CN106854652A - 一种杨树PtCYP85A3基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种杨树PtCYP85A3基因及应用，所述基因能够提高植物的生物量、果实产量及抗盐耐旱性，本发明通过具体试验将PtCYP85A3基因导入番茄和山新杨中来说明PtCYP85A3基因在控制番茄和杨树的生长发育及抗逆性上起着重要的作用，在植物基因工程及遗传改良基因上均具有重要的应用价值。

Description

一种杨树PtCYP85A3基因及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种杨树PtCYP85A3基因及提高植物的生物量、果实产量及增强植株抗逆性中的应用。

背景技术

杨树是世界上重要的树种之一，在全世界的分布非常广泛，具有生长迅速，材质优良等特点，可以提供板材和造纸原料。杨树的基因操纵也相对容易，因此科学家把它作为一种模式木本植物加以研究(Taylor G，2002)。杨树富含木质纤维素，且多年生，也是作为生物质能源十分理想的原料树种。不久前，杨树的基因组测序工作已经完成(Tuskan GA etal，2006)，科学家们计划在此基础上改造杨树，使之生长更迅速、树冠更小，还致力于培育出纤维素含量更高、木质素含量更低的新品种，从而更有利于纤维素乙醇的生产。

BRs的研究开始于40年前，Mitchell et al从油菜花中提取出某种能使大豆第二节间伸长的物质(Mitchell et al.，1970)。经过对BRs合成突变体和BRs不敏感突变体的一系列分析，现已解了BRs的合成路径。植物甾醇激素的合成与动物激素合成存在不同，动物甾醇激素的前体是胆甾醇，而植物油菜素内酯的合成是以芸苔甾醇为前提。动物甾醇激素和植物甾醇激素在合成路径上的分歧开始于环固醇的形成，这是植物体内特有反应。油菜素内酯的合成可以分为两大步骤，第一步是油菜素内酯合成前体芸苔甾醇的合成，第二步是由芸苔甾醇合成油菜素内酯。

目前已经研究发现了许多油菜素内酯(brassinosteroid，BR)合成缺陷的突变体，如det2(Li et al.，1996；Fujioka et al.，1997)，dwf4(Choe et a1.，1998)，拟南芥cpd(Szekeres et al.，1996)，番茄dwarf(Lycopersicon esculentum；Bishop et al.，1999)，豌豆lkb(Pisum sativum；Nomura et al.，1997，1999)等，研究发现BR的缺乏会缩小地上部分的延伸，降低繁殖力，延迟衰老，改变植物的维管结构和影响光形态建成。通过外源施加BRs可以恢复这些突变体的反常表型。现在广泛认为BRs是一种必不可少的化学信号和植物激素，其内源水平对于维持植物正常的生长发育十分重要。

油菜素内酯作为植物的第六大激素广泛影响着植物的生长发育，尤其促进植物地上部分的生长。近些年的研究发现BRs与作物产量之间有很重大的联系。

水稻突变体d11，d2-1是BRs合成途径上的突变体，d61-1是BRs不敏感突变体。D11编码一个细胞色素P450蛋白，参与6-脱氧香蒲甾醇和香蒲甾醇的供给；d61-1是水稻BRs受体的突变体；D2编码P450蛋白，参与BRs合成的后C6途径。d11突变体表现出水稻种子长度大幅下降，但宽度却与野生型相同，而d61-1，d2的种子也比野生型小，但是其长度和宽度都发生改变。从d11，d61-1，d2-1突变体都改变了种子的大小，说明BRs与种子的大小有某种联系，而种子的大小影响作物的产量，那么说明BRs可能与作物的产量有关(Tanabe et al.，2005)。

DWF4编码油菜素内酯22位的羟化酶，是控制BRs合成的关键基因，已有很多报道将DWF4在植物体内过表达以提高植物体内BRs的含量。比如，在拟南芥中过表达AtDWF4使得过表达株系在光和黑暗下下胚轴比野生型长。成熟期时，转基因过表达植株花序的高度是野生型的35％，角果和分支的总数是野生型的两倍，种子的数目是野生型的59％(Choe etal.，2001)。在水稻中分别过表达玉米和拟南芥的DWF4基因均能提高水稻的分蘖数和种子的产量(Wu et al.，2008)。烟草中过表达拟南芥DWF4使得烟草花序高度是野生型的14％(Choe et al.，2001)。

DWF1是油菜素内酯合成的上游基因，过表达DWF1的研究在水稻和拟南芥中曾涉及到。水稻中过表达DWF1，植株变高，节间弯曲幅度变大，原锥花序变多，第二节间伸长(ZhiHong et al.2005)。但在拟南芥中过表达AtDWF1并没有什么明显表型(Klahre et al.，1998)。拟南芥中过表达AtDWF2，促进植物的营养生长(Kim et al.，2010)。

但是，对于本发明所涉及的杨树PtCYP85A3基因能不能在植物体内过表达以提高植物体内BRs的含量，并进而提高植株的生物量、果实产量及增强植株的抗逆性目前还没有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种杨树PtCYP85A3基因及应用，通过增加内源BRs的含量，提高植物的生物量(如株高和茎粗)、果实产量及抗盐耐旱性等。

为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

一种杨树PtCYP85A3基因，所述基因是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

上述PtCYP85A3基因编码的蛋白质，所述蛋白质是SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

其中，PtCYP85A3基因全长为3274bp，其中包含9个外显子，8个内含子，cDNA全长为1553bp，其中包含长72bp的5’非编码区，长86bp的3’非编码区，该基因编码区长度为1395bp，编码464个氨基酸的蛋白质，疏水氨基酸占43.7％，蛋白分子量为53.65kD，等电点为9.46。

本发明最重要的目的在于提供杨树PtCYP85A3基因的应用，包括提高植物的果实产量及提高其抗逆性，还能够提高木本植物木材生物量，本发明通过在杨树和番茄中的具体实验，验证了可以大大提高杨树和番茄的生物量、果实产量及增强植株抗逆性。其中所述抗逆性包括耐盐性和抗旱性等，但是本文的保护范围并不限于杨树和番茄，在所有的植物中均能起到相同的作用。

上述合成酶基因以及相关基因，均属于本发明保护范围。

含有上述基因的表达载体、重组载体、重组菌株或转基因细胞系，都在本发明的保护范围。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以通过合适的表达体系在外源宿主中表达以得到相应的酶或其他更高的生物活性或产量。

