CN108504682A - 一种Cre/loxP基因删除系统及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种Cre/loxP基因删除系统及其应用。该系统包括植物表达载体I和II；植物表达载体I包括两个同向的loxP位点，所述的同向loxP位点间依次插入有目标基因I的表达元件和NCre的表达元件；植物表达载体II包括两个同向的loxP位点，所述的同向loxP位点间插入有CCre的表达元件。其能够使外源基因在转基因作物的营养生长阶段正常表达，能保持外源基因所带来的优良性状，转基因作物进入生殖生长阶段，发生对外源基因的删除，从而收获无外源基因的果实和种子，消除转基因安全隐患；其还具有高效性和简洁性。

Description

一种Cre/loxP基因删除系统及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种Cre/loxP基因删除系统及其应用。

背景技术

随着生物技术的不断发展，转基因技术现已成为进行基因功能研究和植物遗传改良的重要工具(王根平等，2016)。植物基因工程技术，也被称为遗传转化技术，是指利用重组DNA技术在体外有目的的对外源或者内源基因进行改造和重新组合，借助生物、物理或化学手段将重组DNA插入到受体植物细胞的基因组中，实现重组基因在受体细胞内的稳定表达和遗传，从而达到赋予受体植物新性状的目的(黄珊等，2012)。随着转基因技术的不断发展与成熟，其已广泛应用于农作物的生产及改良中，且越来越多的转基因农作物已经向商品化发展(Griffiths AJF et al.,2005)。

尽管人们对转基因作物的接受度越来越高，但事实上转基因植物的基因组上存在的选择标记基因(通常是抗生素基因或抗除草剂基因)仍然是监管机构和公众所关注的焦点，具有很大争议。这些争议多数是围绕转基因植物对食品安全和环境安全两方面的潜在影响展开的(Yau YY et al.,2012)。因此，如何才能在利用好转基因技术的同时又能解决转基因植物的生物安全性问题，消除公众的忧虑，就成为了现如今亟待解决的问题。目前，已经报道的解决转基因安全问题的技术有很多种，根据其原理和目的大致可分为以下几类：防止基因逃逸的方法，安全标记基因法，基因定点修饰技术，标记基因删除技术。而在标记基因剔除法中，运用最多的就是Cre/LoxP系统。

自1988年，Sauer等首次在小鼠细胞内利用Cre/loxP重组酶系统实现了loxP位点之间基因片段的删除(Sauer B et al.,1987)后，Cre/loxP重组酶系统已经被广泛应用于生物科学领域，包括动物、植物和酵母。罗克明等建立了能高效且彻底删除外源基因的删除系统“Gene-deletor”，但是该系统的局限在于其不能用于杂交体系。为了能将该系统运用于杂交作物当中，将重组酶进行拆分成为解决这个问题的主要办法。葛佳等根据Cre重组酶的结构，选取了五个拆分位点，并且都用内含肽Intein介导，通过比较拆分后的重组活性选出了最佳的拆分位点。将拆分后的无活性的Cre重组酶片段分别构建到两个载体中，通过农杆菌介导的植物转化得到转基因拟南芥，并进行杂交实验，证实了在866位点拆分重组酶Cre，并通过Intein介导拆分后的片段在拟南芥杂交系统中可恢复重组活性，但杂交后的拟南芥种子中仍存在外源基因。

发明内容

为解决上述问题本发明提供一种Cre/loxP基因删除系统，该系统能够高效删除杂交作物种子中的外源基因。

一种Cre/loxP基因删除系统，其特征在于，包括植物表达载体I和II；植物表达载体I包括两个同向的loxP位点，所述的同向loxP位点间依次插入有目标基因I的表达元件和NCre的表达元件，所述NCre的基因序列如SEQ ID No.1所示；植物表达载体II包括两个同向的loxP位点，所述的同向loxP位点间插入有CCre的表达元件，所述CCre的基因序列如SEQID No.2所示。

进一步的，上述植物表达载体II的两个同向loxP位点间还插入有目标基因II的表达元件，该表达元件位于CCre表达元件之前。

进一步的，所述NCre的表达元件包括启动子、NCre基因、内含肽基因In和终止子，所述启动子为花粉特异性启动子或胚珠特异性启动子，所述内含肽基因In的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

进一步的，所述CCre的表达元件包括启动子、内含肽基因IC、CCre基因和终止子，所述启动子为花粉特异性启动子或胚珠特异性启动子，其与控制NCre的启动子不具有同种特异性，所述内含肽基因IC的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

进一步的，所述花粉特异性启动子是指proACA9或proDLL，所述胚珠特异性启动子是指proDD45，proACA9的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，proDLL的核苷酸序列如SEQ IDNo.6所示，proDD45的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示.

进一步的，所述目标基因是抗生物胁迫、抗非生物基因、提高农作物产量或改善农作物品质的目标基因。

进一步的，所述目标基因I和II的表达元件包括，启动子、目标基因和终止子，所述启动子为CaMV35S，其核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

进一步的，所述NCre表达元件的启动子和NCre基因间依次插入有连接肽基因和报告基因，所述CCre表达元件的启动子和CCre基因间依次插入有连接肽基因和报告基因，连接肽为LP4/2A，报告基因为GFP或GUS，所述连接肽基因的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。

上述Cre/LoxP基因删除系统在生产无外源基因的果实或种子中的应用也是本发明的保护范围。

本发明还提供一种利用上述Cre/loxP基因删除系统生产无外源基因的果实或种子的制备方法，包括以下步骤：

(1)构建上述的植物表达载体I和II；

(2)将植物表达载体I导入植物基因组，制备转基因植物I；

(3)将植物表达载体II导入植物基因组，制备转基因植物II；

(4)将转基因植物I和II作为亲本互相杂交，获得无外源基因的果实或种子。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的基因删除系统能够彻底删除两个同向的loxP位点之间的目标基因表达元件、特异性启动子、重组酶基因、内含肽和终止子等所有外源基因，获得无任何外源基因的种子或果实。

