ES2283311T3 - Aislamiento y caracterizacion de un promotor de beta-tubulina especifico de fibras procedente de algodon. - Google Patents
Aislamiento y caracterizacion de un promotor de beta-tubulina especifico de fibras procedente de algodon. Download PDFInfo
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Abstract
Un promotor que es específico de fibras de algodón, que comprende un fragmento de 1433 kb del promotor del gen de la tubulina-beta de algodón CFTUB2 que posee la secuencia de Sec ID Nº: 2.
Description
Aislamiento y caracterización de un promotor de
\beta-tubulina específico de fibras procedente de
algodón.
La presente invención se refiere al campo de la
biología molecular vegetal, en particular a plantas transgénicas y
promotores útiles en la creación de plantas transgénicas, y más
particularmente a promotores específicos de fibras.
El algodón es la fibra natural más utilizada en
la industria textil. La producción anual del algodón en todo el
mundo es de alrededor de 100 millones de balas valorados en 45.000
millones de dólares americanos. Aunque se han realizado mejoras
significativas en la calidad y el rendimiento de las fibras por
medio de cultivo clásico en las últimas décadas, el potencial para
mejorar todavía más las propiedades de las fibras a través del
cultivo clásico es limitado debido a los requisitos de
compatibilidad de especies y rasgos disponibles. La ingeniería
genética proporciona nuevos enfoques para mejorar más el algodón
introduciendo genes para crear nuevos germenplasmas con
características altamente deseables.
Las fibras de algodón (pelos de semilla) son
tricomas monocelulares que sufren un alargamiento rápido y
sincrónico. Los microtúbulos corticales proporción la información
espacial necesaria para la alineación de las microfibrillas de
celulosa que confinan y regulan el alargamiento celular [Giddings y
Stalehelin, 1991; Cyr y Palevitz, 1995; Fisher y Cyr, 1995]. El
desarrollo de las fibras consiste en cuatro etapas solapantes (es
decir, inicio, formación de la pared celular primaria, formación de
la pared celular secundaria y maduración) [Basra y Malik, 1984].
Las tubulinas y las actinas pueden desempeñar papeles funcionalmente
importantes en el desarrollo de las células de las fibras. La fibra
madura es un compuesto biológico de celulosa, agua, cantidades
pequeñas de proteínas, pectinas, hemicelulosa, sustancias
minerales, cera, cantidades pequeñas de ácidos orgánicos, azúcares
y pigmentos que proporcionan una capacidad de desgaste y una
estética excelentes [Arthur, 1900; Basra y Malik, 1984; Roser,
1985]. Para la diferenciación y el desarrollo de las fibras se
requieren muchos genes. Estos genes se expresan de forma diferente
durante las diferentes etapas del desarrollo de la fibra y, hasta
ahora, únicamente se han identificado algunos de los genes
implicados en la biosíntesis del gran número de proteínas
estructurales específicas de la fibra, enzimas, polisacáridos, ceras
o ligninas [John y Crow, 1992; John, 1996a; Song y Allen, 1997; Ma
y col., 1997; Hawai y col., 1998; Whittaker y Triplett, 1999]. Se
puede considerar que estos genes aislados poseen una potencial
aplicación en la mejora de las fibras de algodón debido al carácter
de su expresión específica de las fibras. Por ejemplo, John ha
estado usando promotores de genes específicos de fibras para
producir algodón mediante ingeniería genética para obtener fibras
alteradas [John, 1996b, 1997a, 1997b].
Un promotor es un fragmento de ADN que determina
la especificad temporal y espacial de la expresión génica durante
el desarrollo de plantas y animales. Durante la última década se han
identificado y aislado muchos genes específicos de tejido y sus
promotores de una amplia variedad de plantas y animales, incluidos
algunos genes y promotores específicos de tejido (Loguerico y col.,
1999; Kawai y col., 1998; Song y Allen, 1997; Ma y col., 1997;
John, 1996a; Rinehart y col., 1996; Hasenfratz y col., 1995; John y
Peterson, 1994; John y Crow, 1992). Se ha demostrado que unos pocos
promotores controlan la expresión génica de forma específica de
fibra en algodón (Rinehart y col., 1996; John, 1996a; John y Crow,
1992). Se pueden usar algunos promotores específicos de tejidos
vegetales para expresar proteínas extrañas en tejidos específicos en
un patrón regulado por el desarrollo [John, 1996b, 1997a,
1997b].
