DE69637252T2

DE69637252T2 - Verfahren unter verwendung eines gewebespezifischen promotors

Info

Publication number: DE69637252T2
Application number: DE69637252T
Authority: DE
Inventors: Yukio Yaizu-shi OKADA; Naohiro Yaizu-shi YOSHIGI; Kazutoshi Nitta-gun ITO; Makoto Nitta-gun KIHARA
Original assignee: Sapporo Breweries Ltd
Current assignee: Sapporo Breweries Ltd
Priority date: 1995-07-05
Filing date: 1996-07-05
Publication date: 2008-06-19
Anticipated expiration: 2016-07-06
Also published as: DE69637252D1; CA2199158A1; CA2199158C; EP0781849A1; ATE373720T1; EP0781849B1; EP0781849A4; AU6319096A; AU717055B2; JP4424756B2; DK0781849T3; US5952489A; WO1997002353A1; ES2293649T3

Description

Technisches Fachgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen unter Verwendung eines gewebespezifischen Promotors für Gene, die spezifisch in Pflanzensamen exprimiert werden können.
Technischer Hintergrund
Gerste ist ein Beispiel für eine Pflanze, die eine essentielle Nutzpflanze für Nahrungsmittel und für die Herstellung von Lebensmitteln und Getränken (Bier, Whisky etc.) darstellt und weltweit angebaut und konsumiert wird. In Übereinstimmung mit vielen Anwendungen für Gerste wurden bisher verschiedene Gerstezüchtungen hergestellt. Eine konventionelle Züchtung von Gerste schließt die Selektion einiger wirksamer Varietäten aus künstlichen oder natürlichen Mutanten und deren darauffolgende Kombination durch Kreuzung oder ähnliches ein, um dadurch die Hybride aus einer Anzahl der so erhaltenen Nachkommen zu ermitteln, die in der Lage sind, den beabsichtigten Phänotyp zu exprimieren. Da diese Art der Züchtung jedoch das Kreuzen einschließt, ist sie problematisch, weil der Genotyp, der eingeführt werden soll, auf einen für die Paarung zwischen verwandten Individuen („relative mating") beschränkt ist und lange Zeit benötigt wird, die geplanten Hybride zu erhalten.
Andererseits wurde durch die neueste Entwicklung in der Biotechnologie wie der Gentechnik und der Zelltechnologie auch für Gerste ein System für die direkte Einführung eines gewünschten Gens in Pflanzen etabliert und es wird erwartet, dass es in der Lage ist, die Probleme in der konventionellen Züchtung zu überwinden (z. B. betrifft BIOTECHNOLOGY 13, 248, 1995 Brauereigerste). Das System erfordert einen gewebespezifischen Promotor. Darin ist es erforderlich, dass genau dort, wo ein fremdes Gen in eine Pflanze eingeführt wird, das Gen in dem geplanten Gewebe rechtzeitig ausreichend exprimiert wird. Zu diesem Zweck muss ein gewebespezifischer Promotor an ein fremdes Gen gekoppelt werden, um das Gen unter der Kontrolle des Promotors exprimierbar zu machen.
Die vorliegende Erfindung soll ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, wie in den Ansprüchen spezifiziert, unter Verwendung eines Promotors, der in der Lage ist, spezifisch in Pflanzensamen exprimiert zu werden, bereit stellen. Als ein Beispiel gelang den hier genannten Erfindern die Isolierung einer Promotorbereichs, der kontrollierend auf die Transkription eines β-Amylase-Gens der Gerste wirkt, und ebenfalls die Analyse der Nucleotidsequenz der Promotorregion.
Die β-Amylase der Gerste ist eine aus Gerstesamen erhältliche β-Amylase (1,4-α-D-Glucanmaltohydrolase [EC 3.2.1.2], die, wie die β-Amylase der Sojabohne, als ein in der industriellen Herstellung von Maltose für die Injektion und Maltose für Lebensmittel und Getränke verwendbares Enzym bekannt ist. Es ist ebenfalls bekannt, dass Gerste zum Keimen gebracht werden kann, um Malz zu ergeben, das ein Rohmaterial für Bier und alkoholische Getränke sein kann. In Malz vorhandene β-Amylase ist eines der wichtigsten Enzyme für die Verzuckerung von Stärke im Maische-Schritt.
In Bezug auf die Gene der β-Amylase der Gerste wurde die vollständige Sequenz der cDNA einer Gerstenvarietät, Hiproly, die 1754 Basen umfasst, berichtet und die 535 Reste umfassende Aminosäuresequenz davon ebenfalls abgeleitet (siehe Eur. J. Biochem., 169, 517, 1987).
Zusätzlich wurde die vollständige Sequenz der cDNA einer Gerstenvarietät, Haruna Nijo, die 1775 Basen umfasst, berichtet und die 535 Aminosäuren umfassende Aminosäuresequenz davon ebenfalls abgeleitet (siehe J. Biochem., 115, 47, 1994; japanische offengelegte Patentanmeldung Nr. 6-303983 ). Ferner wurde die vollständige Sequenz der Region des Strukturgens der chromosomalen DNA der Varietät Haruna Nijo, die 3825 Basen umfasst, berichtet (siehe japanische Patentanmeldung Nr. 7-92004 ).