1.该删除系统能够使外源基因在转基因作物的营养生长阶段正常表达，因而能保持外源基因所带来的优良性状，在转基因作物进入生殖生长阶段后，即发生对外源基因的删除，从而收获无外源基因的果实和种子，消除转基因安全隐患；

2.该删除系统具有高效性和简洁性，即只需要单一的重组酶Cre和较短的重组酶结合序列(loxP)就能发挥其功能。

附图说明

图1是特异性启动子proACA9、proDLL、proDD45控制的Cre/loxP基因删除系统的植物表达载体构建示意图；

图2是转基因单拷贝纯合拟南芥植株启动子特异性检测，其中，A：转pCCre:nls-ACA9株系启动子特异性检测；B：转pCCre:nls-DLL株系启动子特异性检测；C：转pNCre:nls-DD45株系启动子特异性验证；

图3是转基因单拷贝纯合拟南芥植株的表达量检测，其中，A：转pCCre:nls-ACA9株系CCre基因表达量检测；B：转pCCre:nls-DLL株系CCre基因表达量检测；C：转pNCre:nls-DD45株系NCre基因表达量检测；

图4是转基因拟南芥pCCre:nls-ACA9与pNCre:nls-DD45杂交F₂代植株NCre、CCre、BAR、NPTII基因表达量检测；

图5是转基因拟南芥pCCre:nls-DLL与pNCre:nls-DD45杂交F₂代植株NCre、CCre、BAR、NPTII基因表达量检测；

图6：各杂交组合F2代植株花粉GUS组织化学染色及删除效率统计，其中，A：pCCre:nls-ACA9与pNCre:nls-DD45杂交F2代植株及pCCre:nls-DLL与pNCre:nls-DD45杂交F2代植株花粉GUS组织化学染色；B：各杂交组合F2代植株花粉的GUS酶活定量测定及删除效率的统计。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明进行进一步的说明。

实施例1特异性启动子控制的Cre/loxP基因删除系统

植物表达载体的构建

1.植物表达载体II(pNCre-nls-DD45)的构建

(1)以实验室保存的pNCre-35S(参见专利CN201310052609)为模板，用引物BAR-F(核苷酸序列如SEQ ID No.10所示)和BAR-R(核苷酸序列如SEQ ID No.11所示)进行PCR扩增，得到的BAR片段两端的酶切位点均是BamH I，胶回收以后，连接到用相同的内切酶酶切的pCXSN载体上，经过菌检、酶切验证正向后得到的质粒命名为pCXSN-BAR；

(2)用Hind III和EcoR I酶切重组质粒pCXSN-BAR，得到的35S::BAR::NOS片段连接到用相同的内切酶酶切的pLML-NOS载体上，得到的重组质粒命名为pLML-NOS-BAR；

(3)以PNCre-35S载体为模板，用引物GFP-F1(核苷酸序列如SEQ ID No.12所示)和GFP-LP4-R1(核苷酸序列如SEQ ID No.13所示)进行第一轮PCR扩增，并以第一轮PCR扩增产物为模板，用引物GFP-F1和LP4-R2进行第二轮PCR扩增，得到的片段两端的酶切位点是BamH1和Hind III，胶回收以后，加“A”连接到pMD19载体上，得到的重组质粒命名为pMD19-GFP-LP4；

(4)以pMD19-GFP-LP4载体为模板，用引物GFP-F2(核苷酸序列如SEQ ID No.14所示)和GFP-LP4-R2(核苷酸序列如SEQ ID No.15所示)进行PCR扩增，得到的片段两端的酶切位点是Avr II和Hind III，胶回收以后，加“A”连接到pMD19载体上，得到的重组质粒命名为pMD19-GFP-LP4(Avr II)

(5)以pNCre-35S为模板，用引物nls:NCre-F(核苷酸序列如SEQ ID No.16所示)和In-R(核苷酸序列如SEQ ID No.17所示)进行第一次PCR扩增，并以扩增后的产物为模板，用引物2A/nls:NCre-F(核苷酸序列如SEQ ID No.18所示)和In-R进行第二次PCR扩增，得到的2A/nls:NCre:In片段两端的酶切位点是Hind III和Sac I，胶回收以后，加“A”，之后连接到pMD19载体上，得到的重组质粒命名为pMD19-2A/nls:NCre:In；

(6)用Hind III酶切重组质粒pMD19-2A/nls:NCre:In，得到的2A/nls:NCre:In片段两端均是Hind III酶切位点，连接到用相同的内切酶酶切的pMD19-GFP-LP4(Avr II)载体上，经过菌检、酶切验证正向后得到的质粒命名为pMD19-GFP-LP4/2A-nls:NCre:In；

(7)用Avr II和Sac I酶切重组质粒pMD19-GFP-LP4/2A-nls:NCre:In，得到的GFP-LP4/2A-nls:NCre:In片段连接到用同样内切酶酶切的pLML-NOS-BAR载体上，得到的重组质粒命名为pLML-NOS-BAR-NCre；

(8)以拟南芥DNA为模板，以proDD45-F(Spe I)和proDD45-R(Spe I)为引物扩增DD45启动子片段，扩增出的proDD45片段两端均是Spe I的酶切位点，将其连接到用同样限制酶酶切的pLML-NOS-BAR-NCre载体上，经过菌检和酶切验证正向后得到的重组质粒命名为pNCre-nls-DD45。