Un gen específico de fibra (denominado CFTUB2),
que codifica la tubulina-\beta, se ha aislado de
algodón. El ADNc completo aislado de CFTUB2 es de 1,623 kb de
longitud, incluyendo 1,338 kb de marco de lectura abierto. Según la
secuencia de ADNc de CFTUB2 del algodón se han aislado dos
fragmentos promotores de CFTUB2 (1,433 kb y 0,984 kb). Los dos
fragmentos promotores de CFTUB2 (1,3 y 0,9 kb) se fusionaron con el
gen GUS para construir vectores de expresión génica para analizar
la función del promotor. Las plantas de algodón y tabaco
transgénicas con los genes fusionados de promotor de CFTUB2/GUS se
identificaron mediante hibridación de tipo Southern. En todas las
plantas de algodón transgénicos estudiadas sólo se detectó actividad
GUS en fibras jóvenes, pero no en los órganos de las flores, como
las anteras, los pétales y los sépalos, ni en las hojas y las
raíces. Este resultado, junto con el análisis de tipo Northern,
indica que el promotor de CFTUB2 es específico de las fibras en
algodón. El promotor controla la expresión génica específica a nivel
transcripcional en las fibras de algodón. El promotor aislado puede
usarse para mejorar las fibras de algodón y crear nuevas variedades
de algodón con una elevada calidad de fibra y rendimiento mediante
manipulación génica.
La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos
del ADNc del gen de CFTUB2 de algodón, (1623 pb; SEC ID Nº 1).
La Figura 2 muestra la secuencia de nucleótidos
del fragmento del promotor de CFTUB2 aislado de 1433 pb (SEC ID Nº
2). El fragmento de 984 pb corresponde a los nucleótidos
449-1433 de esta secuencia.
La Figura 3 muestra constructos del promotor de
CFTUB2 fusionado con el gen GUS en los vectores de expresión.
El promotor de CFTUB2 es un promotor activo
específico de fibras en algodón. Los resultados de un análisis de
tipo Northern de los ADNc de una variedad de tejidos de algodón
mostraron que un clon de ADNc que comprende un gen de CFTUB2 se
expresaba fuertemente en fibras jóvenes de 8 y 14 días después de la
antesis (DPA) y también se expresaba en óvulos jóvenes de 4, 8 y 14
DPA, pero menos o nada en los demás tejidos. La secuenciación del
clon de ADNc reveló que poseían una longitud de 1623 pb que contiene
un marco de lectura abierto de 1338 pb (Figura 1). Al comparar las
secuencias nucleotídicas y polipeptídicas previstas del algodón
CFTUB2 con los bancos de datos, se encontró que el ADNc de CFTUB2
compartía una homología del 96-98% a nivel de los
aminoácidos y una homología de aproximadamente un 78% a nivel
nucleotídico con los ADNc de la \beta-tubulina y
de genes de otras plantas (como Arabidopsis, tabaco, arroz,
soja, maíz, patata, zanahoria, etc.) [Liaud y col., 1992; Snustad y
col., 1992; Villemur y col., 1994; Tonoike y col., 1994; Taylor y
col., 1994; Kang y col., 1994; Okamura y col., 1997; Chu y col.,
1998; Okamura y col., 1999].
Los transcritos del gen de CFTUB2 exhibieron la
acumulación más elevada en fibras jóvenes de algodón de 8 DPA y
después se observó una disminución visible en la acumulación de los
productos génicos (ARNm) con el posterior desarrollo de las fibras.
La comparación de la expresión génica en diferentes etapas del
desarrollo de óvulos de algodón también mostró que los transcritos
génicos se acumulaban más en los óvulos de 8 DPA que en los de 4 y
14 DPA y se produjo una disminución gradual y visible a un nivel
indetectable en la acumulación de productos génicos con desarrollo
de fibras de 8 DPA a 28 DPA. Esto sugiere que el gen se expresa de
forma específica con una estricta regulación a nivel
transcripcional durante el desarrollo de fibras y óvulos de
algodón, como ocurre con otros genes específicos de fibras de
algodón [Whittaker y Triplett, 1999; Shin y Brown, 1999; Kawai y
col., 1998; John 1996a; Song y Allen, 1997; Ma y col., 1997;
Rinehart y col., 1996; John y Crow, 1992].
