ES2293649T3 - Metodo que emplea un promotor especifico de tejido. - Google Patents
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Abstract
Un método para producir plantas transgénicas, que comprende transformación de plantas con un vector que comprende un promotor capaz de expresar un gen introducido en semillas de plantas, dicho promotor comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1.
Description
Método que emplea un promotor específico de
tejido.
La presente invención se refiere a un método
para producir plantas transgénicas utilizando un promotor específico
de tejido para genes capaces de ser expresados específicamente en
semillas de plantas.
La cebada que es un ejemplo de plantas es un
cultivo agrícola esencial como comida y para la producción de
alimentos y bebidas (cerveza, whisky, etc.), y se cultiva y consume
en todo el mundo. Con arreglo a los muchos usos para la cebada, se
han producido hasta ahora varios cultivos selectivos de cebada. Un
cultivo selectivo convencional de cebada comprende seleccionar
algunas variedades eficaces a partir de mutantes naturales o
artificiales seguido por su combinación a través de cruce o similar
para encontrar de ese modo a partir de un número de progenie
resultante los híbridos capaces de expresar el fenotipo deseado. Sin
embargo, al consistir en el cruce, el cultivo selectivo de este
tipo es problemático en tanto que el genotipo que se va a introducir
se limita a uno por cruce relativo y en que lleva mucho tiempo
conseguir los híbridos deseados.
Por otra parte, con el desarrollo reciente en
biotecnología tal como la tecnología en ingeniería genética y
tecnología celular, se ha establecido un sistema para introducir
directamente el gen deseado en plantas incluso para la cebada, y se
espera que sea uno capaz de salvar los problemas de los cultivos
selectivos tradicionales (por ejemplo, se hace referencia a
BIOTECHNOLOGY 13, 248, 1995 para la cebada para la fabricación de
cerveza). El sistema requiere un promotor específico de tejido. En
esto, precisamente, donde un gen exógeno se introduce en una
planta, se requiere que el gen se exprese lo suficiente en el
tejido deseado en el tiempo correcto. Para este propósito, un
promotor específico de tejido se debe unir al gen exógeno para hacer
así el gen expresable bajo el control del promotor.
La presente invención es proporcionar un método
de producir plantas transgénicas según se especifica en las
reivindicaciones haciendo uso de un promotor capaz de ser expresado
específicamente en las semillas de las plantas. Como un ejemplo,
los inventores de la presente invención han tenido éxito en el
aislamiento de una región del promotor que actúa para controlar la
transcripción de un gen de \beta-amilasa de cebada
y también en el análisis de la secuencia de nucleótidos de la
región del promotor.
La \beta-amilasa de cebada es
una \beta-amilasa que se obtiene de las semillas
de cebada
(1,4-\alpha-D-glucanmaltohidrolasa
[EC 3.2.1.2]), que se sabe es una enzima que se puede utilizar,
como la \beta-amilasa de soja, en la producción
industrial de maltosa para inyección y maltosa para alimentos y
bebidas. También se sabe que la cebada se puede germinar para dar
malta que puede ser una materia prima para la cerveza y licores. La
\beta-amilasa que existe en la malta es una de
las enzimas más importante para la sacarificación del almidón en el
paso de aplastar.
En cuanto al gen de la
\beta-amilasa de cebada, se ha descrito la
secuencia completa del ADNc de una variedad de cebada, Hiproly, que
comprende 1754 bases, y también se ha deducido la secuencia de
aminoácidos de la misma que comprende 535 residuos (ver Eur. J.
Biochem. 169, 517, 1987).
Además, se ha descrito la secuencia completa del
ADNc de una variedad de cebada, Haruna Nijo, que comprende 1775
bases, y también se ha deducido la secuencia de aminoácidos de la
misma que comprende 535 residuos (ver J. Biochem., 115, 47, 1994;
Solicitud de Patente Japonesa Accesible al Público No.
6-303983). Además, se ha descrito la secuencia
completa de la región del ADN cromosómico del gen estructural de la
variedad, Haruna Nijo, que comprende 3825 bases (ver Solicitud de
Patente Japonesa No. 7-92004).
Yoshida describe la región 5' corriente arriba
de la \beta-amilasa de la batata. De Yoshida et
al. Gene 120 (1992), 255-259 no está claro si
la secuencia 5' del promotor divulgada es capaz de controlar la
expresión específica de genes en la semilla y este documento no
sugiere que pudiera ser útil utilizar tal promotor para la
expresión específica de genes en semillas. Finalmente, la región 5'
corriente arriba de la secuencia de la batata divulgada en Yoshida
y col. no está en absoluto relacionada con la secuencia 5' del
promotor divulgada según la presente invención.
