ES2250358T3 - Aislamento y caracteristica de un promotor antero-especifico(cofs)en algodon. - Google Patents
Aislamento y caracteristica de un promotor antero-especifico(cofs)en algodon.Info
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Abstract
Una molécula de ácido nucleico aislada que contiene un promotor antero-específico que comprende el promotor del gen CoFS de algodón, comprendiendo dicha molécula de ácido nucleico aislada la SEC. ID Nº:2
Description
Aislamiento y caracterización de un promotor
antero-específico (CoFS) en algodón.
La presente invención se refiere al campo de la
biología molecular de plantas. En particular, la invención se aplica
a promotores de algodón y sus usos para crear plantas transgénicas,
y más específicamente a promotores
antero-específicos de algodón.
El algodón es la fibra natural usada más
exhaustivamente en la industria textil. La producción anual mundial
de algodón es de más de 100 millones de fardos valorada en 45 mil
millones de dólares de EE.UU. Aunque se han realizado mejoras
importantes en la calidad y la cosecha mediante la reproducción
clásica en las décadas anteriores, el potencial para continuar
mejorando las propiedades de algodón a través de la reproducción
clásica es limitado debido a los requisitos para la compatibilidad
de especie y a los rasgos disponibles. La ingeniería genética
proporciona enfoques nuevos para seguir mejorando el algodón
introduciendo genes para crear nuevos germoplasmas con
características muy deseables, por ejemplo, la resistencia frente a
plagas de insectos.
La antera es el órgano reproductor masculino en
las plantas que dan flores. El desarrollo de la antera puede
dividirse en dos fases generales. Durante la fase 1, se diferencian
la mayoría de células especializadas y tejidos, las células madre de
las microesporas pasan por una meiosis y se forman tétradas de
microesporas. Durante la fase 2, las microesporas son liberadas de
las tétradas seguido por la maduración del grano de polen, la
degeneración de tejido, el desprendimiento y la liberación de polen.
Los genes expresados específicamente durante el desarrollo de antera
y polen han sido estudiados en algunas especies de plantas. Allen
and Lonsdale, Plant J.3:261-271, 1993; Bird, y col.,
Plant Mol. Biol. 11:651-662, 1988; Brown and Crouch,
Plant Cell 2:263-274, 1990; Grierson y col., Nucl
Acids Res. 14:8595-8603, 1986; Hanson, y col., Plant
Cell 1:173-179, 19S9; Ursin y col., Plant Celt
1:727-736, 1989; John and Petersen, Plant Mol Biol
26(6):1989-1993, 1994; Atanassov y col.,
Plant Mol. Biol 38:1169-1178.1998; Liu y col., Plant
Mol Biol 33:291-300, 1997; Treacy et al.,
Plant Mol Biol 34:603-611, 1997; Agnes y col.,Plant
Mol. Biol 40:857-872, 1999. Entre los 20.000 a
25.000 genes expresados en antera de tabaco, solamente 10.000 genes
son antero-específicos. Kamalay and Goldberg, Proc.
Natl Acad. Set USA 81:2801-2805, 1984; Koltunow, y
col., Plant Celt 2:1201-1224, 1990.
Un promotor es un fragmento de ADN que condiciona
la especificidad temporal y espacial de la expresión génica durante
el desarrollo vegetal y animal. Muchos genes específicos de tejido y
sus promotores han sido identificados y aislados de una gran
variedad de plantas y animales durante la década anterior,
incluyendo genes específicos de tejido y promotores de algodón.
Loguerico y col., Mol. Gen. Genet.
26l(4/5):660-671, 1999; Kawai y col., Plant
Cell Physiol. 39(12):138O-1383, 1998; Song
and Allen, Biochem. Biophys. Acta
1351(1)1305-312,1997; Ma y col.,
Biochim. Biophys. Acta 1344(2):
111-114,1997; John, Plant Mol. Biol.
30(2):297-306,1996; Rinehart y col., Plant
Physiol. 112(3): 1331-1341, 1996; Hasenfratz
et al., Plant Physiol. 108(4):
1395-1404, 1995; John and Peterson, Plant Mol. Biol.