2.植物表达载体I(pCCre-nls-ACA9)的构建

(1)以pCXSN载体为模板，用引物NOS-F1(核苷酸序列如SEQ ID No.19所示)和NOS-F2(核苷酸序列如SEQ ID No.20所示)进行PCR扩增，得到的NOS片段两端的酶切位点是PstI和Nco I，胶回收以后连接到用相同内切酶酶切的pCA-LML载体上，得到的重组载体命名为pLML-NOS；

(2)以pCCre-35S为模板(实验室保存)，用引物NPT II-F(核苷酸序列如SEQ IDNo.21所示)和NPT II-R(核苷酸序列如SEQ ID No.22所示)进行PCR扩增，得到的NPT II片段两端的酶切位点均是BamH I，胶回收以后，连接到用相同的内切酶酶切的pCXSN载体上，经过菌检、酶切验证正向后得到的质粒命名为pCXSN-NPTII；

(3)用Hind III和EcoR I酶切上述得到的重组质粒pCXSN-NPT II，经过酶切得到的35S::NPT II::NOS片段连接到用相同的内切酶酶切的pLML-NOS载体上，得到的重组质粒命名为pLML-NOS-NPT II；

(4)以PCMBIA1305.1载体为模板，用引物GUS-F(核苷酸序列如SEQ ID No.23所示)和GUS-LP4-R1(核苷酸序列如SEQ ID No.24所示)进行第一轮PCR扩增，并再以第一轮PCR扩增产物为模板，用引物GUS-F和LP4-R2(核苷酸序列如SEQ ID No.23所示)进行第二轮PCR扩增，得到的片段两端的酶切位点是BamHI和HindIII；胶回收之后，加“A”连接到PMD19载体上，得到的重组质粒命名为PMD19-GUS-LP4；

(4)以pMD19-GUS-LP4载体为模板，用引物GUS-F1(核苷酸序列如SEQ ID No.25所示)和LP4-R2进行PCR扩增，得到的片段两端的酶切位点是Avr II和Hind III，胶回收以后，加“A”连接到pMD19载体上，得到的重组质粒命名为pMD19-GUS-LP4(Avr II)；

(5)以pCCre-35S为模板，用引物2A/Ic-F(核苷酸序列如SEQ ID No.26所示)和CCre:nls-R(核苷酸序列如SEQ ID No.27所示)进行PCR扩增，得到的2A/Ic:CCre:nls片段两端的酶切位点是Hind III和Sac I，胶回收以后，加“A”，之后连接到pMD19载体上，得到的重组质粒命名为pMD19-2A/Ic:CCre:nls；

(6)用Hind III酶切重组质粒pMD19-2A/Ic:CCre:nls，得到的2A/Ic:CCre:nls片段两端均是Hind III酶切位点，连接到用相同的内切酶酶切的pMD19-GUS-LP4(Avr II)载体上，经过菌检、酶切验证正向后得到的质粒命名为pMD19-GUS-LP4/2A-Ic:CCre:nls；

(7)用Avr II和Sac I酶切重组质粒pMD19-GUS-LP4/2A-Ic:CCre:nls，得到的GUS-LP4/2A-Ic:CCre:nls片段连接到用同样内切酶酶切的pLML-NOS-NPTII载体上，得到的重组质粒命名为pLML-NOS-NPT II-CCre；

(8)以拟南芥DNA为模板，以proACA9-F(EcoR I)和proACA9-R(EcoR I)为引物扩增ACA9启动子片段，扩增出的ProACA9片段两端均是EcoR I的酶切位点，将其连接到用同样限制酶酶切的pLML-NOS-NPT II-CCre载体上，经过菌检和酶切验证正向后得到的重组质粒即为pCCre-nls-ACA9。

(9)以同样的方法构建得到的植物表达载体I(pCCre-nls-DLL)。

实施例2转基因拟南芥阳性植株的筛选及鉴定

1.农杆菌的活化

(1)取保存于-80℃的农杆菌菌种，蘸取少量菌液，用接种环划线于YEP固体培养基上；

(2)待长出单克隆后，挑取单菌落于20mLYEP液体培养基中，振荡培养于28℃，180rpm的摇床内16～24h；

(3)取200μL一活菌液接种于250mLYEP培养基中，28℃，200rpm振荡过夜培养，直至菌液OD 600达到1.2左右；

(4)将二活菌液转移至50mL离心管中，4℃，4000rpm离心10min，弃上清；

(5)用等体积的1/2MS重悬液体培养基重悬菌体，使得OD₆₀₀为0.8左右；

(6)28℃，180-200rpm振荡培养2h后，用于转化拟南芥。

2.拟南芥的遗传转化(采用花序侵染法)

(1)拟南芥幼苗培养

取适量野生型拟南芥种子置于2mL离心管中，加入无菌水冲洗2-3次；然后加入1mL75％酒精，消毒30s，用无菌水冲洗干净；然后加入体积分数为10％的NaClO溶液消毒10min，每隔2-3min剧烈震荡种子，使种子与消毒液充分接触；最后用无菌水反复冲洗5-6次，洗净种子表面残留的次氯酸钠溶液；将消毒后的种子均匀铺于1/2MS培养基表面，7天左右长出真叶。

(2)拟南芥的种植

将在1/2MS培养基上生长10天左右的拟南芥幼苗移栽于培养基质(V营养土：V蛭石：V珍珠岩＝6：3：1)中，放置于光照培养箱中，培养条件为23℃，湿度70％，16h光照，8h黑暗培养，30天左右开花，即可用于遗传转化。

(3)转化

将野生型拟南芥的果荚及盛开的花剪除，只留花序进行转化。将活化后的重悬菌液倒入培养皿中，作为转化介质；将只留有花序的拟南芥浸到转化介质内8min，用滤纸吸干表面菌液后，保鲜膜包好，放置于光照培养箱内黑暗培养24小时。

