔｔｉ＋　Ｅ、　ａｎｄ　’ｌＩ”ｏｚｓ＋　Ｓ、（１９８６）、Ｐｌ ａｓｍｉｄ　１６：１−１４゜ Ｈｉｎｎｅｎ、　Ａ、、　Ｈｉｃｋｓ、　Ｊ、Ｂ、　ａｎｄ　Ｆｉｎｋ＋　Ｇ、 Ｒ，（１９７８）。

Ｈｏｅｋｅｍａ＋　Ａ＋＋　Ｈｉｒｓｃｈ、　Ｐ、Ｒ，、Ｈｏｏｙｋａａｓ、　 Ｐ、Ｊ、Ｊ、　ａｏ、ｄ１８０゜ Ｈｏｐｐｅｒ、　Ｊ、Ｅ、　ａｎｄ　Ｒｏｖｅ、　Ｌ、Ｂ、（１９７８）、Ｊ、 　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、２５３：　７５６６−７５６９゜Ｈｏｒｅｃｈ、　Ｒ，Ｂ、　ａｎｄ 　Ｆｒｙ、　Ｊ、Ｅ、、　ＨＯｆｆｍａｎｎ＋　Ｎ、ＬｌＥｉｃｈｈｏｌｔｚ、 　Ｄ、、　Ｒｏｇｅｒｓ、　Ｓ、Ｇ、　ａｎｄ　Ｆｒａｌｅｙ、　Ｒ，Ｔ。

（１９８５Ｌ　５ｃｉｅｎｃｅ　２２７：　１２２９−１２３１−Ｉ　ｔＯｒ　 ＨＩＦｕｋｕｄａ　＋　ＹｌＭｕｒａｔａ、　Ｋ、ａＤ、ｄ　Ｋｘｍｕｒａ、　 Ａ。

Ｋａｗａｍｕｒａ、　Ｆ、　ａｎｄ　Ｄｏｉ＋　Ｒ，Ｈ，（１９８４）＋　Ｊ＋ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

１６０：　４４２−４４４゜ ｘＯｋｌ　Ｊ、、　Ｍａａｔ、　Ｊ、、　ｖａｎ　ｄｅｒ　ｖＯ３ｓｅｎ、　Ｊ 、Ｐ、Ｂ、Ｍ、　ａｎｄＶｅｎｅｍａ、　ｏ、　（１９８５）、　ＥＰ−Ａ−０ １５７４４１゜Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｕ、に、（１９７０）、Ｎａｔｕｒｅ　２２７ ：　６８０−６８５゜Ｌｅｄｅｂｏ　ｅｒｌ　Ａ−Ｍ−＋　Ｍａａ　ｔ＋　Ｊ− ＋　Ｖｅｒｒｌｐｓ＋　Ｃ−Ｔ　、ＶＩＳＳｅｒ＋Ｃ，、ＪａｎＯＷｉＣＺ＋　 Ｚ、Ａ、ａｎｄ　Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、Ｃ，Ｐ、（１９８４）＋Ｅｐ−Ａ−０ １７３３７８゜ Ｌｅｄｅｂｏｅｒ　＋　Ａ−Ｍ−＋　Ｅｄｅｎｓ＋　Ｌ−＋　Ｍａａ　ｔ＋　Ｊ −＊　Ｖ１８８ｅｒ＋　Ｃ１Ｂｏｓ、、Ｔ、Ｗ、、Ｖｅｒｒｉｐｓ、Ｃ，Ｔ、、 Ｊａｎｏｗｉｃｚ、Ｚ、、Ｅｃｋ、ａｒｔ。

Ｍ、、Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐ、Ｒ，ａｎｄ　Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、Ｃ，Ｐ−（ １９８５）＋Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１３：　３０６３−３０８ ２−Ｌｅｈｒａｃｈｊ　Ｈ−＊　ＤｌａｍＯｎｄ＋　Ｄ　、＋　ｗｏｚｎｅｙＩ 　Ｊ　０Ｍ−ａｎｄ７２５７−７２６８゜ Ｍａｎｌａｔｌａ＋　Ｔ−ｒ　Ｆｒ１ｔＳＣｆｉ＋　Ｅ、Ｆ、ａｎｄ　Ｓａｍｂ ｒｏｏｋ、Ｊ−（１９８２）、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　 １ａｂＯｒａｔｏｒｙ　！ｎａｎｕａｌ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、Ｍ、Ｄ、ａｎｄ　Ｃａｒｕｔｈ’３ｒＳＩ　Ｍ、Ｈ，（１ ９８１）ｌ　Ｊ。