26(6): 1989-1993, 1994; John and Crow, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89(13):5769-5773, 1992;
Zabaleta y col. (The Plant Journal (1998) 15 (1),
49-59) definen regiones promotoras reguladoras
responsables de la expresión incrementada en anteras y polen de tres
genes codificados en el nucleo del Complejo I (nCl) mitocondrial de
Arabidopsis Thaliana.
El documento WO 92/13957 se refiere a promotores
antero-específicos de maíz.
Estos promotores específicos de tejido de plantas
pueden usarse para controlar la expresión de genes foráneos en
plantas transgénicas de una manera específica de tejido que dominará
la mayor parte de la segunda generación de cultivos transgénicos.
Algunos tejidos de plantas no expresan niveles altos del transgén en
todos los tejidos deseados o en el tejido deseado en especial. En el
algodón transgénico Bt, por ejemplo, el nivel de expresión del gen
Bt es sumamente bajo en la flor, incluyendo la antera, y resulta
poca protección contra plagas de insectos en estos tejidos. Para
conseguir el mejor control frente a plagas de insectos de algodón,
sería muy ventajoso identificar promotores
antero-específicos que pueden producir niveles de
expresión génica más altos en estos tejidos.
Por lo tanto, la presente invención suministra
una molécula de ácido nucleico aislada que contiene un promotor
antero-específico que comprende el promotor del gen
CoFS de algodón, comprendiendo dicha molécula de ácido nucleico
aislada la SEC. ID Nº: 2. En una realización adicional, la invención
suministra una planta transgénica que expresa un transgén bajo el
control de un promotor antero-específico de algodón
del gen CoFS de algodón como se define por la SEC. ID Nº:2.
Fig. 1 muestra los resultados de un ensayo de
visualización diferencial de ADNc de CoFS.
Fig. 2 presenta una transferencia Northern que
indica la expresión del gen CoFS.
Fig. 3 es un diagrama esquemático de las
construcciones de los vectores promotores de CoFS y el gen CoFS del
algodón.
Fig. 4 muestra los resultados de un ensayo de la
expresión del gen GUS bajo el control del promotor del gen CoFS en
plantas de tabaco transgénicas.
Fig. 5 muestra los resultados de un ensayo de la
expresión del gen GUS bajo el control del promotor de CoFS en
plantas de tabaco transgénicas.
Un gen antero-específico (CoFS) y
su correspondiente promotor se aislaron del algodón mediante un
ensayo de visualización diferencial. La actividad y la especificidad
de tejido del promotor aislado fue confinada en plantas de tabaco
transgénico que usaban el promotor de CoFS para controlar la
expresión del gen indicador GUS.
El análisis de transferencia Northern de ADNc de
una gama de tejidos de algodón indicaba que un clon de ADNc que
comprendía el gen de CoFS fue expresado enérgicamente en anteras, y
también se expresó en tejido de pétalo, pero menos o nada en
absoluto en otros tejidos. Véase Fig. 1.
Un gen antero-específico (llamado
CoFS) se aisló a partir del algodón. El ADNc aislado de CoFS
completo es de 8,4 kb de longitud. Véase Tabla I. Sobre la base de
la secuencia de ADNc de CoFS, se aisló un fragmento promotor de CoFS
(2,6 kb). Véase la tabla II. Comparando las secuencias de nucleótido
y polipéptido predicho del gen CoFS de algodón con secuencias
publicadas revelaron que el gen era aproximadamente
54-58% idéntico a nivel de aminoácidos con los genes
de acil-CoA sintetasa (probable ligasa de cCoA de
ácido de cadena larga, EC 6.2.1.3) de algunas plantas como
Brassica napus (X94624) y Arabidopsis (AL078468,
AL161560). Se encontró menor homología a nivel de nucleótido,
indicando que CoFS es un gen nuevo hallado en algodón. El análisis
de la secuencia génica de CoFS reveló que podría contener
9-10 exones y 8-9 intrones en su
marco de lectura abierto, basado en las secuencias de aminoácido de
las acil-CoA sintetasas conocidas.