Y. Hisahiro, Resúmenes de Patentes de Japón
(Número de Publicación 06303983), 1994, es un resumen que divulga
el ADNc que codifica la \beta-amilasa de cebada.
De forma similar Yoshigi et al., J. Biochem. 115 (1995),
47-51 describen la clonación de la secuencia
completa del ADNc que codifica la \beta-amilasa de
una cierta cebada cultivar utilizando amplificación de ARNm
mediante la reacción en cadena de la polimerasa. Según estos
autores, este estudio aspiraba a clonar el ADNc de la
\beta-amilasa de endospermo de cebada y determinar
la estructura primaria de la \beta-amilasa de
cebada.
Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
83 (1986), 8560-8564 tiene que ver con el análisis
funcional de los elementos reguladores en un gen específico de
embriones de planta. El gen específico de embriones debería ser
activo en las semillas de la planta. Los autores admiten, sin
embargo, que el análisis funcional de las secuencias reguladoras de
la \beta-conglicinina no fue directo. Esto es,
entre otros, debido al hecho de que las diferencias en la expresión
de varios mutantes de deleción podrían o no ser responsable del
estado "inactivo" o "activo" del gen en cuestión. De
forma más importante, una característica decisiva de la actividad
del promotor descubierta de acuerdo con D8 es un motivo de 6
pares de bases ricas en (G + C) que se repite,
Esta repetición no está presente en el promotor
utilizado según la invención.
Sin embargo, respecto a la región del promotor
que actúa para controlar la transcripción del tal gen de la
\beta-amilasa, no hay ningún informe que se
refiera al aislamiento del promotor del gen, por no decir el
análisis de la secuencia de nucleótidos del mismo.
Los inventores de la presente invención, han
tratado de aislar la región del promotor del gen de la
\beta-amilasa de cebada que se puede expresar
activamente en semillas de cebada en desarrollo, utilizándolo de
este modo en la mejora de las semillas de cebada o en la producción
de productos en semillas de cebada, han estudiado con la mayor
seriedad obtener este objeto, y, como resultado, han completado la
presente invención.
Según la presente invención, se pueden unir un
gen exógeno deseado y un terminador para el mismo al sitio
corriente debajo de la región del promotor obtenido, e introducir en
una planta tal como la cebada, en donde el gen exógeno se puede
expresar en las semillas en desarrollo de la planta. De este modo,
la región del promotor se puede utilizar en la mejora de las
semillas de cebada y otras plantas y también en la producción de
sustancias en tales semillas.
El primer aspecto de la presente invención es un
método para producir plantas transgénicas según se especifica en
las reivindicaciones que hace uso de un promotor que actúa para
expresar un gen introducido en las semillas de la planta.
El promotor tiene un peso molecular de 1.28 kb y
comprende sitios de corte para ser cortados con las enzimas de
restricción Sal I, Apa I, Xba I, Bam HI, Hind III, EcoT 221, Xba I y
Bam HI, en ese orden (esto corresponde con el área blanca mostrada
en la Fig. 2), y que comprende la secuencia de nucleótidos de la
Secuencia Número 1 en la Lista de Secuencias.
La presente invención emplea un vector que
comprende dicho promotor.
Según lo indicado, la presente invención tiene
que ver con un método para producir plantas transgénicas, que
comprende la transformación de plantas con dicho vector.
El aspecto adicional de la presente invención es
una planta transgénica transformada con dicho vector.
La Fig. 1 es un mapa físico que muestra un clon
que comprende la región del promotor del gen de la
\beta-amilasa.
La Fig. 2 es un mapa físico que muestra el
fragmento Sal I-Sal I de 2.4 kb que comprende la
región 5'-terminal de un gen estructural de un gen
de la \beta-amilasa y la región del promotor del
gen de la \beta-amilasa.
La Fig. 3 muestra el proceso de construcción de
un plásmido indicador.
La Fig. 4 es un gráfico que muestra la actividad
GUS de varias líneas celulares.
La Fig. 5 muestra un vector de expresión pSBG503
de una \beta-amilasa termófila.
La Fig. 6 es un gráfico que muestra
comparativamente la termofilia de varias
\beta-amilasas extraídas de semillas de
individuos de plantas derivadas de protoplastos en los que se
introdujo un gen de \beta-amilasa termófila según
la presente invención.
Como se ha mencionado anteriormente, la
\beta-amilasa de cebada es una
\beta-amilasa
(1,4-\alpha-D-glucanmaltohidrolasa
[EC 3.2.1.2]) que se obtiene de semillas de cebada.