Dos fragmentos en la región promotora se
aislaron y clonaron en el vector pGEM-T,
respectivamente. Un fragmento del promotor de CFTUB2 era de 1433 pb
de longitud (Figura 2) y otro era de 984 pb de longitud. Ambos
fragmentos funcionaban como promotores activos específicos de
fibra. Los constructos del gen de fusión del promotor de CFTUB2/GUS
se usaron para transformar el tabaco y el algodón mediante
transferencia génica mediada por Agrobacterium, usando el
vector pBI121 que contiene el gen de fusión del promotor CaMV35S/GUS
como control positivo. Consistente con los resultados del análisis
de tipo Northern, el gen GUS inducido por el promotor de CFTUB2 fue
expresado específicamente en las fibras jóvenes, pero no en otros
tejidos, en las 31 plantas de algodón transgénico estudiadas,
mientras que la actividad GUS se detectó en todos los tejidos de
plantas de algodón control positivo (35S:GUS). Se obtuvo un total
de 36 plantas de algodón transformadas y se transplantaron en tierra
para su crecimiento y maduración. De igual forma, se encontró que
bajo la actividad de CFTUB2, la actividad del gen GUS sólo se
detectaba en las semillas de las demás 15 plantas de tabaco
transgénicas estudiadas, lo que sugiere que la actividad del
promotor CFTUB2 también era específica de tejido en plantas de
tabaco (la fibra de algodón, siendo un pelo elongado del
recubrimiento de la semilla, presenta una correspondencia
histológica en el recubrimiento de la semilla de tabaco). Este
resultado, junto con el análisis de tipo Northern, indica que el
promotor de CFTUB2 controla la expresión génica específica a nivel
transcripcional en las fibras de algodón.
De acuerdo con esto, una forma de realización de
la presente invención es un promotor específico de fibras que
comprende un fragmento activo de 1433 kb del promotor génico de
CFTUB2 de la fibra de algodón.
Otra forma de realización de la presente
invención es un promotor específico de fibra que comprende un
fragmento activo de 984 kb del promotor génico de CFTUB2 de la
fibra de algodón que posee la secuencia de nucleótidos 449 a 1433
de la SEC ID Nº 2. Un fragmento activo es una secuencia de longitud
más corta que la SEC ID Nº 2, que mantiene aun actividad como
promotor específico de fibra en el algodón. Un fragmento puede
comprender escisiones, deleciones, truncamientos o sustituciones de
la secuencia de SEC ID Nº 2, o una combinación de las mismas. Un
fragmento activo preferido es el fragmento que consiste en los
nucleótidos 449-1433 de la SEC ID Nº 2.
Los promotores de la presente invención son
útiles en la creación de algodón transgénico con las características
de la fibra alteradas. El uso de promotores específicos de fibra de
la presente invención permite la expresión selectiva de un transgén
en la fibra de algodón, lo que permite mayor latitud en los tipos de
transgenes empleados. La expresión selectiva evita problemas, tales
como la carga metabólica impuesta sobre la planta transgénica
mediante la expresión sistémica de un transgén, o los efectos
adversos de la expresión de un transgén en los tejidos que no son
fibras. Los ejemplos para expresar los genes deseables en la fibra
de algodón, pero no en otras partes de las plantas de algodón,
incluyen; (1) genes de antocinina para algodón coloreado, (2) genes
de proteínas de seda del gusano de seda o de arañas para incrementar
la resistencia de la fibra de algodón, (3) y biosíntesis de
polihidroxibutirato en la fibra de algodón para mejorar las
propiedades térmicas y las características de aislamiento [John y
col., 1996]. Existen numerosos ejemplos en la técnica de genes
potenciadores de fibras que podrían estar vinculados de forma
beneficiosa a los promotores de la presente invención y usarse para
transformar el algodón usando técnicas bien conocidas (véase, por
ejemplo, Umbeck, 1992), para obtener la expresión del transgén
en fibras de algodón transgénico. Véase, por ejemplo, John
1996b, 1997a, 1997b; John y col., 1996.