ＭｃＣｌｅａｒｙ、Ｂ、Ｖ−（１９８３Ｌ　Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２ ２：　６４９−６５８゜ ＭＣＣ１ｅａｒ７＋　Ｂ、ｖ、、ｃｒｌｔｃｈｘｅｙ、ｐ、ａｎｄ　Ｂｕｌｐｌ ｎ、ｐ、ｖ。

（１９８４）、ＥＰ−Ａ−０１２１９６０゜Ｍｅｉｅｒ＋　Ｈ，ａｎｄ　Ｒｅ１ ｄ、　Ｊ、Ｓ、Ｇ、（１９８２ル１ｎ＠Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｐｌ ａｎｔ　ＰｆｉｙＳｉＯＩＯｇｙ′、Ｎｅｗ　５ｅｒｉｅｓ１３Ａ、　Ｌｏｅｗ ｕｓ、　Ｆ、Ａ、　ａｎｄ　Ｔａｎｎｅｒ、　Ｗ、　（ｅｄｉｔｏｒｓ）、　ｐ ｐＭｅｓｓｉｎｇ＋　Ｊ、、　Ｃｒｅａ、　Ｒ，ａｎｄ　Ｓｅｅｂｕｒｇ、　Ｐ 、Ｈ，（１９８１ルＮｏｇｉ、Ｙ、ａｎｄ　ＦｕｋａＳａＷａ＋　’ｒ、（１９ ８３Ｌ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｄ、１１：　８５５５−８５６８゜Ｎ ｏｒｒａｎｄｅｒ、ｔＬｔ　Ｈｅｍｐｅ、Ｔ、ａｎｄ　Ｍｅｓｓｊｎｇ、Ｊ、（ １９８３）＋Ｇｅｎｅ　２６：　１０１−１０６゜ Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、Ｎ、Ｊ、ａｎｄ　Ｂｒ０Ｗｎｌｅｌｅ＋　Ｇ、Ｇ、（１９ ７６）＋Ｎａｔｕｒｅ　２６３：　２１１−２１４゜５ｅｉｌｅｒ、　Ａ、　（ １９７７）、　Ｐｌａｎｔａ　１３４：　２０９−２２１−３ｕｍｎｅｒ−８ｍ ｉｔｈ、Ｍ、、Ｂｏｚｚａｔｏ＋　Ｒ，Ｐ、、５ｋｉｐｐｅｒ、Ｎ、。

３３３−３４０゜ Ｔａｊｉｍａ、　Ｍ、＋　Ｎｏｇｉ、　Ｙ、　ａｎｄ　Ｆｕｋａｓａｗａ＋　Ｔ 、（１９８５）＋ＴａｕＳＳｉｇ＋　Ｒ，ａｎｄ　Ｃａｒｌｓｏｎ＋　Ｍ、　（ １９３３）、　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、ＩＣ１９４３−１９５４− Ｔｕｌ　ｔｅ＋　Ｍ−Ｆ−＋　ＤｏｂｓｏｎＩ　Ｍ−Ｊ　、＋　Ｒｏｔ）８ｒ　 ｔＳ＋　Ｎ−Ａ、＋　Ｋｌｎｇ＊Ｒ，Ｍ、、Ｂｕｒｋｅ、Ｄ、Ｃ，、Ｋｉｎｇｓ ｍａｎ、Ｓ、Ｍ、ａｎｄ２６８゜ Ｗｙｃｋｏｆｆ、Ｍ、、Ｒｏｄｂａｒｄ、Ｄ、ａｎｄ　Ｃｈ、ｒａｍｂａｃｈ、 Ａ。

（１９７７）、Ａｎａ、１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、７８：　４５９−４８２−Ｙａｎ ｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、Ｃ，、Ｖｉｅｉｒａ、Ｊ、ａ、ｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ 、Ｊ。