(4)24h后，将转化后的拟南芥置于光照培养箱中，23℃，湿度70％，16h光照8h黑暗培养，30天左右可收种子。

3.拟南芥DNA的提取及鉴定

(1)准备若干2mL灭菌离心管。每管加入1mL CTAB和60uLβ–巯基乙醇，65℃水浴锅预热；

(2)以生长于培养基质15d左右的拟南芥幼苗为样品，取叶片约0.1g置于上述预热的CTAB抽提液中，用组织研磨器将其充分破碎；

(3)于65℃水浴45min，中途间隔轻轻振荡三次混匀，取出后12000rpm/min，离心1min，取上清于另一干净的2ml离心管内；

(4)加入等体积的氯仿︰异戊醇(24︰1)，轻柔颠倒混匀后平放乳化10min。于18℃，12000rpm/min，离心10min。

(5)取上清于新的2mL离心管中，加入等体积-20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，12000rpm/min，离心10min，弃上清；

(6)用750μL无水乙醇再漂洗一次，吸干乙醇，于37℃恒温箱中干燥。

(7)用25-50μL加入RNase的无菌水溶解沉淀，得转基因植物基因组DNA粗提物。

(8)通过PCR扩增的方法鉴定是否为转基因阳性植株。

实施例3转基因拟南芥单拷贝纯合体的筛选与鉴定

1.转基因拟南芥单拷贝纯合体的筛选

(1)收取转化后拟南芥的种子，此代为T1代，干燥后置于4℃冰箱春化3-4天；

(2)消毒后铺于含抗生素的1/2MS培养基表面，10天左右可获得转基因拟南芥；将其栽种于培养基质中，45天左右可收获T2代种子；

(3)将T2代种子继续铺于含有抗生素的1/2MS培养基表面，10天后观察种子的萌发情况，若有3/4萌发，1/4未萌发，则可判断转基因T1代为单拷贝插入；若萌发率远高于3/4，则T1代为多拷贝插入；

(5)选择16株左右单拷贝插入的转基因拟南芥T2代幼苗，栽种于培养基质中，45天左右单株收获T3代种子；

(6)将转基因T3代种子继续铺于含有抗生素的1/2MS培养基表面，10天左右观察种子的萌发情况，若全部萌发，则可确定为单拷贝纯合体。

实施例4转基因拟南芥单拷贝纯合植株启动子特异性验证

1.转基因单拷贝纯合植株GUS组织染色

(1)将拟南芥植株的叶片(花器官、果荚)放入加有适量GUS的离心管中，37℃染色2h；

(2)取出幼苗，在水中洗去GUS染色液，加入适量无水乙醇，60℃脱色15min；

(3)将幼苗取出，置于0.04mol/L盐酸在20％的甲醇中，60℃，处理15min；

(4)将幼苗取出后置于7％的氢氧化钠在60％的乙醇中，室温处理15min；

(5)将幼苗分别置于40％、20％、10％的乙醇中；

(6)5％的乙醇处理15min；

(7)25％的甘油处理15min；

(8)50％的甘油压片。

2.转基因单拷贝纯合植株GFP荧光强度检测

(1)在解剖镜下，用镊子将拟南芥花器官的胚珠剥离；

(2)用荧光共聚焦显微镜观察胚珠的荧光强度；

结果分析：GUS信号只在转基因pCCre-nls-ACA9及pCCre-nls-DLL的花器官中被检测到，而在莲座叶、果荚及幼苗中未检测到GUS信号；GFP信号特异性地在转基因pNCre-nls-DD45单拷贝纯合株系的胚珠中被检测到。

实施例4转基因拟南芥单拷贝纯合植株CCre/NCre基因表达量的检测

1.拟南芥花器官总RNA的提取

(1)称取20～30朵拟南芥的花，放入加有液氮的研钵中，迅速研磨，加入1mLTrizol，剧烈混匀；

(2)室温裂解8-10min，4℃，12000rpm，离心10分钟，取上清液；

(3)加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15秒；

(4)室温乳化2-3min，4℃放置10min，12000rpm，离心15min，取上清液；

(5)加入0.5mL异丙醇，4℃放置10min，12000rpm，离心10min，弃上清液；

(6)用DEPC水处理过的75％乙醇清洗沉淀，7500rpm，离心5min，弃上清液；

(7)室温风干3min左右；

(8)加入约50μL RNase-free water。

2.RNA的反转录

按照TaKaRa公司的反转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNAEraser(Perfect Real Time)说明书进行操作，将得到的总RNA进行反转录，反应产物放在-20℃冰箱备用，反应体系如下所示：

(1)DNA的消化

反应程序为：42℃2min；4℃保存。

2)反转录反应

反应程序为：37℃15min；85℃5s；4℃保存。

3.检测转基因单拷贝纯合植株花器官(CCre/NCre)表达量

(1)以拟南芥AtUBC为内参基因，用qUBC-F和qUBC-R扩增内参基因

(2)以内参基因UBC为对照，用qCCre-F及qCCre-R扩增CCre基因；用qNCre-F及qNCre-R扩增NCre基因。

结果分析：通过实时荧光定量PCR对转基因pCCre-nls-ACA9、pCCre-nls-DLL单拷贝纯合株系花器官中的CCre基因及转基因PCCre-nls-DD45单拷贝纯合株系的NCre基因进行表达水平的检测。结果显示，CCre、NCre基因在上述转基因株系的花器官中均有表达。因此，我们验证了在连接肽LP4/2A的作用下与报告基因GUS融合的CCre基因及和与报告基因GFP融合的NCre基因能在花器官中表达。