\newpage
Ejemplo
1
Las semillas de algodón se esterilizaron en
superficie con etanol al 70% durante 30-60 segundos
y de H_{2}O_{2} al 10% durante 30-60 minutos,
seguido por lavado con agua estéril. Las semillas germinaron en
medio ½ MS con luz a 28ºC en un cuarto de cultivo, y los
cotiledones e hipocotilos cortados de plántulas estériles se usaron
como materiales de explante de transformación. Las plantas de
algodón se cultivaron en macetas para la extracción de ADN y
ARN.
El ARN total se extrajo de fibras jóvenes,
ovarios, anteras, pétalos, sépalos, hojas y raíces de algodón usando
el método del tiocianato de guanidinio o el sistema de aislamiento
de ARN total SV (Promega). El Poli(A) + ARN se purificó
usando columnas de SPIN de oligo(dT)-celulosa
de un kit de purificación de ARNm (Pharmacia Biotech). El ADNc del
algodón se sintetizó usando un kit de síntesis de ADNc (Pharmacia
Biotech). Se construyeron bancos de ADNc de algodón insertando los
fragmentos de ADNc en el vector de expresión ZAP (Stratagene).
El poli(A) + ARN de fibras jóvenes de
algodón de aproximadamente 8 y 14 días después de la antesis (DPA),
respectivamente, se convirtieron a ADNc que se usaron para construir
bancos de ADN de algodón. De los bancos de ADNc de las fibras, de
forma aleatoria se escogieron 200 clones de ADNc y, posteriormente,
se secuenciaron. Algunos clones con potencial implicación en la
expansión celular se seleccionaron de acuerdo con los datos de la
secuencia.
Para encontrar clones de ADNc cuyos transcritos
se expresan específicamente en fibras de algodón, el patrón de
expresión de los clones de ADNc seleccionados se analizó mediante
hibridación de tipo Northern con ARN total aislado de fibras de
algodón, óvulos, anteras, pétalos, sépalos, cuadros, hojas y raíces,
usando sondas de los clones. Las muestras de ARN de los diferentes
tejidos de algodón se separaron en geles de
agarosa-formaldehído y se transfirieron a membranas
de nailon Hybond-N mediante transferencia capilar.
Las transferencias de tipo Northern de ARN se hibridaron en
solución ExpressHyb (Clontech) a 68ºC con sondas de ADNc ^{38}P
preparadas mediante marcaje aleatorio (Promega
Prime-a-Gen Labelling System). Tras
la hibridación, las transferencias se lavaron a 68ºC en SSC X 0,1,
SDS al 0,5% durante 30-60 minutos. Los resultados
experimentales mostraron que un clon de ADNc se expresaba
fuertemente en fibras jóvenes de 8 y 14 DPA y también se expresaba
en óvulos jóvenes de 4, 8 y 14 DPA, pero menos o nada en otros
tejidos.
Los fragmentos de la PCR y los fragmentos del
ADNc se subclonaron en vectores y un plásmido de ADN preparado con
un kit de plásmidos Qiagen se usó como moldes en las reacciones de
la PCR. Los productos de la PCR se secuenciaron mediante un
autosecuenciador. La secuenciación del clon de ADNc reveló que tenía
una longitud de 1623 pb que contiene un marco de lectura abierto de
1338 pb e idéntico al gen de la \beta-tubulina
(Figura 1). Este es el primer clon de ADNc de CFTUB2 aislado del
algodón. La comparación de las secuencias nucleotídicas y
polipeptídicas previstas del algodón CFTUB2 con los bancos de datos,
se encontró que el ADNc de CFTUB2 compartía un
96-98% de homología a nivel aminoacídico y alrededor
de un 78% de homología a nivel nucleotídico con los ADNc conocidos
de la \beta-tubulina y los genes de otras plantas
(tales como Arabidopsis, tabaco, arroz, soja, maíz, patata,
zanahoria etc.) [Liaud y col., 1992; Snustad y col., 1992; Villemur
y col., 1994; Tonoike y col., 1994; Taylor y col., 1994; Kang y
col., 1994; Okamura y col., 1997; Chu y col., 1998; Okamura y col.,
1999].