El fragmento promotor de CoFS se fusionó con el
gen GUS para formular vectores de expresión del gen para analizar la
función del promotor. Se identificaron plantas de tabaco transgénico
con los genes de fusión del promotor de CoFS/GL'5' por hibridación
de transferencia Southern. En las plantas transgénicas estudiadas,
la actividad de GUS fue detectada en antera, y débilmente en
ovarios, estilos y estigmas, pero no en pétalos u otros tejidos.
Este resultado, junto con el análisis de transferencia Northern,
indica que el promotor de CoFS es antero-específico
en algodón. El promotor controla la expresión génica específica a
nivel transcripcional en anteras de algodón. El promotor aislado
puede ser usado en la expresión mejorada de los genes deseados en
antera y tejidos relacionados de los órganos sexuales de la planta
para crear nuevas variedades de plantas, aumentando así calidad y
cosecha de la planta mediante manipulación génica.
Los promotores de la presente invención son
útiles para crear plantas transgénicas, especialmente incluyendo
algodón, habiendo aumentado la expresión del transgén en tejido de
antera. La mejor expresión de genes protectores, tales como el gen
de Bt, en tejido de antera resulta en una planta con resistencia
incrementada frente a plagas Bt-sensibles. Los genes
que pueden ser expresados bajo el control de este promotor incluyen
cualquier gen apropiado para el propósito.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Se incluyen los siguientes ejemplos no
restrictivos para ilustrar la invención.
Las semillas de algodón fueron esterilizadas en
superficie con etanol al 70% durante 30-60 segundos
y H_{2}O_{2} al 10% durante 30-60 minutos,
seguido de lavado con agua estéril. Las semillas fueron germinadas
en un medio de ½ MS a 28ºC con 16 horas de iluminación. Los
cotiledones e hipocotilos fueron cortados de plántulas estériles
como material de explante de transformación. Las plantas de algodón
fueron cultivadas en macetas para la extracción de ADN y ARN. Se
extrajo el ARN total de fibras jóvenes, ovarios, anteras, pétalos,
sépalos, hojas y raíces de algodón usando el método del tiocianato
de guanidinio o SV Total RNA Isolation System (Promega). Se purificó
Poli(A)^{+}ARN usando columnas de filtración de
oligo(dT)-celulosa de un equipo de
purificación de ARNm (Pharmacia Biotech). Se usó ARN total de
tejidos diferentes de algodón para la transcripción reversa de la
primera hebra de ADNc. Estos ADNc fueron usados como plantillas en
PCR de visualización diferencial.
El análisis de visualización diferencial fue
llevado a cabo con el equipo de visualización diferencial
(Clontech). El ADNc de la primera cadena fue sintetizado con 2
\mug de ARN total como materiales de inicio de transcripción
inversa y oligo(dT) como iniciadores a 42ºC durante 1 hora.
Las reacciones de PCR de visualización diferencial fueron realizadas
con un ciclo inicial que consiste en 94ºC durante 5 minutos, 40ºC
durante 5 minutos y 68ºC durante 5 minutos, seguido por dos ciclos
que consisten en 94ºC durante 2 minutos y 40ºC durante 5 minutos y
68ºC durante 5 minutos, y luego 25 ciclos que consisten en 94ºC
durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto y 68ºC durante 2 minutos, y
una extensión final a 68ºC durante 7 minutos. Las bandas de
visualización diferencial diana fueron recortadas y reamplificadas
para un análisis adicional. Los fragmentos de PCR, ADN y ADNc fueron
subclonados en vectores, y ADN de plásmido y fagémido preparado con
un Qiagen Plasmid Kit fueron usados como plantillas en las
reacciones de PCR. Los productos de PCR fueron ordenados en serie
por autosecuenciador.
El ADNc de algodón fue sintetizado usando un
equipo de síntesis de ADNc (Stratagene). Se construyeron genotecas
de ADNc de algodón insertando los fragmentos de ADNc en el vector de
expresión ZAP (Stratagene). Se seleccionaron productos de
visualización diferencial antero- y pétalo- específicos
reproducibles (véase Fig. 1) para un análisis adicional. Los ADNc en
cada banda diana fueron recolectados y regenerados por amplificación
de PCR. Los ADNc aislados fueron subclonados posteriormente en un
vector y secuenciados.