Yoshida beschreibt die 5'-stromaufwärts gelegene Region der β-Amylase der Süßkartoffel. Aus Yoshida et al. Gene 120 (1992), 255–259 ist vollkommen unklar, ob die offenbarte 5'-Promotorsequenz in der Lage ist, eine samenspezifische Genexpression zu kontrollieren und dieses Dokument legt nicht nahe, dass es nützlich sein könnte, eine solche Promotorregion für eine samenspezifische Expression zu verwenden. Schließlich ist die in Yoshida et al. offenbarte 5'-stromaufwärts gelegene Region der Süßkartoffelsequenz völlig ohne Bezug zur 5'-Promotorsequenz, die nach vorliegender Erfindung offenbart wird.
Bei Y. Hisahiro, Patent Abstracts of Japan (Publikationsnummer 06303983), 1994 handelt es sich um eine Zusammenfassung, die die β-Amylase der Gerste codierende cDNA offenbart. In ähnlicher Weise beschreiben Yoshigi et al., J. Biochem. 115 (1995), 47–51 die Clonierung der die β-Amylase einer bestimmten Gerstensorte codierenden cDNA in voller Länge unter Verwendung der Polymerase-Ketten-Reaktion zur Amplifikation der mRNA. Nach den Autoren zielte diese Studie darauf ab, eine cDNA der β-Amylase des Gersten-Endosperms zu clonieren und die Primärstruktur der β-Amylase der Gerste zu bestimmen.
Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA83 (1986), 8560–8564 befasst sich mit der funktionellen Analyse regulatorischer Elemente in einem embryospezifischen Pflanzengen. Das embryospezifische Gen sollte in Pflanzensamen aktiv sein. Die Autoren räumen jedoch ein, dass die funktionelle Analyse der regulatorischen Sequenzen von β-Conglicinin nicht einfach war. Dies ist unter anderem auf die Tatsache zurückzuführen, dass Unterschiede in der Expression verschiedener Deletionsmutanten für einen „aus"- oder „an"-Zustand des fraglichen Gens verantwortlich sein können oder nicht. Wichtiger, ein ausschlaggebendes Merkmal der Promotoraktivität, das in Übereinstimmung mit D8 entdeckt wurde, ist ein sechs
Basenpaar langes (G + C)-reiches Wiederholungsmotiv,
Diese Wiederholung ist in dem nach der Erfindung verwendeten Promotor nicht vorhanden.
Es existiert jedoch hinsichtlich der Promotorregion, die als Kontrolle der Transkription eines solchen β-Amylasegens agiert, kein Bericht bezüglich der Isolation des Promotorgens, geschweige denn der Analyse der Nucleotidsequenz davon.
Die hier genannten Erfinder haben versucht, die Promorregion eines Gersten-β-Amylasegens zu isolieren, das aktiv in Gerste entwickelnden Samen exprimiert werden kann, um sie dabei für die Verbesserung von Gerstensamen oder für die Herstellung von Produkten aus Gerstensamen auszunützen, haben uns ernsthaft damit befasst, dieses Ziel zu erreichen, und haben als ein Ergebnis die vorliegende Erfindung vervollständigt.
Nach vorliegender Erfindung kann ein gewünschtes fremdes Gen und ein Terminator dafür mit der stromabwärts gelegenen Stelle der erhaltenen Promotorregion verbunden und in eine Pflanze wie Gerste eingeführt werden, wobei das fremde Gen in den Pflanzen entwickelnden Samen exprimiert werden kann. Somit kann die Promotorregion für die Verbesserung von Gerstesamen und anderen Pflanzen und auch für die Herstellung von Substanzen in solchen Samen verwendet werden.
Offenbarung der Erfindung
Der erste Aspekt vorliegender Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, wie in den Ansprüchen spezifiziert, unter Verwendung eines Promotors, der agiert, um ein eingeführtes Gen in Pflanzensamen zu exprimieren.
Der Promotor besitzt ein Molekulargewicht von 1,28 Kb und enthält Schnittstellen, um mit Restriktionsenzymen gespalten zu werden, nämlich SalI, ApaI, XbaI, BamHI, HindIII, EcoT221, XbaI und BamHI, in dieser Reihenfolge (dies entspricht der in 2 gezeigten weißen Fläche) und umfasst die Nucleotidsequenz von Sequenz Nummer 1 im Sequenzprotokoll.
Die vorliegende Erfindung verwendet einen Vektor, der diesen Promotor enthält. Wie angegeben, beschäftigt sich die vorliegende Erfindung mit einem Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, das eine Transformation von Pflanzen mit diesem Vektor einschließt.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine transgene Pflanze, die mit diesem Vektor transformiert ist.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 ist eine physikalische Karte, die einen Clon zeigt, der die Promotorregion eines β-Amylasegens enthält.
2 ist eine physikalische Karte, die ein 2,4 Kb-SalI-SalI-Fragment zeigt, das die 5'-terminale Region einer Strukturgens eines β-Amylasegens und die Promotorregion des β-Amylasegens enthält.
3 zeigt einen Konstruktionsablauf für ein Reporterplasmid.
4 ist ein Graph, der die GUS-Aktivität verschiedener Zelllinien zeigt.
5 zeigt einen Expressionsvektor pSBG503 einer thermophilen β-Amylase.