Los ARN totales de diferentes tejidos de algodón
se usaron para la transcripción inversa de los ADNc de primera
cadena que se usaron como moldes en las reacciones de PCR
diferencial. El análisis de la reacción diferencial se llevó a cabo
usando un kit de reacción diferencial (Clontech). El ADNc de primera
cadena se sintetizó con 2 pg de ARN total como materiales de
partida de la transcripción inversa y oligo(dT) como
cebadores a 42ºC durante 1 hora. Las reacciones de PCR de
diferencial se llevaron a cabo con un ciclo inicial consistente en
94ºC durante 5 minutos, 40ºC durante 5 minutos y 68ºC durante 5
minutos, seguido por dos ciclos consistentes en 94ºC durante 2
minutos y 40ºC durante 5 minutos y 68ºC durante 5 minutos, y después
25 ciclos consistentes en 94ºC durante 1 minuto y 60ºC durante 1
minuto y 68ºC durante 2 minutos, y una extensión final a 68ºC
durante 7 minutos.
Las bandas de la reacción diferencial objetivo
se escindieron y reamplificaron para su posterior análisis. Los
productos de la reacción diferencial específicos de fibra y
reproducibles se eligieron para su posterior análisis. Se recolectó
el ADNc en cada banda diana y se regeneró mediante amplificación por
PCR. El ADNc aislado fue subclonado posteriormente en vectores y
secuenciado.
El análisis de tipo Northern mostró que los
transcritos del gen CFTUB2 exhibían una elevada acumulación en
fibras jóvenes de algodón de 8 DPA y, a continuación, una
disminución visible en la acumulación de los productos génicos
(ARNm) con el posterior desarrollo de las fibras. La comparación de
la expresión génica en diferentes etapas del desarrollo de los
óvulos de algodón también mostró que los transcritos génicos se
acumulaban más en óvulos de 8 DPA que en los de 4 y 14 DPA, y se
produjo una disminución gradual y visible hasta un nivel
indetectable en la acumulación de productos génicos con desarrollo
de fibras de 8 DPA a 28 DPA. Esto sugiere que el gen se expresa
específicamente con una estricta regulación a nivel transcripcional
durante el desarrollo de las fibras de algodón y los óvulos, como
se ve con otros genes específicos de la fibra de algodón [Whittaker
y Triplett, 1999; Shin y Brown, 1999; Kawai y col., 1998; John,
1996a; Song y Allen, 1997; Ma y col., 1997; Rinehart y col., 1996;
John y Crow, 1992].
\newpage
Ejemplo
2
Según la secuencia seleccionada del ADNc de
CFTUB2, el promotor de CFTUB2 se aisló de los bancos de algodón de
Walker mediante PCR de Genoma Walker.
Se extrajo el ADN total de las hojas de las
plantas de algodón y se purificó usando el siguiente método. A 4 g
de los tejidos de las hojas se añadió N_{2} líquido y las hojas se
homogeneizaron a fondo. A los tejidos homogeneizados en un tubo de
50 ml se añadieron 20 ml de tampón de extracción helado (63 g/l de
glucosa, Tris. HCl 0,1 M (pH 8,0), EDTA 5 mM, 20 g/l de
PVP-40, 1 g/l de DIECA, 1 g/l de ácido ascórbico, 2
ml/l de betamercaptoetanol) y se centrifugaron a 2500 rpm durante
15 minutos. Después de eliminar el sobrenadante, a cada tubo se
añadieron 10 ml de tampón de lisis. Los precipitados resuspendidos
se incubaron a 65ºC durante 30 minutos. A cada tubo se añadieron 10
ml de cloroformo, se mezclaron con las muestras y se centrifugaron a
3500 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se transfirió a un
tubo limpio y se repitió la extracción con cloroformo otra vez. El
sobrenadante se transfirió a un tubo limpio y a cada tubo se
añadieron 0,6 volúmenes de isopropanol para la precipitación del
ADN. Después de centrifugar a 3500 rpm durante 30 minutos, el ADN se
lavó con etanol al 70%. A continuación el ADN genómico aislado se
disolvió en agua estéril o TE (Tris HCl 10 mM, EDTA 1 mM) para
usar.