（１９８５ン、Ｇｅｎｅ　３３：　１０３１０３−１１９−Ｙａｒ、Ｊ、Ｇ、、 （）ｏｒｍａｎ、Ｍ、Ｃ，ａｎｄ　Ｐｏ１ａｚｚｉ、Ｊ。

（１９８５Ｌ　Ｄｅｖ、Ｉｎｄ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２６：　１８１−１９２ ゜使用した略号衣 ＥＰ−Ａ−最初の優先権主張臼または、優先権がない場合は出願臼から約１８カ 月後に公衆審査のために公開されたヨーロッパ特許出願 ｐＮＰＧ　ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトヒラノシド ＡＴＰ　アデノシントリホスフェート ｄＣＴＰ　デオキシシトシントリホス７エートＴＴＰ　デオキシチミン）　ｌ） ホスフェート（）ＡＰＤＨグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロデナ ーゼ ０Ｄ２６０　２６０　ｎｍにおける光学密度ＳＤＳ　ドデシル硫酸ナトリウム ＨＡｃ　酢酸 ＮａＡｃ　酢酸ナトリウム Ｅ緩衝液　４　Ｑ　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＡＣｐＪ（７−６ｔ　２　Ｑ　ｍＭＮ ’ａＡｃ　、２０　ｍＭ　ＥＤＴＡ Ｏ緩衝液　１０　ｍＭＴｒｉｓ　−Ｈ（ＪｐＨ７，５，１ｍ１ｖｌＥＤＴＡ。

ＥＤＴＡ　、０．５　Ｍ　Ｎａ（Ｊ　、Ｑ、ｉデルコシルＳＴＥ緩衝液　１Ｑ　 Ｑ　ｍＭＮａｃｊ、１Ｑ　ｍＭＴｒｉｓ　−ＨＣｌｐＨ７−５，を鮨ＥＤＴＡ ＭＯＰＳ　３−　（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸ｉ、４０Ｐｓ緩衝液　 Ｑ、０２　Ｍ　ＭＯＰＳ　、　ｐＨ７，［］　、　１　ｍＭ　ＥＤＴＡＳＳＣｉ 　５ＱｍＭＮａＣｊ、１　５ｍＭクエン酸す　ト　リ　ラムＹＭＭ　アミノ改を 含まない０．６７％酵母窒素ベースと２．０％グルコースを含む酵母最小培地Ｙ ＰＤ　培地　２％グルコース、２％バクトーペプ゛トン（Ｄｉｆｃｏ　）、１％ 酵母エキス（Ｄｉｒｃｏ　）ＹＰｆｌ培地　２％ガラクトース、２％バクトーペ プトン（ＤｉｆｃＯ）＋　１％酵母エキス（Ｄｉｒｃｏ　）ＦＤＡ染色　フルオ レスセインニ酢酸塩染色他の略号および種々の表現の意味は、０１ｉｖｅｒ、　 Ｓ。

Ｇ、＆　Ｗａｒｄ＋　Ｊ　１Ｍ−：　Ａ　ｄｌｃｔｌＯｎａｒｙｏｆ　ｇｅｎｅ ｔｌｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ＋　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ 　Ｐｒｅｓｓ　＊　１９８５に記載されている。

ｐＵＲＹ　２７０３．　ｐＴＪＲＹ　２７０５＝　ｐＵＲｙ　２７０５’および ｐＵＲＹ　２７０６は、それぞれｐＵＲ２７０３，ｐＵＲ２７０５、ｐＵＲ２７ ０５’およびｐＵＲ２７０６の同義語である。

Ａ一種皮 Ｂ−糊粉細胞 Ｅ−薄い内乳層 第２図 鋳型としてグア一種子の糊粉細胞から精製したＲＮＡに酵母からのポＩＪ　−Ａ 、　ＲＮＡプレバレージョン（２μＳ；レーンＡ）およびグアーからのポリ−Ａ 、　ＲＮＡ　（５ｆｉｇ：レーンＢ、Ｃ）を翻訳の鋳型として使用した。翻訳生 成物全直接（レーンＡ、Ｂ、）またはα−ガラクトシダ−ゼ特異抗体とインキュ ベーション後（レーンＣ）、ゲルに適用した。１４Ｃ標識蛋白質（Ａｍｅｒｓｈ ａｍ　）を分子量標準として用いた（レーンＤ）。レーンＣの暴露は、−７０° Ｃで一夜暴露した他のサンプルの場合より５倍長くした。