6 ist ein Graph, der vergleichend die Thermophilie verschiedener β-Amylasen zeigt, die aus Samen von Pflanzenindividuen extrahiert wurden, die von Protoplasten, in die ein thermophiles β-Amylasegen nach vorliegender Erfindung eingeführt wurde, abgeleitet sind.
Die beste Ausübungsart der Erfindung
Wie vorstehend erwähnt, ist die β-Amylase der Gerste eine β-Amylase (1,4-α-D-Glucanmaltohydrolase [EC 3.2.1.2], die aus Gerstesamen erhalten wird.
Wie vorstehend erwähnt, wurde die vollständige Sequenz der cDNA des Gens dieses Enzyms, wie von bestimmten Gerstevarietäten abgeleitet, berichtet. Bis jetzt existiert jedoch hinsichtlich der Promotorregion, die kontrollierend auf die Transkription solch eines β-Amylasegens wirkt, kein Bericht in Bezug auf die Isolation des Promotorgens und Analyse der Nucleotidsequenz davon.
Es ist bekannt, dass die β-Amylase der Gerste in Gerstenpflanzen besonders in sich entwickelnden Samen produziert wird und dass das Enzym ein wesentliches Protein darstellt, das zu ungefähr 1 bis 2% zu den löslichen Proteinen im Endosperm beiträgt (siehe Hereditas, 93, 311, 1980).
Mit vorstehendem Wissen erwarteten die hier genannten Erfinder, dass eine Promotorregion, die in der Lage ist, spezifisch in Pflanzensamen exprimiert zu werden, als der transkriptionelle Kontrollfaktor für ein fremdes Gen, das in eine Pflanze eingeführt werden soll, zum Zweck, die Pflanzensamen zur Herstellung der zum fremden Gen gehörenden Substanz zu bringen, verwendet werden könnte. Außerdem bemerkten wir spezifisch für Gerste, dass sowohl die Isolation als auch die Identifikation der Promotorregion eines β-Amylasegens der Gerste wichtig ist, um ein fremdes Gen durch die Verwendung des Promotors erfolgreich in Gerste einzuführen.
Um die vorliegende Erfindung konkret zu veranschaulichen, wird nachstehend ein Verfahren im Detail beschrieben, das die Isolation und Analyse der Promotorregion eines β-Amylasegens der Gerste, die Konstruktion eines Expressionsvektors, der die Promotorregion enthält, die Einführung des Expressionsvektors zusammen mit einem fremden Gen in eine Pflanze und das Veranlassen der so transformierten Samen, das fremde Gen zu exprimieren, einschließt.
(1) Herstellung chromosomaler Gersten-DNA:
In Gerste existiert die gleiche chromosomale Gersten-DNA in allen Zellen jeden Gewebes. Aus Gerstesamen, die im Dunkeln in Vermiculit bei 20°C für 7 Tage zum Keimen gebracht wurden, können die primären Blätter hierin verarbeitet werden, um die beabsichtigte chromosomale Gersten-DNA zu ergeben. Die Präparation der DNA kann durch jede bekannte Methode durchgeführt werden. Zum Beispiel wird auf das Verfahren, das in „Cloning and Sequencing – Manuals for Experiments in Plant Biotechnology" (veröffentlicht von Nohson Bunka Publishing Co., 1989), Seite 252, beschrieben ist, verwiesen.
(2) Erzeugung einer genomischen Gerstenbank:
Unter Verwendung der chromosomalen Gersten-DNA kann durch jede bekannte Methode eine genomische Gerstenbank erzeugt werden. Es wird zum Beispiel auf das Verfahren, das in „Cloning and Sequencing – Manuals for Experiments in Plant Biotechnology" (veröffentlicht von Nohson Bunka Publishing Co., 1989), Seite 272 beschrieben wird, verwiesen.
(3) Erzeugung einer Sonde:
Sonden, die zum Absuchen der genomischen Gerstenbank verwendet werden, können durch das Markieren eines geeigneten DNA-Fragments, das heißt eines DNA-Fragments, das eine zu der Sequenz des Gens komplementäre Sequenz aufweist, erzeugt werden, um durch das Absuchen mit DIG-High Prime (hergestellt von Boehringer Mannheim Co.) selektiert zu werden.
(4) Clonierung der Promotorregion des β-Amylasegens der Gerste:
Um die Promotorregion des β-Amylasegens der Gerste zu clonieren, kann die genomische Gerstenbank unter Verwendung der, wie vorstehend erwähnt (3), erzeugten Sonde abgesucht werden. Dieses Absuchen kann durch jedes bekannte Verfahren durchgeführt werden. Zum Beispiel wird auf das in „Cloning and Sequencing – Manuals for Experiments in Plant Biotechnology" (veröffentlicht von Nohson Bunka Publishing Co., 1989), Seite 134 beschriebene Verfahren verwiesen. Der Nachweis der vorgesehenen Clone kann durch die Verwendung des DIG Luminescent-Detection Kit (hergestellt von Boehringer Mannheim Co.) durchgeführt werden.
(5) Sequenzierung:
Die Promotorregion kann z. B. nach dem Verfahren der chemischen DNA-Degradation von Maxam-Gilbert (siehe Methods in Enzymology, 65, 499, 1980) oder der Didesoxy-vermittelten Ketten-Terminations-Methode von Sanger (siehe Gene, 19, 269, 1982) sequenziert werden.