Acerca del gen de esta enzima, se ha descrito la
secuencia completa del ADNc derivada de variedades particulares de
cebada, como se ha mencionado anteriormente. Sin embargo, respecto a
la región del promotor, que actúa para controlar la transcripción
de tal gen de la \beta-amilasa, no hay hasta ahora
ningún informe que se refiera al aislamiento del promotor del gen y
al análisis de secuencia del mismo.
Se sabe que, en plantas de cebada, la
\beta-amilasa de la cebada se produce
específicamente en las semillas en desarrollo, y que la enzima es
una proteína esencial que representa aproximadamente del 1 al 2% de
las proteínas solubles en el endospermo (ver Hereditas, 93, 311,
1980).
Sabiendo lo anterior, los inventores de la
presente invención esperaban que se pudiera utilizar una región del
promotor capaz de ser específicamente expresada en semillas de
planta como el factor de control transcripcional para un gen
exógeno que se va a introducir en una planta con el propósito de
hacer que las semillas de la planta produzcan una sustancia
relacionada con el gen exógeno. Además, para la cebada, se advirtió
específicamente que el aislamiento así como la identificación de la
región del promotor del gen de la \beta-amilasa de
cebada es importante para introducir con éxito un gen exógeno en la
cebada mediante el uso del promotor.
Para ilustrar concretamente la presente
invención, se describe en detalle posteriormente un proceso que
comprende aislar y analizar la región del promotor del gen de la
\beta-amilasa de cebada, construir un vector de
expresión que comprende la región del promotor, introducir el
vector de expresión junto a un gen exógeno, y hacer que las
semillas así transformadas expresen el gen exógeno.
En la cebada, el mismo ADN cromosómico existe en
todas las células de cada tejido. A partir de semillas de cebada
germinadas en vermiculita en la oscuridad a 20ºC durante 7 días, se
pueden procesar las hojas primordiales para dar el ADN cromosómico
de cebada deseado. La preparación del ADN se puede llevar a cabo
mediante cualquier método conocido. Por ejemplo, se hace referencia
al método descrito en "Cloning and Sequencing - Manuals for
Experiments in Plants Biotechnology" (publicado por Nohson Bunka
Publishing Co., 1989), página 252.
Utilizando el ADN cromosómico de cebada, se
puede generar una genoteca genómica de cebada mediante cualquier
método conocido. Por ejemplo, se hace referencia al método descrito
en "Cloning and Sequencing - Manuals for Experiments in Plants
Biotechnology" (publicado por Nohson Bunka Publishing Co., 1989),
página 272.
Se pueden preparar las sondas para utilizar en
el screening de la genoteca genómica de cebada mediante marcaje de
un fragmento adecuado de ADN, o esto es, un fragmento de ADN que
tiene una secuencia que es complementaria a la secuencia del gen
que se va a seleccionar a través del screening, con
DIG-High Prime (producido por Boehringer Mannheim
Co.).
Para clonar la región del promotor de la
\beta-amilasa de cebada, la genoteca genómica de
cebada se puede examinar mediante el uso de la sonda preparada en
(3) anteriormente. El screening se puede llevar a cabo mediante
cualquier método conocido. Por ejemplo, se hace referencia al método
descrito en "Cloning and Sequencing - Manuals for Experiments in
Plants Biotechnology" (publicado por Nohson Bunka Publishing Co.,
1989), página 134. La detección de los clones deseados se puede
llevar a cabo mediante el uso de del kit de detección "DIG
Luminescent Detection Kit" (producido por Boehringer Mannheim
Co.).
La región del promotor se puede secuenciar, por
ejemplo, según el método de degradación química del ADN de Maxam
-Gilbert (ver Methods in Enzimology, 65, 499, 1980) o el método de
terminación de la cadena mediado por dideoxi de Sanger (ver Gene,
19, 269, 1982).
Para determinar la actividad promotora de la
región del promotor así obtenida a través de los pasos mencionados
anteriormente, se pueden unir un gen indicador, tal como un gen de
\beta-gluclonidasa (GUS), y un terminador, tal
como el terminador del gen de la nopalina sintetasa (NOS), al sitio
corriente abajo de la región del promotor para formar un plásmido
indicador, y se puede medir la actividad del producto traducido del
gen indicador. Como gen indicador y terminador, se pueden utilizar
productos comercialmente disponibles, tal como el plásmido pBI 101
(producido por Clontech Co.).
Para determinar la actividad del promotor en
células de endospermo de las semillas en desarrollo mediante el uso
del plásmido indicador construido anteriormente, se puede emplear
cualquier método conocido (ver Plant Cell Reports, 10, 595, 1992).
