ES2308332T3 - Secuencias reguladoras de plantas para el control selectivo de la expresion de genes. - Google Patents
Secuencias reguladoras de plantas para el control selectivo de la expresion de genes. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2308332T3 ES2308332T3 ES05010470T ES05010470T ES2308332T3 ES 2308332 T3 ES2308332 T3 ES 2308332T3 ES 05010470 T ES05010470 T ES 05010470T ES 05010470 T ES05010470 T ES 05010470T ES 2308332 T3 ES2308332 T3 ES 2308332T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- baselineskip
- plant
- sequences
- dna
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
- C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
- C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
- C12N15/8234—Seed-specific, e.g. embryo, endosperm
Abstract
Una molécula de ADN aislada que comprende un polinucleótido que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia nucleotídica con la SEQ ID Nº: 38.
Description
Secuencias reguladoras de plantas para el
control selectivo de la expresión de genes.
La presente invención se refiere al aislamiento
y uso de moléculas de ácidos nucleicos para el control de la
expresión génica en plantas, específicamente a promotores novedosos
de plantas.
Uno de los objetivos de la ingeniería genética
en plantas es el de producir plantas con características o rasgos
agronómicamente importantes. Los avances recientes en la ingeniería
genética han proporcionado las herramientas necesarias para
transformar plantas para que contengan y expresen genes extraños
(Kahl et al. (1995) World Journal of Microbiology and
Biotechnology 11: 449-460). Los rasgos o las
calidades de interés particularmente deseables para la manipulación
mediante ingeniería genética de las plantas incluirían, sin
limitaciones, resistencia a insectos y otras plagas y agentes
causantes de enfermedades, tolerancia a herbicidas, estabilidad,
rendimiento, o duración de almacenamiento mejorados, tolerancia al
medio ambiente y mejoras nutricionales. Los avances tecnológicos en
la transformación y regeneración de plantas han permitido que los
investigadores tomen porciones de ADN, tal como uno o varios genes
de una fuente heteróloga, o de una fuente nativa, pero modificados
para presentar calidades diferentes o mejoradas, e incorporen el ADN
exógeno en el genoma de una planta. Luego es posible expresar el o
los genes en la célula vegetal para mostrar la o las características
o el o los rasgos agregados. En un enfoque, la expresión de un gen
novedoso que no se expresa habitualmente en una planta o tejido
vegetal particular puede conferir el efecto fenotípico deseado. En
otro enfoque, la transcripción de un gen o de una parte de un gen
con orientación antisentido puede producir el efecto deseado al
impedir o inhibir la expresión de un gen endógeno.
Los promotores aislados vegetales son de
utilidad para modificar plantas por medio de una manipulación
mediante ingeniería genética para que contengan las características
fenotípicas deseadas. Con el fin de producir tal planta
transgénica, se introduce en la célula vegetal un vector que incluye
una secuencia genética heteróloga que confiere el fenotipo deseado
cuando se expresa en la planta. El vector también incluye un
promotor vegetal que está unido operativamente a la secuencia
genética heteróloga, a menudo se trata de un promotor que no está
asociado habitualmente con el gen heterólogo. El vector se introduce
entonces en una célula vegetal con el fin de producir una célula
vegetal transformada y la célula vegetal transformada se regenera en
una planta transgénica. El promotor controla la expresión de la
secuencia de ADN introducida a la que el promotor está unido
operativamente y de esa manera se logra la característica deseada
conferida por dicha secuencia de ADN.
Dado que el promotor es un elemento regulador en
5' que desempeña un papel integral en la expresión general de uno o
varios genes, sería ventajoso contar con una variedad de promotores
para adaptar la expresión génica de manera que el o los genes se
transcriban de forma eficaz en el momento adecuado durante el
crecimiento y desarrollo de la planta, en la ubicación óptima en la
planta y en la cantidad necesaria como para producir el efecto
deseado. En un caso, por ejemplo, la expresión constitutiva de un
producto génico puede ser ventajosa en una ubicación de la planta,
pero menos beneficiosa en otra parte de la planta. En otros casos,
puede ser beneficioso tener un producto genético producido en una
etapa determinada del desarrollo de la planta o como respuesta a
determinados estímulos químicos o medioambientales. El desarrollo
comercial de germoplasma genéticamente mejorado también ha avanzado
a la etapa de introducción de múltiples rasgos en plantas de
cultivo, conocido también como el enfoque de apilamiento de genes.
En este enfoque, se pueden introducir en una planta múltiples genes
que confieren diferentes características de interés. Cuando se
introducen múltiples genes en una planta es importante que cada gen
se module o controle para una expresión óptima y que los elementos
reguladores sean diversos con el fin de reducir el potencial de
silenciamiento de genes que puede producirse por la recombinación
de secuencias homólogas. A la luz de estas y otras consideraciones,
resulta evidente que un óptimo control de la expresión génica y la
diversidad de elementos reguladores son importantes en la
biotecnología de plantas.
Las secuencias reguladoras apropiadas deben
estar presentes y en la ubicación adecuada con respecto a la
secuencia de ADN de interés, para que el ADN recién insertado se
pueda transcribir y de esa manera, si se desea, traducirse en una
proteína en la célula vegetal. Estas secuencias reguladoras
incluyen, pero sin limitaciones, un promotor, una secuencia líder
no traducida en 5' y una secuencia de poliadenilación en 3'. La
capacidad para seleccionar los tejidos para la transcripción de tal
ADN extraño y el momento durante el crecimiento vegetal en el que
obtener la transcripción de dicho ADN extraño también es posible con
la elección de las secuencias promotoras apropiadas que controlan
la transcripción de estos genes.
Se puede emplear una variedad de tipos o clases
diferentes de promotores para la manipulación mediante ingeniería
genética de plantas. Los promotores se pueden clasificar partiendo
de la base de la especialidad tisular o de intervalo. Por ejemplo,
los promotores denominados promotores constitutivos pueden
transcribir secuencias de ADN unidas operativamente y de forma
eficaz y expresar dichas secuencias de ADN en múltiples tejidos. Los
promotores específicos de tejidos o mejorados para tejidos se
pueden ubicar hacia el extremo 5' y estar ligados operativamente a
secuencias de ADN que habitualmente se transcriben con niveles más
altos en ciertos tejidos vegetales o específicamente en ciertos
tejidos vegetales. Otras clases de promotores incluirán, pero sin
limitaciones, los promotores inducibles cuya actividad puede
desencadenarse por estímulos externos, tales como agentes químicos,
estímulos del desarrollo o estímulos medioambientales. Por
consiguiente, los diferentes tipos de promotores deseados se pueden
obtener por aislamiento de las regiones reguladoras hacia el extremo
5' de secuencias de ADN que se transcriben y expresan de una manera
constitutiva, mejorada para tejidos o inducible.
Los avances tecnológicos de la bioinformática y
de secuenciación de gran rendimiento han proporcionado herramientas
moleculares adicionales para el descubrimiento de promotores. Se
pueden emplear células, tejidos u órganos vegetales diana
particulares en una etapa específica del desarrollo o bajo
condiciones químicas, medioambientales o fisiológicas determinadas
como fuente de material para aislar el ARNm y construir las
bibliotecas de ADNc. Las bibliotecas de ADNc se secuencian
rápidamente y las secuencias expresadas se catalogan
electrónicamente. El uso de software para el análisis de secuencias
permite estudiar miles de secuencias en un período corto y comparar
las secuencias de las bibliotecas de ADNc seleccionadas. La
combinación de métodos de substracción por ordenador y de
laboratorio permite a los investigadores rastrear y comparar
bibliotecas de ADNc e identificar las secuencias que tengan el
perfil de expresión deseado. Por ejemplo, se pueden identificar las
secuencias que se expresan preferiblemente en un tejido por
comparación de una biblioteca de ADNc de un tejido con las
bibliotecas de ADNc de otros tejidos y "substraer"
electrónicamente las secuencias comunes para encontrar las
secuencias que solamente se expresan en el tejido diana de interés.
La secuencia mejorada para el tejido se puede usar entonces como
una sonda o cebador para clonar el correspondiente ADNc de longitud
completa. A continuación se puede usar una biblioteca genómica de
la planta de in-
terés para aislar el correspondiente gen y los elementos reguladores asociados, incluyendo las secuencias promotoras.
terés para aislar el correspondiente gen y los elementos reguladores asociados, incluyendo las secuencias promotoras.
Es posible aislar múltiples secuencias
promotoras que confieran el perfil de expresión deseado, tal como
promotores embrionarios o mejorados o específicos para tejido de
callos, por comparación selectiva de las bibliotecas de ADNc del
tejido embrionario o del tejido de callos de interés con bibliotecas
de ADNc que no son objetivo o que no presentan antecedentes, tales
como bibliotecas de tejido foliar y radicular, para hallar las
regiones reguladoras en 5' asociadas con las secuencias expresadas
en dichas bibliotecas objetivo. Las secuencias promotoras aisladas
se pueden usar para modular selectivamente la expresión de cualquier
gen unido operativamente y proporcionar una diversidad adicional de
elementos reguladores en un vector de expresión vegetal en los
enfoques de apilamiento de genes.
El documento WO 98/37184 describe el promotor
LEC1. El promotor era activo a estadios muy tempranos del desarrollo
embrionario.
El documento WO 93/05164 describe promotores
específicos da callos.
La presente invención proporciona secuencias de
ácidos nucleicos que comprenden secuencias reguladoras ubicadas
hacia el extremo 5' de las secuencias codificantes de ADN
estructurales de plantas que se transcriben en tejidos embrionarios
o de callos y se muestran en la SEQ ID Nº: 38.
En un aspecto, la presente invención proporciona
secuencias de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia
seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID Nº: 38 o cualquier
fragmento, región o elemento cis de la secuencia que tenga
la capacidad de regular la transcripción de secuencias de ADN unidas
operativamente.
La presente invención también proporciona
secuencias de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de SEQ
ID Nº: 38 que son promotores.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
al uso de al menos un elemento cis, o un fragmento o una
región del mismo, de las secuencias promotoras en 5' descritas que
se puedan combinar para crear promotores novedosos o utilizarse en
una combinación novedosa con otra secuencia reguladora heteróloga
para crear un promotor quimérico que puede modular la transcripción
de una secuencia de ADN unida operativamente.
Por lo tanto, la presente invención se refiere
al uso de la secuencia de ácidos nucleicos que se describe en la
SEQ ID Nº: 38, o cualquier fragmento, región o elemento cis
de las secuencias descritas, que pueden regular la transcripción de
una secuencia de ADN cuando están unidas operativamente a dicha
secuencia de ADN. Por ello, la invención no sólo engloba la
secuencia tal como se describe en la SEQ ID Nº: 38, sino que también
incluye cualquier derivado truncado o de deleción, o fragmentos o
regiones de la misma, que puedan funcionar independientemente como
promotores, incluyendo los elementos cis, que pueden
funcionar como secuencias reguladoras junto con una o varias
secuencias reguladoras cuando están ligados operativamente a una
secuencia que se pueda transcribir.
La presente invención engloba entonces un nuevo
promotor, o un promotor quimérico o híbrido, que comprende una
secuencia de ácidos nucleicos tal como se describe en la SEQ ID Nº:
38. Los promotores quiméricos o híbridos pueden consistir en
fragmentos, regiones o elementos cis de cualquier longitud de
la secuencia descrita en la SEQ ID Nº: 38, combinadas con cualquier
otro promotor de longitud completa o mínimo activo en la
transcripción. Por ejemplo, una secuencia promotora seleccionada de
la SEQ ID Nº: 38 se puede combinar con un promotor CaMV 35S u otro
promotor para construir un nuevo promotor quimérico. También se
puede utilizar un promotor mínimo en combinación con las secuencias
de ácidos nucleicos de la presente invención. Un nuevo promotor
también comprende cualquier promotor construido mediante
manipulación por ingeniería genética de la secuencia de ácidos
nucleicos que se describe en la SEQ ID Nº: 38 o cualquier fragmento,
región o elemento cis de las secuencias descritas, en
cualquier forma que sea suficiente para transcribir una secuencia de
ADN unida operativamente.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a la capacidad de la secuencia promotora de SEQ ID Nº: 38, o
fragmentos, regiones o elementos cis de la misma, para
regular la transcripción de secuencias unidas operativamente para
dicha transcripción en tejidos embrionarios o de callos. Los
fragmentos, las regiones o los elementos cis de SEQ ID Nº:
38 que pueden regular la transcripción de secuencias de ADN unidas
operativamente en ciertos tejidos se pueden aislar a partir de la
secuencia de ácidos nucleicos descrita de SEQ ID Nº: 38 y usar para
manipular por ingeniería genética promotores novedosos que confieran
una expresión embrionaria mejorada o mejorada en callos de dichas
secuencias de ADN unidas operativamente o en combinación con otras
secuencias reguladoras heterólogas.
La presente invención también engloba
construcciones de ADN que comprenden la secuencia descrita tal como
se muestra en la SEQ ID Nº: 38, o cualquier fragmento, región o
elemento cis de la misma, incluyendo promotores novedosos
generados usando las secuencias descritas, o cualquier fragmento,
región o elemento cis de dichas secuencias descritas.
La presente invención también incluye cualquier
célula y planta transgénica que contenga el ADN que se describe en
la secuencia tal como muestra en la SEQ ID Nº: 38, o cualquier
fragmento, región o elemento cis de la misma.
La presente invención también proporciona un
método para regular la transcripción de una secuencia de ADN que
comprende ligar operativamente la secuencia de ADN a cualquier ácido
nucleico que comprenda todo o cualquier fragmento, región o
elemento cis de una secuencia de SEQ ID Nº: 38.
En otra realización, la presente invención
proporciona un método para conferir una expresión mejorada o
específica embrionaria o en callos ligando operativamente una
secuencia de SEQ ID Nº: 38, o cualquier fragmento, región o
elemento cis de las secuencias descritas, a cualquier
secuencia de ADN que pueda transcribirse. Los fragmentos, las
regiones o los elementos cis del promotor descrito que se
muestra en la SEQ ID Nº: 38 que puedan conferir una mayor expresión
en tejidos embrionarios o de callos a secuencias de ADN unidas
operativamente, pueden manipularse por ingeniería genética y
utilizarse independientemente en combinaciones novedosas, incluyendo
multímeros o derivados truncados, y los promotores novedosos se
pueden ligar operativamente a una secuencia de ADN que puede
transcribirse. Los fragmentos, las regiones o los elementos
cis descritos de las secuencias descritas que puedan
conferir una mayor expresión en tejidos embrionarios o de callos a
las secuencias de ADN unidas operativamente se pueden usar en
combinación con un promotor heterólogo, incluyendo un promotor
mínimo, para crear un promotor novedosos quimérico o híbrido.
La presente invención también proporciona un
método para obtener una planta transgénica mediante la introducción
en la célula de una planta de una construcción de ADN que comprende:
(i) un promotor que comprende un ácido nucleico que contiene una
secuencia de SEQ ID Nº: 38, o fragmentos, regiones o elementos
cis de la misma, y que se encuentra unida operativamente al
promotor, (ii) una secuencia de ADN que puede transcribirse y (iii)
una región no traducida en 3'.
La presente invención también proporciona un
método para aislar al menos una secuencia reguladora en 5' de un
perfil de expresión deseado de una planta objetivo de interés por
medio de la evaluación de una colección de secuencias de ácidos
nucleicos de EST derivadas de al menos una biblioteca de ADNc
preparada a partir del tipo de célula vegetal de interés, la
comparación de las secuencias de EST de al menos una biblioteca de
ADNc vegetal objetivo y al menos una biblioteca de ADNc de EST no
objetivo procedente de un tipo de célula vegetal diferente, la
substracción de las secuencias de EST comunes encontradas en ambas
bibliotecas objetivo y no objetivo, el diseño de cebadores
específicos de genes a partir de las EST restantes después de las
substracciones que sean representativas de las secuencias
expresadas seleccionadas como objetivo y el aislamiento de al menos
una secuencia reguladora y flanqueante en 5' correspondiente, que
incluye al menos una secuencia promotora de una biblioteca genómica
preparada a partir de la planta objetivo usando cebadores
específicos de genes.
Los aspectos anteriores y otros de la invención
serán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada
y de los dibujos adjuntos.
La presente invención incluye una lista de
secuencias de la que la SEQ ID Nº 38 es parte de la presente
invención.
La figura 1 es un mapa de plásmido del
pMON19469
La figura 2 es un mapa de plásmido del
pMON39721
La figura 3 es un mapa de plásmido del
pMON51002
La figura 4 es un mapa de plásmido del
pMON51008
La figura 5 es un mapa de plásmido del
pMON51001
La figura 6 es un mapa de plásmido del
pMON51009
La figura 7 es un mapa de plásmido del
pMON51003
La figura 8 es un mapa de plásmido del
pMON51010
El plásmido pMON19469 es un vector de expresión
que consiste en los siguientes componentes genéticos:
P-CaMV.35S es el promotor para el ARN 35S del CaMV
(virus del mosaico de la coliflor) que contiene una duplicación en
tándem de la región -90 a -300 (patente de los EE.UU. número
5.322.938); el intrón I-Zm.Hsp70 es la secuencia
pertinente de la proteína de choque térmico del maíz que se describe
en las patentes de los EE.UU. números 5.593.874 y 5.859.347);
Ec.GUS: 1 es la región codificante de la
beta-glucuronidasa de E. coli;
T-AGRTU.nos es la señal de terminación del gen de
la nopalina sintasa; ori-M13 y
ori-pUC son orígenes de replicación; AMP es la
región codificante para la selección con ampicilina.
El plásmido pMON39721 es un vector de
transformación vegetal de doble borde (bordes de
ADN-T derecho (BD) e izquierdo (BI)) que consiste
en los siguientes componentes genéticos: P-CaMV.35S
es el promotor CaMV 35S (patente de los EE.UU. número 5.352.605);
AGRTU.nptII es la secuencia codificante de Agrobacterium
tumefaciens que confiere resistencia al antibiótico kanamicina;
T-AGRTU.nos es la secuencia de terminación en 3' del
gen de la nopalina sintasa aislada de Agrobacterium
tumefaciens; ori322 y oriV son orígenes de replicación; aad es
la secuencia codificante que confiere resistencia a los antibióticos
espectinomicina y estreptomicina.
El plásmido pMON51002 es un vector de expresión
que consiste en los siguientes componentes genéticos:
ZM-70025861 es el promotor para la expresión
mejorada en embriones de Zea mays aislado de una biblioteca
genómica de embriones de Zea mays; el intrón
I-Zm.Hsp70 es la secuencia pertinente de la proteína
de choque térmico del maíz que se describe en las patentes de los
EE.UU. números 5.593.874 y 5.859.347; Ec.GUS: 1 es la región
codificante de la beta-glucuronidasa de E.
coli; T-AGRTU.nos es la señal de terminación del
gen de la nopalina sintasa; ori-M13 y
ori-pUC son orígenes de replicación; AMP es la
región codificante para la selección con ampicilina.
El plásmido pMON51008 es un vector de
transformación vegetal de doble borde, bordes de
ADN-T derecho (BD) e izquierdo (BI), que consiste
en los siguientes componentes genéticos: ZM-70025861
es el promotor de la expresión mejorada en embriones de Zea
mays aislado de una biblioteca genómica de embriones de Zea
mays; el intrón I-Zm.Hsp70 es la secuencia
pertinente de la proteína de choque térmico del maíz que se describe
en las patentes de los EE.UU. números 5.593.874 y 5.859.347);
Ec.GUS: 1 es la región codificante de la
beta-glucuronidasa de E. coli;
T-AGRTU.nos es la señal de terminación de la
nopalina sintasa; P-CaMV.35S es el promotor CaMV
35S (patente de los EE.UU. número 5.352.605); AGRTU.nptII es la
secuencia codificante de Agrobacterium tumefaciens que
confiere resistencia al antibiótico kanamicina;
T-AGRTU.nos es la secuencia de terminación en 3' del
gen de la nopalina sintasa aislada de Agrobacterium
tumefaciens; ori322 y oriV son orígenes de replicación; aad es
la secuencia codificante que confiere resistencia a los antibióticos
espectinomicina y estreptomicina.
El plásmido pMON51001 es un vector de expresión
que consiste en los siguientes componentes genéticos:
ZM-700267629 es el promotor de la expresión
mejorada en embriones de Zea mays aislado de una biblioteca
genómica de embriones de Zea mays; el intrón
I-Zm.Hsp70 es la secuencia pertinente de la proteína
de choque térmico del maíz que se describe en las patentes de los
EE.UU. números 5.593.874 y 5.859.347; Ec.GUS: 1 es la región
codificante de la beta-glucuronidasa de E.
coli; T-AGRTU.nos es la señal de terminación del
gen de la nopalina sintasa; ori-M13 y
ori-pUC son orígenes de replicación; AMP es la
región codificante para la selección con ampicilina.