(6) Konstruktion eines Reporter-Plasmids:
Um die Promotoraktivität der so durch die vorstehend erwähnten Schritte erhaltenen Promotorregion zu bestimmen, kann ein Reportergen wie ein β-Gluclonidase (GUS)-Gen und ein Terminator wie ein Nopalinsynthasegen(NOS)-Terminator mit der stromabwärts gelegenen Stelle der Promotorregion verknüpft werden, um ein Reporterplasmid zu erzeugen, und die Aktivität des von dem Reportergen translatierten Produkts kann gemessen werden. Verwendbar als Reportergen und Terminator sind im Handel erhältliche Produkte wie das Plasmid pBI 101 (hergestellt von Clontech Co.).
(7) Nachweis der Promotoraktivität in Endospermzellen sich entwickelnder Samen:
Um die Promotoraktivität in Endospermzellen von sich entwickelnden Samen durch die Verwendung des, wie vorstehend beschrieben, konstruierten Reporterplasmids zu bestimmen, kann jedes bekannte Verfahren eingesetzt werden (siehe Plant Cell Reports, 10, 595, 1992). In Kürze: Aus den Endospermzellen sich entwickelnder Samen wird ein Protoplast hergestellt, in den das Reporterplasmid nach einem bekannten Verfahren, z. B. einer Polyethylenglykol-Methode (siehe z. B. Theor. Appl. Genet., 91, 707, 1995; japanische offengelegte Patentanmeldung Nr. 7-184492 ) eingeführt wird, und die GUS-Aktivität in den resultierenden Zelllinien wird gemessen.
(8) Erzeugung transgener Pflanzen:
Unter Verwendung des Promotors eines Gersten-β-Amylasegens der vorliegenden Erfindung wird ein Expressionsvektor konstruiert. Dann wird der Vektor in Pflanzenzellen eingeführt, um eine transgene Pflanze zu erhalten.
Als ein Beispiel enthält das Expressionsvektorplasmid zur Verwendung in vorliegender Erfindung als Gen, das exprimiert werden soll, ein thermophiles β-Amylasegen, als transkriptionellen Kontrollfaktor den Promotor der Erfindung und als Terminator einen Blumenkohl-Mosaikvirus-35S-Terminator. Dieses Expressionsvektorplasmid wird in Pflanzen eingeführt, die dadurch die vorgesehene thermophile β-Amylase in den Samen herstellen können.
Das thermophile β-Amylasegen, das mit dem Promotor verbunden werden soll, kann von jedem Organismus stammen oder kann sogar jedes modifizierte Gen sein, das durch Modifizierung des von dem Organismus abgeleiteten Gens hergestellt wurde. Die hier genannten Erfinder verwendeten hier ein thermophiles β-Amylasegen, das durch ortsspezifische Mutation eines β-Amylasegens der Gerste (siehe japanische offengelegte Patentanmeldung Nr. 7-327681 ) erhalten wurde.
Um das rekombinante Plasmid direkt in Pflanzenzellen einzuführen, können jedes Elektroporations-Verfahren (siehe z. B. Nature, 319, 791, 1986), Polyethylenglykol-Verfahren, Partikelkanonen-Verfahren (siehe z. B. Nature, 327, 70, 1987), Laserperforations-Verfahren (siehe z. B. Barley Genetics VI, 231, 1991), Verfahren mit Agrobakterium (siehe z. B. Plant J., 6, 271, 1994) und andere verwendet werden. Die hier genannten Erfinder verwendeten hier Gerste als Testmaterial und ein Polyethylenglykol-Verfahren unter Verwendung von Protoplasten als Methode zur Geneinführung.
Gersteprotoplasten können nach jeder üblichen Protoplasten-Präparationsmethode unter Verwendung von Cellulase und Pektinase vorzugsweise aus unreifem, vom Embryo stammendem Kallus (siehe Kihara & Funatsuki, 1995, Plant Sci., 106: 115–120; japanische offengelegte Patentanmeldung Nr. 7-213183 ) oder aus Suspensionskulturzellen mit Regenerationsfähigkeit, die aus solch einem unreifen, vom Embryo stammenden Kallus etabliert wurden, hergestellt werden, siehe Kihara & Funatsuki, 1994, Breeding Sci., 44:157–160; Funatsuki & Kihara, 1994, Plant Cell Rep., 13:551–555; Japanische offengelegte Patentanmeldung Nr. 4-360633 ).
Nach der Bildung von Kolonien aus den Protoplasten wurden das flüssige Medium und die als Ammenzellen verwendete Zellsuspension entfernt und die Kolonien wurden weiter in einem ein Selektionsreagenz wie Geneticin (G418), Hygromycin, Bialafos oder ähnnliches enthaltenden Flüssigmedium kultiviert. In dem Medium wachsen somit nur resistente Kolonien.
Die so gezüchteten Kolonien wurden auf ein festes Medium, das jedes der Selektionsreagenzien, Geneticin (G418), Hygromycin, Bialafos und andere enthält, übertragen. Weitere Kultur auf dem festen Medium ergibt embryonale Kalli oder Embryoide, die dann auf ein anderes festes Medium, das kein selektives Reagenz enthält, übertragen werden, was zu ihrer Regeneration zu Pflanzen führt. Die auf diese Weise gezüchteten Pflanzenindividuen werden dann in Töpfe umgesetzt und darin unter üblichen Kultivierungsbedingungen gezogen, z. B. bei einer Tageslänge von 16 Stunden, bei 10000 Lux und bei 18°C; sie sind dadurch fertile transgene Pflanzen.