Brevemente, se prepara un protoplasto a partir de células de
endospermo de semillas en desarrollo, en el que se introduce el
plásmido indicador según un método conocido, por ejemplo, un método
con polietilenglicol (ver, por ejemplo, Theor. Appl. Genet., 91,
707, 1995; Solicitud de Patente Japonesa Accesible al Público No.
7-184492), y se mide la actividad GUS en las líneas
celulares resultantes.
Utilizando el promotor del gen de la
\beta-amilasa de la presente invención, se
construye un vector de expresión. Después, el vector se introduce
en células vegetales para obtener una planta transgénica.
Como un ejemplo, el vector de expresión
plasmídico para utilizar en la presente invención comprende un gen
de una \beta-amilasa termófila como el gen a
expresar, el promotor de la invención como el factor de control
transcripcional, y un terminador 35S del virus del mosaico de la
coliflor como terminador. Este vector de expresión plasmídico se
introduce en la planta, que de esta manera puede producir la
\beta-amilasa termófila deseada en semillas.
El gen de la \beta-amilasa
termófila que se va unir al promotor puede ser uno derivado de
cualquier organismo o puede ser incluso cualquiera modificado que
se prepara mediante modificación del gen derivado del organismo.
Los inventores de la presente invención, emplean aquí un gen de
\beta-amilasa termófila obtenido a través de
mutación de sitios específicos del gen de la
\beta-amilasa de cebada (ver Solicitud de Patente
Japonesa Accesible al Público No. 7-327681).
Para introducir directamente el plásmido
recombinante en las células vegetales, se puede utilizar cualquier
método de electroporación (por ejemplo, ver Nature, 319, 791, 1986),
métodos con polietilenglicol, métodos de bombardeo con partículas
(por ejemplo, ver Nature, 327, 70, 1987), métodos de perforación con
láser (por ejemplo, ver Barley Genetics VI, 231, 1991), métodos con
Agrobacterium (por ejemplo, ver Plant J., 6, 271, 1994) y otros.
Los inventores de la presente invención, emplearon aquí cebada como
material de ensayo y un método con polietilenglicol utilizando
protoplastos como método de introducir genes.
Los protoplastos de cebada se pueden preparar
preferiblemente a partir de una masa de células (callo) inmaduras
derivadas de un embrión (ver Kihara & Funatsuki, 1995, Plant
Sci., 106: 115-120; Solicitud de Patente Japonesa
Accesible al Público No. 7-213183) o a partir de un
cultivo de células en suspensión con capacidad de regeneración
establecida de esa masa de células inmaduras derivadas de un embrión
(ver Kihara & Funatsuki, 1994, Breeding Sci., 44:
157-160; Funatsuki & Kihara, 1994, Plant Cell
Rep., 13: 551-555; Solicitud de Patente Japonesa
Accesible al Público No. 4-360633), según cualquier
método ordinario de preparación de protoplastos utilizando celulasa
y pectinasa.
Después de la formación de colonias a partir de
los protoplastos, se retiran el medio líquido y la suspensión de
células utilizadas como células nodriza, y las colonias se cultivan
en un medio líquido que contiene un reactivo de selección, tal como
geneticina (G148), higromicina, bialafos o similares. De este modo,
solo crecen en el medio las colonias resistentes.
Las colonias así crecidas se transferirán a un
medio sólido que contiene cualquiera de los reactivos de selección,
geneticina (G148), higromicina, bialafos y otros. El cultivo
adicional en el medio sólido produce callos embriogénicos o
embrioides, que se transfieren entonces a un medio sólido diferente
que no contiene reactivo de selección, resultando en su
regeneración en plantas.
Los individuos de plantas crecidos de este modo
se trasplantan después en macetas y se cultivan allí en condiciones
normales de cultivo, por ejemplo, con una duración del día de 16
horas, a 10000 luxes y a 18ºC, siendo de este modo plantas
transgénicas fértiles.
A partir de las semillas obtenidas de las
plantas, se extrae una \beta-amilasa, que se trata
entonces con calor. La actividad de la enzima tratada con calor se
mide para determinar su termofilia. La actividad amilasa se puede
medir a través de la sacarificación del almidón con la enzima. Los
inventores de la presente invención, emplearon aquí un reactivo de
determinación de amilasa (Diacolor AMY, nombre comercial de un
producto de Ono Pharmaceutical Co.), con el que solo la actividad
de la \beta-amilasa se puede determinar
selectivamente incluso en una pequeña cantidad de una muestra que
contiene la enzima.