Para confirmar qué transcritos de ADNc se
acumularon específicamente en anteras de algodón, los patrones
expresión de ADNc fueron analizados por hibridación de transferencia
Northern con ARN total aislado de fibras de algodón, ovulos,
anteras, pétalos, sépalos, tallos, hojas y raíces, usando sondas
obtenidas de los clones de ADNc. Para el análisis de transferencia
Northern, las muestras de ARN de diferentes tejidos de algodón
fueron separados sobre geles de agarosa-formaldehído
y transferidos sobre membranas de nylon Hybond-N por
transferencia capilar. Las transferencias Northern de ARN fueron
hibridadas en solución ExpressHyb (Clontech) a 68ºC con sondas
^{32}P-ADNc preparadas por marcaje aleatorio
(Prime-a-Gene Labelling System,
Promega). Después de la hibridación, las transferencias fueron
lavadas a 68ºC en 0,1 x SSC, 0,5% SDS durante 30-60
minutos.
Un clon fue identificado como un fragmento de 275
pb de ADNc de CoFS (véase Tabla III). Se halló que e fragmento de
ADNc compartía 73% de homología con el gen de
acil-CoA sintetasa (X94624) de Brassica napus
en una región de 33 aminoácidos del marco de lectura abierto. La
hibridación de transferencia Northern reveló que los transcritos de
ADNc de CoFS se acumularon en gran parte en anteras de algodón, y
también se acumularon más o menos en pétalos, pero estos transcritos
no fueron detectados en ARN de fibras,ovulos, tallos, hojas y raíces
(véase Fig. 2). Este resultado indica que la expresión de ADNc de
CoFS es antero-específica en algodón.
Se prepararon materiales a partir de planta de
algodón como en el Ejemplo 1. Semillas de tabaco fueron
esterilizadas en superficie con etanol al 70% durante
30-60 segundos y HgCL 0,1% durante 15 minutos,
seguido de lavado con agua estéril. Las semillas fueron germinadas
sobre un medio ½ MS a la luz a 28ºC, y se usaron hojas cortadas de
plántulas estériles como materiales experimentales.
El ADN total fue extraído y purificado de hojas
de plantas de algodón y tabaco de acuerdo con el siguiente método.
Tejidos de hoja (z-4g) fueron totalmente
homogeneizados en N2 líquido. Los tejidos homogeneizados fueron
puestos en un tubo de 50 ml con 20 ml de tampón de extracción helado
y sedimentado a 2500 rpm durante 15 minutos. Después de retirar el
sobrenadante, cada pastilla fue resuspendida en 10 ml de tampón de
lisis e incubada a 65ºC durante 30 minutos. Se añadieron diez
mililitros de cloroformo a cada tubo y se mezcló con las muestras.
Entonces las muestras fueron sedimentadas a 3500 rpm durante 10
minutos. El sobrenadante fue transferido a un tubo limpio, y la
extracción de cloroformo se repitió otra vez. El sobrenadante fue
transferido a un tubo limpio, y se añadió isopropanol 0,6 en volumen
a cada tubo para la precipitación de ADN. Después de centrifugar a
3500 rpm durante 30 minutos, el ADN fue lavado con etanol 70%. El
ADN genómico aislado se disolvió entonces en agua estéril para su
uso.
Se construyeron genotecas de ADN genómico de
algodón a partir de hojas de plantas de algodón. El ADN se digirió
parcialmente con BamH I, y los fragmentos de ADN fueron clonados en
el sitio BamH I del vector express ZAP (Stratagene). Las genotecas
de ADN genómico de algodón fueron sometidas a revisión usando
fragmentos de gen CoFS aislados por Genome Walk PCR como sondas.
Se construyeron genotecas de Genome Walker usando
el Universal Genome Walker Kit (CJontech). Se digirió ADN genómico
de hojas de plantas de algodón con cinco enzimas de restricción
respectivamente, purificadas por la extracción de fenol/cloroformo y
se precipitó en etanol. El ADN digerido se ligó a adaptadores Genome
Walker.