包含本发明所提供的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性，或者提高了产量或优化了蛋白动力学特征或其他致力于得到的性质。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因可以在异源宿主中表达并通过DNA芯片技术了解它们在宿主代谢链中的功能。

包含本发明所提供的核苷酸序列编码的蛋白以及可以合成在功能上与PtCYP85A3相同或类似的核苷酸序列和蛋白。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因可以通过遗传重组来构建重组质粒以获得新型生物合成途径，也可以通过插入、置换、缺失或失活进而获得新型生物合成途径。

包含本发明所提供的非核糖体肽合成酶可以通过缺失、插入或失活来自于相同或不同的非核糖体肽合成酶系统的一个或多个非核糖体肽合成酶结构域、模块或基因而产生新的聚肽化合物。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的片段或基因可以用来构建非核糖体肽合成酶库或非核糖体肽合成酶衍生库或组合库。

本基因还可用在基因工程、蛋白表达、酶催化反应等方面，也可用于寻找和发现用于医药、工业或农业的化合物或基因以扩大PtCYP85A3基因的来源范围，具有较高的应用前景。

本发明具有如下优点：

本发明通过将PtCYP85A3基因导入番茄和山新杨中，结果发现可以显著提高番茄和杨树的生物量(如株高和茎粗)、果实产量及抗盐耐旱性。说明PtCYP85A3基因对于控制番茄和杨树的生长发育及抗逆性起着重要的作用，在林木的基因工程及无性系林业领域具有重要的应用价值，并且此基因可以应用于杨树或者番茄的植物遗传改良。

附图说明

图1是杨树与番茄的氨基酸序列比对结果和系统进化树；其中图1a是杨树与番茄的氨基酸序列比对结果，图1b是系统进化树。

图2是PtCYP85A3在毛果杨中不同组织的表达情况；不同组织中PtCYP85A3表达的(a)RT-PCR和(b)Real-time PCR结果。杨树EF1β基因作为内标，图中，Ap(顶芽)，JL(嫩叶)，ML(成熟叶)，Pe(叶柄)，EP(伸长茎的韧皮部)，EX(伸长茎的木质部)，TP(增粗茎的韧皮部)，TX(增粗茎的木质部)，R(根)。

图3是不同处理时间和处理浓度对PtCYP85A3的表达量的影响。

图4是PtCYP85A3蛋白定位于内质网的情况；图中，(a)杨树叶肉细胞原生质体瞬时表达pA7-YFP、PtCYP85A3-YFP、ER-YFP，pA7-YFP为阴性对照，ER-YFP为阳性对照；(b)ER-CFP和PtCYP85A3-YFP或pA7-YFP共转杨树叶肉细胞原生质体，458nm下观察CFP荧光信号，标尺＝5μm。

图5是PtCYP85A3互补番茄d^x突变体情况；图中，(a)载体模式图；(b-d)野生型、突变体和35S：：PtCYP85A3的表型，1bar＝5cm；b为T0代转基因植株，c和d分别为6周和八周的T1代转基因株系。

图6是过量表达杨树PtCYP85A3的转基因番茄的分子检测和表型；图中，(a)载体示意图；(b)PtCYP85A3转基因番茄的PCR检测结果；(c)PtCYP85A3转基因番茄的RT-PCR检测结果；(d)PtCYP85A3转基因番茄2个月的株高表型，其中WT表示野生型，V表示空载体，L1、L2、L5和L6表示独立的四个转基因株系。

图7是PtCYP85A3转基因杨树的分子检测结果。图中，(a)转化载体示意图；(b)转基因杨树的PCR检测结果；(c)转基因杨树的GUS染色结果；(d)转基因杨树的RT-PCR检测结果。

图8是PtCYP85A3转基因杨树的株高和直径表型；图中，(a)温室中正常生长9周的转基因杨树株高表型，1bar＝20cm；(b)温室中正常生长13周的转基因杨树株高表型，1bar＝20cm；(c)温室中正常生长13周的转基因杨树上、中、下的直径，1bar＝0.5cm。

图9是PtCYP85A3转基因杨树大苗的产量统计图；图中按照顺序依次为株高、直径、节间数、节间长、茎鲜重、叶鲜重、叶干重、叶长和叶宽，n≥6，误差＝±SD，P＜0.01为极显著(**)，P＜0.05为显著(*)。

图10是PtCYP85A3转基因杨树大田表型。图中，(a)WT、L3、L5和L8株高表型，bar＝30cm；(b)WT、L3、L5和L8胸径(左)和地径(右)表型，bar＝10mm；(c-e)WT、L3、L5和L8株高，胸径，地径的统计结果，n＝16，误差＝±SD，P＜0.01为极显著(**)，P＜0.05为显著(*)。

图11是PtCYP85A3转基因杨树的石蜡切片；图中，(a)WT、L3、L5和L8茎的横切面，bar＝1μm；(b-c)WT、L3、L5和L8木质部和韧皮部厚度的统计，n≥4，误差＝土SD，P＜0.01为极显著(**)，P＜0.05为显著(*)。

图12是PtCYP85A3转基因杨树透射电镜结果和木质素纤维素含量测定；图中，(a)WT、L3、L5和L8的透射电镜，bar＝5μm；(b-d)WT、L3、L5和L8细胞壁干物质、纤维素和木质素含量测定；(e)WT、L3、L5和L8细胞壁厚度的统计，n≥70，误差＝±SD，P＜0.01为极显著(**)，P＜0.05为显著(*)。

图13是PtCYP85A3转基因杨树在大田抗盐性试验；图中，中间为野生型WT，左右分别为L3和L8。

图14是PtCYP85A3转基因杨树在大田抗旱性试验；图中，中间为野生型WT，左右分别为L3和L8。

具体实施方式

下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

一、材料与方法：

1.培养基

MS₀培养基：4.43g/L MS salts，20g/L蔗糖，pH值用NaOH调至5.8；

LB培养基：10g/L蛋白胨(Typtone)，5g/L酵母提取物(Yeast Extract)，10g/L氯化钠，固体培养基加入0.8％的琼脂粉；

2.载体构建

设计引物扩增PtCYP85A3全长编码序列，获得一个长约1395bp的DNA片段，然后将其连入SmaI酶切的克隆载体pBlueScript II KS(pKS；Stratagene)中，酶切鉴定，将测序正确的质粒利用XbaI和PstI进行酶切，酶切片段经回收后连入pCAMBIA1301/pCAMBIA2301载体中，其中PtCYP85A3由CaMV 35S(Cauliflower mosaic virus)启动子驱动。构建载体所用引物见表1。