El plásmido pMON51009 es un vector de
transformación vegetal de borde doble, bordes de
ADN-T derecho (BD) e izquierdo (BI), que consiste
en los siguientes componentes genéticos:
ZM-700267629 es el promotor de la expresión
mejorada en embriones de Zea mays aislado de una biblioteca
genómica de embriones de Zea mays; el intrón
I-Zm.Hsp70 es la secuencia pertinente de la proteína
de choque térmico de maíz que se describe en las patentes de los
EE.UU. números 5.593.874 y 5.859.347); Ec.GUS: 1 es la región
codificante de la beta-glucuronidasa de E.
coli; T-AGRTU.nos es la señal de terminación del
gen de la nopalina sintasa, P-CaMV.35S es el
promotor CaMV 35S (patente de los EE.UU. número 5.352.605);
AGRTU.nptII es la secuencia codificante de Agrobacterium
tumefaciens que confiere resistencia al antibiótico kanamicina;
T-AGRTU.nos es la secuencia de terminación en 3'
del gen de la nopalina sintasa aislado de Agrobacterium
tumefaciens; ori322 y oriV son orígenes de replicación; aad es
la secuencia codificante que confiere resistencia a los antibióticos
espectinomicina y estreptomicina.
El plásmido pMON51003 es un vector de expresión
que consiste en los siguientes componentes genéticos:
ZM-700263624 es el promotor de la expresión
mejorada en embriones de Zea mays aislado de una biblioteca
genómica de embriones de Zea mays; el intrón
I-Zm.Hsp70 es la secuencia pertinente de la proteína
de choque térmico del maíz que se describe en las patentes de los
EE.UU. números 5.593.874 y 5.859.347); Ec.GUS: 1 es la región
codificante de la beta-glucuronidasa de E.
coli; T-AGRTU.nos es la señal de terminación del
gen de la nopalina sintasa; ori-M13 y
ori-pUC son orígenes de replicación; AMP es la
región codificante para la selección con ampicilina.
El plásmido pMON51010 es un vector de
transformación vegetal de borde doble, bordes de
ADN-T derecho (BD) e izquierdo (BI), que consiste
en los siguientes componentes genéticos:
ZM-700263624 es el promotor de la expresión
mejorada en embriones de Zea mays aislado de una biblioteca
genómica de embriones de Zea mays; el intrón
I-Zm.Hsp70 es la secuencia pertinente de la proteína
de choque térmico de maíz que se describe en las patentes de los
EE.UU. números 5.593.874 y 5.859.347); Ec.GUS: 1 es la región
codificante de la beta-glucuronidasa de E.
coli; T-AGRTU.nos es la señal de terminación del
gen de la nopalina sintasa, P-CaMV.35S es el
promotor CaMV 35S (patente de los EE.UU. número 5.352.605)
AGRTU.nptII es la secuencia codificante de Agrobacterium
tumefaciens que confiere resistencia al antibiótico kanamicina;
T-AGRTU.nos es la secuencia de terminación 3' del
gen de la nopalina sintasa aislada de Agrobacterium
tumefaciens; ori322 y oriV son orígenes de replicación; aad es
la secuencia codificante que confiere resistencia a los antibióticos
espectinomicina y estreptomicina.
Los genes de interés (GOI) que confieren
tolerancia a un herbicida o antibiótico, gen de una proteína
insecticida, genes de resistencia a enfermedades, genes que afectan
el crecimiento, metabolismo o desarrollo vegetal, la producción de
aceite y aceites modificados y genes que codifican proteínas
farmacéuticas, por ejemplo, son considerados aspectos de la
presente invención. Dichas composiciones y los métodos que se
describen en el presente documento se pueden usar con respecto a
cualquier planta que pueda modificarse genéticamente mediante los
métodos de biotecnología vegetal. Las composiciones y los métodos
del presente documento describen secuencias de ADN que son de
utilidad para la expresión de productos transgénicos en embriones y
semillas vegetales.
Las siguientes definiciones y métodos se
proporcionan para definir mejor la presente invención y para guiar
a los expertos habituales en la técnica en expertos en la técnica en
la práctica de la presente invención. A menos que se indique lo
contrario, los términos se comprenderán según su uso convencional
por los expertos en la técnica pertinente. Se utiliza la
nomenclatura de las bases de ADN definidas en el 37 CFR \NAK
1.822. Se emplea la nomenclatura de residuos de aminoácidos
habitual de una y tres letras.
"(Secuencia de) ácido nucleico" o
"(secuencia de) polinucleótidos" se refiere a ADN o ARN de
cadena simple o doble de origen genómico o sintético, es decir, un
polímero de bases de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos,
respectivamente, leído desde el extremo 5' hacia el extremo 3'. El
ácido nucleico puede representar la cadena sentido o la cadena
complementaria (antisentido).
"Nativo" se refiere a una secuencia de
ácido nucleico que se produce en la naturaleza ("de tipo
natural").
Secuencia "heteróloga" se refiere a una
secuencia que se origina de una fuente o especie extraña o, si
proviene de la misma fuente, está modificada con respecto a su
forma original.
Una secuencia "aislada" de ácido nucleico
está substancialmente separada o purificada de otras secuencias de
ácidos nucleicos con las que se asocia habitualmente dicho ácido
nucleico en la célula del organismo del que procede naturalmente el
ácido nucleico, es decir, otro ADN cromosómico o extracromosómico.
El término engloba ácidos nucleicos que se purifican
bioquímicamente para separar substancialmente los ácidos nucleicos
y otros componentes celulares. El término también engloba ácidos
nucleicos recombinantes y ácidos nucleicos sintetizados
químicamente.
El término "substancialmente purificado",
tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una
molécula separada de substancialmente todas las demás moléculas
habitualmente asociadas con ella en su estado nativo. Más
preferiblemente, una molécula substancialmente purificada es la
especie predominante presente en una preparación. Una molécula
substancialmente purificada puede estar libre en más de un 60%,
preferiblemente libre en el 75%, más preferiblemente libre en el
90%, de las otras moléculas (exclusivas de solvente) presentes en la
mezcla natural. El término "substancialmente purificado" no
pretende englobar las moléculas presentes en su estado nativo.
Una primera secuencia de ácido nucleico presenta
una "identidad substancial" con una secuencia de ácido nucleico
de referencia si, cuando se alinean de forma óptima (con un total
de inserciones o supresiones de nucleótidos apropiados que
representa menos del 20 por ciento de la secuencia de referencia en
el margen de comparación) con el otro ácido nucleico (o la cadena
complementaria del mismo), hay al menos aproximadamente un 75% de
identidad de secuencia de nucleótido, preferiblemente al menos
aproximadamente un 80% de identidad, más preferiblemente al menos
aproximadamente un 85% de identidad y lo más preferiblemente lo más
preferiblemente al menos aproximadamente un 90% de identidad en el
margen de comparación de al menos 20 posiciones de nucleótidos,
preferiblemente al menos 50 posiciones de nucleótidos, más
preferiblemente al menos 100 posiciones de nucleótidos y lo más
preferiblemente la longitud completa del primer ácido nucleico. La
alineación óptima de secuencias para la alineación en una ventana
de comparación se puede realizar mediante el algoritmo de homología
local de Smith y Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981;
mediante el algoritmo de alineación por homología de Needleman y
Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443, 1970; mediante el método de
búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad.
Sci. EE.UU. 85: 2444, 1988; preferiblemente con las puestas en
práctica por ordenador de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y
TFASTA del Paquete de Software de Wisconsin Genetics, Release 7.0,
Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI. El
ácido nucleico de referencia puede ser una molécula de longitud
completa o una porción de una molécula más larga. Alternativamente,
dos ácidos nucleicos presentan una identidad substancial si uno se
hibrida con el otro bajo condiciones astringentes, como se definirá
más adelante.
Una primera secuencia de ácido nucleico está
"unida operativamente" con una segunda secuencia de ácido
nucleico cuando las secuencias están dispuestas de manera tal que
dicha primera secuencia de ácido nucleico afecta a la función de la
segunda secuencia de ácido nucleico. Preferiblemente, las dos
secuencias son parte de una sola molécula de ácido nucleico
contigua y más preferiblemente son adyacentes. Por ejemplo, un
promotor está unido operativamente a un gen si el promotor regula o
interviene mediando la transcripción del gen en una célula.
Un ácido nucleico "recombinante" se elabora
por medio de una combinación artificial de dos segmentos de
secuencia por lo demás separados, por ejemplo, mediante síntesis
química o manipulación de segmentos de ácidos nucleicos aislados
con técnicas de ingeniería genética. Las técnicas para la
manipulación de ácidos nucleicos son bien conocidas (véase, por
ejemplo, Sambrook et al., 1989, y Ausubel et al.,
1992).
Los métodos para la síntesis química de ácidos
nucleicos se describen, por ejemplo, en Beaucage y Carruthers,
Tetra. Letts. 22: 1859-1862, 1981, y
Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 103: 3185, 1981.
La síntesis química de ácidos nucleicos se puede realizar, por
ejemplo, con sintetizadores automáticos de oligonucleótidos
comerciales.
Una "secuencia sintética de ácidos
nucleicos" se puede diseñar y sintetizar químicamente para lograr
una mayor expresión en células huésped particulares y a los fines
de clonación en vectores apropiados. Las células huésped a menudo
presentan un patrón preferido de utilización de codones (Murray
et al., 1989). Los ADN sintéticos diseñados para mejorar la
expresión en un huésped particular deberían, por ello, reflejar el
patrón de utilización de codones en la célula huésped. Hay
programas de ordenador para estos fines, incluyendo, sin
limitaciones, los programas "BestFit" o "Gap" del Paquete
de Software para Análisis de Secuencias, Genetics Computer Group,
Inc., Centro de Biotecnología de la Universidad de Wisconsin,
Madison, WI 53711.
La "amplificación" de ácidos nucleicos o
"reproducción de ácidos nucleicos" se refiere a la producción
de copias adicionales de una secuencia de ácido nucleico y se lleva
a cabo usando tecnologías de reacción en cadena de la polimerasa
(PCR). Se conoce una variedad de métodos de amplificación en la
técnica y se describen, entre otros, en las patentes de los
EE.UU. números: 4.683.195 y 4.683.202 y en PCR Protocols: A Guide
to Methods and Applications, ed. Innis et al., Academic
Press, San Diego, 1990. En PCR, un cebador se refiere a un
oligonucleótido corto de secuencia definida que se alinea con un
molde de ADN para iniciar la reacción en cadena de la
polimerasa.
Los términos "transformado",
"transfectado" o "transgénico" se refieren a una célula,
tejido, órgano u organismo en el que se ha introducido un ácido
nucleico extraño, tal como un vector recombinante. Preferiblemente,
el ácido nucleico introducido está integrado en el ADN genómico de
la célula, tejido, órgano u organismo receptor, de manera tal que
el ácido nucleico introducido es heredado por la subsiguiente
progenie. Una célula u organismo "transgénico" o
"transformado" también incluye la progenie de la célula o del
organismo y la progenie producida en un programa de cría empleando
dicha planta "transgénica" como progenitor en un cruzamiento y
que muestra un fenotipo alterado como resultado de la presencia de
una construcción o un vector recombinante.
El término "gen" se refiere a ADN
cromosómico, ADN plásmido, ADNc, ADN sintético u otro ADN que
codifica un péptido, polipéptido, proteína o molécula de ARN y las
regiones flanqueantes de la secuencia codificante que participa en
la regulación de la expresión. Algunos genes pueden transcribirse en
ARNm y traducirse en polipéptidos (genes estructurales); otros
genes pueden transcribirse en ARN (por ejemplo ARNr, ARNt); y otros
tipos de funciones genéticas como reguladores de la expresión
(genes reguladores).
"Expresión" de un gen se refiere a la
transcripción de un gen para producir el correspondiente ARNm y la
traducción de este ARNm para producir el correspondiente producto
génico, es decir, un péptido, polipéptido o proteína. La expresión
génica está controlada o modulada por elementos reguladores
incluyendo los elementos reguladores en 5', tal como
promotores.
"Componente genético" se refiere a
cualquier secuencia de ácido nucleico o elemento genético que
también puede ser un componente o parte de un vector de expresión.
Ejemplos de componentes genéticos incluyen, pero sin limitaciones,
regiones promotoras, secuencias líder no traducidas en 5', intrones,
genes, regiones no traducidas en 3' y otras secuencias reguladoras
o secuencias que afectan a la transcripción o a la traducción de una
o varias secuencias de ácidos nucleicos.
Los términos "construcción de ADN
recombinante", "vector recombinante", "vector de
expresión" o "casete de expresión" se refieren a cualquier
agente, tal como un plásmido, cósmido, virus, BAC (cromosoma
artificial bacteriano), secuencia de replicación autónoma, fago o
secuencia de nucleótidos de ADN o ARN circular o linear de cadena
simple o de cadena doble, derivado de cualquier fuente, que puede
integrarse en el genoma o replicarse de forma autónoma, que
comprende una molécula de ADN en la que se han ligado una o varias
secuencias de ADN de una manera funcionalmente operativa.
"Complementario" se refiere a la asociación
natural de secuencias de ácidos nucleicos mediante apareamiento de
bases (pares A-G-T con la secuencia
complementaria T-C-A). La
complementariedad entre dos moléculas de cadena simple puede ser
parcial, si solamente algunos de los pares de ácidos nucleicos son
complementarios; o completa, si todos los pares de bases son
complementarios. El grado de complementariedad afecta la eficacia y
la fuerza de las reacciones de hibridación y amplificación.
"Homología" se refiere al nivel de
similitud entre secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos en lo
que se refiere al porcentaje de identidad de posición de
nucleótidos o aminoácidos, respectivamente, es decir, la similitud
o identidad de secuencia. La homología también se refiere al
concepto de propiedades funcionales similares entre diferentes
ácidos nucleicos o proteínas.
\newpage
"EST" o etiquetas de secuencia expresada
son secuencias cortas de clones seleccionadas aleatoriamente de una
biblioteca de ADNc (o ADN complementario) que son representativos de
los insertos de ADNc de estos clones aleatoriamente seleccionados
(McCombie, et al., Nature Genetics, 1: 124, 1992; Kurata,
et al., Nature Genetics, 8: 365,1994; Okubo, et al.,
Nature Genetics, 2: 173, 1992).
El término "Northern electrónico" se
refiere a un análisis de secuencia por ordenador que permite la
comparación electrónica de secuencias de múltiples bibliotecas de
ADNc partiendo de la base de parámetros que son identificados por
el investigador, incluyendo la abundancia de poblaciones de EST en
múltiples bibliotecas de ADNc o exclusivamente de conjuntos de EST
de una o de combinaciones de bibliotecas.
"Formación de subconjuntos" se refiere a un
método de comparación de secuencias de ácidos nucleicos de fuentes
diferentes o múltiples que se puede usar para evaluar el perfil de
expresión de las secuencias de ácidos nucleicos que reflejan la
actividad de transcripción genética y la estabilidad de mensaje en
un tejido particular, en un momento particular o bajo condiciones
particulares.
"Promotor" se refiere a una secuencia de
ácido nucleico ubicada hacia el extremo 5' con respecto al codón de
iniciación de la traducción de un marco de lectura abierto (o región
que codifica una proteína) de un gen y que participa en el
reconocimiento y la unión de la ARN polimerasa II y otras proteínas
(factores de transcripción que actúan en trans) para iniciar la
transcripción. Un "promotor vegetal" es un promotor nativo o no
nativo que es funcional en células vegetales. Los promotores
constitutivos son funcionales en la mayoría o todos los tejidos de
una planta durante todo el desarrollo de la planta. Los promotores
específicos de tejidos, órganos o células se expresan única o
predominantemente en un tejido, órgano o tipo de célula particular,
respectivamente. En lugar de expresarse "específicamente" en un
tejido, órgano o tipo de célula dado, un promotor puede presentar
una expresión "mejorada", es decir, un nivel de expresión
mayor, en una parte (por ejemplo, tipo de célula, tejido u órgano)
de la planta en comparación con otras partes de la planta. Los
promotores regulados temporalmente son funcionales sólo o
predominantemente durante ciertos períodos del desarrollo de la
planta o en ciertos momentos del día, como, por ejemplo, en el caso
de los genes asociados con el ritmo circadiano. Los promotores
inducibles expresan selectivamente una secuencia de ADN unida
operativamente como respuesta a la presencia de un estímulo
endógeno o exógeno, por ejemplo por compuestos químicos (inductores
químicos) o como respuesta a señales medioambientales, hormonales,
químicos y/o del desarrollo. Los promotores inducibles o regulados
incluyen, por ejemplo, los promotores regulados por luz, calor,
estrés, inundaciones o sequía, fitohormonas, lesiones o sustancias
químicas, tal como etanol, jasmonato, ácido salicílico o
protectores.
Se puede emplear cualquier promotor vegetal como
secuencia reguladora en 5' para modular la expresión de uno o
varios genes particulares. Un promotor preferido sería un promotor
vegetal de la ARN polimerasa II. Los promotores vegetales de ARN
polimerasa II, como los de otros eucariotas superiores, presentan
estructuras complejas y están compuestos por varios elementos
distintivos. Uno de dichos elementos es la caja TATA o la caja
Goldberg-Hogness, que es necesaria para la expresión
correcta de genes eucariotas in vitro y una iniciación de la
transcripción precisa y eficaz in vivo. La caja TATA está
ubicada normalmente a aproximadamente de -25 a -35, es decir, a
25-35 pares de bases (pb) hacia el extremo 5' del
sitio de iniciación de la transcripción, o sitio protegido,
definido como la posición +1 (Breathnach y Chambon, Ann. Rev.
Biochem. 50: 349-383, 1981; Messing et al.,
En: Genetic Engineering of Plants, Kosuge et al., eds., págs.
211-227, 1983). Otro elemento común, la caja CCAAT,
está ubicado entre -70 y -100 pb. En plantas, la caja CCAAT puede
presentar una secuencia consenso diferente de la secuencia
funcionalmente análoga de los promotores de mamíferos (el análogo
vegetal se ha denominado "caja AGGA" para diferenciarla de su
homóloga animal; Messing et al., En: Genetic Engineering of
Plants, Kosuge et al., eds., págs. 211-227,
1983). Además, prácticamente todos los promotores incluyen
secuencias o potenciadores activadores adicionales hacia el extremo
5' (Benoist y Chambon, Nature 290: 304-310, 1981;
Gruss et al., Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU. 78:
943-947, 1981; y Khoury y Gruss, Cell 27:
313-314, 1983) que se extienden desde
aproximadamente -100 pb hasta -1,000 pb o más hacia el extremo 5'
del sitio de iniciación de la transcripción.
Cuando se fusionan a secuencias de ADN
heterólogas, dichos promotores producen normalmente la transcripción
de la secuencia fusionada de una manera que es similar a la de la
secuencia genética con la que el promotor está asociada
habitualmente. Los fragmentos promotores que incluyen secuencias
reguladoras se pueden agregar (por ejemplo, fusionar al extremo 5'
o insertar dentro de un promotor activo que posee sus propias
secuencias reguladoras parciales o completas (Fluhr et al.,
Science 232: 1106-1112, 1986; Ellis et al.,
EMBO J. 6: 11-16, 1987; Strittmatter y Chua, Proc.
Nat. Acad. Sci. EE.UU. 84: 8986-8990, 1987; Poulsen
y Chua, Mol. Gen. Genet. 214: 16-23, 1988; Comai
et al., Plant Mol. Biol. 15: 373-381, 1991).
Alternativamente, las secuencias reguladoras heterólogas se pueden
agregar a la región hacia el extremo 5' de un promotor inactivo,
truncado, por ejemplo, un promotor que solamente incluya el centro
TATA y, a veces, los elementos CCAAT (Fluhr et al., Science
232: 1106-1112, 1986; Strittmatter y Chua, Proc.
Nat. Acad. Sci. EE.UU. 84: 8986-8990, 1987; Aryan
et al., Mol. Gen. Genet. 225: 65-71,
1991).
Los promotores están compuestos normalmente de
múltiples "elementos reguladores de la transcripción que actúan
en cis", o simplemente "elementos cis", distintos, cada uno
de los cuales puede conferir un aspecto diferente del control
general de la expresión génica (Strittmatter y Chua, Proc. Nat.