实施例5拟南芥的人工杂交

(1)选取未开放的花作为母本，用镊子将多余的花蕾移除，一般只保留最佳的花蕾5个左右；

(2)将花蕾固定在解剖镜视野的正中央，用消毒后的镊子拨松花苞，去掉绿色的花萼，撑开白色花瓣，把淡黄色的雄蕊(共6个)夹掉，只留一个柱头，套袋，以免被飘散的花粉污染；

(3)选择已经完全开放的花作为父本，第二天上午10点左右从杂交父本上用镊子摘取花药，轻轻涂抹在去雄的柱头上，授以父本的花粉，做标记；

(4)3天后柱头伸长，则杂交成功；

(5)杂交成功后，将母本植株上未杂交花蕾去除，30天左右收集杂交种子。

结果分析：我们选取转基因pCCre-nls-ACA9、pCCre-nls-DLL以及pNCre-nls-DD45植株各3个株系进行人工杂交，根据启动子的表达模式，我们设计了相关的杂交组合，为了便于统计我们对各杂交组合内9个杂交株系进行编号，即1-9。

实施例6转基因拟南芥单拷贝纯合植株相关载体基因表达量的检测

1.拟南芥花器官总RNA的提取

2.RNA的反转录

4.检测各杂交组合F2代植株及亲本花器官(CCre/NCre)表达量

(1)以拟南芥AtUBC为内参基因，用qUBC-F和qUBC-R扩增内参基因

(2)以内参基因UBC为对照，用qCCre-F及qCCre-R扩增CCre基因；用qNCre-F及qNCre-R扩增NCre基因；用qBAR-F和qBAR-R扩增BAR基因；用qNPTII-F和qNPTII-R扩增NPTII基因；。

结果分析：由于pCCre-nls-ACA9与pNCre-nls-DD45杂交F2代植株和pCCre-nls-DLL与PNCre-nls-DD45杂交F2代植株CCre、NCre、BAR、NPTII基因的表达水平与对照组(亲本)相比有明显的下调，但各组合内F2代的9个杂交株系间CCre、NCre、BAR、NPTII基因的表达水平无显著性差异。因此，我们从转录水平证实了该系统对外源基因的删除。

实施例7拟南芥的花粉蛋白提取及GUS酶活检测

1.拟南芥花粉蛋白的提取

(1)室温条件下，收集接近100朵盛开的拟南芥的花于1.5ml的离心管中，加入1mlK-HEPES花粉蛋白提取缓冲液；

(2)旋涡震荡仪充分震荡拟南芥的花2-5分钟，充分使花粉与花分开；

(3)4℃,350pm离心1分钟，使花粉沉淀至管底；

(4)用镊子夹取液面上层拟南芥的花残渣；

(5)重复步骤3和4，弃上清液；

(6)将离心管置于冰上，用研磨棒彻底捣碎花粉(如果花粉被完全捣碎，液体将会变成淡黄色)；

(7)加入50ul K-HEPES花粉蛋白提取缓冲液，置于冰上1h；

(8)12000rpm,4℃,离心10min,取上清液至新的离心管中；

(9)重复步骤7和8。

2.GUS酶活性定量检测

(1)用反应终止液将4-MUG母液(1mmol/L)稀释成浓度范围在0-10umol/L的系列标准液，通过测定它们的荧光强度作出一条标准曲线；

(2)取6支试管分别编号，取蛋白样品20μL加入80μL,37℃预热的GUS酶提取液(50mmol/L磷酸钠缓冲液，10mmol/L EDTA，1mmol/L MUG，0.1％Triton X-100，10mmol/Lβ-疏基乙醇)中，再加入100ulMUG底物，37℃温浴。在5min、10min、15min、20min、30min分别取出混合物200uL，加入到800ul的反应终止液中,室温避光保存。

(3)用荧光分光光度计在激发波长365nm、发射波长455nm，狭缝宽度2.5nm条件下，测定不同时间点的荧光值；

(4)酶活力单位定义为：每分钟水解MUG生成1nmol或1mg、1μg、1ng 4-MUG的酶量为一个活力单位，根据定义求出各样品的酶活力。

由于各组合内F2代的9个杂交株系间相关载体基因的表达水平无显著性差异，因此我们随机选取其中3个杂交株系进行后续实验。由图可知，相比于对照组(亲本)而言，pCCre-nls-ACA9与pNCre-nls-DD45杂交F2代植株和pCCre-nls-DLL与pNCre-nls-DD45杂交F2代植株部分花粉检测不到GUS信号。通过上述实验能够定性地说明各杂交组合F2代植株体内发生了对外源基因的删除，为了能准确地计算各组合的删除效率，我们对各杂交组合F2代植株的花器官进行GUS酶活的定量测定并根据各杂交组合GUS酶活数据对删除效率进行统计，统计学分析显示，pCCre-nls-ACA9与pNCre-nls-DD45杂交F2代植株各株系的删除效率分别为：64％，59％，61％；pCCre-nls-DLL与pNCre-nls-DD45杂交组合内各株系的删除效率分别为69％，73％，67％。