Ahora, la presente invención se describirá en
detalle más adelante con referencia a los siguientes ejemplos, que,
sin embargo, no están pensados para restringir el ámbito de la
presente invención.
Se germinaron alrededor de 1000 granos de cebada
(Haruna Nijo) en vermiculita en la oscuridad a 20ºC durante 7 días.
Se cogieron las hojas primordiales (alrededor de 65 g) así crecidas
y se cortaron en trozos pequeños de alrededor de 1 cm de largo, a
partir de los cuales se preparó el ADN cromosómico. Como resultado,
se extrajo alrededor de 1 mg de ADN a partir de 10 g de hojas.
150 \mug del ADN cromosómico preparado en el
Ejemplo 1 se digirieron parcialmente con 1 U de Sau 3AI, a 37ºC
durante 1 hora, y los fragmentos resultantes se fraccionaron
mediante centrifugación en un gradiente de densidad de sacarosa. Se
purificó la fracción que comprendía los fragmentos de alrededor de
18 kb y se insertó en un vector de fago \lambda EMBL3 (producido
por Stratagene Co.). El vector resultante se empaquetó utilizando
Gigapack II Gold (producido por Stratagene Co.) en partículas de
fago \lambda, con las que se transformaron Escherichia coli
XL1-Blue MRA(P2) (producido por Stratagene
Co.).
Un fragmento Eco RV-Hind III
derivado de un gen estructural de \beta-amilasa de
cebada descrito en la Solicitud de Patente Japonesa No.
7-92004, o esto es, el fragmento de ADN que tiene la
secuencia de nucleótidos de la Secuencia Número 2 en la Lista de
Secuencias se marcó con digoxigenina, utilizando
DIG-High Prime (producido por Boehringer Mannheim
Co.), para obtener una sonda.
La placa de la genoteca genómica de cebada
formada en el Ejemplo 2 se transfirió a una membrana de nylon,
"Hybond N" (producida por Amersham Co.), y después se realizó
un screening a través de la hibridación de placa ordinaria
utilizando la sonda preparada en el Ejemplo 3. Para detectar el clon
deseado, se utilizó el kit de detección "DIG Luminescent
Detection Kit" (producido por Boehringer Mannheim Co.). Como
resultado, se obtuvo un clon positivo. Este clon tenía la región
5-terminal del gen estructural de la
\beta-amilasa y la región corriente arriba que
contiene la región del promotor para el gen.
El mapa físico del clon así obtenido se muestra
en la Fig. 1, en la que las abreviaturas indican los sitios que son
reconocidos y cortados por las enzimas de restricción indicadas, las
líneas finas indican las zonas del vector, el área negra indica la
región 5'-terminal del gen estructural de la
\beta-amilasa, y el área blanca indica el sitio
corriente arriba que contiene la región del promotor. La flecha allí
indica la dirección del gen de la
\beta-amilasa.
Del clon positivo obtenido en el Ejemplo 4, se
cortó el fragmento Sal I-Sal I de 2.4 kb compuesto
de la región 5'-terminal del gen estructural de la
\beta-amilasa y la región del promotor. Este
fragmento se insertó en un plásmido pUC119, a partir del cual se
formó un clon de deleción utilizando el kit
Kilo-Sequence Deletion Kit (producido por Takara
Shuzo Co.). Después de esto, la región del promotor se secuenció
según el método de la terminación de la cadena mediada por dideoxi
de Sanger.
El mapa físico del fragmento Sal
I-Sal I de 2.4 kb se muestra en la Fig. 2, en la que
las abreviaturas indican los sitios que son reconocidos y cortados
por las enzimas de restricción indicadas, el área negra indica la
región 5'-terminal del gen estructural de la
\beta-amilasa, y el área blanca indica la zona
corriente arriba que contiene la región del promotor.
La secuencia de nucleótidos de la región del
promotor del gen estructural de la \beta-amilasa
así secuenciada es la Secuencia Número 1 en la Lista de Secuencias.
La secuencia parcial de nucleótidos del fragmento Sal
I-Sal I de 2.4 kb así secuenciado es la Secuencia
Número 3 en la Lista de Secuencias. Comparando la secuencia de
nucleótidos de la región 5'-terminal del gen
estructural de la \beta-amilasa con el gen
estructural de la \beta-amilasa de cebada que ya
se había obtenido (ver Solicitud de Patente Japonesa No.
7-92004), se confirmó que el fragmento obtenido
aquí es un gen de \beta-amilasa. La región del
promotor secuenciada aquí contenía una caja TATA que existe
ampliamente en regiones de promotores en eucariotas.