Se realizaron dos reacciones en cadena de
polimerasa de Genome Walker sucesivamente: Se usó 1 ul de cada
genoteca de ADN de Genome Walker como plantillas en el PCR
principal, y los productos de PCR principal se usaron como
plantillas en el PCR secundario. El PCR comenzó a 95ºC durante 1
minuto, seguido por 35 ciclos de 95ºC durante 15 segundos y 68ºC
durante 4 minutos y una extensión final a 68ºC durante 6 minutos.
Las bandas diana de PCR se purificaron usando un Geneclean Kit (Bio
101).
Los rastreos mostraron dos clones positivos del
gen CoFS. Un clon contenía una región de gen de CoFS de algodón de
4.801 kb, y el otro un fragmento de ADN de algodón de 3.913 kb
cubriendo parte de la región promotora de CoFS. Tres fragmentos de
promotor de CoFS (0,73 1,4 y 2,6 kb, respectivamente) se aislaron a
partir de las genotecas de Genome Walter de algodón. El gen CoFS
completo aislado del algodón era de 8,4 kb de longitud, incluyendo
una región promotora de 2,6 kb. Las secuencias se muestran en las
Tablas I y II.
Para caracterizar la función del promotor de CoFS
en la expresión antero- específica del gen de CoFS, un fragmento de
0,7 kb, un fragmento de 1,4 kb y un fragmento de 2,5 kb del promotor
de CoFS se fusionaron con la secuencia de codificación GUS en el
vector de expresión génica pBI121 (reemplazando al promotor
CaMV35S), respectivamente. Véase Fig. 3.
Los vectores fueron construidos de la siguiente
manera. Se crearon por PCR un sitio de Hind HI y un sitio de BamH I
al extremo 5' y al extremo 3' de los fragmentos del promotor de CoFS
de 0,7, 1,4 y 2,4 kb respectivamente. El fragmento Hind XWBamHl fue
inicialmente subclonado en un vector pGEM-T
(Promega). ADN plasmídico que contenía los fragmentos de promotor de
CoFS fue digerido con Hind III y BamHl, y el fragmento digerido se
aisló por electroforesis en gel de agarosa. Tres construcciones
quiméricas promotor de CoFS/GUS fueron generadas por inserción del
fragmento de 0,7, 1,4 ó 2,4 kb, respectivamente, reemplazando al
promotor CaMV 35S, en los sitios Hind III/BamH l del vector
pBI121.
Las construcciones promotor de CoFS/gen de fusión
GUS se usaron para transformar tabaco por transferencia génica
mediada por Agrobacterium, usando el vector pBI121 que
contiene un promotor de CaMV35S/proteina de fusión GUS como un
control positivo. El promotor de CaMV35S es un promotor
constitutivo, activo en todos los tejidos vegetales. Odell y col.,
Nature 313:810-812, 1985; Ow y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 84:4870-4874, 1987; McCabe and
Martinell, Biotechnol 11:596-598, 1993.
Los vectores binarios que contienen promotor de
CoFS/genes de fusión GUS fueron transferidos a la cepa LBA 4404 de
Agrobacterium tumefaciens. Las transformaciones en tabaco se
realizaron usando el método hoja-disco
(Horsch, y col., 1985). Las hojas de tabaco fueron cortadas en pedazos de unos 2x2 centímetros, y sumergidas en la suspensión de Agrobacterias durante cinco minutos. Los explantes de tabaco infectado se cultivaron en medio MS con 1 mg/L 6-BA durante 48 horas a 28ºC y transferidos a una selección de medio MS conteniendo 100 mg/L de kanamicina y 1 mg/L 6-BA durante 20-30 días. Fueron seleccionados los brotes resistentes a kanamicina (transformados). Los brotes transformados fueron cortados del callo y hechos arraigar sobre el medio de MS con 50-100 miligramos/L de kanamicina. Las plantas transformadas de tabaco fueron trasplantadas a tierra para crecer hasta la madurez.
(Horsch, y col., 1985). Las hojas de tabaco fueron cortadas en pedazos de unos 2x2 centímetros, y sumergidas en la suspensión de Agrobacterias durante cinco minutos. Los explantes de tabaco infectado se cultivaron en medio MS con 1 mg/L 6-BA durante 48 horas a 28ºC y transferidos a una selección de medio MS conteniendo 100 mg/L de kanamicina y 1 mg/L 6-BA durante 20-30 días. Fueron seleccionados los brotes resistentes a kanamicina (transformados). Los brotes transformados fueron cortados del callo y hechos arraigar sobre el medio de MS con 50-100 miligramos/L de kanamicina. Las plantas transformadas de tabaco fueron trasplantadas a tierra para crecer hasta la madurez.