Acad. Sci. EE.UU. 84: 8986-8990, 1987; Ellis et
al., EMBO J. 6: 11-16, 1987; Benfey et
al., EMBO J. 9: 1677-1684, 1990). A los
"elementos cis" se unen factores de proteínas que actúan en
trans y que regulan la transcripción. Algunos elementos cis se unen
a más de un factor y los factores de transcripción que actúan en
trans pueden interactuar, con diferentes afinidades, con más de un
elemento cis (Johnson y McKnight, Ann. Rev. Biochem. 58:
799-839, 1989). Los factores de transcripción, los
elementos cis correspondientes y el análisis de su interacción en
plantas se describen, por ejemplo, en: Martin, Curr. Opinions
Biotech. 7: 130-138, 1996; Murai, En: Methods in
Plant Biochemistry and Molecular Biology, Dashek, ed., CRC Press,
1997, págs. 397-422; y Methods in Plant Molecular
Biology, Maliga et al., eds., Cold Spring Harbor Press,
1995, págs. 233-300. Las secuencias promotoras de la
presente invención pueden contener "elementos cis" capaces de
modular la expresión génica.
Los elementos cis se pueden identificar mediante
varias técnicas, incluyendo análisis de deleción, es decir, la
deleción de uno o varios nucleótidos del extremo 5' o internos en el
promotor; análisis de proteínas de unión a ADN usando huellas con
la ADNasa I, interferencia por metilación, ensayos de cambio de
movilidad por electroforesis, huella genómica in vivo
mediante PCR mediada por ligación y otros ensayos convencionales; o
por similitud de secuencia con motivos de elementos cis conocidos
con los métodos de comparación de secuencia convencionales. La
estructura fina de un elemento cis se puede estudiar adicionalmente
por mutagénesis (o substitución) de uno o varios nucleótidos o con
otros métodos convencionales. Véase, por ejemplo, Methods in Plant
Biochemistry and Molecular Biology, Dashek, ed., CRC Press, 1997,
págs. 397-422; y Methods in Plant Molecular
Biology, Maliga et al., eds., Cold Spring Harbor Press, 1995,
págs. 233-300.
Los elementos cis se pueden obtener por síntesis
química o por clonación a partir de promotores que incluyen dichos
elementos y se pueden sintetizar con secuencias flanqueantes
adicionales que contengan sitios de enzimas de restricción útiles
para facilitar la subsiguiente manipulación. En una realización, los
promotores están compuestos de múltiples "elementos reguladores
de la transcripción que actúan en cis", o simplemente
"elementos cis", distintos, cada uno de los cuales puede
modular un aspecto diferente del control general de la expresión
génica (Strittmatter y Chua, Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU. 84:
8986-8990, 1987; Ellis et al., EMBO J. 6:
11-16, 1987; Benfey et al., EMBO J. 9:
1677-1684, 1990). Por ejemplo, las combinaciones de
regiones o fragmentos de elementos cis del promotor 35S pueden
presentar patrones de expresión específicos de tejidos (véase la
patente de los EE.UU. número 5.097.025). En una realización, se
pueden identificar regiones de secuencia que comprenden los
"elementos cis" de la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID
Nº: 38 usando programas de ordenador diseñados específicamente para
identificar los motivos, dominios o elementos cis dentro de las
secuencias por comparación con elementos cis conocidos o se pueden
usar para alinear múltiples secuencias reguladoras en 5' para
identificar nuevos elementos cis.
La presente invención incluye los elementos cis
de SEQ ID Nº: 38, o los homólogos de los elementos cis conocidos
por realizar la regulación genética que presentan homología con las
secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención. En la
bibliografía se conocen varios de dichos elementos, tal como los
elementos que son regulados por numerosos factores tal como luz,
calor o estrés; los elementos que son regulados o inducidos por
patógenos o sustancias químicas y similares. Dichos elementos
pueden regular la expresión génica de forma positiva o negativa,
según las condiciones. Los ejemplos de elementos cis incluyen, pero
sin limitaciones, elementos que responden a oxígeno (Cowen et
al., J. Biol. Chem. 268(36): 26904, 1993), elementos
reguladores ligeros (véase, por ejemplo, Bruce y Quaill, Plant Cell
2(11): 1081. 1990, y Bruce et al., EMBO J. 10: 3015,
1991), un elemento cis que responde al tratamiento con jasmonato de
metilo (Beaudoin y Rothstein, Plant Mol. Biol. 33: 835, 1997),
elementos que responden a ácido salicílico (Strange et al.,
Plant J. 11: 1315, 1997), elementos que responden al choque térmico
(Pelham et al., Trends Genet. 1: 31, 1985), elementos que
responden al estrés abiótico y por lesiones (Loace et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89: 9230, 1992; Mhiri et al.,
Plant Mol. Biol. 33: 257, 1997), elementos de temperatura baja
(Baker et al., Plant Mol. Biol. 24: 701, 1994; Jiang et
al., Plant Mol. Biol. 30: 679, 1996; Nordin et al., Plant
Mol. Biol. 21: 641, 1993; Zhou et al., J. Biol. Chem. 267:
23515, 1992) y elementos que responden a sequía (Yamaguchi et
al., Plant Cell 6: 251-264, 1994; Wang et
al., Plant Mol. Biol. 28: 605, 1995; Bray E. A. Trends in Plant
Science 2: 48, 1997).
La presente invención engloba entonces regiones,
dominios, fragmentos o "elementos cis" de las moléculas de
ácidos nucleicos descritas y los fragmentos de ácido nucleico pueden
incluir cualquier región contigua de las secuencias descritas. Las
regiones promotoras de la presente invención que se muestran en la
SEQ ID Nº: 38 pueden contener uno o varios elementos reguladores
incluyendo, sin limitaciones, "elementos cis" o dominios que
pueden regular la transcripción de secuencias de ADN unidas
operativamente en semillas de plantas y en los tejidos de dichas
semillas. Los tejidos de las semillas vegetales incluyen el embrión,
compuesto de células embrionarias y tejidos embrionarios, tal como
el escutelo, el endosperma, la aleurona y el recubrimiento de la
semilla.
Los promotores vegetales pueden incluir
promotores producidos por medio de la manipulación de promotores
conocidos para producir promotores sintéticos, quiméricos o
híbridos. Dichos promotores pueden combinar elementos cis de uno o
varios promotores, por ejemplo, por adición de una secuencia
reguladora heteróloga a un promotor activo con sus propias
secuencias reguladoras parciales o completas (Ellis et al.,
EMBO J. 6: 11-16, 1987; Strittmatter y Chua, Proc.
Nat. Acad. Sci. EE.UU. 84: 8986-8990, 1987; Poulsen
y Chua, Mol. Gen. Genet. 214: 16-23, 1988; Comai
et al., Plant. Mol. Biol. 15: 373-381, 1991).
Los promotores quimérico también se han desarrollado mediante la
adición de una secuencia reguladora heteróloga a la región 5' de un
promotor inactivo, truncado, es decir, un promotor que solamente
incluye el centro TATA y, optativamente, los elementos CCAAT (Fluhr
et al., Science 232: 1106-1112, 1986;
Strittmatter y Chua, Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU. 84:
8986-8990, 1987; Aryan et al., Mol. Gen.
Genet. 225: 65-71, 1991). Por consiguiente, la
presente invención comprende el diseño, la construcción y el uso de
promotores quiméricos o híbridos que comprenden al menos uno de los
elementos cis de SEQ ID Nº: 38 para modular la expresión de
secuencias de ácidos nucleicos unidas operativamente.
Las secuencias promotoras, los fragmentos,
regiones o elementos cis de las mismas de SEQ ID Nº: 38 pueden
transcribir las secuencias de ADN en tejido embrionario y por ello
pueden regular selectivamente la expresión de genes en estos
tejidos. Las secuencias promotoras que regulan la expresión génica
preferiblemente en tejidos embrionarios son de utilidad en la
transformación y para la expresión selectiva de genes en tejidos
maternos. Por ejemplo, los promotores mejorados de embriones pueden
ligarse operativamente a marcadores calificables, tal como GUS o
GFP. Estos genes reporter (indicadores) codifican para la
\beta-glucuronidasa y la proteína fluorescente
verde, respectivamente, y cuando están ligados operativamente a las
secuencias reguladoras en 5' de la presente invención, pueden ser
indicativos del potencial de transformación de los tejidos
embrionarios y para optimizar los parámetros de transformación y
regeneración. Las secuencias reguladoras en 5' de la presente
invención también se pueden usar para la transcripción selectiva de
cualquier gen de interés, incluyendo, pero sin limitaciones, los
genes destinados a mejorar los rasgos de calidad de las
semillas.
El advenimiento de las técnicas genómicas, que
comprenden técnicas moleculares y bioinformáticas, ha dado como
resultado una secuenciación y análisis rápidos de una gran cantidad
de muestras de ADN de un inmenso número de objetivos, incluyendo,
pero sin limitaciones, especies vegetales de importancia agronómica.
Para identificar las secuencias de ácidos nucleicos de la presente
invención en una base de datos o colección de secuencias de ADNc,
el primer paso comprende la construcción de bibliotecas de ADNc de
tejidos vegetales objetivo de interés. En resumen, las bibliotecas
de ADNc se construyen primero a partir de estos tejidos que se
cosechan en una etapa particular del desarrollo o en condiciones
ambientales determinadas. Al identificar los genes que se expresan
diferencialmente en los tejidos vegetales en las distintas etapas
del desarrollo, o en condiciones diferentes, se pueden identificar
y aislar las correspondientes secuencias reguladoras de dichos
genes. La obtención de imágenes de los transcritos permite
identificar las secuencias con preferencia por los tejidos
partiendo de la base de una obtención de imágenes específica de las
secuencias de ácidos nucleicos de una biblioteca de ADNc. El
término, obtención de imágenes de los transcritos, tal como se
utiliza en el presente documento, significa un análisis que permite
comparar la abundancia de los genes expresados en una o varias
bibliotecas. Los clones contenidos en una biblioteca de ADNc son
secuenciados y las secuencias se comparan con las secuencias
contenidas en bases de datos disponibles al público. Los métodos por
ordenador permiten que el investigador realice consultas que
comparan las secuencias de múltiples bibliotecas. El proceso permite
una identificación rápida de los clones de interés en comparación
con los métodos de hibridación por substracción convencionales
conocidos por los expertos en la técnica.
El uso de metodologías convencionales, permite
construir bibliotecas de ADNc a partir del ARNm (ARN mensajero) de
un tejido u organismo dado usando cebadores poli dT y transcriptasa
inversa (Efstratiadis, et al., Cell 7: 279, 1976; Higuchi,
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 73: 3146, 1976;
Maniatis, et al., Cell 8: 163, 1976; Land et al.,
Nucleic Acids Res. 9: 2251, 1981; Okayama, et al., Mol. Cell.
Biol. 2: 161, 1982; Gubler, et al., Gene 25: 263, 1983).
Se pueden emplear varios métodos para obtener
los construcciones de ADNc de longitud completa. Por ejemplo, se
puede utilizar la transferasa terminal para agregar colas
homopoliméricas de residuos dC a los grupos hidroxilo 3' libres
(Land, et al., Nucleic Acids Res. 9: 2251, 1981). Esta cola
se puede hibridar entonces con un oligo poli dG que puede actuar
como un cebador para la síntesis de la segunda cadena de longitud
completa de ADNc. Okayama y Berg, describen un método para obtener
construcciones de ADNc de longitud completa. Este método se ha
simplificado mediante el uso de adaptadores de cebadores sintéticos
que contienen tanto colas homopoliméricas para cebar la síntesis de
la primera y segunda cadena como sitios de restricción para la
clonación en vectores plásmidos (Coleclough, et al., Gene
34: 305, 1985) y de bacteriófagos (Krawinkel, et al., Nucleic
Acids Res. 14: 1913, 1986; y Han, et al., Nucleic Acids Res.
15: 6304, 1987).
Estas estrategias se pueden asociar a
estrategias adicionales para aislar poblaciones raras de ARNm. Por
ejemplo, una célula de mamífero normal contiene entre 10.000 y
30.000 secuencias diferentes de ARNm. Davidson, Gene Activity in
Early Development, 2ª ed., Academic Press, Nueva York, 1976. La
cantidad de clones necesarios para alcanzar una probabilidad dada
sobre la presencia de un ARNm poco abundante en una biblioteca de
ADNc es N =
(ln(1-P))/(ln(1-1/n)),
en la que N es la cantidad de clones requerida, P es la probabilidad
deseada y 1/n es la fracción proporcional del ARNm total
representada por un ARNm poco común individual (Sambrook, et
al., 1989).
Un método para enriquecer las preparaciones de
ARNm en las secuencias de interés consiste en un fraccionamiento
por tamaño. Dicho método consiste en un fraccionamiento por
electroforesis a través de un gel de agarosa (Pennica, et
al., Nature 301: 214, 1983). Otro de tales métodos emplea
centrifugación con gradiente de sacarosa en presencia de un agente,
tal como hidróxido metilmercúrico, que desnaturaliza la estructura
secundaria en el ARN (Schweinfest, et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. (EE.UU.) 79: 4997-5000, 1982).
Un método adoptado con frecuencia consiste en
construir bibliotecas de ADNc equiparadas o normalizadas (Ko,
Nucleic Acids Res. 18: 5705, 1990; Patanjali, S. R. et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 88: 1943, 1991). Normalmente, la
población de ADNc se normaliza mediante hibridación por
substracción. Schmid, et al., J. Neurochem. 48: 307, 1987;
Fargnoli, et al., Anal. Biochem. 187: 364, 1990; Travis,
et al., Proc. Natl. Acad. Sci (EE.UU.) 85: 1696, 1988; Kato,
Eur. J. Neurosci. 2: 704, 1990; y Schweinfest, et al., Genet.
Anal. Tech. Appl. 7: 64, 1990). La substracción representa otro
método para reducir la población de algunas secuencias en la
biblioteca de ADNc. Swaroop, et al., Nucleic Acids Res. 19:
1954, 1991). Las bibliotecas normalizadas se pueden construir
usando el procedimiento de Soares (Soares et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. (EE.UU.) 91: 9228, 1994). Este enfoque está diseñado
para reducir la variación inicial de 10.000 veces en las frecuencias
de ADNc individuales para obtener abundancias relativas en un orden
de magnitud, manteniendo al mismo tiempo la complejidad general de
las secuencias de la biblioteca. En el proceso de normalización, la
preponderancia de clones de ADNc de gran abundancia disminuye
drásticamente, los clones con una abundancia mediana permanecen
relativamente sin cambios y los clones de transcritos poco comunes
aumentan de manera efectiva en cuanto a su abundancia.
Las EST pueden secuenciarse mediante varios
métodos. Se pueden utilizar dos métodos básicos para la
secuenciación de ADN, el método de terminación de cadena de Sanger
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 74: 5463, 1977 y el
método de degradación química de Maxam y Gilbert, Proc. Nat. Acad.
Sci. (EE.UU.) 74: 560, 1977. La automatización y los avances
tecnológicos, tal como la sustitución de la secuenciación basada en
radioisótopos por la secuenciación basada en fluorescencia, han
reducido los esfuerzos necesarios para secuenciar el ADN (Craxton,
Methods, 2: 20, 1991; Ju et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
(EE.UU.) 92: 4347, 1995; Tabor y Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci.
(EE.UU.) 92: 6339, 1995). Los secuenciadores automáticos se pueden
adquirir de numerosos proveedores, por ejemplo, Pharmacia Biotech,
Inc., Piscataway, Nueva Jersey (Pharmacia ALF),
LI-COR, Inc., Lincoln, Nebraska
(LI-COR 4,000) y Millipore, Bedford, Massachusetts
(Millipore BaseStation).
Se ha encontrado que las EST de más de 150 pb
son de utilidad para las búsquedas de similitud y el mapeo. (Adams,
et al., Science 252: 1651, 1991. Las secuencias de EST varían
normalmente en un intervalo de 150-450 bases. Esta
es la longitud de la información de secuencia que se genera
habitualmente y de manera fidedigna utilizando datos de secuencia
de una única serie. Normalmente, sólo se obtienen datos de secuencia
de una única serie de una biblioteca de ADNc, Adams, et al.,
Science 252: 1651, 1991. La secuenciación automática de una única
serie normalmente da como resultado un error o tasa de ambigüedad de
bases de aproximadamente el 2-3%. (Boguski, et
al., Nature Genetics, 4: 332, 1993).
Se han construido, o parcialmente construido,
bases de datos de EST a partir de, por ejemplo, C. elegans
(McCombrie, et al., Nature Genetics 1: 124, 1992), línea de
células hepáticas humanas HepG2 (Okubo, et al., Nature
Genetics 2: 173, 1992); ARN de cerebro humano (Adams, et
al., Science 252: 1651, 1991; Adams, et al., Nature 355:
632, 1992); Arabidopsis, (Newman, et al., Plant Physiol.
106: 1241, 1994); y arroz (Kurata, et al., Nature Genetics
8: 365, 1994). La presente invención emplea EST aisladas de varias
bibliotecas preparadas a partir de tejido embrionario y de callos
de maíz como una herramienta para identificar las secuencias
promotoras asociadas con los genes expresados en estos tejidos
deseados, que luego facilita el aislamiento de las secuencias
reguladoras en 5', tal como promotores, que regulan a estos
genes.
Los análisis de secuencia por ordenador se
pueden usar para identificar secuencias expresadas diferencialmente
incluyendo, pero sin limitaciones, aquellas secuencias expresadas en
un tejido en comparación con otro tejido. Por ejemplo, se puede
encontrar un conjunto diferente de secuencias del ADNc aislado del
tejido vegetal aislado de tejido radicular frente a tejido foliar.
Por consiguiente, se pueden comparar secuencias de bibliotecas de
ADNc preparadas a partir de plantas cultivadas bajo diferentes
condiciones ambientales o fisiológicas. Una vez identificadas las
secuencias preferidas de la biblioteca de ADNc de interés, los
clones genómicos se pueden aislar de una biblioteca genómica
preparada a partir del tejido vegetal, y se pueden identificar y
aislar las correspondientes secuencias reguladoras incluyendo, pero
sin limitaciones, secuencias reguladoras en 5'.
En una realización preferida, las secuencias de
las etiquetas de secuencia expresada (EST) de diversas bibliotecas
de ADNc son catalogadas en una base de datos de secuencias. Esta
base de datos se utiliza para identificar objetivos promotores de
un tejido particular de interés. La selección de las etiquetas de
secuencia expresada para el subsiguiente aislamiento del promotor
refleja la presencia de una o varias secuencias entre las EST
representativas de un muestreo aleatorio de una biblioteca de ADNc
individual, o una colección de bibliotecas de ADNc. Por ejemplo, la
identificación de secuencias reguladoras de la expresión de
transcritos en tejido embrionario o de callos se efectúa por la
identificación de las EST halladas en bibliotecas de ADNc preparadas
a partir de tejido embrionario o de callos y ausente o menos
abundantes en otras bibliotecas de ADNc en la base de datos. Las
EST más importantes se evalúan entonces por su relativa abundancia
dentro de la biblioteca y se evalúa el perfil de expresión para una
EST dada. El término abundancia, tal como se utiliza en el presente
documento, significa la cantidad de veces que aparece un clon o una
agrupación de clones en una biblioteca. De esta manera se
identifican las secuencias que están mejoradas o en gran abundancia
en un tejido u órgano específico que representa un perfil de
expresión objetivo y se pueden diseñar cebadores a partir de las
secuencias de EST identificadas. Se puede usar un enfoque basado en
PCR para amplificar las regiones flanqueantes de una biblioteca
genómica de la planta objetivo de interés. Los expertos en la
técnica conocen varios métodos para amplificar secuencias de ADN
desconocidas adyacentes a una región central de secuencia conocida.
Los métodos incluyen, pero sin limitaciones, PCR inversa (IPCR),
PCR vectorette, PCR conformada como Y, así como enfoques de
desplazamiento por el genoma.
En una realización preferida, el ADN genómico
ligado a un adaptador es sometido a una ronda primaria de
amplificación por PCR con un cebador específico de genes y un
cebador que puede alinearse con la secuencia adaptadora. El
producto de la PCR se utiliza luego como molde para una ronda de
amplificación por PCR anidada con un segundo cebador específico de
genes y un segundo adaptador. A continuación, los fragmentos
resultantes de la reacción de PCR anidada se aíslan, purifican y
subclonan en un vector apropiado. Los fragmentos son secuenciados y
se pueden identificar los sitios de iniciación de la traducción
cuando la EST deriva de un ADNc truncado. Los fragmentos se pueden
clonar en vectores de expresión vegetales como fusiones de
transcripción o traducción con un gen reporter, tal como
\beta-glucuronidasa (GUS). Los construcciones se
pueden evaluar mediante análisis transitorios y a continuación las
regiones reguladoras en 5' se ligan operativamente a otros genes y
secuencias reguladoras de interés en un vector de transformación
vegetal adecuado y se analiza la expresión del o de los genes de
interés en las plantas transformadas mediante cualquiera de varios
métodos conocidos por los expertos en la técnica.