Se construyó un plásmido indicador según el
método ilustrado en la Fig. 3. Exactamente, se insertó un fragmento
Hind III-Eco RI que contiene el gen GUS y el
terminador NOS de un plásmido pBI 101 (producido por Clontech Co.)
en el sitio Hind III-Eco RI de un plásmido pUC 118
para preparar un plásmido pBI 11.
Por otra parte, se cortó un fragmento Pst
I-Eco RI del fragmento de la Secuencia Número 3 que
está compuesto de la primera hasta la base 1672 de la secuencia de
nucleótidos del clon de deleción producido en el Ejemplo 5, o esto
es, el plásmido compuesto de la región del promotor de la Secuencia
Número 1 y los 341 bp de la región 5'-terminal del
gen estructural de la \beta-amilasa, que contenía
dicha región del promotor. Los extremos del fragmento Pst
I-Eco RI así cortado se hicieron romos, utilizando
un kit para producir extremos romos (producido por Takara Shuzo
Co.), y el fragmento romo se insertó en el sitio Sma I del plásmido
pBI 11 para dar un plásmido indicador pSBG 530.
Además, el fragmento Hind
III-Hind III que codifica el extremo
5'-terminal de la región del promotor de la
\beta-amilasa del plásmido pSBG 530 se eliminó del
plásmido para dar otro plásmido indicador pSBG 530dH.
Se determinó la actividad de la región del
promotor del gen de la \beta-amilasa aislada en
células de endospermo en semillas en desarrollo en un sistema de
ensayo transitorio utilizando los plásmidos indicadores producidos
en el Ejemplo 6.
Primero, las semillas en desarrollo de una
variedad de cebada, Bomi que se habían recogido en alrededor de 14
días a partir de la floración se pelaron para eliminar sus cáscaras,
después se esterilizaron una vez en etanol al 70% y otra vez con
una dilución 1/5 de ácido hipocloroso, y después de esto se lavaron
con agua un total de tres veces. Se extrajo el endospermo de estas,
y se procesó durante la noche con una solución CPW
(KH_{2}PO_{4} 0.2 mM, CaCl_{2} 10 mM, MgSO_{4} 1 mM,
KNO_{3} 1 mM) que contenía celulasa al 0.4%, y manitol al 11%, a
25ºC.
Los protoplastos resultantes se lavaron con la
solución CPW con manitol al 11%, y se dividieron entonces en
secciones plurales de 10^{6} protoplastos cada una por sistema de
transformación. A cada sección de protoplastos, se añadieron 30
\mug del ADN y 200 \mul de una solución C100S (sorbitol al 7%,
CaCl_{2} 10 mM, MES 4.7 mM, pH 5.7) y se resuspendieron. La
suspensión resultante se procesó entonces con 0.5 ml de la solución
C100S (pH 7.0) a la que se había añadido polietilenglicol 1540 al
40%, durante 10 minutos.
A esto se añadieron 10 ml de una solución LW
(ver Lazzeri et al., Theor. Appl. Genet., 81: 437, 1991), y
la mezcla resultante se centrifugó. Al residuo resultante se
añadieron 3 ml de un medio L1 (ver Theor. Appl. Genet., 81: 437,
1991), que se incubó entonces durante la noche a 25ºC. Al cultivo
resultante se le añadieron 20 ml de la solución LW, que se
centrifugó después. El residuo resultante se resuspendió en 200
\mul de extracto de GUS (NaPO_{4} 0.05 M, EDTA 0.01 M,
sarcosina al 0.1%, Triton X-100 al 0.1%
2-mercaptoetanol al 0.1%), y la suspensión se
congeló y se descongeló repetidamente dos veces. Esto se centrifugó,
y el sobrenadante resultante se utilizó como solución de enzima sin
procesar para la determinación de la actividad del promotor.
Exactamente, la solución de enzima sin procesar
obtenida anteriormente se hizo reaccionar con
4-metilumbeliferil-\beta-D-gluclonido,
después se paró la reacción con una solución de carbonato sódico
0.2 M, y se cuantificó el residuo de
4-metilumbeliferil producido, a partir de lo que se
determinó la actividad del promotor. Para cuantificar la proteína,
se utilizó el "Protein Assay" producido por
Bio-Rad Co.
La actividad GUS en cada línea celular se
muestra en la Fig. 4, de la que se confirma que la región del
promotor de la \beta-amilasa era activa en
células de endospermo de semillas de cebada en desarrollo. La
actividad GUS en la línea celular en la que se había introducido
pSBG 530dH disminuyó hasta alrededor de 2/3 de la de la línea en la
que se había introducido pSBG 530, de lo que se confirma que la
región del promotor necesita la secuencia de nucleótidos de
Secuencia Número 1 en la Lista de Secuencias.