Las plantas de tabaco transgénico que poseían el
promotor de CoFS/gen GUS (o 35S/gen GUS) quiméricos, y control
negativo, plantas no transformadas fueron analizadas por hibridación
de transferencia Southern de ADN y por ensayo histoquímico de GUS.
Para el análisis de transferencia Southern, el ADN genómico total de
las hojas de tabaco transgénico fue digerido con enzimas de
restricción, separado en geles de azarosa, y transferidos sobre
membranas de nylon Hybond-N por transferencia
capilar. Las transferencias Southern de ADN fueron hibridadas en
solución ExpressHyb (Clontech) a 68ºC con sondas
^{32}P-DNA preparadas por marcaje aleatorio
(Promega Prime-a-Gene Labelling
System). Después de la hibridación, las transferencias fueron
lavadas a 68ºC en 0,1 x SSC, 0,5% SDS durante 30-60
minutos. Las membranas de nylon marcadas con ^{32}P fueron
expuestas a película de rayos X a -70ºC para autorradiografía. véase
Fig. 4 para los resultados.
Se hicieron ensayos histoquímicos sobre la
actividad de GUS en plantas de tabaco transgénico según un protocolo
descrito previamente, Jefferson, Plant MoL Biol Rep.
5:387-405, 1987, con algunas modificaciones. Se
incubaron tejidos frescos de las plantas en una solución
X-gluc
(5-bromo-4-cloro-3-indolilglucuronido)
consistente en fosfato de sodio 0,1M (pH 7,0), acido
etilen-diamino-tetraacético (EDTA)
10 mM, 0,5 mM ferrocianuro de potasio y X-gluc 0,1%
(Clontech chemical) durante la noche. Los materiales de la planta
teñidos se limpiaron y fijaron aclarando con etanol 100% y 70%
sucesivamente, y las muestras se examinaron y fotografiaron
directamente o bajo microscopio. Véase Fig. 5.
Los resultados de análisis de transferencias
Southern demostraron que el promotor de CoFS/gen GUS estaba
integrado en el genoma del tabaco. Se obtuvieron más de 50 plantas
transgénicas de tabaco y se transplantaron a tierra para crecer
hasta la maduración. De acuerdo con los resultados del análisis de
transferencias Northern del algodón, el gen GUS dirigido por el
promotor de CoFS se expresó especifica y enérgicamente en las
anteras de tabaco. La débil actividad del gen GUS bajo el promotor
de CoFS también se detectó en ovarios, estilos y estigmas, pero no
se detectó actividad de GUS en pétalos u otros tejidos en todas las
plantas de tabaco transgénico estudiadas. Este resultado, junto con
el análisis de transferencias Northern de arriba, indica que el
promotor de CoFS es capaz de controlar la expresión génica
específica al nivel transcripcional en anteras de plantas.
Odell JT, Nagy F, Chua
N-H, 1985. Identification of DNA
sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 3 5
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Ow DW, Jacobs JD, Howell SH,
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35S RNA promoter determined by use of the firefly luciferase gene
as a reporter of promoter activity. Proc. Natl. Acad. Sci.
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\hskip1cmCai, Lin
\hskip1cmCheng, Ning H
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<120> Aislamiento y caracterización de un
promotor antero-específico (CoFS) en algodón
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<130> 2577-143
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<140>
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<141>
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<160> 3
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<212> ADN
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<213> Arabidopsis sp.
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<400> 3
Claims (2)
1. Una molécula de ácido nucleico aislada que
contiene un promotor antero-específico que comprende
el promotor del gen CoFS de algodón, comprendiendo dicha molécula de
ácido nucleico aislada la SEC. ID Nº:2
2. Una planta transgénica que expresa un transgén
bajo control de un promotor antero-específico que
comprende el promotor del gen CoFS de algodón como se define por la
SEC. ID Nº:2 .
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