第３図 ペプチドのアミノ酸配列およびそれから誘導されるプローブのヌクレオチド配列 内部ペプチド（Ａ）とＮ１（２末端配列（Ｂ）をアミノ酸の一文字記号で示す。

混合７″ローブのヌクレオチド配列は、それから誘導したアミノ酸配列０丁ぐ下 に示す。

混合位置の記号は、Ｕ−ＡまたはＧ；Ｖ−Ｔ−ｊたはＣ；Ｘ−Ａ、Ｇ、Ｔまたは Ｃ；　Ｙ−ＴまたはＧである。ＭＰ３６は２１マー（１２８種）、ＭＰ４２は１ ４７−（１６種）、ＭＰ４３は１４マー（８種）、ＭＰ４４は４１マー（１２８ 種）である。

第４図 グアーｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドプローブｍＰ３３のノデノ法ハイブリダイ ゼーション レーンＡ：　グア一種子の糊粉細胞からの５μｓポリ−ＡＲＮＡ レーンＢ：　グア一種子の糊粉細胞からの５／１９全ＮＡ 最もストリンジェントな洗浄は５　ｘ　ｓｓｃ　ｏ、ｉ％ＳＤＳ中３５°Ｃで実 施した。

Ｅ、　ｃｏｌｉ　’）ボソームＲＮＡを分子量標準とした。

第５図 プラスミドｐＵＲ２３０２の制限地図、サブクローンおよび配列決定策略 Ａ：　プラスミドｐＵＲ２３０２の予備制限地図Ｂ：　Ｍ１３ベクターＭ　１３ 　ｌｐ　１８およびＭ１３ｍｐ　１９にサブクローニングしたｐＵＲ２３０２お よびｐＵＲ２３１４の７ラグメント Ｃ：　ｐＵＲ２３Ｄ　２およびｐＵＲ２３１４の配列を確立するために用いられ る配列決定策略。四角は、様々のオリゴヌクレオナトとの配列決定反応のための プライム部位を示す（Ｕ：共通Ｍ　１３プライマー：数：配列決定実験のために 合成し之オリゴヌクレオチドゾライマー）。下部の線は超らせん配列決定実験を 示す。

グアーα−がラクトシダーゼｃＤＮＡクローンｐＵＲ２３０２５／−３′鎖のヌ クレオチド配列を示す。

ｃＤＮＡクローニング操作で合成さｎたボｌ）　ｄＣ）／ｄＣ尾部ヲ５′側に示 しくヌクレオチド６〜２ｏ参照）、６′部位ではｄＧ／ｄＣ尾部がボｌ）　−Ａ 尾部の後に続く（示していない）。ポリアゾニレ−ジョン一致配列（Ｐｒｏｕ、 ｄｆｏｏｔ　＆　Ｂｒｏｗｎｌｅｅ　、１９７６　）は、ヌクレオチドの上に線 で印をした。ヌクレオチド配列から誘導されるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配 列の上部に一文字記号で示す。アミノ酸の番号は成熟蛋白質について＋１から始 めた。プレープロ配列におけるアミノ酸には負の番号を付した。

第７図 プラスミドｐＵＲ”ｆ　２７０３およびｐＵＲＹ　２７０５の構築計画 数僅のフラグメントの詳細な説明は例２に記述した。

使用した記号： ＝ヨ　（）ＡＰＤＨプロモーター 口二二二　プレープロタウマチン遺伝子−ニーコ　α−ガラクトシダーゼ遺遺伝 ※７クク　ｌｅｕ　−２遺伝子 列 二二二二　２μｍ酵母ベクター 予め合成した個々の一重鎖オリゴヌクレオチドフラグメントは矢印の間の番号で 示す。Ａ　（ＧＡＰＤＨプロモーター−成熟α−ガラクトシダーゼ）およびＢ（ Ｃ）ＡＰＤＨプロ単一ター−インベルターゼシグナル配列−成熟α−ガラクトシ ダーゼノ中の同一番号（・ま、用いた同一の一重鎖オリゴヌクレオチドに相当す る。

制限酵素切断部位は完全二本鎖フラグメントの上に示す。翻訳の開始および成熟 α−ガラクトシダーゼのえ初の残基は二本鎖配列の下部にそれぞれＭｅｔおよび はカッコ内にキロ塩基対で示したヌクレオチド番号の任意の開始点である。且ｖ ｌとＥｃ、ｏＲｌは例外として、制限部位は消化および二重消化によって確認さ れた。