Según el método de Kihara & Funatsuki (1994,
Breeding Sci., 44: 157-160) o el método de Funatsuki
& Kihara (1994, Plant Cell Rep., 13: 551-555),
se pusieron embriones inmaduros de una longitud de aproximadamente
0.5 a 1.0 mm de una variedad de cebada, Igri, en medio L2 para
indicación del callo. Después de un mes, los callos así formados se
transfirieron a medio líquido L1 y se cultivaron en el mismo desde 2
a 4 meses agitando el cultivo, mientras eran expuestos a luz débil
(a 500 luxes). De este modo se formó un cultivo líquido en
suspensión que comprendía masas de células con un diámetro de
aproximadamente de 1 a 3 mm.
A 1 g de las células, se añadieron alrededor de
10 ml de una solución de enzima (Celulasa Onozuka RS al 1.0%,
Pectoliasa Y-23 al 0.1%, MES 5 mM disueltos en
solución LW) y la mezcla resultante se dejó inmóvil a 25ºC durante 2
a 3 horas.
La suspensión de protoplastos así obtenida se
filtró a través de una membrana de malla de 64 \mu y de una
membrana de malla de 26 \mu, y después se centrifugó para recoger
los protoplastos. Después, estos se lavaron con una solución LW un
total de tres veces.
A continuación, se resuspendieron de 1 x
10^{6} a 3 x 10^{6} de los protoplastos así obtenidos en 250
\mul de un medio líquido, Ca-S compuesto por un
plásmido pSBG503 (vector de expresión para la
\beta-amilasa termófila ver Fig. 5) 10 \mug/ml,
CaCl_{2} 100 mM, sorbitol 0.6 M y MES al 0.1% y que se había
ajustado a pH 5.7. El plásmido pSBG503 comprendía un gen de
resistencia a kanamicina y un gen de \beta-amilasa
termófila, en el que un promotor de actina de arroz y un terminador
35S del virus del mosaico de la coliflor (35St) estaban unidos al
gen de resistencia a kanamicina mientras que la región del promotor
de la \beta-amilasa de cebada de la Secuencia
Número 1 y un terminador 35S del virus del mosaico de la coliflor lo
estaban al gen de la \beta-amilasa termófila,
cada uno como factor de control transcripcional y terminador,
respectivamente. El gen de la \beta-amilasa
termófila comprendía el primer intrón del gen de la
\beta-amilasa de cebada. A la suspensión
resultante se añadieron gota a gota 600 \mul de
Ca-S que contenía polietilenglicol al 40% y que
había sido ajustado a pH 7.0. Esto se dejó inmóvil como estaba
durante 10 minutos, mientras se agitaba a intervalos de 5 minutos.
Esto se diluyó con 10 ml de una solución LW y se centrifugó después
para recoger los protoplastos.
Los protoplastos así recogidos se resuspendieron
entonces en 1 ml de medio L1 que contenía maltosa 0.6 M,
2,4-D 2.0 mg/litro y agarosa al 1.8%, y se
extendieron inmediatamente sobre una placa Petri de 6 cm para hacer
sobre ella un disco con un diámetro de alrededor de 4.5 cm. Después
de haber solidificado, el sólido resultante se separó de la placa,
y se incubó en 5 ml de un medio líquido (este comprendía los mismos
componentes que los que constituyen el medio utilizado
anteriormente para hacer la suspensión de protoplastos) que contenía
200 mg/ml de una suspensión de células de cebada, con agitación a
una velocidad de agitación de 50 rpm.
15 días después del inicio del cultivo de
protoplastos, se retiraron el medio líquido y la suspensión de
células, y se añadieron 3 ml de un medio líquido que contenía
geneticina (G418) 20 \mug/ml al cultivo de protoplastos. Después,
el cultivo de protoplastos resultante se cultivo adicionalmente
durante 14 días con agitación, resultando en el crecimiento de
colonias resistentes en agarosa y alrededor de ella y también en el
medio líquido.
Las colonias así crecidas se transfirieron a
medio L3 con geneticina (G418) 20 \mug/ml y que contenía, como
hormonas, 2,4-D 0.5 mg/litro y bencilaminopurina
(BAP) 1.0 mg/litro. De 3 a 15 días después de la transferencia, se
encontraron callos embriogénicos o embrioides que crecían en el
medio de selección.