Se puede emplear cualquier planta para la
identificación de genes y secuencias reguladoras. Los ejemplos de
objetivos vegetales adecuados para el aislamiento de genes y
secuencias reguladoras incluyen, pero sin limitaciones, Acacia,
alfalfa, manzano, albaricoquero, Arabidopsis, alcachofa, rúcula,
espárrago, aguacate, banana, cebada, judías, remolacha, zarzamora,
arándano, brócoli, col, repollo, canola, melón cantalupa, zanahoria,
mandioca, ricino, coliflor, apio, cerezo, achicoria, cilantro,
cítricos, clementinas, trébol, coco, café, maíz, algodón, pepino,
abeto Douglas, berenjena, endibias, escarola, eucalipto, hinojo,
higo, ajo, calabaza, uva, pomelo, melón dulce, Pachyrhizus
erosus, kiwi, lechuga, puerro, limón, lima, pino de incienso,
linaza, mango, melón, champiñones, nectarina, nueces, avena,
palmera, colza, quimbombó, olivo, cebolla, naranjo, una planta
ornamental, palmera, papaya, perejil, pastinaca, guisante,
melocotón, cacahuete, pera, pimiento, caqui, pino, piña, plátano,
ciruelo, granado, álamo, patata, calabaza, membrillo, pino radiata,
achicoria, rábano, semilla de colza, frambuesa, arroz, centeno,
sorgo, pino del sur, soja, espinaca, calabaza squash, fresa,
remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, batata, ocozol,
mandarina, té, tabaco, tomate, tritical, césped, nabo, vid, sandía,
trigo, hilaza y calabacín. Los objetivos vegetales particularmente
preferidos incluyen maíz, algodón, soja y trigo.
Las moléculas de ácido nucleico de la presente
invención se aíslan de maíz (Zea mays). La planta de maíz desarrolla
aproximadamente 20-21 hojas, estilos
aproximadamente 65 días después de la aparición y madura
aproximadamente 125 días después de la aparición. Las plantas de
maíz normales siguen un patrón general de desarrollo, pero el
intervalo de tiempo entre las diferentes etapas y la morfología
varía entre los distintos híbridos, y las condiciones de
crecimiento y ambientales.
Existen varias etapas identificables en el
desarrollo de las plantas de maíz. Las etapas se definen como etapas
vegetativas (V) y reproductoras (R). Las subdivisiones de las
etapas V se designan numéricamente como V1, V2, V3, etc., hasta
V(n), donde (n) representa la última etapa foliar antes de la
formación de espiguillas (VT) y la primera etapa V es la etapa de
aparición (VE). Por ejemplo, VE es la aparición a partir del suelo
de la hoja de una plántula, V1 representa la primera hoja verdadera,
V2 representa la segunda hoja, etc. Las etapas reproductoras
comprenden desde la primera aparición de estilos hasta la semilla
madura y se representan de la siguiente manera: R1 es la formación
de estilos, R2 es la formación de vesículas, R3 es la etapa lechosa,
R4 es la etapa de formación de masa, R5 es la etapa dentada y R6 es
la madurez fisiológica (véase por ejemplo, Ritchie SW et al.
(1986) How a Corn Plant Develops, Universidad de Ciencia y
Tecnología del Estado de Iowa, Servicio de Extensión Cooperativa,
Ames, Iowa, IA 48: 1-21).
Se puede emplear cualquier tipo de tejido
vegetal como tejido objetivo para la identificación de genes y las
secuencias reguladoras asociadas, incluyendo, pero sin limitaciones,
las secuencias promotoras. En la presente invención se utilizó
tejido de maíz. Se prefieren emplear tejidos embrionarios de maíz o
callos de maíz como tejidos objetivo para la identificación de las
secuencias promotoras. Se construyeron bibliotecas de ADNc de maíz
a partir de tejido embrionario aislado de maíz veintiún días después
de la polinización (21-DAP) y trece días después de
la polinización (13-DAP) y tejido de callos de maíz
Tipo II.
Se puede utilizar cualquier método que permita
una comparación diferencial entre diferentes tipos o clases de
secuencias para aislar los genes o las secuencias reguladoras de
interés. Por ejemplo, en un enfoque de búsqueda diferencial, se
preparó una biblioteca de ADNc a partir de ARNm de un tejido
particular en un huésped bacteriófago usando un kit de clonación
disponible comercialmente. Las colonias se dispersan sobre placas
que contienen un manto con un huésped bacteriano, tal como E.
coli, para generar placas de bacteriófago. Se pueden levantar
aproximadamente 105-106 placas con las membranas de
unión de ADN. Se efectúan pruebas con sondas con membranas por
duplicado usando sondas generadas a partir del ARNm de los tejidos
objetivo y no objetivo para determinar la expresión diferencial
entre el tejido objetivo y un tejido no objetivo o expresión basal.
Las sondas se marcan para facilitar su detección después de
hibridación y desarrollo. Se pueden seleccionar las placas que se
hibridan con las sondas derivadas del tejido objetivo, pero no las
sondas derivadas del tejido no objetivo, que presentan el patrón de
expresión diferencial deseado para su posterior análisis. Las
bibliotecas de ADN genómico también se pueden preparar a partir de
una especie elegida por digestión parcial con una enzima de
restricción y selección según el tamaño de los fragmentos de ADN
dentro de un intervalo de tamaño particular. El ADN genómico puede
clonarse en un vector adecuado incluyendo, pero sin limitaciones,
un bacteriófago, y prepararse usando un kit adecuado como se
describió anteriormente (véase, por ejemplo, Stratagene, La Jolla,
CA o Gibco BRL Gaithersburg, MD).
Las técnicas de hibridación diferencial
descritas son bien conocidas por los expertos en la técnica y se
pueden usar para aislar una clase de secuencias deseada. El
término, clases de secuencias, tal como se utiliza en el presente
documento, se refiere a aquellas secuencias que se pueden agrupar
partiendo de la base de un identificador común incluyendo, pero sin
limitaciones, secuencias aisladas de una planta objetivo común, una
biblioteca común o un tipo de tejido vegetal común. En una
realización preferida, las secuencias de interés se identifican
partiendo de la base del análisis de la secuencia y de la consulta
de una colección de diversas secuencias de ADNc de bibliotecas
provenientes de diferentes tipos de tejidos. El método descrito
proporciona un ejemplo de un enfoque de búsqueda diferencial basado
en análisis de secuencia electrónico de las EST de plantas derivadas
de diversas bibliotecas de ADNc.
Varios métodos utilizados para evaluar la
expresión génica se basan en la medición del nivel de ARNm en una
muestra de órgano, tejido o célula. Los métodos habituales incluyen,
pero sin limitaciones, blot (inmunotransferencia) de ARN, ensayos
con protección por ribonucleasas y RT-PCR. En otra
realización preferida, se emplea un método de alto rendimiento por
el cual es posible identificar varias secuencias reguladoras con
enfoque de perfilamiento de transcritos. El desarrollo de la
tecnología de microordenamiento de ADNc permite la monitorización
sistemática de los perfiles de expresión génica para miles de genes
(Schena et al, Science, 270: 467, 1995). Esta tecnología de
ADN basada en chips permite el ordenamiento de miles de secuencias
de ADNc sobre un superficie de soporte. Estos ordenamientos son
hibridados simultáneamente con múltiples sondas de ADNc marcado
preparado a partir de muestras de ARN de diferentes tipos de
células o tejidos, permitiendo un análisis de expresión comparativo
directo. Esta tecnología se demostró primero analizando la expresión
diferencial en 48 genes de Arabidopsis provenientes de raíces y
brotes (Schena et al, Science, 270: 467, 1995). Más
recientemente, se monitorizaron los perfiles de expresión de más de
1400 genes usando microordenamiento de ADNc (Ruan et al, The
Plant Journal 15: 821, 1998). Los microordenamientos proporcionan
un método cuantitativo de gran rendimiento y reproducible para
analizar la expresión génica y caracterizar la función de los genes.
El enfoque de perfilamiento de transcritos usando
microordenamientos proporciona entonces otra herramienta valiosa
para el aislamiento de secuencias reguladoras, tal como promotores,
asociadas con estos genes.
La presente invención emplea análisis de
secuencia de gran rendimiento para conformar el fundamento de una
rápida identificación por ordenador de las secuencias de interés.
Los expertos en la técnica comprenderán los recursos disponibles
para los análisis de secuencia. Las comparaciones de secuencia se
pueden llevar a cabo determinando la similitud de la secuencia de
prueba o consulta con secuencias que se encuentran en bases de
datos disponibles al público o registradas ("análisis de
similitud") o buscando ciertos motivos ("análisis de secuencia
intrínseco") (por ejemplo, elementos cis) (Coulson, Trends in
Biotechnology, 12: 76, 1994; Birren, et al., Genome
Analysis, 1: 543, 1997).
La secuencia de nucleótidos proporcionada en la
SEQ ID Nº: 38 o fragmentos de la misma o complementos de la misma,
o una secuencia de nucleótidos al menos idéntica en un 90%,
preferiblemente idéntica en un 95%, incluso más preferiblemente
idéntica en un 99% o 100% a la secuencia proporcionada en la SEQ ID
Nº: 38 o fragmentos de la misma, o complementos de la misma, se
pueden "proporcionar" en diversos medios para facilitar su uso.
Tal medio también puede proporcionar un subconjunto de las mismas
en una forma que permita al experto en la técnica examinar las
secuencias.
En una aplicación de esta realización, la
secuencia de nucleótidos de la presente invención puede registrarse
en un medio para lectura por ordenador. Tal como se utiliza en el
presente documento, "un medio para lectura por ordenador" se
refiere a cualquier medio que pueda ser leído y al cual se pueda
acceder directamente con un ordenador. Dichos medios incluyen, pero
sin limitaciones: medios de almacenamiento magnéticos, tal como
disquetes, discos duros, medios de almacenamiento y cintas
magnéticas; medios de almacenamiento ópticos, tal como
CD-ROM; medios de almacenamiento eléctricos, tal
como RAM y ROM; y también híbridos de estas categorías, tal como
medios de almacenamiento magnéticos/ópticos. El experto en la
técnica comprenderá rápidamente la forma de utilizar cualquiera de
los medios para lectura por ordenador conocidos en la actualidad
para crear un producto que comprenda un medio para lectura por
ordenador en el cual se haya registrado una secuencia de
nucleótidos de la presente invención.
Al proporcionar una o varias de las secuencias
de nucleótidos de la presente invención, el experto en la técnica
puede acceder rutinariamente a la información de secuencia para
diversos fines. Las secuencias se pueden analizar mediante varios
métodos, tales como mediante análisis de las secuencias sin la ayuda
del software diseñado para dicho propósito. El software de
ordenador también se encuentra disponible al público para permitir
que los expertos en la técnica accedan a la información de
secuencia provista en un medio de lectura por ordenador. Los
ejemplos de bases de datos públicas incluirán, sin limitaciones, la
Base de Datos de ADN de Japón (DDBJ) (http: //www.ddbj.nig.ac.jp/);
Genebank (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/web/Genbank/Index.html); y la
Base de Datos de Secuencias de Ácidos Nucleicos del Laboratorio de
Biología Molecular Europeo [European Molecular Biology Laboratory
Nucleic Acid Sequence Database] (EMBL)(http:
//www.ebi.ac.uk/ebi_docs/embl_db.html) o versiones de las mismas.
Se han desarrollado varios algoritmos de búsqueda diferentes,
incluyendo, pero sin limitaciones, el conjunto de programas
denominados BLAST. Hay cinco implementaciones de BLAST, tres
diseñadas para consultas por secuencias de nucleótidos (BLASTN,
BLASTX y TBLASTX) y dos diseñadas para consultas sobre secuencias de
proteínas (BLASTP y TBLASTN) (Coulson, Trends in
Biotechnology, 12: 76-80, 1994; Birren, et
al., Genome Analysis, 1: 543, 1997).
También es de utilidad cualquier programa
diseñado para la búsqueda de motivos en la presente invención. Los
programas de análisis de secuencia diseñados para la búsqueda de
motivos se pueden usar para la identificación de elementos
cis. Los programas de ordenador preferidos incluyen, pero sin
limitaciones, MEME, SIGNAL SCAN y GENESCAN. Meme es un programa que
identifica motivos conservados (ya sean de ácidos nucleicos o de
péptidos) en un grupo de secuencias no alineadas. Meme guarda estos
motivos como un conjunto de perfiles. Estos perfiles se pueden usar
para efectuar búsquedas en una base de datos de secuencias. El
algoritmo MEME (versión 2.2) se puede encontrar en la versión 10.0
del paquete GCG; MEME (T. Bailey y C. Elkan, Machine
Learning, 21(1-2):
51-80,1995 y la dirección de la página de web es:
(http: //www.sdsc.edu/MEME/meme/website/COPYRIGHT.html.).
SignalScan es un programa que identifica motivos conocidos en las
secuencias de prueba usando información de otras bases de datos de
motivos (Prestridge, D.S., CABIOS 7, 203-206
(1991). La información sobre SignalScan versión 4.0 se encuentra
disponible en la siguiente dirección de página de web: http:
//biosci.cbs.umn.edu/software/sigscan.html. El sitio ftp para
Signal Scan es ftp: //biosci.cbs.umn.edu/software/sigscan.html. Las
bases de datos usadas con Signal Scan incluyen PLACE (http:
//www.dna.affrc.go.ip/htdocs/PLACE (Higo et al., Nucleic
Acids Research 27(1): 297-300 (1999) y
TRANSFAC (Heinemeye, X. et al., Nucleic Acid Research
27(1): 318-322) que se pueden encontrar en
la siguiente página de web: http: //transfac.gbf.de/. GeneScan es
otro programa adecuado para la búsqueda de motivos (Burge, C y
Karlin, S. J. Mol. Biol. 268, 78-94 (1997) y
la información sobre la versión 1.0 se encuentra disponible en la
siguiente dirección de página de web: http:
//gnomic.stanford.edu/GENESCANW.html. Tal como se utiliza en el
presente documento, "un motivo estructural objetivo" o
"motivo objetivo" se refiere a cualquier secuencia o
combinación de secuencias seleccionada racionalmente, donde la o las
secuencias se eligen partiendo de la base de su configuración
tridimensional que se forma con el plegamiento del motivo objetivo.
Existe una gran variedad de motivos objetivos conocidos por los
expertos en la técnica. Los motivos objetivo de proteínas incluyen,
pero sin limitaciones, sitios enzimáticos activos y secuencias
señal. Motivos objetivo preferidos de la presente invención
incluyen, pero sin limitaciones, secuencias promotoras, elementos
cis, estructuras en horquilla y otros elementos de expresión,
tal como secuencias de unión a proteínas.
Tal como se utiliza en el presente documento, el
término "medios de búsqueda" se refiere a uno o varios
programas que se implementan en un sistema por ordenador para
comparar una secuencia objetivo o un motivo estructural objetivo
con la información de secuencia guardada en los medios de
almacenamiento de datos. Los medios de búsqueda se utilizan para
identificar fragmentos o regiones de las secuencias de la presente
invención que coincidan con una secuencia objetivo o motivo
objetivo particular. Además, se pueden comparar múltiples secuencias
con el fin de identificar las regiones o motivos comunes que pueden
ser responsables de funciones específicas. Por ejemplo, los
elementos cis o los dominios de secuencia que confieren un
perfil de expresión específico se pueden identificar cuando se
alinean y analizan múltiples regiones promotoras de clases de
promotores similares utilizando determinados paquetes de
software.
La presente invención proporciona además
sistemas, en particular sistemas por ordenador, que contienen la
información de secuencia descrita en el presente documento. Tal como
se utiliza en el presente documento, un "sistema por
ordenador" se refiere al hardware, software y los medios de
almacenamiento de datos usados para analizar la información sobre
las secuencias de nucleótidos de la presente invención. El hardware
mínimo de los sistemas por ordenador de la presente invención
comprende una unidad de procesamiento central (CPU), medios de
entrada, medios de salida y medios de almacenamiento de datos. Los
expertos en la técnica comprenderán que cualquiera de los
diferentes de sistemas por ordenador disponibles es adecuado para su
uso en la presente invención y que dichos programas proporcionan un
medio eficaz para el análisis de datos de secuencia comparados con
un análisis por inspección de las secuencias sin la ayuda de los
sistemas por ordenador.
Las SEQ ID Nº: 6-35 son
cebadores diseñados a partir de secuencias de ADNc identificadas
mediante las comparaciones de secuencia obtenidas por ordenador.
Estas secuencias se utilizan para extender la secuencia de ácido
nucleico usando técnicas de amplificación con la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) (véase por ejemplo, Mullis et al.,
Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263, 1986; Erlich, et
al., solicitud de patente europea 50.424; solicitud de patente
europea 84.796, solicitud de patente europea 258.017, solicitud de
patente europea 237.362; Mullis, solicitud de patente europea
201.184; Mullis, et al., patente de los EE.UU. número
4.683.202; Erlich, patente de los EE.UU. número 4.582.788; y Saiki,
et al., patente de los EE.UU. número 4.683.194). Los
expertos en la técnica conocen varios métodos de amplificación por
PCR y se emplean para identificar secuencias de ácidos nucleicos
adyacentes a una secuencia conocida. Por ejemplo, se han descrito
métodos de PCR inversa (IPCR) para amplificar secuencias de ADN
desconocidas adyacentes a una región central de una secuencia
conocida. También hay otros métodos, tal como PCR por captura
(Lagerstrom M., et al., PCR Methods Applic. 1: 111, 1991) y
PCR por desplazamiento (Parker, JD et al., Nucleic Acids Res
19: 3055, 1991). Muchos proveedores también han desarrollado kits
basados en modificaciones de estos métodos con el fin de una
identificación de las secuencias de interés. Los avances técnicos,
incluyendo mejoras en el diseño de cebadores y adaptadores, mejoras
en la enzima polimerasa y en las características del termociclador,
han permitido métodos más rápidos y eficaces para el aislamiento de
las secuencias de interés.
En una realización preferida, las secuencias
flanqueantes que contienen los elementos reguladores en 5' de la
presente invención sen aíslan usando un enfoque de desplazamiento
por el genoma (kit Universal GenomeWalkerMR, CLONTECH Laboratories,
Inc., Palo, Alto, CA). En resumen, el ADN genómico purificado se
somete a una digestión con una enzima de restricción que produce
fragmentos de ADN genómico con extremos que se ligan con adaptadores
GenomeWalkerMR. Se usan cebadores GenomeWalkerMR junto con
cebadores específicos de genes en dos reacciones consecutivas de
PCR (reacciones de PCR primaria y anidada) para producir productos
de PCR que contienen las secuencias reguladoras en 5', que a
continuación se clonan y se secuencian.
Además de su uso para modular la expresión
génica, las secuencias promotoras de la presente invención también
son de utilidad como sondas o cebadores en experimentos de
hibridación de ácidos nucleicos. Las sondas y cebadores de ácidos
nucleicos de la presente invención se pueden hibridar bajo
condiciones astringentes con una secuencia de ADN objetivo. El
término "condiciones de hibridación astringentes" se define
como aquellas condiciones bajo las cuales una sonda o un cebador se
hibrida específicamente con una o varias secuencias objetivo y no
con secuencias que no son objetivo, determinado empíricamente. El
término "condiciones astringentes" se define funcionalmente
con respecto a la hibridación de una sonda de ácidos nucleicos con
un ácido nucleico objetivo (es decir, con una secuencia particular
de ácido nucleico de interés) con el procedimiento de hibridación
específico que se describe en Sambrook et al., 1989, en
9.52-9.55. Véase también, Sambrook et al.,
1989 en 9.47-9.52, 9.56-9.58;
Kanehisa, Nucl. Acids Res. 12: 203-213, 1984;
y Wetmur y Davidson, J. Mol. Biol. 31:
349-370, 1968. Las condiciones de astringencia
apropiadas que promueven una hibridación de ADN, por ejemplo,
cloruro de sodio/citrato de sodio 6,0 x (SSC) a aproximadamente
45ºC, seguido de un lavado de SSC 2,0 x a 50ºC, son conocidas por
los expertos en la técnica o se pueden consultar en Current
Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y.,
1989, 6.3.1-6.3.6. Por ejemplo, la concentración de
sales en el paso de lavado se puede seleccionar entre una baja
astringencia de aproximadamente SSC 2,0 x a 50ºC a una alta
astringencia de aproximadamente SSC 0,2 x a 50ºC. Además, se puede
aumentar la temperatura en el paso de lavado desde condiciones de
baja astringencia a temperatura ambiente, aproximadamente 22ºC,
hasta condiciones de astringencia alta a aproximadamente 65ºC. Se
puede variar tanto la temperatura como la concentración salina, o
bien, se puede mantener constante la temperatura o la concentración
de sales en tanto se cambia la otra variable.