Aus den von den Pflanzen erhaltenen Samen wird eine β-Amylase extrahiert, die dann hitzebehandelt wird. Die Aktivität des auf diese Weise hitzebehandelten Enzyms wird gemessen, um seine Thermophilie zu bestimmen. Die Amylase-Aktivität kann durch die Verzuckerung von Stärke mit dem Enzym gemessen werden. Die hier genannten Erfinder verwendeten hierin ein Amylase-Bestimmungsreagens (Diacolor AMY, Handelsbezeichnung eines Produkts von Ono Pharmaceutical Co.), mit dem nur die Aktivität von β-Amylase selektiv bestimmt werden kann, sogar in einer kleinen Menge einer Probe, die das Enzym enthält.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird nun im Detail nachstehend unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben, wobei jedoch nicht beabsichtigt ist, den Gültigkeitsbereich der vorliegenden Erfindung einzuschränken.
Beispiel 1:
Präparation von chromosomaler Gersten-DNA:
Etwa 1000 Gerstenkörner (Haruna Nijo) wurden in Vermiculit im Dunkeln bei 20°C für 7 Tage zum Keimen gebracht. Die auf dieser Weise gewachsenen primären Blätter (etwa 65 g) wurden abgenommen und dann in feine Stücke von etwa 1 cm Länge geschnitten, aus denen chromosomale DNA präpariert wurde. Aus 10 g Blättern wurden als ein Ergebnis etwa 1 mg DNA extrahiert.
Beispiel 2:
Aufbau einer genomischen Gerstenbank:
150 μg chromosomale DNA, wie in Beispiel 1 hergestellt, wurde teilweise mit 1 E Sau 3A1 bei 37°C für 1 Stunde gespalten und die resultierenden Fragmente wurden durch eine Saccharose-Dichte-Zentrifugation fraktioniert. Die Fraktion, die Fragmente von etwa 18 kB enthielt, wurde gereinigt und in einen λ-Phagenvektor EMBL3 (hergestellt von Stratagene Co.) inseriert. Unter Verwendung von Gigapack II Gold (hergestellt von Stratagene Co.) wurde der resultierende Vektor in lambda-Phagen-Partikel verpackt, mit denen Escherichia coli XL1-Blue MRA (P2) (hergestellt von Stratagene Co.) transformiert wurde.
Beispiel 3:
Erzeugung einer Sonde:
Ein vom strukturellen β-Amylasegen der Gerste abgeleitetes EcoRV-HindIII-Fragment, das in der japanischen Patentanmeldung Nr. 7-92004 beschrieben wurde, das heißt das DNA-Fragment, das die Nucleotidsequenz von Sequenznummer 2 im Sequenzprotokoll aufweist, wurde mit Digoxigenin unter Verwendung von DIG-High Prime (hergestellt von Boehringer Mannheim Co.) markiert, um eine Sonde zu erhalten.
Beispiel 4:
Clonierung der Promotorregion des β-Amylasegens der Gerste:
Der Plaque der wie in Beispiel 2 erzeugten genomischen Gerstenbank wurde auf eine Nylonmembran, „Hybond N" (hergestellt von Amersham Co.), übertragen und dann durch eine übliche Plaque-Hybridisierung unter Verwendung der in Beispiel 3 erzeugten Sonde abgesucht. Um den vorgesehenen Clon nachzuweisen, wurde ein DIG Luminescent Detection Kit (hergestellt von Boehringer Mannheim Co.) verwendet. Als ein Ergebnis wurde ein positiver Clon erhalten. Dieser Clon besaß die 5'-terminale Region des strukturellen β-Amylasegens und die stromaufwärts gelegene Region, die eine Promotorregion für das Gen enthält.
Die physikalische Karte des so erhaltenen Clons wird in 1 gezeigt, in der die Abkürzungen die Stellen anzeigen, die durch das angegebene Restriktionsenzym erkannt und gespalten werden, die dünnen Linien geben die Vektorstellen an, die schwarze Fläche zeigt die 5'-terminale Region des strukturellen β-Amylasegens und die weiße Fläche gibt die stromaufwärts gelegene Stelle, die den Promotor enthält, an.
Beispiel 5:
Sequenzierung der Promotorregion des β-Amylasegens:
Aus dem wie in Beispiel 4 erhaltenen positiven Clon wurde das SalI-Salt-Fragment von 2,4 Kb, das aus dem 5'-terminalen Bereich des strukturellen β-Amylasegens und der Promotorregion gebildet wird, ausgeschnitten. Dieses Fragment wurde in ein Plasmid pUC119, von dem ein Deletions-Clon unter Verwendung eines Kilo-Sequence Deletion Kit (hergestellt von Takara Shuzo Co.) erzeugt wurde, inseriert. Danach wurde die Promotorregion nach der Didesoxy-vermittelten Ketten-Terminations-Methode nach Sanger sequenziert.