SEQUENCE LISTING

<110> 西南大学

<120> 一种Cre/loxP基因删除系统及其应用

<130> 11

<160> 35

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 866

<212> DNA

<213> Bacteriophage P1

<400> 1

atgtccaatt tactgaccgt acaccaaaat ttgcctgcat taccggtcga tgcaacgagt 60

gatgaggttc gcaagaacct gatggacatg ttcagggatc gccaggcgtt ttctgagcat 120

acctggaaaa tgcttctgtc cgtttgccgg tcgtgggcgg catggtgcaa gttgaataac 180

cggaaatggt ttcccgcaga acctgaagat gttcgcgatt atcttctata tcttcaggcg 240

cgcggtctgg cagtaaaaac tatccagcaa catttgggcc agctaaacat gcttcatcgt 300

cggtccgggc tgccacgacc aagtgacagc aatgctgttt cactggttat gcggcggatc 360

cgaaaagaaa acgttgatgc cggtgaacgt gcaaaacagg ctctagcgtt cgaacgcact 420

gatttcgacc aggtaagtct tcttttcctt tactctttac agaaatggta atctcagata 480

tagtaatgga taagatccaa aaatgacact tttaaccaag attgtacgaa gatcttttta 540

aactccattt tttattttga catctaaatt ggatttaact cggccttgct gtattttggc 600

aggttcgttc actcatggaa aatagcgatc gctgccagga tatacgtaat ctggcatttc 660

tggggattgc ttataacacc ctgttacgta tagccgaaat tgccaggatc agggttaaag 720

atatctcacg tactgacggt gggagaatgt taatccatat tggcagaacg aaaacgctgg 780

ttagcaccgc aggtgtagag aaggcactta gcctgggggt aactaaactg gtcgagcgat 840

ggatttccgt ctctggtgta gctgat 866

<210> 2

<211> 336

<212> DNA

<213> Bacteriophage P1

<400> 2

gatccgaata actacctgtt ttgccgggtc agaaaaaatg gtgttgccgc gccatctgcc 60

accagccagc tatcaactcg cgccctggaa gggatttttg aagcaactca tcgattgatt 120

tacggcgcta aggatgactc tggtcagaga tacctggcct ggtctggaca cagtgcccgt 180

gtcggagccg cgcgagatat ggcccgcgct ggagtttcaa taccggagat catgcaagct 240

ggtggctgga ccaatgtaaa tattgtcatg aactatatcc gtaacctgga tagtgaaaca 300

ggggcaatgg tgcgcctgct ggaagatggc gattag 336

<210> 3

<211> 390

<212> DNA

<213> Synechococcus sp.

<400> 3

atgaaatttg ctgaatattg cctgtctttt ggtaccgaaa ttttaaccgt tgagtacggc 60

ccattgccca ttggcaaaat tgtgagtgaa gaaattaatt gttctgtgta cagtgttgat 120

ccagaaggga gagtttacac ccaggcgatc gcccaatggc atgaccgggg agagcaggaa 180

gtattggaat atgaattgga agatggttca gtaatccgag ctacctctga ccaccgcttt 240

ttaaccaccg attatcaact gttggcgatc gaagaaattt ttgctaggca actggacttg 300

ttgactttag aaaatattaa gcaaactgaa gaagctcttg acaaccatcg tcttcccttt 360

ccattacttg acgctgggac aattaaatag 390

<210> 4

<211> 111

<212> DNA

<213> Synechococcus sp.