Por ejemplo, la hibridación usando sondas o
cebadores de ADN o ARN se puede efectuar a 65ºC en SSC 6x, SDS
0,5%, Denhardt 5x, ADN no específico 100 \mug/ml (por ejemplo, ADN
de esperma de salmón sonicado) con lavado de SSC 0,5x, SDS 0,5% a
65ºC, para lograr una gran astringencia.
Se considera que las condiciones de hibridación
con una astringencia menor, tal como una hibridación más baja y/o
temperaturas de lavado más bajas, se pueden usar para identificar
secuencias relacionadas que presentan un grado menor de similitud
de secuencia si se conserva la especificidad de unión de la sonda o
del cebador con la o las secuencias objetivo. Por consiguiente, las
secuencias de nucleótidos de la presente invención se pueden usar
por su capacidad para formar, selectivamente, moléculas dobles con
extensiones complementarias de fragmentos de ADN. La detección de
segmentos de ADN por medio de hibridación es bien conocida por los
expertos en la técnica y entonces, según la aplicación considerada,
será deseable emplear condiciones de hibridación variables para
lograr grados variables de selectividad de la sonda con respecto a
la secuencia objetivo y la elección del método dependerá de los
resultados deseados.
La secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID Nº:
38 y cualquier variante de la misma, pueden hibridarse con otras
secuencias de ácidos nucleicos bajo condiciones de astringencia
apropiadamente seleccionadas. Tal como se utiliza en el presente
documento, se dice que dos moléculas de ácidos nucleicos tienen
capacidad de hibridarse específicamente entre sí, si las dos
moléculas pueden formar una estructura de ácido nucleico de cadena
doble, antiparalela. Se dice que una molécula de ácido nucleico es
el "complemento" de otra molécula de ácido nucleico si
muestran una complementariedad completa. Tal como se utiliza en el
presente documento, se dice que las moléculas muestran una
"complementariedad completa" cuando cada uno de los nucleótidos
de una de las moléculas es complementario a un nucleótido de la
otra. Se dice que dos moléculas son "mínimamente
complementarias" si se pueden hibridar entre sí con suficiente
estabilidad como para permitir que permanezcan alineadas entre sí
bajo condiciones convencionales de al menos "baja
astringencia". De manera similar, se dice que las moléculas son
"complementarias" si se pueden hibridar entre sí con suficiente
estabilidad como para permitirles permanecer alineadas entre sí
bajo condiciones convencionales de "gran astringencia". Las
condiciones convencionales de astringencia fueron descritas por
Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, 2^{a} Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring
Harbor, Nueva York, 1989, y por Haymes et al., Nucleic
Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press,
Washington, DC, 1985.
En una realización preferida, la secuencia de
ácidos nucleicos de SEQ ID Nº: 38, o un fragmento, una región,un
elemento cis o un oligómero de estas secuencias, se pueden
usar en ensayos de hibridación de otros tejidos vegetales para
identificar genes y secuencias reguladoras asociadas muy
relacionadas u homólogas. Estas incluyen, pero sin limitaciones,
ensayos de hibridación Southern o Northern en cualquier substrato
incluyendo, pero sin limitaciones, un tejido vegetal apropiadamente
preparado, celulosa, nylon, o filtro de combinación, chip o placa
de vidrio. Dichas metodologías son bien conocidas en la técnica y se
encuentran disponibles en un kit o una preparación que pueden
suministrar proveedores comerciales.
Por supuesto, los fragmentos también se pueden
obtener mediante otras técnicas tal como por síntesis directa del
fragmento por medios químicos, de práctica común utilizando un
sintetizador automático de oligonucleótidos. Además, los fragmentos
se pueden obtener por aplicación de tecnología de reproducción de
ácidos nucleicos, tal como la tecnología PCR^{MR} (reacción en
cadena de la polimerasa) mediante técnicas de ADN recombinante
conocidas en general por los expertos en la técnica de la biología
molecular. Con respecto a la amplificación de una secuencia de
ácido nucleico objetivo (por ejemplo, por PCR) usando un par de
cebadores de amplificación particular, las "condiciones
astringentes para PCR" se refieren a condiciones que permitan que
el par de cebadores se hibride solamente con la secuencia de ácido
nucleico objetivo con la cual se uniría un cebador que posee la
correspondiente secuencia de tipo natural (o el complemento de la
misma) y preferiblemente para producir un único producto de
amplificación.
Un fragmento de un ácido nucleico, tal como se
utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier porción
del ácido nucleico que sea menor que la longitud completa. El
fragmento también puede comprender al menos una longitud mínima que
puede hibridarse específicamente con un ácido nucleico nativo en las
condiciones de hibridación astringentes definidas anteriormente. La
longitud de dicho fragmento mínimo es preferiblemente de al menos 8
nucleótidos contiguos, más preferiblemente 15 nucleótidos contiguos,
incluso más preferiblemente al menos 20 nucleótidos contiguos y lo
más preferiblemente al menos 30 nucleótidos contiguos de una
secuencia de ácido nucleico nativa.
Las secuencias de ácidos nucleicos de la
presente invención también se pueden usar como sondas y cebadores.
Las sondas y cebadores de ácido nucleico se pueden preparar
partiendo de la base de una secuencia genética nativa. Una
"sonda" es un ácido nucleico aislado a la cual se une una
molécula reporter o marca detectable convencional, por ejemplo, un
isótopo radioactivo, un ligando, un agente quimioluminiscente o una
enzima. Los "cebadores" son ácidos nucleicos aislados que se
alinean con una cadena de ADN objetivo complementaria por
hibridación de los ácidos nucleicos para formar un híbrido entre el
cebador y la cadena de ADN objetivo, luego se extienden a lo largo
de la cadena de ADN objetivo con una polimerasa, por ejemplo, una
ADN polimerasa. Los pares de cebadores se pueden usar para la
amplificación de una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, con
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otros métodos de
amplificación de ácidos nucleicos convencionales.
Las sondas y los cebadores son generalmente de
15 nucleótidos o más de longitud, preferiblemente de 20 nucleótidos
o más, más preferiblemente de 25 nucleótidos y lo más
preferiblemente de 30 nucleótidos o más. Dichas sondas y cebadores
se hibridan específicamente con una secuencia de ADN o ARN objetivo
bajo condiciones de hibridación de gran astringencia y se hibridan
específicamente con una secuencia nativa objetivo de otra especie
bajo condiciones de astringencia más baja. Preferiblemente, las
sondas y los cebadores según la presente invención presentan una
similitud de secuencia completa con la secuencia nativa, si bien se
pueden diseñar sondas que difieran de la secuencia nativa y que
conserven la capacidad para hibridarse con secuencias nativas
objetivo mediante métodos convencionales. Los métodos para preparar
y usar sondas y cebadores se describen, por ejemplo, en
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., vol.
1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (de aquí en
adelante, "Sambrook et al., 1989"); Current Protocols
in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene
Publishing y Wiley-InterScience, Nueva York,
1992 (con actualizaciones periódicas) (de aquí en adelante,
"Ausubel et al., 1992"); e Innis et al., PCR
Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press:
San Diego, 1990. Los pares de cebadores para PCR pueden derivar de
una secuencia conocida, por ejemplo, utilizando programas de
ordenador para tal fin, Primer (Versión 0.5, \ccirculo 1991,
Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA). Los
cebadores y las sondas basadas en las secuencias promotoras nativas
que se describen en el presente documento se pueden usar para
confirmar y, si fuera necesario, modificar las secuencias descritas
por métodos convencionales, por ejemplo, por una nueva clonación y
secuenciación.
En otra realización, se pueden modificar las
secuencias de nucleótidos de los promotores que se describen en el
presente documento. Los expertos en la técnica pueden crear
moléculas de ADN que presentan variaciones en la secuencia de
nucleótidos. La secuencia de nucleótidos de la presente invención
que se muestra en la SEQ ID Nº: 38 puede modificarse o alterarse
para mejorar sus características de control. Un método preferido de
alteración de una secuencia de ácido nucleico es el uso de PCR para
modificar nucleótidos seleccionados o regiones de secuencias. Estos
métodos son conocidos por los expertos en la técnica. Las secuencias
se pueden modificar, por ejemplo por inserción, supresión o
substitución de secuencias de molde en un enfoque de modificación
de ADN basado en PCR. Las moléculas de ADN "variantes" son
moléculas de ADN que contienen cambios en los cuales se suprime,
agrega y/o substituye uno o varios nucleótidos de la secuencia
nativa, preferiblemente conservando substancialmente la función
promotora. En el caso de un fragmento promotor, un ADN
"variante" puede incluir cambios que afectan la transcripción
de un promotor mínimo al cual está unido operativamente. Las
moléculas de ADN variantes se pueden producir, por ejemplo,
mediante técnicas habituales de mutagénesis de ADN o mediante
síntesis química de la molécula de ADN variante o una porción de la
misma.
En otra realización, la secuencia de nucleótidos
que se muestra en la SEQ ID Nº: 38 incluye secuencias de cualquier
longitud que pueden regular una secuencia de ADN unida
operativamente. Por ejemplo, la secuencia descrita en la SEQ ID Nº:
38 puede estar truncada o delecionada y conservar todavía la
capacidad de regular la transcripción de una secuencia de ADN unida
operativamente. En una realización relacionada, el elemento cis de
las secuencias descritas puede conferir una especificidad
particular, tal como conferir una expresión mejorada de las
secuencias de ADN unidas operativamente en tejidos embrionarios o de
callos y por ello también pueden regular la transcripción. En
consecuencia, se puede emplear cualquier fragmento, porción o región
de secuencia de las secuencias descritas como secuencias
reguladoras, incluyendo, pero sin limitaciones, elementos o motivos
cis. Por ejemplo, se puede suprimir uno o varios pares de bases del
extremo 5' o 3' de una secuencia promotora para producir un
promotor "truncado". También se puede insertar, suprimir o
sustituir uno o varios pares de bases ubicados internamente en la
secuencia promotora. Los promotores se pueden construir de manera
tal que los fragmentos o elementos promotores están ligados
operativamente, por ejemplo, ubicando dicho fragmento hacia el
extremo 5' de un promotor mínimo. Un promotor mínimo o basal es una
porción de ADN que puede reclutar y unirse a la maquinaria de
transcripción básica. Un ejemplo de la maquinaria de transcripción
básica en células eucariotas es el complejo de la ARN polimerasa II
y las proteínas accesorias del mismo. Los componentes enzimáticos
de la maquinaria de transcripción básica pueden iniciar la
transcripción y elongar un gen dado, utilizando un promotor mínimo
o basal. Es decir, no se agregan secuencias que actúan en cis en la
región promotora que puedan reclutar y unirse a los factores de
transcripción que modulan la transcripción, por ejemplo, que
mejoran, reprimen, hacen que la transcripción sea dependiente de
hormonas, etc. Se pueden combinar substituciones, deleciones,
inserciones o cualquier combinación de las mismas para producir una
construcción final.
Los ácidos nucleicos nativos o sintéticos según
la presente invención se pueden incorporar en construcciones
recombinantes de ácidos nucleicos, normalmente construcciones de
ADN, que pueden introducirse y replicarse en una célula huésped. En
una realización preferida, las secuencias de nucleótidos de la
presente invención que se muestran en la SEQ ID Nº: 38, o
fragmentos, variantes o derivados de la misma, se incorporan en un
vector de un casete de expresión que incluye las regiones promotoras
de la presente invención unidas operativamente a un componente
genético, tal como un gen marcador seleccionable, rastreable o
calificable. Las secuencias de ácidos nucleicos descritas de la
presente invención preferiblemente están unidas operativamente a un
componente genético, tal como un ácido nucleico que confiera la
característica deseada asociada con la morfología, fisiología,
crecimiento y desarrollo vegetal, rendimiento, mejoras
nutricionales, resistencia a enfermedades o plagas, o tolerancia al
medio ambiente o a sustancias químicas. Estos componentes genéticos,
tal como genes marcadores o genes de interés agronómico, pueden
funcionar en la identificación de una célula vegetal o planta
transformada, o para producir un producto de utilidad agronómica.
Las secuencias promotoras de la presente invención se pueden usar
para regular la expresión de cualquier secuencia unida
operativamente que puede transcribirse. Las secuencias unidas
operativamente que pueden transcribirse particularmente preferidas
incluyen, pero sin limitaciones, aquellas secuencias que se
expresan con preferencia en el tejido embrionario o de callos.
En una realización preferida, un componente
genético produce un producto que sirve como un dispositivo de
selección y funciona en un tejido vegetal regenerable para producir
un compuesto que le confiera al tejido vegetal resistencia a un
compuesto que de otra manera le sería tóxico. Los genes de interés
para su uso como marcadores seleccionables, rastreables o
calificables incluyen, pero sin limitaciones, GUS (región
codificante de la beta-glucuronidasa, GFP
(secuencia codificante de la proteína fluorescente verde), LUX
(región codificante de la luciferasa) o genes de tolerancia a
antibióticos o herbicidas. Los ejemplos de transposones y genes de
resistencia a antibiótico asociados incluyen los transposones Tns
(bla), Tn5 (nptII), Tn7 (dhfr), penicilinas, kanamicina (y
neomicina, G418, bleomicina); metotrexato (y trimetoprim);
cloranfenicol; kanamicina y tetraciclina.
Las características que son de utilidad como
marcadores seleccionables en plantas fueron descritas en un informe
sobre el uso de microorganismos (Advisory Committee on Novel Foods
and Processes, julio de 1994). Estos incluyen selección astringente
con una cantidad mínima de tejido no transformado, grandes
cantidades de sucesos de transformación independientes sin una
interferencia significativa con la regeneración, aplicación a una
gran cantidad de especies y disponibilidad de un ensayo para
calificar los tejidos por la presencia del marcador.
Se conocen varios genes marcadores
seleccionables en la técnica y diversos marcadores de resistencia a
antibióticos cumplen con estos criterios, incluyendo aquellos que
son resistentes a kanamicina (nptII), higromicina B (aph IV) y
gentamicina (aac3 y aacC4). Los genes marcadores seleccionables
dominantes que son de utilidad incluyen genes que codifican para
genes de resistencia a antibióticos (por ejemplo, resistencia a
higromicina, kanamicina, bleomicina, G418, estreptomicina o
espectinomicina); y genes de resistencia a herbicidas (por ejemplo,
fosfinotricinacetiltransferasa). Una estrategia útil para la
selección de transformantes por resistencia a herbicidas se
describe, por ejemplo, en Vasil, Cell Culture and Somatic Cell
Genetics of Plants, Vols. I-III, Laboratory
Procedures and Their Applications Academic Press, Nueva York, 1984.
Los genes marcadores seleccionables particularmente preferidos para
su uso en la presente invención serían genes que confieran
resistencia a compuestos tales como antibióticos, como kanamicina,
y herbicidas como glifosato (Della-Cioppa et
al., Bio/Technology 5(6), 1987, patente de los
EE.UU. 5.463.175, patente de los EE.UU. 5.633.435). También se
pueden poner en práctica otros dispositivos de selección y que aún
se consideran dentro del alcance de la presente invención.
Para la práctica de la presente invención, se
emplean composiciones y métodos y vectores y células huésped
convencionales en la preparación, tal como se describe, entre otros,
en Sambrook et al., 1989. En una realización preferida, la
célula huésped es una célula vegetal. Se han descrito varios
vectores adecuados para una transfección estable de células
vegetales o para establecer plantas transgénica en, por ejemplo,
Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual,
1985, supp. 1987); Weissbach y Weissbach, Methods for Plant
Molecular Biology, Academic Press, 1989; Gelvin et al.,
Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers,
1990; y R.R.D. Croy, Plant Molecular Biology LabFax, BIOS
Scientific Publishers, 1993. Los vectores de expresión vegetales
incluyen, por ejemplo, uno o varios genes vegetales clonados bajo el
control de transcripción de secuencias reguladoras en 5' y 3'.
También incluyen un marcador seleccionable tal como se describió
para seleccionar células huésped que contienen la construcción.
Dichos vectores de expresión vegetales también contienen una región
reguladora promotora (por ejemplo, una región reguladora que
controla una expresión inducible o constitutiva, regulada por el
medio ambiente o regulada por el desarrollo o específica de células
o de tejidos), un sitio de iniciación de la transcripción, un sitio
de unión a ribosoma, una señal de procesamiento de ARN, un sitio de
terminación de la transcripción y una señal de poliadenilación.
Otros tipos de secuencias reguladoras consideradas como componentes
genéticos en un vector de expresión incluyen, pero sin limitaciones,
una secuencia líder no traducida que se pueda acoplar con el
promotor. En una realización particularmente preferida, la célula
huésped es una célula vegetal y el vector de expresión vegetal
comprende una región promotora descrita en la SEQ ID Nº: 38. Los
vectores de expresión vegetales también pueden comprender secuencias
adicionales incluyendo, pero sin limitaciones, sitios de enzimas de
restricción que son de utilidad para los fines de la clonación.
Hay varios promotores que son de utilidad para
la expresión génica en plantas para cualquier gen de interés
incluyendo, pero sin limitaciones, marcadores seleccionables,
marcadores calificables, genes para la tolerancia a plagas,
tolerancia a enfermedades, para mejoras nutricionales y cualquier
otro gen de interés agronómico. Los ejemplos de promotores
constitutivos útiles en la expresión génica de plantas incluyen,
pero sin limitaciones, el promotor 35S del virus en mosaico de la
coliflor (CaMV), que confiere una expresión constitutiva, de nivel
alto en la mayoría de los tejidos vegetales (véase, por ejemplo,
Odel et al., Nature 313: 810, 1985), incluyendo
monocotiledóneas (véase, por ejemplo, Dekeyser et al.,
Plant Cell 2: 591, 1990; Terada y Shimamoto, Mol. Gen.
Genet. 220: 389, 1990); el promotor de la nopalina sintasa (An
et al., Plant Physiol. 88: 547, 1988) y el promotor
de la octopina sintasa (Fromm et al., Plant Cell 1:
977, 1989) y el promotor del virus en mosaico de la escrofularia
(FMV) (patente de los EE.UU. número 5.378.619 es un vector de
transformación vegetal de borde doble, bordes de
ADN-T derecho (BD) e izquierdo (BI), que consiste en
los siguientes componentes genéticos: ZM-700267629
es el promotor de la expresión mejorada en embriones de Zea
mays aislado de una biblioteca genómica de embriones de Zea
mays; el intrón I-Zm.Hsp70 es la secuencia
pertinente de la proteína de choque térmico de maíz descrita en las
patentes de los EE.UU. números 5.593.874 y 5.859.347); Ec.GUS: 1 es
la región codificante de la beta-glucuronidasa de
E. coli; T-AGRTU.nos es la señal de
terminación del gen de la nopalina sintasa,
P-CaMV.35S es el promotor CaMV 35S (patente de los
EE.UU. número 5.352.605).
Se puede utilizar una variedad de promotores de
genes vegetales que son regulados en respuesta a señales
ambientales, hormonales, químicas y/o del desarrollo para la
expresión de un gen unido operativamente en células vegetales,
incluyendo promotores regulados por (1) calor (Callis et al.,
Plant Physiol. 88: 965, 1988), (2) luz (por ejemplo, el
promotor de guisante rbcS-3A, Kuhlemeier et
al., Plant Cell 1: 471, 1989; el promotor rbcS de maíz,
Schaffner y Sheen, Plant Cell 3: 997, 1991; o el promotor de
la proteína de unión de clorofila a/b, Simpson et al.,
EMBO J. 4: 2723, 1985), (3) hormonas, tal como ácido
abscísico (Marcotte et al., Plant Cell 1: 969, 1989),
(4) lesiones (por ejemplo, wunI, Siebertz et al., Plant
Cell 1: 961, 1989); o (5) sustancias química, tal como
jasmonato de metilo, ácido salicílico o un protector. También puede
ser ventajoso emplear (6) promotores específicos de órganos (por
ejemplo, Roshal et al., EMBO J. 6: 1155, 1987;
Schernthaner et al., EMBO J. 7: 1249, 1988; Bustos
et al., Plant Cell 1: 839, 1989). Los promotores de
la presente invención son promotores mejorados para células
embrionarias y mejorados para tejidos embrionarios que pueden estar
ligados operativamente a cualquier gen de interés en un vector de
expresión.