Die physikalische Karte des 2,4 Kb SalI-Salt-Fragments wird in 2 gezeigt, in der die Abkürzungen die Stellen angeben, die durch die angegebenen Restriktionsenzyme erkannt und gespalten werden, die schwarze Fläche kennzeichnet die 5'-terminale Region des strukrurellen β-Amylasegens und die weiße Fläche zeigt die stromaufwärts gelegene Stelle, die die Promotorregion enthält.
Die Nucleotidsequenz der auf diese Weise sequenzierten Promotorregion des β-Amylasegens ist Sequenz Nummer 1 im Sequenzprotokoll. Die teilweise Nucleotidsequenz des so sequenzierten 2,4 Kb-SalI-Salt-Fragments ist Sequenz Nummer 3 im Sequenzprotokoll. Der Vergleich der Nucleotidsequenz der 5'-terminalen Region des strukturellen β-Amylasegens mit der des strukturellen β-Amylasegens der Gerste, die bereits erhalten wurde (siehe japanische Patentanmeldung Nr. 7-92004 ), bestätigte, dass das hier erhaltene DNA-Fragment ein β-Amylasegen ist. Die hier sequenzierte Promotorregion enthielt eine TATA-Box, die in Promotorregionen in Eukaryonten weit verbreitet existiert.
Beispiel 6:
Erzeugung eines Reporterplasmids:
In Übereinstimmung mit dem in 3 dargestellten Verfahren wurde ein Reporterplasmid erzeugt. Genau gesagt, wurde ein HindIII-EcoRI-Fragment, das das GUS-Gen und den NOS-Terminator des Plasmids pBI 101 (hergestellt von Clontech Co.) enthält, in die HindIII-EcoRI-Stelle des Plasmids pUC118 inseriert, um Plasmid pBI 11 herzustellen.
Andererseits wurde vom Fragment von Sequenz Nummer 3, das aus Base 1 bis 1672 der Nucleotisequenz des in Beispiel 5 erzeugten Deletions-Clons besteht, das heißt, das aus der Promotorregion von Sequenz Nummer 1 und der 5'-terminalen Region aus 341 Bp des strukturellen β-Amylasegens zusammengesetzt ist, ein PstI-EcoRI-Fragment, das diese Promotorregion enthält, herausgespalten. Die Enden des so gespaltenen PstI-EcoRI-Fragments wurden unter Verwendung eines Blunting-Kits (hergestellt von Takara Shuzo Co.) in glatte Enden überführt und das so mit glatten Enden versehene Fragment wurde in die SmaI-Stelle des Plasmids pBI 11 eingeführt, um ein Reporterplasmid pSBG 530 zu ergeben.
Ferner wurde das HindIII-HindIII-Fragment, das die 5'-terminale Seite der β-Amylase-Promotorregion des Plasmids pSBG 530 codiert, von dem Plasmid entfernt, um ein weiteres Reporterplasmid pSBG 530dH zu ergeben.
Beispiel 7:
Nachweis von Promotoraktivität in Endospermzellen in sich entwickelnden Samen:
Die Aktivität der isolierten Promotorregion des β-Amylasegens in Endospermzellen in sich entwickelnden Samen wurde in einem transienten Testsystem unter Verwendung des Reporterplasmids von Beispiel 6 bestimmt.
Zuerst wurden sich entwickelnde Samen der Gerstenvarietät Bomi, die innerhalb von etwa 14 Tagen ab der Blühte geerntet worden waren, geschält, um ihre Spelzen zu entfernen, danach einmal mit 70% Ethanol und noch einmal mit einer 1/5 Verdünnung von Hypochlorsäure sterilisiert und danach insgesamt dreimal mit Wasser gewaschen. Daraus wurde das Endosperm extrahiert und über Nacht bei 25°C mit einer CPW-Lösung (0,2 mM KH₂PO₄, 10 mM CaCl₂, 1 mM MgSO₄, 1 mM KNO₃), die 0,4% Cellulase und 11% Manit enthielt, weiterverarbeitet.
Die so erhaltenen Protoplasten wurden mit der 11% Mannit enthaltenden CPW-Lösung gewaschen und dann in mehrere Sektionen von je 10⁶ Protoplasten pro Transformationssystem geteilt. Zu jeder Protoplasten-Sektion wurden 30 μg der DNA und 200 μl einer C100S-Lösung (7% Sorbit, 10 mM CaCl₂, 4,7 mM MES, pH-Wert 5,7) gegeben und suspendiert. Die so erhaltene Lösung wurde dann mit 0,5 ml, C100S-Lösung (pH-Wert 7,0), die zugegebene 40% Polyethylenglykol 1540 enthielt, für 10 Minuten weiterverarbeitet.