<400> 4

atggttaaag ttatcggtcg taggtctctg ggcgtgcagc gcatctttga tatcggtctg 60

ccgcaggacc ataactttct gctagccaac ggcgctatcg ctgctaactg c 111

<210> 5

<211> 1236

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 5

acgcaaatct tgaggctgat caaatgatgg aagtaactgg tgacattagc aacacacagt 60

gagaactgag aaaccattgg aagcaagaaa ggatctcaaa caaaaacagt tgttatcatt 120

tcatttgatg atggaatcga atctgagttg tgtttagggt ttctctgggt taatctcagt 180

ctatgtgggc acattttagt cttctacaaa ttataagaca ctcttcactt atttagaagc 240

tcactcatca gaaaagaaaa aaaaaacttt gctcagtctc tcatctgtgt gtttgattat 300

attttcaggc agaaaacttt tttttgttct tgtatttgat tacaattagt taaatattta 360

agacttagta gagataatgc aatctatgta taaaaataga aacaatgatt ggttatgtcg 420

tgcaacccaa gtgaccttaa tgtcgtacac acgttcatca ggttaaaacg aaatttctca 480

gcaacttcac tattctctct gtcacattgt tttattcttt tccattatct ttattggaaa 540

cttgattaga aagaactgat taaggtatga agataattag tgtaccattc ttcacatgat 600

acgaggtgaa caatagtata tcagaatact agaataattt tataagttat aaagatgaat 660

ggtataccac ttattacaaa acgaaaacat agttagatct gagaagaagg aaagattttt 720

gttttaaaaa atgagatggt tagatatatg ccatgttaag agatgccacc atgttcttct 780

tcttcttctt acccggaaaa aactctttct tcttctcttt cccataaaaa gaaacaaaaa 840

aaaactaact tcccacaaat tttgccaaac caaaccaaaa atagtaatga tctcattcaa 900

tttgaaccct ctctccattt tctttcatag ttttttttta gggtaaatca aaatattaat 960

gttggttaga aactcaaaaa ttagtttctc ttttttttct ctgtgattga cagagaggta 1020

agagaaaaaa aagagagaaa gtgtttcggt ttttgttgcc ttctctcgag ttaggccttc 1080

tctcttccgt cacaccatca ttttttttct ccataacgac caaatcataa aaccggtcgt 1140

tcctattttt tctttctctg cgttttttgt ttcgaattct tcaatagaat tttaaaagaa 1200

agaagaaagc tgggtgagac gaaggaagga agaatg 1236

<210> 6

<211> 1631

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 6

tggtttttga ggcaactccc ctttcacata tcatttatac aaaaacacat accatcaact 60

tcaattcctt tcgggacgaa cggtacagat ccagttgcga tgattatatc ttttccggtg 120

ataatattgt caccatattt aaccttttgt gggccctgca aagtgcacaa aagactaaag 180

agtattagga tcaccacata acaacgacct atcatttgga gtttatatag tcaaccaaag 240

acaataacat actgaccaga acagcgccaa accctgtcaa tatgtcaaca ccaagtgcct 300

tcatagaatt ggtgagatta ttcctaattt tggtagccag gttacttgcg tggtcagcca 360

caccttggcg gtcataacca gcagctgaaa cctgttttcc aagggagtca atggaaggaa 420

acaagagtca aggccaggaa gatgatactt gcttcacaat gatttgagat caaaattgag 480

cgtctacaat tgcattctac aggaattttt actacctgca aaccaaaagc cttcatgtga 540

tgttcgttct ggagttccct catcctacca ctaacagcaa gtagagcttt ggaaggcaca 600

cagcctctgt taacgcaagt acctccaaca acatctcctt caatgatagc agttttgagt 660

ccctatacaa cgttatcaaa acaacaatca ctcgatgaga tcatgaatac cgtaaagaaa 720

tacagtaata gctagtacga ttccaaaatt ggcatattga agaagatgtt gcaaagcatt 780

cctgaaccat ctctatcaaa caaagcatat gattccacta tcaatttgat ccagagtatt 840

ggcaaagcat agaatcataa tcgaacttga attcttccta attaataaga ggaagaaaga 900

ggaccttctc gacggcgtgc aatgcagctc catggccacc aactccagct ccgataatga 960

tcaaatcata atcgaatgat ttcgatggag ctccatttcc agcggaagaa gaagcagcgg 1020

cggagacttc gattctccta ctctgaatat ggaaacggca cgaggtcaat tgcttcgacg 1080

gagagaagca aaacgcttct cgccggagtc cacagaaccg gagatttctc ggcgtagaag 1140

gagctgcgtt ggatgaacaa agcgtacgat tcgctaaagg aagcgatgct tgtgagaagg 1200

aaagagaaag aaccgattgc attgtgtacg agagagtgaa tgagagatct gtgtagagaa 1260

aaagggagtg acggagatga caagtctgta ctagtctcac tccgacgagc ggaggcggag 1320

atatcaaagc ggagatgaca cgtgtcacgt ttctcgtctt taaaccggag atttcaaaat 1380

tcccggctat aatatccaac tctgagccca ttgggccttt tatttctcgg tctgcctgac 1440

gttatcttgt gagagccacg tggggaagga gaacggcgaa cagttcaaac ggcagactcc 1500

gacacgtgtg gaaaagcaga acacgtgtca aaagaacgct gttctgtttc acaatcttct 1560

ccttacttgt tgttgaagag agaagtatta acagagaaag agagaagcaa caagtgaaga 1620

aagaaagaaa a 1631

<210> 7

<211> 1031

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 7

ctttgataaa tgttcctcgc tgacgtaaga agacattagt aatggttata atatatagct 60

ttctatgaat gtatggtgag aaaatgtctg ttcactgatt ttgagtttgg aataaaagca 120

tttgcgtttg gtttatcatt gcgtttatac aaggacagag atccactgag ctggaatagc 180

ttaaaaccat tatcagaaca aaataaacca ttttttgtta agaatcagag catagtaaac 240

aacagaaaca acctaagaga ggtaacttgt ccaagaagat agctaattat atctatttta 300

taaaagttat catagtttgt aagtcacaaa agatgcaaat aacagagaaa ctaggagact 360

tgagaatata cattcttgta tatttgtatt cgagattgtg aaaatttgac cataagttta 420

aattcttaaa aagatatatc tgatctagat gatggttata gactgtaatt ttaccacatg 480

tttaatgatg gatagtgaca cacatgacac atcgacaaca ctatagcatc ttatttagat 540

tacaacatga aatttttctg taatacatgt ctttgtacat aatttaaaag taattcctaa 600

gaaatatatt tatacaagga gtttaaagaa aacatagcat aaagttcaat gagtagtaaa 660

aaccatatac agtatatagc ataaagttca atgagtttat tacaaaagca ttggttcact 720

ttctgtaaca cgacgttaaa ccttcgtctc caataggagc gctactgatt caacatgcca 780

atatatacta aatacgtttc tacagtcaaa tgctttaacg tttcatgatt aagtgactat 840

ttaccgtcaa tcctttccca ttcctcccac taatccaact ttttaattac tcttaaatca 900

ccactaagct tcgaatccat ccaaaaccac aatataaaaa cagaactctc gtaactcaat 960

catcgcaaaa caaaacaaaa caaaacaaaa accccaaaaa gaaagaataa tggcttctaa 1020

cacaagtttc c 1031

<210> 8

<211> 538

<212> DNA

<213> Cauliflower mosaic virus

<400> 8

attgtcgttt cccgccttca gtttagcttc atggagtcaa agattcaaat agaggaccta 60

acagaactcg ccgtaaagac tggcgaacag ttcatacaga gtctcttacg actcaatgac 120

aagaagaaaa tcttcgtcaa catggtggag cacgacacac ttgtctactc caaaaatatc 180

aaagatacag tctcagaaga ccaaagggca attgagactt ttcaacaaag ggtaatatcc 240