表1

3.核酸片段的回收和连接

核酸片段的回收和连接参照相应试剂盒说明进行：

(1)紫外灯下，切取含所需DNA条带的凝胶块置于1.5mL Eppendorf管中；加入适量溶胶液于55℃温育10min，使凝胶充分溶解于溶液中；

(2)将溶液倒入吸附柱中，室温放置2min，10000rpm离心30s，倒掉收集管中液体；

(3)在吸附柱中加入500μL漂洗液，10000rpm离心30s，倒掉收集管中的液体，重复一次；10000rpm空管离心2min；

(4)吸取30μL 65℃预热的蒸馏水点在吸附柱中央，室温放置2min；

(5)将吸附柱放在1.5mL Eppendorf管中，10000rpm离心2min，收集的液体中即含有回收的目标片段；

(6)取7μL回收的核酸片段(酶切后带有粘性末端)和1μL对应的质粒载体(酶切后带有同样的粘性末端)放到1.5mL的Eppendorf管中，加入1μL的T4DNA Ligase，1μL的10×T4DNA Ligase buffer，16℃连接过夜；

(7)连接产物即可直接用于转化T1或者DH5α菌株。

4.大肠杆菌的转化

(1)DH5α或T1感受态细胞放置冰中融化(或室温片刻，待菌体处于冰水混合状态时迅速插入冰中)，加入目的DNA(质粒或连接产物)轻轻混匀，冰上静置30min；

(2)42℃水浴热激90s，迅速放回冰上并静置2min；

(3)向离心管中加入900μL不含抗生素的无菌LB培养基，混匀后37℃，200rpm复苏60min；

(4)5000rpm离心1min收菌，留取100μL左右上清轻轻吹打重悬菌块(若为蓝白斑筛选，则另外加入50μL X-Gal，10μL IPTG)，混匀并涂布到含相应抗生素LB培养基上；

(5)将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

5.农杆菌的转化

(1)取-80℃保存的农杆菌感受态于冰上融化。每100μL感受态加1μg(体积不大于10μL)质粒DNA混匀，冰上静置30min，液氮1min；

(2)37℃水浴热激5min，迅速放回冰上并静置5min；

(3)加入900μL不含抗生素的无菌LB培养基，于28℃振荡培养2-3h；

(4)6000rpm离心1min收菌，留取100μL左右上清轻轻吹打重悬菌块，涂布于含相应抗生素的LB平板上，倒置放28℃培养箱培养2-3天。

6.质粒的小量提取

(1)取2mL菌液倒入Eppendorf管，12000rpm离心1min；

(2)弃上清，沉淀悬于300μL Solution I中(可适当裂解几分钟)；加入300μLSolution II，轻轻颠倒混匀(室温放置5min)；加入300μL Solution III，轻轻颠倒混匀；

(3)12000rpm离心10min，小心吸取上清液；上清液中加入等体积异丙醇，-20℃沉淀20min；

(4)12000rpm离心10min；弃上清，沉淀加入1mL 75％乙醇洗涤；12000rpm离心2min，弃掉上清；37℃或室温干燥沉淀；

(5)每管中加入30μL无菌水溶解质粒；

(6)0.8％琼脂糖电泳检测质粒。

质粒抽提液成分如下：

Solution I(Resuspension solution)：50mM Tris-HCl(pH 7.5)，10mM EDTA(pH8.0)，RNase A 100μg/mL

Solution II(Lysis solution)：0.2M NaOH，1％SDS

Solution III(Neutralization solution)：1.32M KAc(pH 4.8)

7.质粒的酶切鉴定及电泳

(1)在10μL反应体系中，加入5μL提取的质粒DNA(100-200ng/μL)，1μL相应的酶切Buffer，酶0.5μL(0.5U)，用ddH₂O将体积补至10μL，37℃酶切2-3h；

(2)酶切完后，在反应体系中加入1μL 10×Loading Buffer混匀，在琼脂糖凝胶中电泳完毕，紫外灯下检测。

8.植物基因组DNA的小量法提取

(1)向1.5mL的无菌离心管内加入400μL的DNA提取缓冲液和一颗大小适宜的钢珠；

(2)用剪刀取一片叶组织，放入离心管内，用研磨仪破碎样品(60Hz，60s)；

(3)10000rpm离心10min，取300μL上清液移至另一支新离心管中；

(4)加入等体积(300μL)异丙醇，沉淀10min，然后10000rpm离心10min；

(6)弃上清，沉淀加入1mL 75％乙醇洗涤一次；然后10000rpm离心5min，弃上清，倒扣室温晾干；

(7)加50-100μL H₂O溶解10min以上，然后5000rpm离心1min，收集上清。

100mL DNA提取液成分如下：20mL 1mol/L Tris-HCl(pH 7.5)+250mM NaCl+5mL0.5mol/L EDTA(pH 8.0)+0.5％SDS+75mL H₂O

9.植物总RNA的提取

(1)取适量新鲜植物材料，液氮研磨成粉末移入1.5mL Eppendorf管中；

(2)加入1mL RNAiso Reagent，混匀，室温静置10min；

(3)加入1/5体积氯仿，振荡混匀，室温静置10min；然后4℃，12000rpm，离心15min；

(4)将上层液体转移至新的Eppendorf中，加入等体积异丙醇，4℃静置10min；然后4℃，12000rpm，离心10min；

(5)弃上清，向沉淀中加入1mL的75％乙醇清涤沉淀，12000rpm，离心5min；

(6)RNA沉淀室温下干燥后加30μL DEPC水溶解，2％变性琼脂糖凝胶电泳分析总RNA，-20℃保存。

10.总RNA的反转录

PolyA mRNA第一链反转录采用II Reverse Transcriptase(唯赞生物，南京)反应体系见表2：

表2

移液器轻轻吹打混匀，25℃10min，50℃30min，85℃5min，然后迅速置于冰上。

反转录产物短期内可于-20℃保存，不要反复冻融。反转录产物(或适当稀释后)可直接用于PCR检测。

11.PCR、RT-PCR和Real-time PCR

PCR反应体系见表3：

表3

PCR扩增程序见表4：

表4

Real-time PCR反应体系见表5：

表5

Real-time PCR三步法扩增程序见表6：

表6

12.杨树叶片原生质体转化与荧光蛋白的亚细胞定位观察

(1)吸取酶解液15mL于培养皿中，用3M黑色胶带将杨树的叶片(约40片)粘去下表皮，置于酶解液中，确保被酶解液浸没，23℃黑暗3-4h，转速40rpm轻轻晃动，取部分绿色液体镜检；