記号：　第７図の説明参照。ほかに、Ａ−ＡＡ　／　ＴＴＴ　。

（）ＧＧ　／　ＣＣＣはそれぞれｄＡ　／　ｄＴおよびｄ（）　／　ｄＣ尾部を 意味する。

塩基対で示したヌクレオチド番号の任意の開始点である。８ａｌＩとＥｃｏＲｌ は例外として、制限部位は消化および二重消化によって確認された。

記号：第９図の説明参照 第１１図 １）ＵＲＹ　２７０３およびｐＵＲＹ　２７０５を有するＳ、　ｃｅｒｅｖｉｓ ｉａｅのウェスターン法での解析操作の詳細な説明は例２に記載した。

レーン１：　グアーから精製したα−ガラクトシダ−ゼ４　ｎｇ レーン２：　レーン１に同じ、１　ｎｇレーン３　：　ｐｕＲｙ　２７０５をも つ細泡の粗抽出液レーン４　：　ｐＵＲＹ　２７０３をもつ細胞の粗抽出液レー ン５：　プラスミドをもｔない細胞の粗細出液詳細な説明は例５に記載した。使 用した記号については第７図の説明を参照のこと。白い箱はプラスミドの模式図 中に示した場所のｔｒｐ　−１遺伝子も意味し、また酵母ベクターの２μｍオリ ジン（図に示した）（ｆ−意味する。黒い箱は、ｐｕｃ２（インベルターゼ）シ グナル配列に代えて、図中に示したようにＫＡＲ３２配列も意味する。

詳細な説明は第６図に記載する。ｐｌ、ｉｓ　４８および］；ＩＵＲ，２６０１ 中に存在するその部分について用いた記号は第１６図中に説明する。ｐＵＲＹ　 ２７０３およびｐＵＲ２６０１中に存在するその部分について用いた記号は第７ 図の説明参照のこと 第１４図 振盪フラスコ中で生育したｐＵＲ２４０５ｉ有するＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓによ るα−ガラクトシダーゼの製造６Ｑ　Ｑ　ｎｍにおける光学密度（ＯＤ　６０口 ＞によって示されるバイオマスの発生およびｐＭＰＧアッセイで定量した生育培 地１ｍｌ中に形成したα−ガラクトシダーゼ（Ｕ）を第１４図に示す。プロット した１直は、生育３゜５．７および２４時間後に測定した。２４時間後に０Ｄ６ ００はＺｅｉｓｓフォトスペクトロメーターで８単位の最大に達した。逆に、α −がラクトシダーゼ含量の最大値約ｒ）、１ｕ／ｍｚ生育培地は、生育７時間後 に認められ、一方、生育２４時間後にその含量は生育培地１ｍｌ中わずか０．０ ０３０に低下した。

ｐＵＲ２４０５ｆ：有するＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓのウェスターン法解析 操作の詳細な説明は例６に記載する。

レーン１：　グアーから精製したα−ガラクトシダーゼ レーン２　：　ｐＵＲ２４０５をもつ細胞の粗抽出液レーン３：　２に同じ レーン４：　％Ｒ２４０５’にもつ細胞の生育培地レーン５：　４に同じ 各工程の詳細な説明は例４に記載する。とくに指示のない限り、使用した記号は 第７図に示し友記号と同ｐＵＲ３５１ＤをもつＨ，ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａのウェ スターン法操作の詳細な説明は例８に記載する。

レーｙ　Ａ　：　Ｈ，ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ　Ｌ　１細胞の抽出液レーンＢ：　 精製グアーα−ガラクトシダーゼ酵素第１８図 プラスミドｐＵＲ２７０６およびｐｕＲ，２７３０の製造計画 詳細な説明は例９に記載する。

各工程の詳細な説明は例１１に記載する。とくに指示のない限り、使用した記号 は第７図に示した記号と同じである。

第２０図 ｐＵＲ８００１で形質転換したタバコ植物および組織に２ける酵素アッセイ 各種植物細胞プレバレージョンの抽出液について、人工基質４−メチルラムベリ フェリルーα−Ｄ　−ｉｆ　ラクトピラノシドを用いて、α−がラクトシダーゼ の存在を分析した。

次に、α−ガラクトシダーゼをコードしたプラスミドｐＵＲ８００１で形質転換 した細胞からのプレバレージョンについて分析した。ベクターＢｉｎ　６をもつ 細胞を対照として用いた。詳細は例１１を参照のこと。