Los bancos de ADN genómico de algodón se
construyeron a partir de hojas de plantas de algodón. El ADN se
digirió parcialmente con BamH I y los fragmentos de ADN se
clonaron en el sitio de BamH I del vector de expresión ZAP
(Stratagene).
Los bancos de Genome Walter se construyeron
usando el kit Universal Genome Walter (Clontech). El ADN genómico
de las hojas de las plantas de algodón se digirió con cinco enzimas
de restricción respectivamente y, después, se purificó mediante
fenol/cloroformo y se precipitó con etanol. El ADN digerido se unió
a los adaptadores de Genome Walker. Se llevaron a cabo,
sucesivamente, dos rondas de reacciones de PCR de Genome Walker. En
la PCR principal se usó como molde 1 \mul de cada banco de ADN de
Genome Walker y los productos de la PCR principal se usaron como
moldes en la PCR secundaria. LA PCR comenzó a 95ºC durante 1 minuto,
seguido por 35 ciclos consistentes en 95ºC durante 15 segundos y
68ºC durante 4 minutos, y una extensión final a 68ºC durante 6
minutos. Las bandas de PCR diana se cortaron y purificaron mediante
el kit Geneclean (Bio 101).
Se aislaron dos fragmentos en la región
promotora y se clonaron en el vector pGEM-T,
respectivamente. En la figura 2, un fragmento del promotor de
CFTUB2 era de una longitud de 1433 pb y otro de una longitud de 984
pb. En los extremos 5' y 3' del fragmento del promotor de CFTUB2 de
0,9 kb del algodón se crearon respectivamente un sitio Hind III y
un sitio BamH I mediante el método de la PCR. Inicialmente, el
fragmento Hind III/BamH I se subclonó en el vector
pGEM-T (Promega). El ADN del plásmido que contiene
el fragmento del promotor de CFTUB2 se digirió con Hind III y Bamh
I y el fragmento digerido se aisló mediante electroforesis en gel de
agarosa. Mediante inserción del fragmento, sustituyendo el promotor
CaMV de 35S, en los sitios Hind III/BamH I del vector pBI121 se
generó un constructo quimérico de promotor de CFTUB2/GUS.
El fragmento del promotor de CFTUB2 BamH I/BamH
I de 1,3 kb se subclonó inicialmente en el vector
pGEM-T (Promega). El ADN plasmídico que contenía el
fragmento del promotor de CFTUB2 se digirió con BamH I y el
fragmento digerido se aisló mediante electroforesis en gel de
agarosa. Mediante inserción del fragmento en el sitio BamH I del
vector pBI101 se generó un constructo quimérico de promotor de
CFTUB2/GUS.
Ejemplo
3
Con el fin de caracterizar la función del
promotor de CFTUB2 en la expresión específica de fibras del gen de
CFTUB2, 1,3 kb del fragmento y 0,9 kb del fragmento del promotor de
CFTUB2 se fusionaron con la secuencia codificadora de gus en el
vector de expresión génica pBI101 o pBI121 (delecionando el promotor
CaMV35S), respectivamente (Figura 3). Los constructos del gen de
fusión del promotor de CFTUB2/GUS se usaron para transformar tabaco
y algodón mediante transferencia génica mediada por Agrobacterium,
usando el vector pBI121 que contiene la fusión del promotor de
CaMV35S/GUS como control positivo. El promotor CaMV35S es activo en
todos los tejidos del algodón y de otras plantas y es un promotor
constitutivo [Odell y col., 1985; Ow y col., 1987; McCabe y
Martinell, 1993]. Un vector binario que contenía un gen de fusión
del promotor de CFTUB2/GUS o el control promotor CaMV35S/Gus se
transfirió a la cepa LBA 4404 de Agrobacterium tumefaciens.
Los explantes de algodón para la transformación se obtuvieron de
plántulas de algodón cultivadas como en el Ejemplo 1. El material
de explante de tabaco se obtuvo de plántulas de tabaco. Las semillas
de tabaco se esterilizaron en superficie con etanol al 70% durante
30-60 segundos y con HgCl_{2} al 0,1% durante 15
minutos, seguido por lavado con agua estéril. Las semillas
germinaron en medio ½ MS con luz a 28ºC en un cuarto de cultivo se
cortaron las hojas de las plántulas estériles para usar como
explantes para la transformación. Los explantes de cotiledón y de
hipocotilo y de algodón u los explantes de hoja de tabaco se
transformaron mediante Agrobacterium, con los vectores y las
plantas transformadas se trasplantaron a tierra en invernadero para
su crecimiento hasta la madurez.