(2)酶解后的混合液体用100-200目筛子过滤，用15mL圆底离心管收集过滤后的绿色液体；

(3)4℃，100g离心15min，brake为3；

(5)轻轻吸去上清，加入4mL预冷的W5溶液重悬，4℃，100g离心1min，brake为3；

(6)轻轻吸去上清，加入4mL预冷的W5溶液重悬，冰上静置30min；

(7)取少量原生质体悬液用血球计数板进行计数，用适量W5溶液稀释至细胞浓度2.5×10⁵个/mL；

(8)室温，100g离心1min，brake为3，轻轻吸去上清，用适量MMG溶液重悬；

(9)于2mL离心管中加入10μL质粒(10-20μg)；

(10)加入100μL原生质体，轻轻混匀；

(11)加入110μL PEG溶液，轻轻混匀；

(12)23℃放置30min；

(13)先加入220μL W5溶液，慢慢混匀，然后再加入440μL W5溶液混匀，最后加入880μL W5混匀后室温，100g离心1min；

(14)轻轻吸去上清，用1mL W5溶液重悬，黑暗，23℃放置6-18h；

(15)吸取少量液体，荧光共聚焦显微镜(Zeiss LSM 510META)下观察。

酶解液：1-1.5％cellulase R-10，0.2-0.4％macerozyme R-10，0.4M mannitol，20mM KCl，20mM MES(pH 5.7)，55℃水浴10min，冷却至室温后加入10mM CaCl₂，5mM β-mercaptoethanol，0.1％BSA

PEG溶液(40％，v/v)：1g PEG 4000(Fluka，#81240)，750μL H₂O，625μL 0.8Mmannitol，250μL 1M CaCl₂

W5溶液：154mM NaCl，125mM CaCl2，5mM KCl，5mM Glucose，0.03％MES，用KOH调pH至5.7，高温灭菌

MMG solution：0.4M mannitol，15mM MgCl₂，0.1％MES，用KOH调pH至5.6，高温灭菌

13.杨树的遗传转化(Wang et al.，2011)

(1)接种含有待转化载体的EHA105菌种50mL的LB液体培养基(含Rif 100μg/mL，Kan 50μg/mL)中，28℃摇床培养至OD₆₀₀＝0.5-0.6；

(2)在超净工作台中，将工作菌液转入离心管中，6500rpm离心5min，将收集到的菌体用液体MS₀培养液稀释至终浓度为OD₆₀₀＝0.2-0.4；

(3)取无菌杨树组培苗叶片，去除主叶脉，剪成大小约为1cm×1cm的小块，放入经MS₀稀释的农杆菌悬液中浸泡5-20min，其间可轻摇几次或置于低速摇床中；

(4)将浸泡过的叶片取出置于无菌滤纸上，吸干表面的菌液，转移至共培养培养基，25℃黑暗条件下共培养48h；

(5)用无菌水清洗叶片三次，转移到分化培养基上，24℃培养；

(6)一周后，将外植体转移至筛选培养，7-10天更换一次新鲜的培养基；

(6)筛选培养30天左右，叶片外植体的转化细胞分化出抗性芽，待其长到5-6片叶时，转移到生根培养基上生根。

共培养培养基：MS₀基本培养基+0.01mg/L TDZ+0.2mM/L AS

分化培养基：MS₀基本培养基+0.5mg/L6-BA+0.1mg/L NAA+0.01mg/L TDZ+400mg/LTim

筛选培养基：MS₀基本培养基+0.1mg/L NAA+400mg/L Tim+10mg/L Hyg

生根培养基：MS₀基本培养基+0.1mg/L NAA+10mg/L Hyg

14.番茄的遗传转化(Zhang et al.，2001)

(1)将番茄种子用10％次氯酸钠表面消毒5min，用无菌水清洗3-5次，然后把种子放在无菌滤纸上晾干，播种到MS₀培养基上；

(2)接种含有待转化载体的EHA105菌种30mL的LB液体培养基(含Rif 100μg/mL，Kan 50μg/mL)中，28℃培养至OD₆₀₀＝0.6-0.8；

(3)在超净工作台中，将工作菌液转入离心管中，6000rpm离心5min，将收集到的菌体用液体MS₀培养液稀释至终浓度为OD₆₀₀＝0.3-0.5；

(4)将播种一周的无菌番茄切去下胚轴，从子叶中间劈开，然后把子叶切成三段，放入经MS₀稀释的农杆菌悬液中浸泡3-5min，其间可轻摇几次；

(5)将浸泡过的叶片取出置于无菌滤纸上，将吸附在其表面的菌液吸干后转移至共培养培养基，25℃黑暗条件下共培养48h；

(6)用无菌水清洗材料三次，转移到筛选培养基上，24℃培养，每10天更换一次新鲜的培养基；

(7)筛选培养2个月后，子叶外植体分化出抗性小苗，待地上部分长至2-4cm，将分化的小苗从外植体部位切下，转移到生根培养基上生根。

(8)2-4周后，取样进行PCR检测和GUS染色；

(9)将转基因阳性小苗移栽到花盆中(黑土∶蛭石∶珍珠岩＝3∶1∶1)，放到温室中培养，日温25℃，夜温15-20℃，光照条件(16h光照/8h黑暗)，每隔三天浇灌一次，每隔一周浇灌一次花无缺。

共培养培养基：MS₀基本培养基+1.0mg/L ZT+0.1mg/L IAA+0.1mM/LAS

筛选培养基：MS₀基本培养基+1.0mg/L ZT+0.1mg/L IAA+400mg/L Tim+50mg/LKan

生根培养基：MS₀基本培养基+0.1mg/L IAA+50mg/L Kan

15.GUS组织化学分析

取植物样品放入GUS反应缓冲液中，37℃保温。当显色强度足够后，吸出GUS反应缓冲液，加入75％乙醇脱色，每隔数小时更换一次乙醇。拍摄时使用50％的甘油以防止水分蒸发过快导致材料皱缩。