Estos callos o embrioides se transfirieron a
medio L3 sin ningún reactivo de selección pero que contenía
2,4-D 0.5 mg/litro y BAP 1.0 mg/litro. Hasta esta
fase, la incubación se realizó con iluminación débil (a alrededor
de 500 luxes) a 25ºC. Después de alrededor de 3 a 15 días, se
observó regeneración de retoños a partir de los callos o
embrioides. Después de que el desarrollo de los retoños fuera
suficiente, estos se transfirieron a un lugar con luz donde se
expusieron a una luz fuerte de alrededor de 7000 luxes.
Los plantones de cebada así crecidos se
transplantaron a medio L3 que no contenía ninguna hormona, para la
inducción del desarrollo de la raíz. Después de alrededor de un mes,
estas se transfirieron a macetas. Después de haber sido
trasplantadas a macetas, estas se cultivaron allí con una duración
del día de 16 horas, a 10000 luxes y a 15ºC, siendo de este modo un
gran número de plantas transgénicas de cebada. La presencia o
ausencia del fragmento del gen de la
\beta-amilasa termófila en las plantas de cebada
así crecidas se examinó mediante reacción en cadena de la
polimerasa (PCR), que verificó la presencia del fragmento allí.
A partir de las semillas en desarrollo de estas
plantas de cebada, se extrajo una amilasa utilizando un tampón
acetato 50 mM que contenía DTT 10 mM. La enzima así extraída se
trató con calor a temperaturas de entre 50 y 75ºC (variando a
intervalos de 2.5ºC) durante 30 minutos, y se midió la actividad
\beta-amilasa, utilizando Diacolor AMY, para
determinar su termofilia. Los resultados se muestran en la Fig.
6.
Como es evidente de los datos en la Fig. 6, se
verificó que las muestras de semilla, a y b, que tenían ambas el
gen de la \beta-amilasa termófila introducido
contenían la \beta-amilasa termófila deseada allí
acumulada, mientras que la muestra de semilla control, p, derivada
de protoplastos que no tenían el gen de la
\beta-amilasa termófila no la contenían. En
particular, se sabe que la acumulación de
\beta-amilasa termófila en la muestra de semilla,
a, es notable.
Según la presente invención, se proporciona un
método para producir plantas transgénicas empleando un promotor
para un gen capaz de ser específicamente expresado en semillas de
plantas. En particular, la presente invención, ha aclarado la
secuencia de nucleótidos de la región del promotor para un gen de
\beta-amilasa y ha aclarado la actividad del
promotor en semillas en desarrollo. Después de que un gen exógeno
adecuado y un terminador se unan al promotor, el vector resultante
se puede introducir en semillas de cebada u otras plantas,
modificando de este modo intencionalmente las semillas de cebada u
otras plantas. Además, también es posible hacer que las semillas de
la planta transgénica resultante produzcan sustancias exógenas allí.
De este modo, la presente invención proporciona muchas ventajas en
el campo del cultivo selectivo de plantas.
| Secuencia Número: 1 |
| Longitud de secuencia: 1276 |
| Tipo: ácido nucleico |
| Tipo de cadena: doble |
| Topología: lineal |
| Tipo de molécula: ADN |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.5cmSecuencia:
| Secuencia Número: 2 |
| Longitud de secuencia: 1066 |
| Tipo: ácido nucleico |
| Tipo de cadena: doble |
| Topología: lineal |
| Tipo de molécula: ADN |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.5cmSecuencia:
\vskip1.000000\baselineskip
| Secuencia Número: 3 |
| Longitud de secuencia: 2142 |
| Tipo: ácido nucleico |
| Tipo de cadena: doble |
| Topología: lineal |
| Tipo de molécula: ADN |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.5cmSecuencia:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> SAPPORO BREWERIES LTD.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Promotor específico de tejido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> B1342EP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 96 92 2237.1
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
05-07-1996
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 7/191028
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
05-07-1995
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1276
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hordeum vulgare
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip0.5cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1066
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hordeum vulgare
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2142
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hordeum vulgare
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (5)
1. Un método para producir plantas transgénicas,
que comprende transformación de plantas con un vector que comprende
un promotor capaz de expresar un gen introducido en semillas de
plantas, dicho promotor comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1.
2. El método para producir plantas transgénicas
según se reivindica en la reivindicación 1, en donde el gen
introducido es un gen de \beta-amilasa
termófila.
3. El método para producir plantas transgénicas
según se reivindica en las reivindicaciones 1 ó 2, en donde la
planta transgénica es cebada.
4. Una planta transgénica transformada con un
vector según se describe en la reivindicación 1.
5. La planta transgénica según se reivindica en
la reivindicación 4, en donde el gen introducido es un gen de
\beta-amilasa termófila.
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