ggaaacctcc tcggattcca ttgcccagct atctgtcact ttattgtgaa gatagtggaa 300

aaggaaggtg gctcctacaa atgccatcat tgcgataaag gaaaggccat cgttgaagat 360

gcctctgccg acagtggtcc caaagatgga cccccaccca cgaggagcat cgtggaaaaa 420

gaagacgttc caaccacgtc ttcaaagcaa gtggattgat gtgatatctc cactgacgta 480

agggatgacg cacaatccca ctatccttcg caagaccctt cctctatata aggaagtt 538

<210> 9

<211> 86

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> artificial

<400> 9

tccaacgcgg cggacgaggt ggctacccag ctgttgaatt ttgaccttct taagcttcgg 60

gagacgtcga gtccaaccct gggcct 86

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> artificial

<400> 10

gaagatcttc atgagcccag aacgacgccc 30

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> artificial

<400> 11

gaagatcttc cgggatcccg ttaaatctcg gtgacgggca 40

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> artificial

<400> 12

cgcggatcca tgaagactaa tctttttctc tttctc 36

<210> 13

<211> 47

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> artificial

<400> 13

gtagccacct cgtccgccgc gttggagagt tcgtcgtgtt tgtatag 47

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> artificial

<400> 14

cctaggatga agactaatct ttttctc 27

<210> 15

<211> 51

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> artificial

<400> 15

cccaagctta agaaggtcaa aattcaacag ctgggtagcc acctcgtccg c 51

<210> 16

<211> 39

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> artificial

<400> 16

atgcccaaga agaagaggaa ggtgtccaat ttactgacc 39

<210> 17

<211> 45

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> artificial

<400> 17

cccaagcttg agctcctatt taattgtccc agcgtcaagt aatgg 45

<210> 18

<211> 48

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> artificial

<400> 18

aagcttgcgg gagacgtcga gtccaaccct gggcctatgc ccaagaag 48

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> artificial

<400> 19

gaagatcttc cgttcaaaca tttggcaata 30

<210> 20

<211> 38

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> artificial

<400> 20

gaagatcttc ggactagtcc cccgatctag taacatag 38

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> artificial

<400> 21

cgcggatcca tggatggatt gcacg 25

<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> artificial

<400> 22

cgcggatcct cagaagaact cgtcaagaag 30

<210> 23

<211> 33

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> artificial

<400> 23

cgcggatcca tggtagatct gagggtaaat ttc 33

<210> 24

<211> 47

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> artificial

<400> 24

gtagccacct cgtccgccgc gttggacacg tgatggtgat ggtgatg 47

<210> 25

<211> 33

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> artificial

<400> 25

cgcggatcca tggtagatct gagggtaaat ttc 33

<210> 26

<211> 50

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> artificial

<400> 26

aagcttgcgg gagacgtcga gtccaaccct gggcctatgg ttaaagttat 50

<210> 27

<211> 49

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> artificial

<400> 27

aagcttgagc tcctacacct tcctcttctt cttgggatcg ccatcttcc 49

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> artificial

<400> 28

gctaaggatg actctggt 18

<210> 29

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> artificial

<400> 29

ttcactatcc aggttacg 18

<210> 30

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> artificial

<400> 30

ggattgctta taacaccc 18

<210> 31

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> artificial

<400> 31

cgaccagttt agttaccc 18

<210> 32

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> artificial

<400> 32

aacttccgta ccgagccg 18

<210> 33

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> artificial

<400> 33

cccgatgaca gcgaccac 18

<210> 34

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> artificial

<400> 34

tgggcacaac agacaatcg 19

<210> 35

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> artificial

<400> 35

tagcagccag tcccttcc 18

Claims (10)

1.一种Cre/loxP基因删除系统，其特征在于，包括植物表达载体I和II；植物表达载体I包括两个同向的loxP位点，所述的同向loxP位点间依次插入有目标基因I的表达元件和NCre的表达元件，所述NCre的基因序列如SEQ ID No.1所示；植物表达载体II包括两个同向的loxP位点，所述的同向loxP位点间插入有CCre的表达元件，所述CCre的基因序列如SEQID No.2所示。

2.一种如权利要求1所述的Cre/loxP基因删除系统，其特征在于，植物表达载体II的两个同向LoxP位点间还插入有目标基因II的表达元件，该表达元件位于CCre表达元件之前。

3.一种如权利要求2所述的Cre/loxP基因删除系统，其特征在于，所述NCre的表达元件包括启动子、NCre基因、内含肽基因In和终止子，所述启动子为花粉特异性启动子或胚珠特异性启动子，所述内含肽基因In的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

4.一种如权利要求3所述的Cre/loxP基因删除系统，其特征在于，所述CCre的表达元件包括启动子、内含肽基因IC、CCre基因和终止子，所述启动子为花粉特异性启动子或胚珠特异性启动子，其与控制NCre基因的启动子不具有同种特异性，所述内含肽基因IC的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

5.一种如权利要求4所述的Cre/loxP基因删除系统，其特征在于，所述花粉特异性启动子是指proACA9或proDLL，所述胚珠特异性启动子是指proDD45，proACA9的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，proDLL的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，proDD45的核苷酸序列如SEQID No.7所示。

6.一种如权利要求5所述的Cre/loxP基因删除系统，其特征在于，所述目标基因I和II的表达元件包括启动子、目标基因和终止子，所述启动子为CaMV35S，其核苷酸序列如SEQID No.8所示。

7.一种如权利要求6所述的Cre/loxP基因删除系统，其特征在于，所述目标基因是抗生物胁迫、抗非生物基因、提高农作物产量或改善农作物品质的基因。

8.一种如权利要求7所述的Cre/LoxP基因删除系统，其特征在于，所述NCre表达元件的启动子和NCre基因间依次插入有连接肽基因和报告基因，所述CCre表达元件的启动子和CCre基因间依次插入有连接肽基因和报告基因，连接肽为LP4/2A，报告基因为GFP或GUS，所述连接肽基因的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。

9.如权利要求1-8任一项所述的Cre/LoxP基因删除系统在生产无外源基因的果实或种子中的应用。

10.一种利用权利要求1-8任一项所述的Cre/LoxP基因删除系统生产无外源基因的果实或种子的制备方法，包括以下步骤：

(1)构建上述的植物表达载体I和II；

(2)将植物表达载体I导入植物基因组，制备转基因植物I；

(3)将植物表达载体II导入植物基因组，制备转基因植物II；

(4)将转基因植物I和II作为亲本互相杂交，获得无外源基因的果实或种子。