GUS反应缓冲液：100mM NaH₂PO₄，10mM EDTA，0.5mM K₃[Fe(CN)₆]，0.5mM K₄[Fe(CN)₆]，0.1％Triton X-100，用NaOH调节pH至7.0，临用前加入X-Gluc至终浓度为0.2-0.5mg/mL

16石蜡切片制作基本技术

石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。

16.1取材

根据要求选取相同部位的杨树材料。采下的标本要注意保湿，冲洗干净后截取大小合适(越小越好，体积一般不超过0.5cm)的样品迅速投入固定液中。

16.2固定

FAA固定液(50％或70％乙醇90mL+冰醋酸5mL+37-40％甲醛5mL)固定24h或更长，抽真空使样品沉在底部。固定液的用量通常为材料块的20倍左右，固定时间则根据材料块的大小、厚薄、固定液的穿透速度而定。

16.3脱水、透明和浸蜡

70％无水乙醇(2h)→85％无水乙醇(2h)→95％无水乙醇(2h)→100％无水乙醇(2h)→1/2无水乙醇+1/2二甲苯(2h)→二甲苯(2h)→1/2二甲苯+1/2碎蜡(36℃温箱中过夜，加入少量番红)→浸蜡(次日清晨调高温度至56℃，打开盖子让透明剂蒸发，2h后将石蜡溶液倾去。将植物材料移入高熔点的熔融纯石蜡小烧杯中，2-4h再换一次熔融纯石蜡，2-4h即可进行包埋)；

主要事项：

(1)逐级脱水大约2h，材料小和幼嫩的可以适当缩短时间，材料大和硬的(木质化程度高)脱水时间可以长一些，但在高浓度脱水剂中脱水时间过长，会使材料变脆，不利于切片。

(2)脱水乙醇的用量为材料体积的3-5倍。

16.4包埋、切片和粘片

(1)用牛皮纸或较硬的、光滑的纸折包埋纸盒；

(2)材料包埋：熔融的石蜡到入纸盒中，用在酒精灯上烧热的镊子或解剖针将材料排好(快速，避免石蜡结晶)，然后将包埋纸盒放入冷水中冷却凝固；

(3)修蜡：每块拉一个材料，双面刀片切开；

(4)粘蜡快：2×2×2.5-3cm的长方形木块，长轴一端刻出网格；木块具网格一端浸入已溶化的废石蜡中，蜡块修成下宽上窄的台体，用烧热的解剖针一面贴蜡块的宽面，一面贴木块的蜡面，粘贴后小蜡块四周用烧热的解剖针加固，使之不留缝隙。切面要与刀口平行；

(5)切片：毛笔托接(厚度视材料和需要而定，蜡带视要求切割)；

(6)粘片：干净载玻片→滴蒸馏水(不用明胶就可以)→用解剖针或刀将切片安放在液面上→放于温台上→调整切片→吸水纸吸去多余水分→温台上烤干后置于30℃温箱中24h。

注意事项：

(1)迅速冷却才能使蜡的结晶颗粒更小，利用切片；

(2)冬天切片用熔点较低的蜡(如54℃)，夏天用熔点较高的蜡(如58-60℃)，但低熔点的石蜡容易展平，高熔点的石蜡不容易展平；

(3)载玻片要提前用多聚赖氨酸(母液稀释10×)浸泡5min，过夜晾干。

16.5切片脱蜡、染色、脱水和透明

干燥后的切片→二甲苯(5-10min)→二甲苯(5-10min)→1/2无水乙醇+1/2二甲苯(5-10min)→无水乙醇(5-10min)→95％无水乙醇(5-10min)→85％无水乙醇(5-10min)→70％无水乙醇(5-10min)→50％无水乙醇(5-10min)→蒸馏水→苯胺蓝(2-5min)→蒸馏水洗两遍，然后显微镜观察。

17木质素和纤维素含量测定

17.1细胞壁的分离

(1)称取60-70mg新鲜或冷冻材料于2mL离心管中；

(2)加入1.5mL的70％乙醇，涡旋混匀；

(3)10000rpm离心10min；

(4)弃上清，加入1.5mL氯仿/甲醇(1∶1，v/v)，混匀重悬；

(5)10000rpm离心10min，弃上清；

(6)加入500μL丙酮重悬，于35℃直至丙酮蒸发完(干燥后的样品可室温保存直至进一步处理)；

(7)加入1.5mL0.1M pH 5.0的醋酸钠重悬样品；

(8)盖紧离心管，80℃水浴20min；

(9)冰上冷却，依次加入35μL0.01％NaN₃，35μL淀粉酶(amylase，50μL/mL H₂O；fromBacillus species，SIGMA)，17μL支链淀粉酶(pullulanase，18.7units from bacillusacidopullulyticus，SIGMA)，盖紧离心管，涡旋混匀；

(10)37℃水浴过夜；

(11)100℃水浴10min以终止反应；

(12)10000rpm离心10min，弃上清；

(13)加入1.5mL的蒸馏水，涡旋混匀，离心，弃上清，重复三次；

(14)加入500μL丙酮重悬，于35℃直至丙酮蒸发完(干燥后的样品即分离出的细胞壁，可室温保存直至进一步处理)。

17.2纤维素含量的测定(参考Foster et al.，2010a)

(1)称取2mg的上述处理好的细胞壁物质于2mL离心管中；

(2)加入1mL Updegraffreagent(醋酸∶硝酸∶水＝8∶1∶2，v/v)；

(3)盖紧离心管，涡旋混匀，100℃水浴30min(溶解除结晶纤维素以外的不溶物质)；

(4)冰上冷却至室温，10000rpm离心15min，弃上清(为防止把样品倒出，可保留150μL上清)；

(5)加入1.5mL的蒸馏水，涡旋混匀，离心，弃上清，重复三次；

(6)加入1.5mL的丙酮，涡旋混匀，离心，弃上清，重复三次；

(7)于35℃干燥直至丙酮蒸发完；

(8)加入175μL72％硫酸(将结晶纤维素完全溶解为葡萄糖)；

(9)室温放置30min，涡旋后再静止15min；

(10)加入825μLH₂O，涡旋混匀；

(11)10000rpm离心5min(管底可能仍有部分棕色不溶物质木质素)；

(12)利用蒽酮比色法测定上清中的葡萄糖含量，用1mg/mL葡萄糖母液(存储在零度)绘制标准曲线，制备重复的0，2，4，6，8，10μg的标准样品，即分别加入0，2，4，6，8，10μL的母液，用水补到100μL；