第２１図 ｐＵＲ８００１ｋもつＮ１（ｏｔｉ、ａｎａのウェスターン法テノ解析 操作の詳細は例１１に説明する。

レーン１：　発芽グアール内乳抽出物 レーン２：Ｂ１ｎ６をもつ仮皮抽出物（対照）レーン３　：　ｐＵＲ８０Ｄ　１ をもつ仮皮抽出物（Ｃ１）レーン４　：　ｐＵＲ８００１をもつ仮皮抽出物（Ｆ ｉｌ）レーン５　：　ｐＵＲ８００１をもつ仮皮抽出物（Ｂ１）矢印は分子量マ ーカーの位置を示す。上から下へ、９２　Ｋｄ　、６　Ｆ３　ｘａ　、４３　ｘ ａおよび２５　Ｋ、ｄである。

陶口α １トド く　の ８ＭＷ ・−１，０７ｈｉｄ 壷 帖 ＜　ｃｏ　ｃＪ 浄書ζ内容（こ変更なし） 浄書ζ内容に変更なし） 浄普？１言に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄３、′ミ古１こ変更なし〕 ひ１ト１；Ｌこ々丸ゴー。

浄書（内容に変更なし） 浄書ζ内容に変更なし） リＥコ、−：、に−６二定叉二′ｊ〜）二江１■ 浄書（内容に変更なし） 浄割内容１こ変更なし） 蜂デー″′１容・°：変三なし） 浄；Ｕ内密こ変効し） 浄書・１内容に俊足なし） ６、Ｑ、高荏：、こΣ支なし） ＦｊＨ出しり 浄１（へ容に変更なし） 浄側ｌ＋Ｔ盲？二変更なし） 浄ｒ側１−亡二下コＹ３−としノ 浄書（内容に変更なし） ン争ゴ、ｎ百）こムｊ蓮：２し） ０／１４．０３０ （＝２ｓｂｐ丁ＤＮＡＬニア）ＬＬ誇反１良浄書（内容に変更なし） ｐＵＲ８００１０−１’ｙ７Ｓ、コ　、ｕ”４”１ｌＪｎ゛’＋ｎｎ、ちｆ”＋ イＸ”　Ｉｌｌ！ｒ％、　７；７）　ｔ　ｆ−□？ｉｈ北！互 手続補正書（自発） 昭和６６年３月４日