Los vectores de expresión vegetales incluyen
señales de procesamiento de ARN, por ejemplo, intrones, que pueden
estar ubicados hacia el extremo 5' o 3' de una secuencia codificante
de un polipéptido en un transgén. Además, los vectores de expresión
pueden incluir secuencias reguladoras adicionales de la región no
traducida en 3' de genes vegetales (Thornburg et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 84: 744 (1987); An et
al., Plant Cell 1: 115 (1989), por ejemplo, una región
de terminación en 3' para incrementar la estabilidad del ARNm, tal
como la región de terminación PI-II de patata o las
regiones de terminación en 3' de la octopina o nopalina sintasa.
Las regiones no traducidas en 5' de un ARNm pueden cumplir una
función importante en el inicio de la traducción y también puede
ser un componente genético para un vector de expresión vegetal. Por
ejemplo, se ha demostrado que las secuencias líder no traducidas en
5' derivadas de los genes de la proteína de choque térmico mejoran
la expresión génica en plantas (véase, por ejemplo la patente de los
EE.UU. 5.362.865). Estas secuencias reguladoras en 5' y 3'
adicionales pueden derivar de una fuente nativa o heteróloga con
respecto a los demás elementos presentes en el vector de
expresión.
Las secuencias promotoras de la presente
invención se usan para controlar la expresión génica en células
vegetales. Más preferiblemente, las secuencias promotoras se usan
para controlar la expresión génica en semillas de plantas. Incluso
lo más preferiblemente, las secuencias promotoras se usan para
controlar la expresión en embriones vegetales. Las secuencias
promotoras descritas son componentes genéticos que forman parte de
los vectores que se emplean en la transformación vegetal. Las
secuencias promotoras de la presente invención se pueden usar con
cualquier plásmido o vector de transformación vegetal adecuado que
contenga un marcador seleccionable o rastreable y los elementos
reguladores asociados, ya descritos, junto con uno o varios ácidos
nucleicos expresados de manera suficiente como para conferir un
rasgo deseable particular. Los ejemplos de genes estructurales
adecuados de interés agronómico considerados en la presente
invención incluyen, pero sin limitaciones, uno o varios genes para
tolerancia a insectos, tal como B.t., tolerancia a plagas tal como
genes para el control de enfermedades producidas por hongos,
tolerancia a herbicidas tal como genes que confieren tolerancia a
glifosato y genes para mejoras en la calidad tal como el
rendimiento, las mejoras nutricionales tal como composición de
vitaminas, aceites y aminoácidos, tolerancia al medio ambiente o al
estrés o cualquier cambio deseable en la fisiología, el
crecimiento, el desarrollo, la morfología o los productos vegetales
de las plantas.
Alternativamente, las secuencias codificantes de
ADN pueden definir estos fenotipos codificando para una molécula de
ARN que no se puede traducir y que produce la inhibición de
expresión deseada de un gen endógeno, por ejemplo por medio de
mecanismos antisentido o de cosupresión (véase, por ejemplo, Bird
et al., Biotech. Gen. Engin. Rev. 9: 207,1991). El
ARN también podría ser una molécula de ARN catalítica (es decir, una
ribozima) manipulada para dividir el producto de ARNm endógeno
deseado (véase por ejemplo, Gibson y Shillitoe, Mol. Biotech.
7: 125,1997). Por consiguiente, cualquier gen que produzca una
proteína o ARNm que exprese un fenotipo o un cambio de morfología
de interés es de utilidad para la práctica de la presente
invención.
Además de los elementos reguladores o las
secuencias ubicadas hacia el extremo 5' o dentro de una secuencia
de ADN, hay secuencias hacia el extremo 3' que afectan a la
expresión génica y por lo tanto el término secuencia reguladora,
tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier
secuencia de nucleótidos ubicada hacia el extremo 5', dentro o
hacia el extremo 3' de la secuencia de ADN que controla, media o
afecta la expresión de un producto genético junto con el aparato de
síntesis de proteínas de la célula.
Las secuencias promotoras de la presente
invención se pueden modificar, por ejemplo para la expresión otros
sistemas vegetales. En otro enfoque, se pueden diseñar o manipular
promotores quiméricos o híbridos con varios métodos. Muchos
promotores contienen secuencias en 5' que activan, mejoran o definen
la fuerza y/o la especificidad del promotor (Atchison, Ann. Rev.
Cell Biol. 4: 127, 1988). Los genes ADN-T por
ejemplo, contienen cajas "TATA" que definen el sitio de
iniciación de la transcripción y otros elementos en 5' ubicados
hacia el extremo 5' con respecto al sitio de iniciación de la
transcripción, modulan los niveles de transcripción (Gelvin, In
Transgenic Plants (Kung, S.-D. Y Us, R., eds), San Diego: Academic
Press, págs. 49-87, 1988). Otro promotor quimérico
combinó un trímero de un activador de la octopina sintasa (ocs) con
un activador de la manopina sintasa (mas) más el promotor y
presentó un incremento en la expresión de un gen reporter (Min Ni
et al., The Plant Journal 7: 661, 1995). Las
secuencias reguladoras hacia 5' de la presente invención se pueden
usar para la construcción de dichos promotores quiméricos o
híbridos. Los métodos para la construcción de variantes de los
promotores de la presente invención incluyen, pero sin limitaciones,
la combinación de los elementos de control de diferentes promotores
o la duplicación de porciones o regiones de un promotor (véase, por
ejemplo, la patente de los EE.UU. 5.110.732 y la patente de los
EE.UU. 5.097.025). Los expertos en la técnica están familiarizados
con los materiales de recursos habituales que describen las
condiciones y los procedimientos específicos para la construcción,
manipulación y aislamiento de macromoléculas (por ejemplo,
moléculas de ADN, plásmidos, etc.), la generación de organismos
recombinantes y la búsqueda y el aislamiento de genes, (véase por
ejemplo Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989; Mailga et al.,
Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press,
1995; Birren et al., Genome Analysis: volumen 1,
Análisis de ADN, (1997); volumen 2, Detección de genes, (1998);
volumen 3, Sistemas de clonación, (1999), volumen 4, Mapeo de
Genomas, (1999), Cold Spring Harbor, Nueva York).
Las secuencias promotoras de la presente
invención se pueden incorporar en un vector de expresión usando
marcadores rastreables o calificables como ya se describió y
evaluarse en análisis transitorios que proporcionan una indicación
de la expresión génica en sistemas vegetales estables. Los métodos
para evaluar la expresión génica en ensayos transitorios son
conocidos por los expertos en la técnica. Se ha descrito la
expresión transitoria de genes marcadores usando diversas plantas,
tejidos y sistemas de distribución de ADN. Por ejemplo, los tipos
de análisis transitorio incluyen, pero sin limitaciones,
distribución directa de genes por medio de electroporación o
bombardeo de partículas de tejidos en cualquier ensayo transitorio
con plantas, usando cualquier especie vegetal de interés. Dichos
sistemas transitorios incluyen, pero sin limitaciones, protoplastos
de cultivos en suspensión en trigo (Zhou et al., Plant
Cell Reports 12: 612. 1993), electroporación de hojas de
protoplastos de trigo (Sethi et al., J. Crop Sci. 52:
152, 1983; electroporación de protoplastos preparados a partir de
tejido de maíz (Sheen, J. The Plant Cell 3: 225, 1991) o
bombardeo de partículas de tejidos de interés específicos. La
presente invención engloba el uso de cualquier sistema de expresión
transitorio para evaluar las secuencias reguladoras unidas
operativamente a genes reporter, genes marcadores o genes de interés
agronómico seleccionados. Los ejemplos de tejidos vegetales
considerados para las pruebas transitorias con un sistema de
distribución apropiado incluyen, pero sin limitaciones, tejidos
foliares basales, callos, cotiledones, raíces, endosperma, tejido
embrionario, tejido floral, polen y tejido epidérmico.
Se puede utilizar cualquier marcador calificable
o rastreable en un ensayo transitorio. Los genes marcadores
preferidos para los análisis transitorios de los promotores o las
secuencias reguladoras en 5' de la presente invención incluyen un
gen GUS (la secuencia codificante de la
\beta-glucuronidasa) o un gen GFP (la secuencia
codificante de la proteína fluorescente verde). Los vectores de
expresión que contienen las secuencias reguladoras en 5' unidas
operativamente a un gen marcador son distribuidos en los tejidos y
luego se analizan los tejidos con el mecanismo apropiado, según el
marcador. Se usan análisis cuantitativos o cualitativos como una
herramienta para evaluar el perfil de expresión potencial de las
secuencias promotoras cuando están unidas operativamente a los
genes de interés agronómico en plantas estables. Por último, las
secuencias reguladoras en 5' de la presente invención se incorporan
directamente en un vector de transformación vegetal adecuado para la
expresión con las secuencias reguladoras en 5' unidas
operativamente a marcadores seleccionables y genes de interés, se
transforman en las plantas y se analiza en las plantas transformadas
de forma estable, así como la progenie de las mismas, la presencia
del perfil de expresión deseado conferido por las secuencias
reguladoras en 5'. Los expertos en la técnica conocen los vectores
adecuados para la transformación de plantas. Los vectores adecuados
incluyen, pero sin limitaciones, plásmidos Ti desarmados
(neutralizados) para los métodos mediados por Agrobacterium. Estos
vectores pueden contener un marcador de resistencia,
1-2 bordes de ADN-T y orígenes de
replicación para E. coli y Agrobacterium junto con uno o
varios genes de interés y regiones reguladoras asociadas. Los
expertos en la técnica saben que para los enfoques mediados por
Agrobacterium hay varias cepas y métodos disponibles. Dichas cepas
incluyen, pero sin limitaciones, cepas de Agrobacterium C58,
LBA4404, EHA101 y EHA105. Las cepas particularmente preferidas son
las cepas de Agrobacterium tumefaciens. Los expertos en la técnica
también conocen otros sistemas de distribución de ADN para la
transformación de plantas e incluyen, pero sin limitaciones,
bombardeo de partículas de tejidos vegetales seleccionados. Los
expertos en la técnica también conocen otros sistemas de
distribución de ADN para la transformación de plantas e incluyen,
pero sin limitaciones, bombardeo de partículas de tejidos vegetales
seleccionados optimizados en general para el huésped vegetal de
interés particular.
Los ejemplos de ácidos nucleicos que se pueden
introducir con los métodos comprendidos por la presente invención
incluyen, por ejemplo, secuencias de ADN o genes de otras especies o
incluso genes o secuencias originarios o presentes en la misma
especie, pero que se incorporan en las células receptoras mediante
métodos de ingeniería genética en lugar de las técnicas clásicas de
reproducción o cría. Sin embargo, el término exógeno también hace
referencia a los genes que no están presentes habitualmente en la
célula que se está transformando o tal vez simplemente no están
presentes en la forma, estructura, etc., como se encuentra en el
segmento de ADN o gen en transformación, o los genes que
habitualmente están presentes pero que se desean, por ejemplo,
sobreexpresar. Por consiguiente, el término ADN o gen "exógeno"
hace referencia a cualquier gen o segmento de ADN que se introduce
en una célula receptora, independientemente de si ya hay un gen
similar presente en dicha célula. El tipo de ADN incluido en el ADN
exógeno incluye ADN que ya está presente en la célula vegetal, ADN
de otra planta, ADN de un organismo diferente o un ADN generado
externamente, tal como una secuencia de ADN que contiene un mensaje
antisentido de un gen, o una secuencia de ADN que codifica una
versión sintética o modificada de un gen.
Los vectores de transformación vegetales que
contienen las secuencias promotoras de la presente invención pueden
introducirse en plantas con cualquier método de transformación de
plantas. Hay diversos métodos disponibles para introducir las
secuencias de ADN en células vegetales y son bien conocidos en la
técnica. Los métodos adecuados incluyen, pero sin limitaciones,
infección bacteriana, vectores bacterianos con un cromosoma binario
artificial, distribución directa de ADN (por ejemplo por medio de
transformación mediada por PEG, captación de ADN mediada por
desecación/inhibición, electroporación, agitación con fibras de
carburo siliconado y aceleración de partículas recubiertas con ADN
(revisado en Potrykus, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.,
42: 205, 1991).
Los métodos para una transformación específica
de dicotiledóneas emplean principalmente Agrobacterium tumefaciens.
Por ejemplo, las plantas transgénica notificadas incluyen, pero sin
limitaciones, algodón (patente de los EE.UU. número 5.004.863;
patente de los EE.UU. número 5.159.135; patente de los EE.UU. número
5.518.908, WO 97/43430), soja (patente de los EE.UU. número
5.569.834; patente de los EE.UU. número 5.416.011; McCabe et
al., Bio/Technology, 6: 923, 1988; Christou et al., Plant
Physiol., 87: 671, 1988); Brassica (patente de los EE.UU. número
5.463.174) y maní (Cheng et al., Plant Cell Rep., 15: 653,
1996).
Se han descrito métodos similares para la
transformación de monocotiledóneas. La transformación y regeneración
de plantas con estos métodos se describieron para varias plantas de
cultivo incluyendo, pero sin limitaciones, espárrago (Asparagus
officinalis; Bytebier et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. EE.UU., 84: 5345, 1987); cebada (Hordeum vulgare;
Wan y Lemaux, Plant Physiol., 104: 37, 1994); maíz (Zea
mays; Rhodes, C.A., et al., Science, 240: 204,
1988; Gordon-Kamm, et al., Plant Cell,
2: 603, 1990; Fromm, et al., Bio/Technology, 8: 833,
1990; Koziel, et al., Bio/Technology, 11: 194, 1993);
avena (Avena sativa; Somers, et al.,
Bio/Technology, 10: 1589, 1992); césped ornamental
(Dactylis glomerata; Horn, et al., Plant Cell
Rep., 7: 469, 1988); arroz (Oryza sativa, incluyendo las
variedades indica y japonica, Toriyama, et
al., Bio/Technology, 6: 10, 1988; Zhang, et al.,
Plant Cell Rep., 7: 379, 1988; Luo y Wu, Plant Mol.
Biol. Rep., 6: 165, 1988; Zhang y Wu, Theor. Appl.
Genet., 76: 835, 1988; Christou, et al.,
Bio/Technology, 9: 957, 1991); sorgo (Sorghum bicolor;
Casas, A.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.,
90: 11212, 1993); caña de azúcar (Saccharum spp.; Bower y
Birch, Plant J., 2: 409, 1992); festuca alta (Festuca
arundinacea; Wang, Z.Y. et al., Bio/Technology,
10: 691, 1992); césped (Agrostis palustris; Zhong et
al., Plant Cell Rep., 13: 1, 1993); trigo (Triticum
aestivum; Vasil et al., Bio/Technology, 10: 667,
1992; Semanas T., et al., Plant Physiol., 102: 1077,
1993; Becker, et al., Plant, J. 5: 299, 1994) y alfalfa
(Masoud, S.A., et al., Transgen. Res., 5: 313, 1996).
Resultará evidente para los expertos en la técnica que se puede
emplear y modificar varias metodologías de transformación para la
producción de plantas transgénicas estables a partir de cualquier
número de cultivos objetivo de interés.
Se analizan las plantas transformadas por la
presencia de los genes de interés y el nivel y/o perfil de expresión
conferido por las secuencias promotoras de la presente invención.
Los expertos en la técnica conocen los diversos métodos disponibles
para el análisis de plantas transformadas. Se puede emplear una gran
variedad de métodos para evaluar la expresión génica y determinar
si el o los genes introducidos están integrados, si funcionan
apropiadamente y si se heredan como se espera que lo hagan. Para la
presente invención, los promotores pueden evaluarse determinando
los niveles de expresión de los genes a los cuales están ligados
operativamente dichos promotores. Se puede determinar una
evaluación preliminar de la función promotora con un método de
ensayo transitorio usando genes reporter, pero una determinación
más definitiva de la evaluación de los promotores surge a partir
del análisis de plantas estables. Los métodos para el análisis de
plantas incluyen, pero sin limitaciones, inmunotransferencias
Southern o Northern, enfoques basados en PCR, análisis bioquímicos,
métodos de examen fenotípico, evaluaciones de campo y ensayos de
inmunodiagnóstico.
Los métodos de la presente invención incluyendo,
pero sin limitaciones, la preparación de bibliotecas de ADNc, la
preparación de bibliotecas genómicas, secuenciación, análisis de
secuencia, tecnologías de PCR, construcción de vectores, ensayos
transitorios y métodos de transformación de plantas, son bien
conocidos por los expertos en la técnica y se llevan a cabo usando
técnicas estándar o modificaciones de las mismas.
Los siguientes ejemplos se incluyen para
demostrar las realizaciones preferidas de la invención. Los expertos
en la técnica comprenderán que las técnicas descritas en los
siguientes ejemplos representan técnicas que se ha descubierto que
funcionan bien en la práctica de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se seleccionaron varios tejidos y etapas del
desarrollo vegetal para la preparación de las bibliotecas de maíz.
Los expertos en la técnica conocen las variaciones que se pueden dar
en la selección y preparación de los tejidos entre un muestreador
de tejidos y otro. A continuación se describen las condiciones para
las bibliotecas objetivo.
Se usó tejido de embriones de maíz trece días
después de la polinización (13-DAP) (biblioteca
SATMON033) o veintiún días después de la polinización
(21-DAP) (biblioteca SATMON017) como fuente de
material para las bibliotecas de ADNc
Embryo-13-DAP o
Embryo-21-DAP, respectivamente. Las
bibliotecas se generaron a partir de maíz (DK604, Dekalb Genetics,
Dekalb, Illinois EE.UU.). Las semillas se plantaron a una
profundidad de aproximadamente 3 cm en tierra de macetas de
2''-3'' que contenían medio de crecimiento Metro 200
y se transplantaron a macetas más grandes de 10'' que contenían la
misma tierra después de 2-3 semanas. Se aplicó el
fertilizante Peters 15-16-17
aproximadamente 3 veces por semana después del transplante, a una
fuerza de 150 ppm N y 2-3 veces durante la vida de
la planta desde el transplante hasta la floración. Se agregó un
total de aproximadamente 900 mg de Fe a cada maceta, durante dos a
tres veces durante la vida de la planta, desde el transplante hasta
la floración. Las plantas de maíz se cultivan en invernadero con
ciclos de 15 h día/9 h noche. La temperatura diurna era de
aproximadamente 80ºF y la temperatura nocturna era de
aproximadamente 70ºF. Los suplementos de luz se proporcionaron con
lámparas de vapor de sodio de 1000W.
Las plantas de maíz seleccionadas se encuentran
más allá de la etapa V10 y los brotes de mazorcas listos para la
fertilización se encerraron en bolsas de papel antes de la aparición
de estilos para retener el polen. Trece días después de la
polinización (13-DAP) o veintiún días después de la
polinización (21-DAP), se separan estas mazorcas y
se retiran los granos de las mismas. Cada grano se disecó en embrión
y endosperma y se retiró la capa de aleurona. Después de la
disección, los embriones se congelaron en nitrógeno líquido y se
guardaron a -80ºC hasta la preparación de ARN.
\newpage
Para la preparación de la biblioteca de callos
regenerantes HI II de tipo II (SATMON025), se prepararon placas de
Petri que contenían medio de iniciación de callos. El medio contenía
vitaminas y sales N6, sacarosa al 3%, prolina 2,3 g/litro,
hidrolizado de caseína 0,1 g/litro, 2,4-D 2
mg/litro, AgNO_{3} 15,3 mg/litro y Bacto-Agar
0,8% y el medio se ajustó a pH 6,0 antes de someter al autoclave. A
los 9-11 días después de la polinización, se
seleccionó una mazorca con embriones inmaduros que medían
aproximadamente 1-2 mm de longitud. Se eliminaron
las chalas y los estilos y la mazorca se rompió en dos mitades y se
colocó en una disolución sometida al autoclave de Clorox/Tween 20.
La mazorca se lavó con agua desionizada y cada uno de los embriones
se extrajo de los granos. Los embriones intactos se colocaron en
contacto con el medio, con el lado del escutelo hacia arriba. Se
sembraron en placa múltiples embriones sobre cada placa y dichas
placas se incubaron en la oscuridad a 25ºC (todos los componentes
de los medios se encuentran disponibles comercialmente y la mayoría
se obtuvo de Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Los tejidos de
callos de tipo II friables formados se transfirieron al medio
descrito anteriormente pero sin AgNO_{3} y se subcultivaron cada
7-10 días, aproximadamente 4 semanas después del
aislamiento de los embriones, los callos se extrajeron de las placas
y se congelaron en nitrógeno líquido. El tejido recogido se guardó
a -80ºC hasta la preparación de ARN.
El ARN se purificó a partir del tejido recogido
usando el reactivo Trizol disponible de Life Technologies
(Gaithersburg, Maryland) esencialmente según las recomendaciones del
proveedor. Se purificó ARN Poli A+ (ARNm) usando perlas magnéticas
oligo dT esencialmente según las recomendaciones del proveedor
(Dynabeads, Dynal Corporation, Lake Success, Nueva York).