(13)每个样品取100μL上清，加入900μL H₂O，混匀后取100μL加入96孔的聚乙烯微量滴定板中，每组三个重复；

(14)加入200μL新鲜配置的蒽酮溶液(2mg蒽酮/mL浓硫酸)；

(15)80℃烤箱中放置30min(样品由黄色变成蓝绿色)；

(16)取出冷却至室温，混匀；

(17)使用酶标仪读取625nm下的吸光值；

(18)利用葡萄糖标准曲线计算出每个样品的葡萄糖含量，即样品中纤维素的含量。

17.3木质素含量的测定(参考Foster et al.，2010b)

(1)称取1-1.5mg的上述处理好的细胞壁物质于2mL离心管中，留一个空管作为对照；

(2)加入250μL的丙酮，收集细胞壁物质于管底，自然干燥直至丙酮蒸发完；

(3)沿着管壁小心翼翼加入100μL新鲜准备的溴乙酰溶液(25％v/v acetylbromide in glacial acetic acid)；

(4)盖好管盖，50℃水浴2h；

(5)50℃再水浴1h，并且每15min涡旋一次；

(6)冰上冷却至室温；

(7)依次加入400μL 2M氢氧化钠和70μL新鲜准备的0.5M盐酸羟胺(hydroxylaminehydrochloride)，涡旋混匀；

(8)用冰醋酸补齐至2mL，涡旋混匀；

(9)取200μL于96孔紫外微量滴定管中，使用酶标仪读取280nm下的吸光值；

(10)利用下面的公式计算出溶液中所含的木质素：

其中，abs代表吸光值，coefficient(Poplar＝18.21；Grasses＝17.75；Arabidopsis＝15.69)。

二、试验步骤

1.PtCYP85A3基因表达分析：通过生物信息学分析从已测序杨树品种(毛果杨)中克隆PtCYP85A3基因。提取毛果杨根、茎、叶等不同组织和不同发育阶段的茎，以及茎不同部位(表皮和木质部)的总RNA，通过RT-PCR技术分析PtCYP85A3在毛果杨中的组织表达特性；同时不同浓度BRs处理后毛果杨幼苗的总RNA，分析PtCYP85A3对BRs的响应。

2.PtCYP85A3蛋白的亚细胞定位：通过荧光蛋白PtCYP85A3-YFP标记的融合蛋白，以及同内质网定位的marker融合蛋白(ER-CFP)的共定位实验，利用杨树叶肉细胞原生质体瞬时转化，研究PtCYP85A3在杨树细胞中的定位。

3.PtCYP85A3功能分析：通过PtCYP85A3分别互补拟南芥(cyp85a2-2)及番茄(d^x)的CYP85A突变体；并且用PtCYP85A3的过表达载体转化拟南芥，分析转基因拟南芥的表型；通过这些实验来确认PtCYP85A3基因是否具有和草本植物相似的生物学功能。

4.构建可以在作物中大量表达的基因表达载体，将目的基因PtCYP85A3分别置于强力组成型表达启动子2×CaMV35S启动子之下，构建成带有潮霉素抗性基因Hyg和卡那霉素抗性基因NPTII的双元载体。

5.借助农杆菌介导的方法将上述基因表达载体导入作物(番茄为卡那霉素抗性，杨树为潮霉素抗性)中，并在启动子的带动下，使目的基因在转基因作物中大量表达；根据基因表达载体上的筛选标记基因筛选具卡那霉素抗性的转基因番茄植株和潮霉素抗性基因的转基因杨树植株。

6.对抗性植株进行PCR检测外源基因是否整合入基因组中；对目的基因纯合株系进行PCR、GUS染色、RT-PCR和real-time PCR检测外源基因的表达水平。

7.PtCYP85A3对番茄和杨树生长发育的影响：PtCYP85A3过表达明显的转基因杨树移到土里进行表型分析，观察叶片、株高、直径、生物量和生长速率的变化；测定表型明显转基因杨树中BRs的含量(叶片)，研究內源BRs含量的变化对杨树生长发育的影响。

8.PtCYP85A3对杨树茎发育的影响：用组织切片的方法研究转基因杨树茎中韧皮部、形成层和木质部的变化；测定转基因杨树中细胞壁组分(纤维素、木质素和各种细胞壁糖类)含量的变化；通过透视电镜观察纤维细胞壁厚度的变化；通过这些实验来研究BRs对杨树次生发育的影响。

9.转基因杨树的田间试验：对生物量、生长速度、或抗逆性明显提高的转基因杨树，向国家林业局申请转基因杨树中试申请，在田间自然状态或盐碱地中进行田间试验来检测转基因杨树性状的稳定性。

三、试验结果

1、比对结果表明PtCYP85A3与拟南芥、水稻、番茄等CYP85A具有很高的相似性，其中同AtCYP85A2相似性高达68.52％；系统进化树分析表明PtCYP85A3同AtCYP85A2位在同一个分支(图1)。我们通过同源序列比对，在杨树中发现了三个与番茄DWARF功能同源的基因，分别命名为PtCYP85A1(XP_002305393)，PtCYP85A3(XP_002330918)和PtCYP85A4(XP_002316079)，氨基酸序列比对如图1a所示。Genebank序列号如下：Arabidopsis thalianaAtCYP85A1(BAB60858.1)和AtCYP85A2(BAC55065.1)，Pisum sativum PsCYP85A1(BAF56235.1)和PsCYP85A6(BAF56236.1)，lycopersicon esculentum LeCYP85A1(DWARF，AAB17070.1)和LeCYP85A3(BAD98244.1)，Oryza sativa OsCYP85A1(BAC45000.1)，Vitisvinifera VvCYP85A1(ABB60086.1)，Populus trichocarpa PtCYP85A1(XP_002305393)，PtCYP85A3(XP_002330918)和PtCYP85A4(XP_002316079)。其中六个底物识别位点SRS(sixsubstrate recognition sites)，Pro-rich motif、a dioxygen binding domian、a Glu-X-X-Arg motif、a Heme binding domain这些区域十分保守。

其中PtCYP85A3与AtCYP85A2相似性高达91.40％，与LeCYP85A1相似性高达94.18％。PtCYP85A3具有细胞色素P450氧化酶比较保守的结构域：Pro-rich motif、adioxygen binding domian、a Glu-X-X-Arg motif、a Heme binding domain。