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. （１）蛋白質またはその前駆体をコードするヌクレオチド配列が挿入された組換 えベクターであって、そのベクターを宿主生物に移すと宿主生物中でそのヌクレ オチド配列を発現させることができるベクターにおいて、蛋白質はα−ガラクト シダーゼ活性を有し、１−４結合β−Ｄ−マンノピラノシル単位の主鎖に付加し た１−６結合α−Ｄ−ガラクトピラノシル単位を切断除去することによりガラク トマンナンのガラクトース含量を低下させる能力を有することを特徴とする組換 えベクター。
2. （２）ヌクレオチド配列は、（ａ）請求の範囲第１項に示した能力を有するα− ガラクトシダーゼをコードする天然のヌクレオチド配列。（ｂ）グアー種子から のα−ガラクトシダーゼに対して産生される抗体と陽性免疫交差反応を示すα− ガラクトシダーゼをコードするヌクレオチド配列、および（ｃ）（ａ）もしくは （ｂ）のα−ガラクトシダーゼと同一であるかまたは請求の範囲第１項に示した 能力を依然として有するその修飾体であるα−ガラクトシダーゼをコードする遺 伝子操作ヌクレオチド配列、からなる群より選ばれる請求の範囲第１項に記載の ベクター。
3. （３）ヌクレオアド前列は、以下のアミノ酸配列【配列があります】 からなる蛋白質をコードする請求の範囲第１項または第２項のいずれかに記載の ベクター。
4. （４）ヌクレオチド配列は、第６図に示したヌクレオチド配列３０７〜１３９８ であり、これは請求の範囲第３項に示したアミノ酸配列１〜３６４に相当するコ ドンである請求の範囲第３項に記載のベクター。
5. （５）（ａ）α−ガラクトシダーゼまたはその前駆体をコードする二本鎖ＤＮＡ （ｄｓ−ＤＮＡ），（ｂ）（ａ）のｄｓ−ＤＮＡのプラス鎖の暗号領域の３′末 端に結合する翻訳停止コドンと所望によりそれに続く選択した宿主生物に適した 転写終結配列、（ｃ）（ａ）のｄｓ−ＤＮＡのプラス鎖の上流に位置する選択し た宿主生物に適した発現レギュロン，（ｄ）ｄｓ−ＤＮＡがα−ガラクトシダー ゼの成熟型をコードし、その型がメチオニン残基で開始しない場合は、（ａ）の ｄｓ−ＤＮＡのプラス鎖の暗号領域の５′末端に結合する翻訳開始コドンＡＴＧ −トリプレット，（ｅ）選択された宿主生物のゲノム中に（ａ）のｄｓ−ＤＮＡ の挿入を容易にするヌクレオチド配列および／または選択された宿主生物に適当 な複製のオリジンおよび所望により選択マーカー、ならびに（ｆ）所望によりα −ガラクトシダーゼの前駆体型の前駆体部分をコードするｄｓ−ＤＮＡから構成 される選択された宿主細胞に適した請求の範囲第１項から第４項までのいずれか に記載のベクター。
6. （６）請求の範囲第１項から第５項までのいずれかに記載の組換えベクターを導 入した結果、好ましくはβ−マンナナーゼを実質的に含まないα−ガラクトシダ ーゼの産生能を有する形質転換宿主生物およびその子孫。
7. （７）植物またはその部分である請求の範囲第６項に記載の宿主生物。
8. （８）微生物である請求の範囲第６項に記載の宿主生物。
9. （９）細菌、かびおよび酵母からなる群より選ばれる請求の範囲第６項に記載の 宿主生物。
10. （１０）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ，Ｂａｃｉ ｌｌｕｓ，Ｈａｎｓｅｎｕｌａ，Ｐｉｃｈｉａ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ，Ｓｏ ｌａｎａｃｅａおよびＮｉｃｏｔｉａｎａからなる群より選ばれる請求の範囲第 ６項に記載の宿主生物。
11. （１１）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｓａｃｃｈａｒ ｏｍｙｃｅｓｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ，Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｍ ａｒｘｉａｎｕｓ　ｖａｒ−ｌａｃｔｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉ ｓ，Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙ−ｍｏｒｐｈａ，Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏ ｒｉｓおよびＮｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍからなる群より選ばれる請求 の範囲第１０項に記載の宿主生物。
12. （１２）１−４結合β−Ｄ−マンノピラノシル単位の主鎖に付加した１−６結合 α−Ｄ−ガラクトピラノシル単位を切断除去することによりガラクトマンナンの ガラクトース含量を低下させる能力を有するα−ガラクトシダーゼを製造する方 法において、請求の範囲第６項から第１１項までのいずれかに記載の宿主生物を 、培養中または培養後誘導時のいずれかにα−ガラクトシダーゼが産生されるよ うな条件下に培養し、ついでα−ガラクトシダーゼを集めることを特徴とする方 法。
13. （１３）α−ガラクトシダーゼは宿主生物から分泌され、ついでα−ガラクトシ ダーゼの捕集は発酵培地から細胞を除去し、所望によりついで得られた培地を濃 縮する請求の範囲第１２項に記載の方法。
14. （１４）ガラクトマンナンの水性プレパレーションを実質的にβ−マンナナーゼ を含まないα−ガラクトシダーゼでインキユベーションすることによりガラクト マンナンのガラクトース含量を低下させる方法において、使用するα−ガラクト シダーゼは請求の範囲第１２項または第１３項のいずれかに記載の方法て製造さ れたものであることを特徴とする方法。
15. （１５）請求の範囲第１４項の方法によって製造されたかラクトース含量の低下 したガラクトマンナンを用い、所望によりこれに１種もしくは２種以上の他の増 粘剤またはゲル化剤を混合する食品，動物飼料または化粧料の製造方法。
16. （１６）請求の範囲第１２項または第１３項のいずれかり方法で製造したα−ガ ラクトシダーゼの、ガラクトマンナン中ガラクトース含量を低化させるための使 用。
17. （１７）ガラクトース含量の高いガラクトマンナンを請求の範囲第１２項または 第１３項のいずれかに記載の方法で製造したα−ガラクトシダーゼで処理するこ とにより得られたガラクトース含量の低下したガラクトマンナンの、食品，動物 飼料または化粧料の製造における使用。