\newpage
Las hojas de tabaco se cortaron en trozos de
alrededor de 2 x 2 cm y se sumergieron en suspensión de
Agrobacterium durante 5 minutos. Los explantes de tabaco
infectados se cultivaron en medio MS con 1 mg/l 6-BA
durante 48 horas a 28ºC y después se transfirieron en medio MS de
selección que contenía 100 mg/l de kanamicina y 1 mg/l de
6-BA durante 20-30 días para
seleccionar los brotes transformados (brotes resistentes a
kanamicina). Los brotes transformados se cortaron desde los callos
y se enraizaron en medio MS con 50-100 mg/l de
kanamicina. Las plantas de tabaco transformadas se transplantaron a
tierra en invernadero para su crecimiento hasta la madurez.
El cotiledón y el hipocotilo se usaron como
explantes para la transformación de algodón. Las semillas de algodón
se esterilizaron en superficie con etanol al 70% durante 30
segundos y de H_{2}O_{2} al 10% durante 60 minutos, seguido por
lavado con agua estéril. Estas semillas se incubaron en agua estéril
a 28ºC. Después de la noche, las semillas brotaron. Se extrajeron
los embriones y se introdujeron en el medio IM (1/2 (MS
(macronutrientes, micronutrientes, EDTA-Fe) + 10
mg/l de VB1 + 1 mg/ml de VB6 + 1 mg/l de VPP + 100 mg/l de
mioinositol) + 2 g/l de fitogel pH = 6,4) a 28ºC durante 7 días. El
cotiledón y el hipocotilo de algodón se usaron como explantes para
la transformación. Después de cortar en piezas de 5 mm^{2} (mm),
los explantes se empaparon en la suspensión de la cepa LBA 4404 de
Agrobacterium tumefaciens (DO_{600} =
0,2-0,4) durante 15 minutos. A continuación, los
explantes se colocaron en medio CM (MS (macronutrientes,
micronutrientes, EDTA-Fe) + 10 mg/l de VB1 + 1
mg/ml de VB6 + 1 mg/l de VPP + 100 mg/l de mioinositol) +
2,4-D 0,1 mg/l + KT 0,1 mg/l + 30 g/l de glucosa +
0,7 mg/l de MgCl_{2} + 2 g/l de fitogel pH = 6,4) a 24ºC durante 2
días. Después de lavar con medio MS líquido, los explantes se
introdujeron en el medio SM (MS (macronutrientes, micronutrientes,
EDTA-Fe) + 10 mg/l de VB1 + 1 mg/ml de VB6 = 1 mg/l
de VPP + 100 mg/l de mioinositol + 2,4-D 0,1 mg/l +
KT 0,1 mg/l + 30 g/l de glucosa + 0,7 mg/l de MgCl_{2} + 2 g/l de
fitogel + 50 mg/l de kanamicina + 200 mg/l de cefutoxima pH = 6,4)
en luz a 28ºC en un cuarto de cultivo para seleccionar y el
subcultivo fue mensual. Después de 2-3 meses de
subcultivo en SM, los callos se indujeron en los explantes, los
callos se transfirieron a medio DM (MS (macronutrientes,
micronutrientes, EDTA-Fe) + 10 mg/l de VB1 + 1 mg/ml
de VB6 + 1 mg/l de VPP + 100 mg/l de mioinositol + 19 g/l de
KNO_{3} + 0,7 mg/l de MgCl_{2} + 30 g/l de glucosa + 3 g/l de
fitogel pH = 6,4) y se subcultivó por mes. Después de
aproximadamente 5 meses, los embriones somáticos comienzan a
formarse. El cultivo de los embriones jóvenes en medio DM continúa
hasta que se desarrollan hasta la madurez. Los embriones maduros se
transfirieron a medio GM (1/2 MS (MS (macronutrientes,
micronutrientes, EDTA-Fe) + 10 mg/l de VB1 + 1
mg/ml de VB6 + 1 mg/l de VPP + 100 mg/l de mioinositol) + 0,01 mg/l
de NAA + 30 g/l de glucosa + 3,5 g/l de fitogel pH = 6,4) en la
caja para su desarrollo en plántulas. Y a continuación, las
plántulas se transplantaron en la tierra para el crecimiento de las
plantas y la recolección de semillas transgénicas.