Dazu wurden 10 ml einer LW-Lösung (siehe Lazzeri et al., Theor. Appl. Genet., 81: 437, 1991) gegeben und das so erhaltene Gemisch wurde zentrifugiert. 3 ml eines L1-Mediums (siehe Theor. Appl. Genet., 81: 437, 1991) wurden zu dem so erhaltenen Rest zugegeben, der dann über Nacht bei 25°C inkubiert wurde. 20 ml der LW-Lösung wurde zu der so erhaltenen Kultur zugegeben, die dann zentrifugiert wurde. Der so erhaltene Rest wurde in 200 μl eines GUS-Extrakts (0,05 M NaPO₄, 0,01 M EDTA, 0,1% Sarkosin, 0,1% Triton X-100, 0,1% 2-Mercaptoethanol) suspendiert und die Suspension wurde dann zweimal wiederholt eingefroren und aufgetaut. Dies wurde zentrifugiert und der so erhaltene Überstand wurde als unverarbeitete Enzymlösung für die Bestimmung der Promotoraktivität verwendet. Genau gesagt: die hier vorstehend erhaltene unverarbeitete Enzymlösung wurde mit 4-Methylumnelliferyl-β-gluconid umgesetzt, dann wurde die Reaktion mit 0,2 M Natriumcarbonat-Lösung gestoppt und der hergestellte 4-Methylumbelliferyl-Rest, von dem die Promotoraktivität bestimmt wurde, quantifiziert. Um das Protein zu quantifizieren wurde ein von Bio-Rad Co. hergestellter „Protein-Test" verwendet.
In 4 wird die GUS-Aktivität in jeder Zelllinie gezeigt; somit wurde bestätigt, dass die isolierte β-Amylase-Promotorregion in den Endospermzellen sich entwickelnder Gerstesamen aktiv war. Die GUS-Aktivität in der Zelllinie, in die pSBG 530dH eingeführt worden war, wurde auf etwa 2/3 der Zelllinie in die pSBG 530 eingeführt worden war, gesenkt; somit wird bestätigt, dass die Promotorregion die Nukleotidsequenz der Sequenz Nummer 1 im Sequenzprotokoll benötigt.
Beispiel 8:
Erzeugung von transgenen Pflanzen:
In Übereinstimmung mit dem Verfahren von Kihara & Funatsuki (1994, Breeding Sci., 44: 157–160) oder dem Verfahren von Funatsuki & Kihara (1994, Plant Cell Rep., 13: 551–556) wurden unreife Embryonen einer Gerstenvarietät, Igri, die eine Länge von annähernd 0,5 bis 1,0 mm aufweisen, zur Kallus-Indikation auf L2-Medium gesetzt. Nach einem Monat wurden die so erzeugten Kalli auf ein flüssiges L1-Medium gesetzt und hierin für 2 bis 4 Monate bei schwacher Lichtexposition (bei 500 Lux) durch Schüttelkulturen gezüchtet. So wurde eine flüssige Suspensionskultur erzeugt, die Zellmassen enthielt, die einen Durchmesser von annähernd 1 bis 3 mm aufwiesen.
Zu 1 g der Zellen wurden etwa 10 ml einer Enzymlösung (1,0% Cellulase Onozuka RS. 0,1% Pectolyase Y-23, 5 MM MES, gelöst in LW-Lösung) hinzugefügt und das so erhaltene Gemisch wurde für 2 bis 3 Stunden bei 25°C stehen gelassen.
Die so erhaltene Protoplasten-Suspension wurde durch eine 64-μ Netzmembran und eine 26-μ Netzmembran gefiltert und dann zentrifugiert, um die Protoplasten zu sammeln. Diese wurden dann insgesamt dreimal mit einer LW-Lösung gewaschen. 1 × 10⁶ bis 3 × 10⁶ so erhaltene Protoplasten wurden weiter in 250 μl eines flüssigen Mediums, Ca-S, das 10 μg/ml des Plasmids pSBG503 (Expressionsvektor für thermophile β-Amylase – siehe 5), 100 mM CaCl₂, 0,6 M Sorbit und 0,1% MES enthielt und das auf einen pH-Wert von 5,7 angepasst worden war, resuspendiert. Das Plasmid pSBG503 enthielt ein Kanamycinresistenz-Gen und ein Gen für thermophile β-Amylase, in dem ein Reis-Aktin-Promotor und ein Blumenkohl-Mosaik-Virus-35S-Terminator (35 St) mit dem Kanamycinresistenz-Gen verknüpft waren, während die Gerste-β-Amylase-Promotorregion von Sequenz Nummer 1 und ein Blumenkohl-Mosaik-Virus-35S-Terminator mit dem Gen für thermophile β-Amylase verbunden waren, jeder als der transkriptionelle Kontrollfaktor beziehungsweise der Terminator. Das Gen für thermophile β-Amylase enthielt das erste Intron eines Gerste-ß-Amylasegens. Zu der so erhaltenen Suspension wurden 600 μl Ca-S, das 40% Polyethylenglykol enthielt und das auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt worden war, tropfenweise zugegeben. Dies wurde für 10 Minuten stehen gelassen, wie es war, wobei es im Abstand von 5 Minuten geschüttelt wurde. Dies wurde mit 10 ml einer LW-Lösung verdünnt und dann zentrifugiert, um die Protoplasten zu sammeln.
Die so gesammelten Protoplasten wurden dann in 1 ml L1-Medium, das 0,6 mM Maltose, 2,0 mg/Liter 2,4-D-und 1,8% Agarose enthielt, resuspendiert und sofort auf einer 6-cm Petrischale verteilt, um darauf eine Scheibe mit einem Durchmesser von etwa 4,5 cm herzustellen. Nach Verfestigung wurde der so erhaltene Feststoff von der Schale geschält und dann in 5 ml eines Flüssigmediums (dieses enthielt die selben Verbindungen wie das vorstehend zur Herstellung der Protoplastensuspension verwendete Medium), das 200 mg/ml Gerste-Suspensionszellen enthielt, schüttelnd bei einer Schüttelgeschwindigkeit von 50 UpM inkubiert.