La construcción de bibliotecas de ADNc es bien
conocida en la técnica y existe una gran cantidad de estrategias de
clonación. Hay muchos kits de construcción de bibliotecas de ADNc
disponibles comercialmente. Se utilizó el sistema de plásmido
Superscript^{MR} para la síntesis de ADNc y clonación de plásmidos
(Gibco BRL, Life Technologies, Gaithersburg, MD), en las
condiciones recomendadas por el proveedor.
Las bibliotecas de ADNc se sembraron en placa
sobre agar LB que contenía los antibióticos apropiados para la
selección y se incubaron a 37ºC durante el tiempo suficiente como
para permitir el crecimiento de colonias individuales. Se colocaron
colonias individuales en cada cavidad de una placa para
microtitulación de 96 cavidades que contenía LB líquido, incluyendo
los antibióticos selectivos. Las placas se incubaron durante toda la
noche a aproximadamente 37ºC con agitación suave para promover el
crecimiento de los cultivos. Se aisló ADN de plásmido de cada clon
utilizando los kits para aislamiento de plásmidos Qiaprep, usando
las condiciones recomendadas por el proveedor (Qiagen Inc., Santa
Clara, CA).
Los clones de ADN de plásmido molde se emplean
para la posterior secuenciación. Para la secuenciación, se usó el
kit ABI PRISM dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction
con ADN Polimerasa AmpliTaq®, FS, (PE Applied Biosystems, Foster
City, CA.
\vskip1.000000\baselineskip
Los promotores se identificaron a partir de una
base de datos de secuencias de EST derivadas de las bibliotecas de
ADNc preparadas con los diversos tejidos de maíz, incluyendo ARNm de
células embrionarias y ARNm mejorado de tejidos embrionarios o de
callos. Las secuencias también se usaron como secuencias de consulta
en las bases de datos de GenBank que contienen secuencias
identificadas y descritas previamente y se buscaron las regiones de
homología usando los programas BLAST. La selección de las etiquetas
de secuencia expresada (EST) para el subsiguiente aislamiento de
promotores reflejará la presencia de una o varias secuencias entre
las EST representativas de un muestreo aleatorio de una biblioteca
de ADNc individual o una colección de bibliotecas de ADNc. Para
identificar las secuencias reguladoras que regulan la expresión de
los transcritos en embriones de maíz, se aplica la función de
formación de subconjuntos, solicitando todas las EST halladas en las
bibliotecas de embriones objetivo y ausentes o en menor abundancia
en otras bibliotecas de EST que no son objetivo en la base de datos.
Las EST candidatas resultantes se someten a una función Northern
electrónica en la que se muestra el perfil de expresión supuesto
del tejido y los niveles de abundancia en una biblioteca para una
EST dada. Se identifican las EST objetivo con el perfil de
expresión y la abundancia en el tejido deseado y se diseñan
cebadores específicos del gen partiendo de la base de dichas
secuencias de EST identificadas. La calificación de producto se
refiere a la fuerza de una coincidencia BLAST entre el clon de EST
de interés y una secuencia de GenBank. El porcentaje de abundancia
se relaciona con la cantidad de veces que aparecen los miembros de
un grupo de secuencias expresadas relacionadas en la biblioteca de
la cual deriva la EST. Se puede llevar a cabo cualquier cantidad de
consultas para obtener las EST deseadas y dependerá de la base de
datos de EST y de los programas por ordenador disponibles para los
análisis de secuencia. Para la presente invención, las secuencias se
identifican mediante la selección de los valores deseados para
abundancia relativa, astringencia y/o calificación de producto. Para
las secuencias promotoras de SEQ ID Nº: 36-51, se
selecciona una abundancia objetivo \geq 1 con un nivel basal
\leq 0, una astringencia \geq 50 y una calificación de producto
\leq 100.
Los ID de clon para las secuencias de EST de
interés que representan el ADNc con el perfil de expresión buscado
se identifican partiendo de la base de estas consultas en la base de
datos. En la Tabla 1 se muestra información basal de las ID de
clones (EST), fuentes de bibliotecas y la información del
identificador de GenBank (gi) para las EST usadas en el
subsiguiente aislamiento de las secuencias promotoras de SEQ ID Nº:
36-51. Se indica la anotación de secuencia para los
ID de clon partiendo de la base de una búsqueda en BLAST de GenBank
con un valor de corte p de 10^{-8}. La información se somete a
cambios a medida que se envían nuevas secuencias a las bases de
datos de secuencias. Las anotaciones para las EST se enumeran de la
siguiente manera con la información sobre la anotación entre
paréntesis: Clon 700614347 (gen de la proteína específica de
embriones (Ose731) de Oryza sativa subsp. Indica, cds
completo); Clon 700257959 (ARNm de la proteína tipo globulina de
Oryza sativa, clon Ose709, cds parcial); Clon 700265029 (ARNm
de la
mio-inositol-1-fosfato
sintasa de Zea mays, cds completo); Clon 700321659 (ARNm
para la proteína Lea grupo 3 MGL3 de Zea mays); Clon
700616085 (gen de la proteína específica de embriones (Ose731) de
Oryza sativa subsp. Indica, cds completo).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las bibliotecas genómicas se prepararon a partir
de ADN de maíz (del maíz híbrido Fr27 x FrMo17) aislado con el
protocolo de purificación de CsCl según la descripción de Ausubel
et al., 1992, o con un método de purificación CTAB (Rogers y
Bendich, Plant Mol. Biol., 5: 69 (1985). Los reactivos se
encuentran disponibles comercialmente (por ejemplo, Sigma Chemical
Co., St. Louis, MO). Las bibliotecas se prepararon según las
instrucciones del proveedor (GENOME WALKER, es la marca comercial
de CLONTECH Laboratories, Inc, Palo Alto, CA). En reacciones
separadas, el ADN genómico se sometió a digestión con enzimas de
restricción durante toda la noche a 37ºC con las siguientes
endonucleasas para generar extremos pegajosos: EcoRV,
ScaI, DraI, PvuII o StuI (CLONTECH
Laboratories, Inc. Palo Alto, CA). Las mezclas de reacción se
extrajeron con fenol:cloroformo, se precipitaron con etanol y se
volvieron a suspender en tampón Tris-EDTA. Los
fragmentos de ADN genómico de extremos pegajosos purificados se
ligaron después con los adaptadores GenomeWalker^{MR} y la
ligación de los fragmentos de ADN resultantes a los adaptadores se
efectuó según el protocolo del proveedor. Las
sub-bibliotecas GenomeWalker^{MR} se dividieron
en alícuotas y se guardaron a -20ºC.
El ADN genómico ligado al adaptador
GenomeWalker^{MR} (anterior) se sometió a una ronda primaria de
amplificación por PCR con el cebador específico de genes 1 (GSP1) y
un cebador que se alinea con la secuencia adaptadora, el cebador
adaptador 1 (AP1) se muestra en la SEQ ID Nº: 1. Se utilizó una
alícuota diluida (1:50) de la reacción primaria de PCR como ADN
entrante para una ronda de amplificación por PCR anidada con el
cebador específico de genes 2 (GSP2) y el cebador adaptador 2 (AP2)
que se muestra en la SEQ ID Nº: 2 o el cebador adaptador 3 (AP3)
que se muestra en la SEQ ID Nº: 3. Las temperaturas de alineamiento
del cebador primario Genome Walker (AP1) y del cebador anidado
(AP2) son de 59ºC y 71ºC, respectivamente. En general, los cebadores
específicos de genes se diseñan para presentar las siguientes
características: 26-30 nucleótidos de longitud,
contenido de GC del 40-60% con temperaturas
resultantes para la mayoría de los cebadores específicos de genes en
el intervalo alto de 60ºC o aproximadamente 70ºC. La Taq polimerasa
empleada, Amplitaq Gold^{MR}, se encuentra disponible de
Perkin-Elmer Biosystems (Branchbury, Nueva Jersey).
Hay muchos instrumentos para ciclos de temperatura y kits de
reactivos disponibles comercialmente de varios proveedores para los
experimentos de PCR e incluyen aquellos disponibles de PE
Biosystems (Foster City, CA), Strategene (La Jolla, CA) y MJ
Research Inc. (Watertown, MA). Después de la reacción primaria de
PCR, se tomó una alícuota (10-15 \mul) para el
análisis sobre gel de agarosa. Cada banda desconocida se amplificó
a partir de 5 sub-bibliotecas genómicas y un control
negativo (sin ADN).
Los componentes y las condiciones de la PCR son
como se definen a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
PCR
PRIMARIA
\vskip1.000000\baselineskip
- A.
- 9 minutos a 95ºC
- B.
- 94ºC durante 2 segundos, 70ºC durante 3 minutos; repetir los ciclos de 94ºC/70ºC durante un total de 7 veces
- C.
- 94ºC durante 2 segundos, 65ºC durante 3 minutos; repetir los ciclos de 94ºC/65ºC durante un total de 36 veces
- D.
- 65ºC durante 4 minutos como extensión final
- E.
- 10ºC para una incubación extendida
\newpage
PCR ANIDADA (reacción
secundaria de
PCR)
- A.
- 9 minutos a 95ºC
- B.
- 94ºC durante 2 segundos, 70ºC durante 3 minutos; repetir el ciclo de 94ºC/70ºC durante un total de 5 veces
- C.
- 94ºC durante 2 segundos, 65ºC durante 3 minutos; repetir el ciclo de 94ºC/65ºC durante un total de 24 veces
- D.
- 65ºC durante 4 minutos como extensión final
- E.
- 10ºC para una incubación extendida
\vskip1.000000\baselineskip
Para el aislamiento de la secuencia promotora
descrita de la SEQ ID Nº: 36 (ID clon 700264271), la SEQ ID Nº: 1
(A) se combinó con la SEQ ID Nº: 6 en una reacción primaria de PCR.
Para la reacción de PCR anidada, la SEQ ID Nº: 2 se combinó con la
SEQ ID Nº: 7 en una reacción secundaria de PCR.
Para el aislamiento de la secuencia promotora
descrita de la SEQ ID Nº: 37 (ID clon 700265872), la SEQ ID Nº: 1
se combinó con la SEQ ID Nº: 8 en una reacción primaria de PCR. Para
la reacción de PCR anidada, la SEQ ID Nº: 2 se combinó con la SEQ
ID Nº: 9 en una reacción secundaria de PCR.
Para el aislamiento de la secuencia promotora de
la SEQ ID Nº: 38 de la invención (ID clon 700263624), la SEQ ID Nº:
1 se combinó con la SEQ ID Nº: 10 en una reacción primaria de PCR.
Para la reacción de PCR anidada, la SEQ ID Nº: 2 se combinó con la
SEQ ID Nº: 11 en una reacción secundaria de PCR.
Para el aislamiento de la secuencia promotora
descrita de la SEQ ID Nº: 39 (ID clon 700267629), la SEQ ID Nº: 1
se combinó con la SEQ ID Nº: 12 en una reacción primaria de PCR.
Para la reacción de PCR anidada, la SEQ ID Nº: 1 se combinó con la
SEQ ID Nº: 13 en una reacción secundaria de PCR.
Para el aislamiento de la secuencia promotora
descrita de la SEQ ID Nº: 40 (ID clon 700258061), la SEQ ID Nº: 1
se combinó con la SEQ ID Nº: 14 en una reacción primaria de PCR.
Para la reacción de PCR anidada, la SEQ ID Nº: 2 se combinó con la
SEQ ID Nº: 15 en una reacción secundaria de PCR.
Para el aislamiento de la secuencia promotora
descrita de la SEQ ID Nº: 41 (ID clon 700614347), la SEQ ID Nº: 1
se combinó con la SEQ ID Nº: 16 en una reacción primaria de PCR.
Para la reacción de PCR anidada, la SEQ ID Nº: 2 se combinó con la
SEQ ID Nº: 17 en una reacción secundaria de PCR.
\newpage
Para el aislamiento de la secuencia promotora
descrita de la SEQ ID Nº: 42 (ID clon 700257959), la SEQ ID Nº: 1
se combinó con la SEQ ID Nº: 18 en una reacción primaria de PCR.
Para la reacción de PCR anidada, la SEQ ID Nº: 2 se combinó con la
SEQ ID Nº: 19 en una reacción secundaria de PCR.
Para el aislamiento de la secuencia promotora
descrita de la SEQ ID Nº: 43 (ID clon 700265029), la SEQ ID Nº: 1
se combinó con la SEQ ID Nº: 20 en una reacción primaria de PCR.
Para la reacción de PCR anidada, la SEQ ID Nº: 2 se combinó con la
SEQ ID Nº: 21 en una reacción secundaria de PCR.
Para el aislamiento de la secuencia promotora
descrita de la SEQ ID Nº: 44 (ID clon 700266438), la SEQ ID Nº: 1
se combinó con la SEQ ID Nº: 22 en una reacción primaria de PCR.
Para la reacción de PCR anidada, la SEQ ID Nº: 2 se combinó con la
SEQ ID Nº: 23 en una reacción secundaria de PCR.
Para el aislamiento de la secuencia promotora
descrita de la SEQ ID Nº: 45 (ID clon 700259522), la SEQ ID Nº: 1
se combinó con la SEQ ID Nº: 24 en una reacción primaria de PCR.
Para la reacción de PCR anidada, la SEQ ID Nº: 2 se combinó con la
SEQ ID Nº: 25 en una reacción secundaria de PCR.
Para el aislamiento de la secuencia promotora
descrita de la SEQ ID Nº: 46 (ID clon 700321659), la SEQ ID Nº: 1
se combinó con la SEQ ID Nº: 26 en una reacción primaria de PCR.
Para la reacción de PCR anidada, la SEQ ID Nº: 2 se combinó con la
SEQ ID Nº: 27 en una reacción secundaria de PCR.
Para el aislamiento de la secuencia promotora
descrita de la SEQ ID Nº: 47 (ID clon 700257969), la SEQ ID Nº: 1
se combinó con la SEQ ID Nº: 28 en una reacción primaria de PCR.
Para la reacción de PCR anidada, la SEQ ID Nº: 2 se combinó con la
SEQ ID Nº: 29 en una reacción secundaria de PCR.
Para el aislamiento de la secuencia promotora
descrita de la SEQ ID Nº: 48 (ID clon 700613864), la SEQ ID Nº: 1
se combinó con la SEQ ID Nº: 30 en una reacción primaria de PCR.
Para la reacción de PCR anidada, la SEQ ID Nº: 2 se combinó con la
SEQ ID Nº: 31 en una reacción secundaria de PCR.
Para el aislamiento de la secuencia promotora
descrita de la SEQ ID Nº: 49 (ID clon
700260279-biblioteca PvuII), la SEQ ID Nº: 1 se
combinó con la SEQ ID Nº: 32 en una reacción primaria de PCR. Para
la reacción de PCR anidada, la SEQ ID Nº: 3 se combinó con la SEQ
ID Nº: 33 en una reacción secundaria de PCR.
Para el aislamiento de la secuencia promotora
descrita de la SEQ ID Nº: 50 (ID clon
700260279-biblioteca DraI), la SEQ ID Nº: 1 se
combinó con la SEQ ID Nº: 32 en una reacción primaria de PCR. Para
la reacción de PCR anidada, la SEQ ID Nº: 3 se combinó con la SEQ
ID Nº: 34 en una reacción secundaria de PCR.
Para el aislamiento de la secuencia promotora
descrita de la SEQ ID Nº: 51 (ID clon 700266176), la SEQ ID Nº: 1
se combinó con la SEQ ID Nº: 34 en una reacción primaria de PCR.
Para la reacción de PCR anidada, la SEQ ID Nº: 3 se combinó con la
SEQ ID Nº: 35 en una reacción secundaria de PCR.
Los fragmentos de ADN resultantes de la
amplificación por PCR anidada se aislaron y purificaron sobre gel.
Una alícuota de 40 \mul de la PCR secundaria se sometió a
electroforesis sobre un gel de agarosa. El fragmento de ADN del
producto de la PCR secundaria se purificó del gel de agarosa usando
el kit BIO101 Geneclean II (Midwest Scientific, Valley Park, MO) en
las condiciones recomendadas por el proveedor. El ADN purificado se
ligó al vector pGEM-T Easy (pGEM-T
Easy Vector System I, Promega Corp., Madison, WI) en las condiciones
recomendadas por el proveedor. Una alícuota de la reacción de
ligación se transformó en un huésped adecuado de E. coli,
tal como DH10B, y las células se sembraron en placa sobre medio de
selección (para DH10B, carbenicilina 100 \mug/ml). Los
transformantes bacterianos se seleccionaron, se cultivaron en medio
de cultivo líquido y luego se aisló el ADN de plásmido usando un
kit disponible comercialmente, tal como el kit Qiaprep Spin
Microprep (Qiagen Corp., Valencia, CA). El plásmido purificado que
contenía el tamaño de inserto predicho según el análisis con
enzimas de restricción se secuenció utilizando el método de
terminación con colorante en ambas direcciones usando los cebadores
directo e inverso M13 que se muestran en las SEQ ID Nº: 4 (cebador
directo M13) y SEQ ID Nº: 5 (cebador inverso M13). Las enzimas de
restricción usadas también se encuentran disponibles comercialmente
de diversos proveedores (por ejemplo, Boehringer Mannheim
(Indianapolis, IN). Se determinaron las regiones flanqueantes en 5'
que contenían las secuencias promotoras y que se muestran en las
SEQ ID Nº: 36-51. La manipulación de los sitios de
restricción para clonar los fragmentos promotores en los vectores
adecuados se realiza normalmente usando métodos de PCR conocidos por
los expertos en la técnica.
Para los análisis de expresión, los fragmentos
promotores se clonaron en vectores de expresión. Si se identifica
un codón de iniciación (AUG) de un gen promotor objetivo, el
fragmento promotor se clona en el vector tal como se muestra en la
figura 1 (pMON19469) en lugar del elemento genético
P-CaMV.35S. Si no se identifica un AUG, el
fragmento promotor se clona en el vector de expresión modificado
para obtener fusiones de traducción con un gen reporter tal como
GUS o GFP.
Las construcciones de expresión se evaluaron en
un ensayo transitorio en plantas. Hay muchos ensayos disponibles y
que son conocidos por los expertos en la técnica. Para un ensayo
histoquímico para determinar la actividad GUS, se recogieron
embriones 13-DAP y se colocaron sobre medios de
cultivo, tal como medio MS (Physiologia Plantarum 15: 473
(1962), junto con callos embrionarios de Tipo II. Para analizar los
promotores en un ensayo transitorio, se bombardearon porciones de
endosperma de granos 13-DAP y segmentos de hojas
etioladas de plántulas 14 días después de la germinación (DAG) con
el vector de expresión de ADN usando un equipo de pistola de
partículas adecuado (véase por ejemplo Christou et al.,
Plant Physiol., 87: 671 (1989); Klein et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. EE.UU., 85: 4305 (1988); Ye,G.-N., et
al., Plant Mol. Biol., 15: 809 (1990). Cada vector de
expresión se bombardea sobre dos placas independientes. Se deja que
los tejidos se recuperen durante 48 horas y luego se colorean con
X-Gluc
(5-bromo-4-cloro-3-indoíl
\beta-D-glucurónido) para detectar
la expresión del gen GUS en los tejidos de interés (Jefferson et
al., EMBO J., 6: 3901 (1987).
\vskip1.000000\baselineskip
Para una transformación vegetal estable, las
secuencias promotoras se clonaron en un vector de transformación
vegetal tal como el que se muestra en la figura 2 (pMON39721) y se
transformaron en el cultivo objetivo de interés con un sistema de
distribución apropiado, tal como una transformación mediada por
Agrobacterium (véase por ejemplo las patentes de los EE.UU. números
5.569.834, 5.416.011, 5.631.152, 5.159.135 y 5.004.863) o con
métodos de bombardeo de partículas (véase por ejemplo las
solicitudes de patente WO 92/15675, WO 97/48814 y la solicitud de
patente europea 586.355 y las patentes de los EE.UU. números
5.120.657, 5.503.998, 5.830.728 y 5.015.580).