Las plantas transgénicas de tabaco y algodón que
poseen el gen quimérico de promotor CFTUB2/GUS (o gen 35S:GUS) y
las plantas no transformadas como controles negativos se analizaron
mediante hibridación del ADN tipo Southern y mediante análisis
histoquímicos de GUS. El ADN genómico total de las hojas de algodón
y de tabaco se digirieron con enzimas de restricción, se separaron
en geles de agarosa y se transfirieron a membranas de nailon
Hybond-N mediante transferencia capilar, las
transferencias de ADN de tipo Southern se hibridaron en solución
ExpressHyb (Clontech) a 68ºC con sondas de
ADN-^{32}P preparadas mediante marcaje aleatorio
(Promega Prime-a-Gene Labelling
System). Después de la hibridación, Las transferencias se lavaron a
68ºC en SSC x 0,1, SDS al 0,5% durante 30-60
minutos. Las membranas de nailon marcadas con ^{32}P se expusieron
a película de rayos X a -70ºC para una autorradiografía. Los
resultados del análisis de tipo Southern demostraron que el gen del
promotor de CFTUB2/GUS estaba integrado en los genomas de tabaco y
de algodón. Se obtuvo un total de 325 plantas de algodón
transformadas, que pertenecen a 31 líneas transformadas, y se
transplantaron a tierra para su crecimiento hasta la madurez.
Los ensayos histoquímicos para actividad GUS en
plantas de tabaco y algodón transgénicas se realizaron de acuerdo
con el protocolo descrito anteriormente por Jefferson y col. (1987)
con algunas modificaciones. Tejidos frescos de las plantas se
incubaron en solución de X-gluc
(5-bromo-4-cloro-3-indolilglucurónido)
consistente en fosfato sódico 0,1M (pH 7,0), ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA) 10 mM, ferrocianuro de potasio 0,5
mM y ferricianuro de potasio 0,5 mM y X-gluc al 0,1%
(Clontech chemical) durante la noche. Los materiales vegetales
marcados se limpiaron después y se fijaron lavando con etanol al
100% y al 70% sucesivamente, y las muestras se analizaron y
fotografiaron directamente o con microscopio. Consistente con los
resultados del análisis de tipo Northern, el gen GUS dirigido por
el promotor de CFTUB2 se expresaba específicamente en las fibras
jóvenes, pero no en otros tejidos, en las 31 plantas de algodón
transgénico estudiadas, mientras que la actividad GUS se detectó en
todos los tejidos de plantas de algodón control positivas (35S:GUS).
Se obtuvo un total de 36 plantas de algodón transformadas y se
transplantaron a tierra para su crecimiento hasta la madurez, todas
ellas con actividad GUS detectable únicamente en las fibras jóvenes,
no en los órganos florales tales como anteras, pétalos y sépalos,
ni en las hojas ni raíces. De igual forma, se encontró que bajo el
promotor de CFTUB2, la actividad del gen GUS sólo se detectaba en
las semillas de las 15 plantas de tabaco transgénicas estudiadas,
lo que sugiere que la actividad del promotor de CFTUB2 también era
específica del tejido en las plantas de tabaco. Este resultado,
junto con el análisis de tipo Northern anterior, indica que el
promotor de CFTUB2 controla la expresión génica específica a nivel
transcripcional en las fibras de algodón.
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promotor de beta-tubulina específico de fibras
procedente del algodón
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Claims (2)
1. Un promotor que es específico de fibras de
algodón, que comprende un fragmento de 1433 kb del promotor del gen
de la tubulina-\beta de algodón CFTUB2 que posee
la secuencia de Sec ID Nº: 2.
2. Un promotor que es específico de fibras de
algodón, que comprende un fragmento de 984 kb del promotor del gen
de la tubulina-\beta de algodón CFTUB2 que posee
la secuencia de nucleótidos 449-1433 Sec ID Nº
2.
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