系统进化树如图1b所示，PtCYP85A3同AtCYP85A2和LeCYP85A1均在一个分支上，具有很高亲缘关系。PtCYP85A3基因全长为3274bp，其中包含9个外显子，8个内含子，cDNA全长为1553bp，其中包含长72bp的5’非编码区，长86bp的3’非编码区，该基因编码区长度为1395bp，编码464个氨基酸的蛋白质，疏水氨基酸占43.7％，蛋白分子量为53.65kD，等电点为9.46。

2、分别提取生长三个月的毛果杨各组织的总RNA，通过RT-PCR和Real-time PCR，分析PtCYP85A3在杨树不同组织部位的转录本分布情况。结果表明PtCYP85A3在顶芽、嫩叶、成熟叶、叶柄、伸长茎的韧皮部和木质部、增粗茎的韧皮部和木质部、根等各组织中的均有表达，且在幼嫩的组织中表达量较高，尤其在嫩叶中表达量最高(图2)。

3、提取经100nM BL处理不同时间和经不同浓度处理30分钟的杨树组培苗的总RNA，并且反转录后用RT-PCR和Real-time PCR的方法分析了PtCYP85A3相对表达量的变化。结果显示PtCYP85A3的表达量随着处理时间的增加和处理浓度的增加均表现出了明显下降趋势(图3)，说明PtCYP85A3在毛果杨中受到BRs的反馈负调节。

4、构建PtCYP85A3-YFP融合载体，以pA7-YFP为空白对照，以ER-YFP(Nelson etal.，2007)为内质网定位的正对照，利用PEG方法转化杨树叶肉细胞的原生质体，融合蛋白在组成型的35S启动子的驱动下瞬时表达，并可在激光共聚焦显微镜下观察其亚细胞定位。通过烟草表皮细胞和杨树原生质体瞬时表达体系表明PtCYP85A3定位于内质网(图4)。

5、PtCYP85A3可以部分互补番茄(d^x)突变体(图5)。

6、将PtCYP85A3基因构建于植物表达载体上，并利用根癌农杆菌介导转入小番茄Micro-TOM中，获得了4个独立的转基因株系，分子鉴定结果如图6所示。

7、过表达PtCYP85A3能够提高转基因番茄产量和生物量。

过量表达PtCYP85A3对番茄的生物量和产量的影响，其统计结果见表7。

表7过量表达PtCYP85A3对番茄的生物量和产量的影响

在两个月的时候测量株高，生殖生长早期统计开花数、第一节间长、第二节间长和叶柄长；三个月时统计地上鲜重、果实数、单株产量和单果鲜重。n＝6，误差＝±SD，P＜0.01为极显著(**)，P＜0.05为显著(*)。从统计结果可知，过量表达PtCYP85A3可以促进番茄的生物量和产量。

8、将PtCYP85A3基因构建于植物表达载体上，并利用根癌农杆菌介导转入杨树中，获得了8个独立的转基因株系。PCR分子鉴定证明了这些基因在杨树基因组中整合，RT-PCR分析证明在多个转基因株系中PtCYP85A3基因在RNA水平上过量表达(图7)。

9、人工气候室盆栽杨树各种指标的表型。

人工气候室盆栽杨树的株高和直径见图8，生物量统计见表8，并且表8中的所有数据均为生长13周的杨树测量结果，其中直径和节间长均为中部测量结果，叶长叶宽叶柄均为成熟展开叶片。n＝6，误差＝±SD，P＜0.01为极显著(**)，P＜0.05为显著(*)。结果表明，过表达PtCYP85A3能够提高杨树的生物量。

表8过表达PtCYP85A3对杨树的生物量的影响

注：表中，株高、叶长、叶宽、叶柄的单位为cm，直径、节间长的单位为mm，茎鲜重的单位为g。

根据RT-PCR结果从八个转基因株系中挑选出表达量最高的L5株系和表达量中等的L3和L8株系，重新移栽一批至温室中，待正常生长至13周时，统计分析株高等各项生物量指标(图9)。

10、PtCYP85A3在杨树中的过表达能够增加转基因杨树中BRs的含量。

分别取生长三个月的杨树嫩叶(因为PtCYP85A3在嫩叶中表达量最高)，每个株系随机抽取三棵独立的单株，然后用液氮研磨成粉，利用干冰邮寄至武汉绿剑可瑞信科技有限公司，委托第三方进行油菜素内酯含量的测定，结果见表9，从统计结果可以看出，PtCYP85A3在杨树中的过表达能够增加转基因杨树中BRs的含量。

表9 PtCYP85A3转基因杨树BRs含量测定结果

11、PtCYP85A3基因能够使杨树的生物量显著增加。

PtCYP85A3转基因杨树大田表型见图10，图10中生物量的表型证明PtCYP85A3基因在杨树中的过表达能够增加杨树株高和茎粗，并且通过PtCYP85A3转基因杨树的石蜡切片(图11)和PtCYP85A3转基因杨树透射电镜结果和木质素纤维素含量测定结果(图12)，可以得出，PtCYP85A3基因能够使杨树的生物量显著增加，尤其是木质部的合成。

12、将野生型和两个转基因株系(L3和L8)分别种植在盐碱地和旱地中，观察其耐盐抗旱性，发现转基因杨树在盐碱和干旱情况下其生物量仍较野生型增加(图13和图14)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 鲁东大学