15 Tage nach dem Start der Protoplastenkultur wurden das flüssige Medium und die Suspensionszellen entfernt und 3 ml eines 20 μg/ml Geneticin (G418) enthaltenden flüssigen Mediums wurden zu der Protoplastenkultur gegeben. Dann wurde die so erhaltene Protoplastenkultur für weitere 14 Tage schüttelnd kultiviert und es resultierte das Wachstum von resistenten Kolonien in Agarose und ringsherum und auch im flüssigen Medium.
Die auf diese Weise gewachsenen Kolonien wurden auf 20 μg/ml Geneticin (G418) und als Hormone 0,5 mg/Liter 2,4-D und 1,0 mg/Liter Benzylaminopurin (BAP) enthaltendes L3-Medium übertragen. 3 bis 15 Tage nach dem Transfer wurden auf dem Selektionsmedium wachsende embryogene Kalli oder Embryoide gefunden.
Diese Kalli oder Embryoide wurden auf L3-Medium, das keine selektiven Reagenzien, aber 0,5 mg/Liter 2,4-D und 1,0 mg/Liter BAP enthielt, übertragen. Bis zu diesem Stadium wurde die Inkubation unter schwacher Beleuchtung (bei etwa 500 Lux) bei 25°C durchgeführt. Nach etwa 3 bis 15 Tagen wurde eine Neubildung von Pflanzensprossen aus den Kalli oder Embryoiden beobachtet. Nach ausreichender Triebentwicklung wurden diese in einen hellen Ort überführt, wo sie starkem Licht von etwa 7000 Lux ausgesetzt wurden.
Die so gewachsenen Gerste-Pflänzchen wurden dann zur Induktion der Wurzelentwicklung auf L3-Medium, das keine Hormone enthielt, verpflanzt. Nach etwa einem Monat wurden diese in Töpfe gepflanzt. Nach der Verpflanzung in Töpfe wurden diese bei einer Tageslänge von 16 Stunden bei 10000 Lux und 15°C gezüchtet; es handelte sich dabei um eine große Zahl transgener Gerstepflanzen. Die Anwesenheit oder Abwesenheit des Genfragments für thermophile β-Amylase in den so gezüchteten Gerstepflanzen wurde durch eine Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) überprüft, die das Vorhandensein des Fragments darin bestätigte.
Aus den sich entwickelnden Samen dieser Gerstepflanzen wurde unter Verwendung eines 50 mM Acetatpuffers, der 10 mM DTT enthielt, eine Amylase extrahiert. Das so extrahierte Enzym wurde bei Temperaturen zwischen 50 und 75°C (sich in Abständen von 2,5°C ändernd) für 30 Minuten hitzebehandelt und die β-Amylase-Aktivität des Enzyms wurde unter Verwendung von Diacolor AMY gemessen, um seine Thermophilie zu bestimmen. Die Ergebnisse werden in 6 gezeigt.
Wie aus den Daten in 6 deutlich, wurde bestätigt, dass die Samenproben a und b, die beide das eingeführte Gen für thermophile β-Amylase besitzen, die vorgesehene thermophile β-Amylase, die sich darin akkumulierte, enthielten, während die Kontrollsamenprobe p, die von den Protoplasten, die kein Gen für thermophile β-Amylase aufweisen, sie nicht enthielt. Insbesondere ist bekannt, dass die Akkumulation der thermophilen β-Amylase in der Samenprobe a bemerkenswert ist.
Möglichkeit zur industriellen Anwendung
Nach vorliegender Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen unter Verwendung eines Promotors für ein Gen, das in der Lage ist, spezifisch in Pflanzensamen exprimiert zu werden, bereit gestellt. Insbesondere hat die vorliegende Erfindung die Nukleotidsequenz der Promotorregion für ein β-Amylasegen aufgeklärt und die Aktivität des Promotors in sich entwickelnden Samen aufgeklärt. Nach Verknüpfung eines geeigneten fremden Gens und eines Terminators mit dem Promotor kann der so erhaltene Vektor in Samen von Gerste oder anderen Pflanzen eingeführt werden; dabei werden die Samen von Gerste oder anderer Pflanzen absichtlich modifiziert. Außerdem ist es auch möglich, die so erhaltenen transgenen Pflanzensamen dazu zu bringen, fremde Substanzen darin zu produzieren. Daher bringt die vorliegende Erfindung viele Vorteile auf dem Gebiet der Pflanzenzüchtung vor. SEQUENZPROTOKOLL

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, umfassend die Transformation von Pflanzen mit einem Vektor, der einen Promotor enthält, der ein in Pflanzensamen eingeführtes Gen exprimieren kann, wobei der Promotor die Sequenz von SEQ ID NO: 1 umfasst.
Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen nach Anspruch 1, wobei das eingeführte Gen das Gen einer thermophilen β-Amylase ist.
Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen nach Anspruch 1 oder 2, wobei die transgene Pflanze Gerste ist.
Transgene Pflanze transformiert mit einem Vektor, wie in Anspruch 1 beschrieben.
Transgene Pflanze nach Anspruch 4, wobei das eingeführte Gen ein Gen einer thermophilen β-Amylase ist.