<120> 一种杨树PtCYP85A3基因及应用

<130> 2017

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1553

<212> DNA

<213> Populus trichocarpa

<400> 1

agagcatttc gataacacta gcagctcttt ccgaggcggg cttggagctg tttttcttcc 60

ttggaagcat caatggcagt tctcttgatg gttcttgtgg cagttctctt tttgttctgt 120

atctcctctg ctttgttgag gttgaacgag gtgagatata ggaagaaagg gttgcctcca 180

ggtactatgg gatggccagt ctttggagag accactgagt ttctaaagca aggtccaaac 240

ttcatgaaga atcagagagc aaggtatggg agtattttca aatcccacat tctggggtgt 300

cctaccattg tgtccatgga tccagagctc aatcgataca tcctaatgaa cgagggaaag 360

ggccttgttc ctggttaccc tcagtccatg ctggatatct taggcaatcg caacattgca 420

gcagttcatg gctccactca caagtacatg agaggggcat tattatccct cattagcccc 480

accatgatca gagaacaact tttgccaaca attgatgagt tcatgagaac ccacctcagc 540

tactgggata ccaaaattat tgacattcaa caaatgacta aggagatggc acttctctct 600

gcacttaagc aaattgctgg cactgattcg tgctcaatat ctcaagcatt catgcctgag 660

tttttcaggc tggttttagg cactttgtca ttgccaattg accttcctgg cacaaattat 720

cgacaaggag tccaggcgag aaaaaatatt gtacgcatgt taaggcagct aatagacggg 780

aggagggcat cgaaattata ccaccaggac atgcttggtc gacttatgag aactgaagaa 840

aacaaattta aactaacaga tgaagagata attgatcaaa taatcacaat tttgtactct 900

ggctacgaaa cggtttcgac cacttcaatg atggcagtca agtatctgca tgatcaccca 960

agagttcttc aggagctaag aaaagagcat ttcgcaatta gagaaaagaa aaggcctgag 1020

gatccaatcg atttaaatga ccttaaatcg atgcgtttta ctcgtgccgt gatttttgag 1080

acctcaagat tggctacaat agtaaatggg gttttgagga agactactaa agaaatggaa 1140

ctaaatagat ttgtgattcc aaaaggatgg agaatctacg tttacacaag ggagataaac 1200

tatgatccat atttatatcc tgacccattc tcctttaacc catggagatg gctggacaaa 1260

agtttggagt ctcaaaacta tctcttcatt tttggaggag gtaccaggca gtgtccagga 1320

aaggagctag gaatagctga gatttcaact ttccttcatt attttgtaac tagatacaga 1380

tgggaagagg ttggaggaga ctcattaatg aaatttccaa gagttgaagc accaaatggg 1440

ctacacatta gggtctcatc tcactaacta ataataacct atgcatgtac agaagagaga 1500

gagatatagc atatcagagc tgataatgat gttctaacat gttagaaagt gaa 1553

<210> 2

<211> 464

<212> PRT

<213> Populus trichocarpa

<400> 2

Met Ala Val Leu Leu Met Val Leu Val Ala Val Leu Phe Leu Phe Cys

1 5 10 15

Ile Ser Ser Ala Leu Leu Arg Leu Asn Glu Val Arg Tyr Arg Lys Lys

20 25 30

Gly Leu Pro Pro Gly Thr Met Gly Trp Pro Val Phe Gly Glu Thr Thr

35 40 45

Glu Phe Leu Lys Gln Gly Pro Asn Phe Met Lys Asn Gln Arg Ala Arg

50 55 60

Tyr Gly Ser Ile Phe Lys Ser His Ile Leu Gly Cys Pro Thr Ile Val

65 70 75 80

Ser Met Asp Pro Glu Leu Asn Arg Tyr Ile Leu Met Asn Glu Gly Lys

85 90 95

Gly Leu Val Pro Gly Tyr Pro Gln Ser Met Leu Asp Ile Leu Gly Asn

100 105 110

Arg Asn Ile Ala Ala Val His Gly Ser Thr His Lys Tyr Met Arg Gly

115 120 125

Ala Leu Leu Ser Leu Ile Ser Pro Thr Met Ile Arg Glu Gln Leu Leu

130 135 140

Pro Thr Ile Asp Glu Phe Met Arg Thr His Leu Ser Tyr Trp Asp Thr

145 150 155 160

Lys Ile Ile Asp Ile Gln Gln Met Thr Lys Glu Met Ala Leu Leu Ser

165 170 175

Ala Leu Lys Gln Ile Ala Gly Thr Asp Ser Cys Ser Ile Ser Gln Ala

180 185 190

Phe Met Pro Glu Phe Phe Arg Leu Val Leu Gly Thr Leu Ser Leu Pro

195 200 205

Ile Asp Leu Pro Gly Thr Asn Tyr Arg Gln Gly Val Gln Ala Arg Lys

210 215 220

Asn Ile Val Arg Met Leu Arg Gln Leu Ile Asp Gly Arg Arg Ala Ser

225 230 235 240

Lys Leu Tyr His Gln Asp Met Leu Gly Arg Leu Met Arg Thr Glu Glu

245 250 255

Asn Lys Phe Lys Leu Thr Asp Glu Glu Ile Ile Asp Gln Ile Ile Thr

260 265 270

Ile Leu Tyr Ser Gly Tyr Glu Thr Val Ser Thr Thr Ser Met Met Ala

275 280 285

Val Lys Tyr Leu His Asp His Pro Arg Val Leu Gln Glu Leu Arg Lys

290 295 300

Glu His Phe Ala Ile Arg Glu Lys Lys Arg Pro Glu Asp Pro Ile Asp

305 310 315 320

Leu Asn Asp Leu Lys Ser Met Arg Phe Thr Arg Ala Val Ile Phe Glu

325 330 335

Thr Ser Arg Leu Ala Thr Ile Val Asn Gly Val Leu Arg Lys Thr Thr

340 345 350

Lys Glu Met Glu Leu Asn Arg Phe Val Ile Pro Lys Gly Trp Arg Ile

355 360 365

Tyr Val Tyr Thr Arg Glu Ile Asn Tyr Asp Pro Tyr Leu Tyr Pro Asp

370 375 380

Pro Phe Ser Phe Asn Pro Trp Arg Trp Leu Asp Lys Ser Leu Glu Ser

385 390 395 400

Gln Asn Tyr Leu Phe Ile Phe Gly Gly Gly Thr Arg Gln Cys Pro Gly

405 410 415

Lys Glu Leu Gly Ile Ala Glu Ile Ser Thr Phe Leu His Tyr Phe Val

420 425 430

Thr Arg Tyr Arg Trp Glu Glu Val Gly Gly Asp Ser Leu Met Lys Phe

435 440 445

Pro Arg Val Glu Ala Pro Asn Gly Leu His Ile Arg Val Ser Ser His

450 455 460

Claims (7)

1.一种杨树PtCYP85A3基因，其特征在于，所述基因是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述杨树PtCYP85A3基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质是SEQID No.2所示的氨基酸序列。

3.含有权利要求1所述杨树PtCYP85A3基因的载体。

4.权利要求1所述杨树PtCYP85A3基因在提高植物果实产量及增强植株抗逆性中的应用。

5.权利要求1所述杨树PtCYP85A3基因在提高木本植物的木材生物量中的应用。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗逆性包括耐盐性和抗旱性。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物包括番茄和杨树。