El fragmento NotI del pMON51002 (figura 3.) que
incluye el promotor Zm.700258061 (SEQ ID Nº: 40) que dirige la
expresión del gen Ec.GUS se aisló y clonó en el sitio NotI del
vector de transformación vegetal pMON39721 (figura 2) para generar
el pMON51008 (figura 4) para una transformación estable de maíz. El
fragmento NotI del pMON51001 (figura 5) que incluye el promotor
Zm.700267629 (SEQ ID Nº: 39) que dirige la expresión del gen Ec.GUS
se aisló y clonó en el sitio NotI del vector de transformación
vegetal pMON39721 para generar el pMON51009 (figura 9) para una
transformación estable de maíz. El fragmento NotI del pMON51003
(figura 7) que incluye el promotor Zm.700263624 (SEQ ID Nº: 38) que
dirige la expresión del gen Ec.GUS se aisló y clonó en el sitio
NotI del vector de transformación vegetal pMON39721 para generar el
pMON51010 (figura 8) para una transformación estable de maíz. Se
usaron métodos bien conocidos en la técnica de la biología
molecular, tal como digestión por endonucleasas, purificación de
fragmentos de ADN, ligación, transformación de bacterias, selección
de antibióticos, purificación de plásmidos, en la construcción de
estas construcciones de transformación vegetal (<biblio>).
Las construcciones de transformación vegetal se transfirieron a
Agrobacterium tumefaciens mediante un procedimiento de
apareamiento triparental (Ditta et al. Proc. Natl Acad.
Sci, EE.UU. 77: 7347 (1980).
Se empleó Agrobacterium tumefaciens (cepa
ABI) y se cultivó en medio líquido LB (50 ml de medio por frasco de
250 ml) que contenía kanamicina 100 mg/l, espectinomicina 50 mg/l y
cloranfenicol 25 mg/l (Sigma-Aldrich, St. Louis,
MO) durante aproximadamente 24 horas (sobre un agitador rotatorio a
150-160 r.p.m.) a 27ºC. El cultivo se centrifugó a
3400 r.p.m. y se volvió a suspender en medio líquido AB (la DO se
ajustó en 0,2 a 660 nm) que contenía la ½ del nivel de
espectinomicina y kanamicina usado en el medio LB, además de 200
\muM de acetosiringona (AS; usado para la inducción de
virulencia) en un frasco de 250 ml. Después del cultivo durante
15-16 horas en las mismas condiciones que el cultivo
con LB, la suspensión de Agrobacterium se cosechó y lavó en
medio ½ MS VI que contenía AS y se centrifugó nuevamente antes de
volver a suspenderla en el medio MS PL (también contiene el mismo
nivel de AS). La concentración final de Agrobacterium fue de
aproximadamente 1 x 10^{9} ufc/ml (que es igual a una DO de 1,0 a
660).
Se empleó un triple híbrido de maíz de (Pa91 x
H99) x A188 para la transformación en estos experimentos. Se
recogieron, de forma aséptica, embriones inmaduros de maíz con un
tamaño de 0,5 mm a 2,0 mm de longitud y se sumergieron en medio
líquido MS PL, que contenía Agrobacterium y 200 \muM de AS,
durante 30 minutos. Los embriones inmaduros se secaron sobre papel
antes de sembrarse en placa sobre ½ de medio de
co-cultivo MS, que contenía 2,4-D
3,0 mg/l, acetosiringona 200 \muM, sacarosa 2%, glucosa 1%,
prolina 12 mM y nitrato de plata 20 \muM, y se cultivaron a 23ºC
durante 2 ó 3 días. Luego se transfirieron los embriones a un medio
de retardo 15AA que consistía en macro y microsales 15AA,
2,4-D 1 mg/l, prolina 12 mM y carbenicilina 500
mg/l y se cultivaron a 27ºC durante 5 días. Los embriones se
transfirieron al primer medio de selección, que contenía medio 15AA
con 2,4-D 1,0 mg/l, prolina 12 mM, carbenicilina 750
mg/l y paromomicina 50 mg/l, y se cultivaron durante 2 semanas a
27ºC. Después se transfirieron los embriones al mismo medio pero
conteniendo un mayor nivel de agentes de selección (paromomicina
100 mg/l) durante 2 semanas antes de transferir estos embriones a
un medio que contenía paromomicina 200 mg/l para una o dos
selecciones más. Los callos seleccionados se transfirieron a medio
de regeneración MS 6BA durante aproximadamente 2 semanas antes de
llevarlos a medio MS OD en Phytatrays y cultivarlos en ambiente
iluminado. Se seleccionaron las plántulas con un desarrollo
vigoroso de raíces y brotes y se colocaron en tierra y se
aclimataron durante 7 días antes de colocarlas en el
invernadero.
Las plantas transgénicas en el invernadero se
cruzaron con H99 y se cosecharon los embriones inmaduros de las
mismas 13 y 21 días después de la polinización para los ensayos de
coloración de la actividad GUS (Tabla 2) y MUG (Tabla 3). Los
ensayos de coloración GUS de los tejidos vegetales transgénicos
(Jefferson et al., EMBO J., 6: 3901 (1987)
proporcionaron un análisis cualitativo de los promotores mejorados
para embriones de maíz de la presente invención para determinar el
patrón de expresión en hojas, raíces, embriones, endosperma y
tejidos de recubrimiento de las semillas de maíz. La expresión de
GUS de las secuencias promotoras de la presente invención no se
detectó en hojas y se detectó con poca frecuencia en los tejidos
radiculares. La expresión de GUS se detectó en semillas, en
especial en los embriones de las semillas. Estos promotores muestran
una mayor expresión en semillas y tejidos asociados a semillas con
relación a la expresión en raíces, hojas u otros tejidos
vegetativos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los ensayos MUG proporcionaron un análisis
cuantitativo de la expresión en embriones y endosperma de las
semillas transgénicas. Se extrajeron proteínas totales de 10
embriones y 10 endospermas disecados de cada mitad de mazorca de
una planta de maíz transgénica. El control negativo PHxA/CK de
tejido de maíz de tipo natural, se evaluó en el punto de tiempo de
13 dpp. En el ensayo MUG se emplearon 500 \mul de tampón de
extracción GUS que se agregaron a los tejidos y los tejidos se
molieron con una mano de mortero de teflón en un tubo Eppendorf de
1,5 ml y se centrifugaron a 10K R.P.M. durante 5 min a 4 grados
(Beckman GS-15R). Se transfirieron 400 \mul de
sobrenadante a una placa de 96 cavidades limpias. Los extractos se
congelaron sobre hielo seco y se guardaron a -80 hasta su uso. El
ensayo MUG consistía en la generación de una curva de actividad
estándar con una dilución seriada de 4-metil
umbeliferona (SIGMA M1381) desde 31,2 pmoles hasta 2000 pmoles. Se
agregaron 5 \mul de cada extracto a una placa de 96 cavidades de
fondo plano (Falcon 3872) por duplicado después de una primera
lectura para determinar el nivel basal. Se agregaron 200 \mul de
solución de ensayo GUS (KPO_{4} 0,1M pH 7,8, EDTA 1,0 mM,
glicerol 5%, DTT 10,0 mM,
4-metil-umbeliferil glucurónido 2
mM (Fluka 69602) a cada cavidad y se mezclaron con las muestras por
pipeteo. La placa se leyó cinéticamente sobre un equipo
F-max (Molecular Devices) a 37ºC con el par de
filtros: excitación-355/emisión-460.
Una lectura habitual consistía en 21 lecturas a intervalos de 3 min
y por último 1 hora. La actividad GUS (pmol/min/\mug proteína) se
calculó partiendo de la base de los resultados MUG y los resultados
de proteínas de cada muestra. Se evaluaron las proteínas totales
usando el kit para ensayo de proteínas de Bio-Rad.
Se usaron diluciones seriadas de proteína BSA desde 0,05 mg/ml
hasta 0,5 mg/ml para la curva estándar. Se agregaron 1,5 \mul de
extracto a la placa de 96 cavidades de fondo plano (Falcon) por
duplicado. Se agregaron 200 \mul de reactivo colorante diluido y
se mezclaron con las muestras. Se midió la absorbancia a 595 nm en
un equipo Spectromax 250 (Molecular Devices) a temperatura ambiente
después de 5 min de incubación a temperatura ambiente. El análisis
MUG demostró que los promotores aislados en la invención se expresan
en tejido de semillas de maíz y diferencialmente en los tejidos de
embriones y endosperma. Se pueden seleccionar líneas de maíz
transformadas de forma independiente de la población de plantas
transformadas con los promotores de la presente invención que se
expresan en diferentes etapas del desarrollo de los embriones y del
endosperma en las semillas.
\newpage
Existe una gran cantidad de sistemas y métodos
de transformación y regeneración y son bien conocidos por los
expertos en la técnica. Las plantas transformadas de forma estable y
la progenie son analizadas a continuación para determinar la
expresión génica en los tejidos de interés mediante cualquiera de
los diversos métodos de evaluación molecular, inmunodiagnóstico,
bioquímico y/o de campo, conocidos por los expertos en la
técnica.
Los elementos reguladores que actúan en
cis necesarios para una regulación promotora apropiada pueden
identificarse de muchas maneras. En un método, se realiza un
análisis de deleción para eliminar regiones del promotor y los
fragmentos promotores resultantes se evalúan por su actividad
promotora. Se considera que un fragmento de ADN es necesario para
la regulación promotora si la actividad del promotor truncado está
alterada en comparación con el fragmento promotor original. Por
medio de este análisis de supresión, es posible identificar
pequeñas regiones de ADN que son necesarios para una regulación
positiva o negativa de la transcripción. También se pueden
identificar motivos de la secuencia promotora y se pueden manipular
nuevos promotores para que contengan estos elementos cis
para modular la expresión de secuencias unidas operativamente
capaces de transcribirse. Véase, por ejemplo, la patente de los
EE.UU. número 5.223.419, cuyo contenido se incorpora por completo en
el presente documento a modo de referencia, la patente de los
EE.UU. número 4.990.607 y la patente de los EE.UU. número
5.097.025.
Un enfoque alternativo consiste en buscar
secuencias similares entre los promotores con perfiles de expresión
parecidos. Los promotores con patrones de actividad superpuestos
pueden tener mecanismos reguladores comunes. Se pueden usar varios
programas de ordenador para identificar motivos de secuencia
conservados entre promotores incluyendo, pero sin limitaciones,
MEME, SIGNAL SCAN o GENE SCAN. Estos motivos pueden representar
sitios de unión para los factores de transcripción que actúan
regulando los promotores. Una vez identificados los motivos de
secuencia, se puede evaluar su función. Por ejemplo, se pueden
eliminar las secuencias de los motivos del promotor para determinar
si el motivo es necesario para un correcto funcionamiento del
promotor. Alternativamente, es posible agregar el motivo a un
promotor mínimo para evaluar si es suficiente para activar la
transcripción. Los elementos reguladores que se sospeche que son
negativos pueden evaluarse por adición a un promotor activo y
observación de una reducción en dicha actividad promotora. Algunos
elementos reguladores que actúan en cis pueden necesitar
otros elementos para funcionar. Por ello, se pueden evaluar
múltiples elementos en diversas combinaciones por cualquiera de los
diversos métodos conocidos por los expertos en la técnica.
Una vez identificados los elementos promotores
funcionales, dichos elementos promotores pueden modificarse en
cuanto a los nucleótidos para afectar la unión a proteínas. Las
modificaciones pueden producir una mayor o menor afinidad de unión,
lo cual afectará el nivel de transcripción a partir de dicho
promotor.
Los elementos promotores pueden actuar de forma
aditiva o sinérgica para afectar la actividad promotora general. En
este sentido, se pueden ubicar elementos promotores de diferentes
regiones reguladoras en 5' en tándem para obtener un promotor con
un espectro de expresión diferente o con un mayor nivel de
expresión. Además, se puede multimerizar un elemento promotor para
incrementar los niveles de expresión específicamente en el patrón
afectado por dicho elemento promotor.
Los métodos técnicos necesarios para construir
vectores de expresión que contengan los nuevos elementos reguladores
en 5' manipulados son conocidos por los expertos en la técnica. Los
promotores manipulados se evalúan en los vectores de expresión y se
efectúan pruebas transitorias ligando operativamente los nuevos
promotores a un gen reporter adecuado, tal como GUS, y ensayos
transitorios en plantas. Los nuevos promotores se ligan
operativamente a uno o varios genes de interés y se incorporan en
un vector de transformación vegetal junto con uno o varios
elementos reguladores adicionales y se transforman en la planta
objetivo de interés mediante un sistema de distribución de ADN
adecuado. Las plantas transformadas de forma estable y la
subsiguiente progenie se evalúan por medio de diversos métodos
moleculares, de inmunodiagnóstico, bioquímicos, fenotípicos o de
campo adecuados para evaluar la o las características agronómicas
deseadas.
Con los métodos que se describen en el presente
documento, los expertos en la técnica de la biología molecular
vegetal pueden aislar secuencias de ADN promotoras que pueden
regular la transcripción de una secuencia de ADN heteróloga unida
operativamente a las secuencias promotoras. Estos promotores son de
utilidad para mejorar la expresión de transgenes en semillas de
plantas, tejidos embrionarios vegetales y tejidos de callos
vegetales con relación a los niveles de expresión que estos
promotores pueden dirigir en otras células y tejidos vegetales, tal
como raíces y hojas. Las moléculas de ADN que constituyen las
secuencias promotoras de la presente invención comprenden diversos
elementos que actúan en cis que pueden aislarse y fusionarse
con moléculas de ADN de secuencias promotoras conocidas para crear
una secuencia promotora híbrida. Estos promotores híbridos tendrán
patrones de expresión diferentes de las secuencias promotoras
conocidas y las secuencias de promotores pueden aislarse con los
métodos de la presente invención. Los promotores conocidos que
funcionan en plantas incluyen, pero sin limitaciones, los
promotores 35S y 19S del virus en mosaico de la coliflor, el
promotor 35S del virus en mosaico de la escrofularia, el promotor
del virus baciliforme de la caña de azúcar y otros promotores de
virus de plantas, promotores de actina de plantas tal como el
promotor de actina de arroz y los promotores de actina de
Arabidopsis y los promotores de ubiquitina de plantas. Se ha
determinado que estos promotores tienen secuencias mínimas que
dirigen la transcripción en células vegetales transgénicas. Estas
secuencias mínimas son componentes de promotores híbridos con
elementos que actúan en cis de las ADN moléculas de la
presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
La lista de referencias citadas por el
solicitante en sólo para conveniencia del solicitante. Dicha lista
no forma parte del documento de patente europeo. Aún cuando se ha
tenido cuidado en la recopilación de las regencias, errores u
omisiones no pueden excluirse y la Oficina Europea de Patentes niega
toda responsabilidad a este respecto.
- \bullet WO 9837184 A [0009]
- \bullet US 5362865 A [0112]
- \bullet WO 9305164 A [0010]
- \bullet US 5110732 A [0116]
- \bullet US 5322938 A [0027]
- \bullet US 5004863 A [0121] [0162]
- \bullet US 5593874 A [0027] [0030] [0031] [0032] [0034]
- \bullet US 5159135 A [0121] [0162]
- {}\hskip0.2cm [0110]
- \bullet US 5518908 A [0121]
- \bullet US 5859347 A [0027] [0030] [0031] [0032] [0034]
- \bullet W0 9743430 A [0121]
- {}\hskip0.2cm [0110]
- \bullet US 5569834 A [0121] [0162]
- \bullet US 5352605 A [0028] [0030] [0032] [0034] [0110]
- \bullet US 5416011 A [0121] [0162]
- \bullet US 4683195 A [0045]
- \bullet US5463174A[0121]
- \bullet US 4683202 A [0045] [0092]
- \bullet US 5631152 A [0162]
- \bullet US 5097025 A [0061] [0116] [0169]
- \bullet WO 9215675 A [0162]
- \bullet EP 50424 A [0092]
- \bullet WO 9748814 A [0162]
- \bullet EP 84796 A [0092]
- \bullet EP 586355 A [0162]
- \bullet EP 258017 A [0092]
- \bullet US 5120657 A [0162]
- \bullet EP 237362 A [0092]
- \bullet US 5503998 A [0162]
- \bullet EP 201184 A [0092]
- \bullet US 5830728 A [0162]
- \bullet US 4582788 A, Erlich [0092]
- \bullet US 5015580 A [0162]
- \bullet US 4683194 A, Saiki [0092]
- \bullet US 5223419 A [0169]
- \bullet US 5463175 A [0108]
- \bullet US 4990607 A [0169]
- \bullet US 5633435 A [0108]
- \bullet US 60151892 B [0175]
\bullet US 5378619 A [0110]
\bulletKAHL et al. World Journal of
Microbiology and Biotechnology, 1995, vol. 11,
449-460 [0002]
\bulletSMITH; WATERMAN. Adv.
Appl. Math., 1981, vol. 2, 482 [0041]
\bulletNEEDLEMAN; WUNSCH. J.
Mol. Blot, 1970, vol. 48, 443 [0041]
\bulletPEARSON; LIPMAN.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, vol. 85, 2444
[0041]
\bulletBEAUCAGE; CARRUTHERS.
Tetra. Letts., 1981, vol. 22,
1859-1862 [0043]
\bulletMATTEUCCI et al. J. Am.
Chem. Soc., 1981, vol. 103, 3185 [0043]
\bullet PCR Protocols: A Guide to Methods and
Applications. Academic Press. 1990 [0045]
\bulletMCCOMBIE et al. Nature
Genetics, 1992. vol. 1. 124 [0053]
\bulletKURATA et al. Nature
Genetics, 1994. vol. 8, 365 [0053] [0074]
\bulletOKUBO et al. Nature
Genetics, 1992, vol. 2, 173 [0053] [0074]
\bulletBREATHNACH; CHAMBON.
Ann. Rev. Biochem., 1981, vol. 50,
349-383 [0057]
\bulletMESSING et al. Genetic
Engineering of Plants. 1983, 211-227
[0057] [0057]
\bulletBENOIST; CHAMBON.
Nature, 1981, vol. 290. 304-310
[0057]
\bulletGRUSS et al. Proc. Nat.
Acad. Sci. USA, 1981, vol. 78, 943-947
[0057]
\bulletKHOURY; GRUSS.
Cell, 1983, vol. 27, 313-314
[0057]
\bulletFLUHR et al. Science,
1986, vol. 232, 1106-1112 [0058] [0058]
[0064]
\bulletELLIS et al. EMBO J.,
1987, vol. 6, 11-16 [0058] [0059] [0061]
[0064]
\bulletSTRITTMATTER; CHUA.
Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1987, vol. 84,
8986-8990 [0058] [0058] [0061] [0064] [0064]
\bulletPOULSEN; CHUA. Mol.
Gen. Genet., 1988, vol. 214, 16-23
[0058] [0064]
\bulletCOMAI et al. Plant Mol.
Biol., 1991, vol. 15, 373-381 [0058]
\bulletARYAN et al. Mol. Gen.
Genet, 1991, vol. 225, 65-71 [0058]
[0064]
\bulletSTRITTMATTER; CHUA.
Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 1987, vol. 84,
8986-8990 [0059]
\bulletBENFEY et al. EMBO J.,
vol. 9, 1677-1684 [0059]
\bulletJOHNSON; MCKNIGHT.
Ann. Rev. Biochem., 1989, vol. 58,
799-839 [0059]
\bulletMARTIN. Curr. Opinions
Biotech., 1996, vol. 7,
130-138[0059]
\bulletMURAL Methods in Plant
Biochemistry and Molecular Biology. CRC Press, 1997,
397-422 [0059]
\bulletMethods in Plant Molecular Biology.
Cold Spring Harbor Press, 1995, 233-300
[0059] [0060]
\bulletMethods in Plant Biochemistry and
Molecular Biology. CRC Press, 1997,
397-422 [0060]
\bulletBENFEY et al. EMBO J.,
1990, vol. 9, 1677-1684 [0061]
\bulletCOWEN et al. J. Biol.
Chem., 1993, vol. 268 (36), 26904 [0062]
\bulletBRUCE; QUAILL. Plant
Cell 1990, vol. 2 (11), 1081 [0062]
\bulletBRUCE et al. EMBO J.,
1991, vol. 10. 3015 [0062]
\bulletBEAUDOIN; ROTHSTEIN.
Plant Mol. Biol., 1997, vol. 33, 835 [0062]
\bulletPELHAM et al. Trends
Genet., 1985, vol. 1, 31 [0062]
\bulletLOACE et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. U. S. A., 1992, vol. 89, 9230 [0062]
\bulletMHIRI et al. Plant Mo.
Biol., 1997, vol. 33, 257 [0062]
\bulletBAKER et al. Plant Mol.
Biol., 1994. vol. 24, 701 [0062]
\bulletJIANG et al. Plant Mol.
Biol., 1996, vol. 30, 679 [0062]
\bulletNORDIN et al. Plant Mol.
Biol., 1993. vol. 21, 641 [0062]
\bulletZHOU et al. J. Biol.
Chem., 1992. vol. 267, 23515 [0062]
\bulletYAMAGUCHI et al. Plant
Cell, 1994, vol. 6, 251-264 [0062]
\bulletWANG et al. Plant Mol.
Biol., 1995, vol. 28, 605 [0062]
\bulletBRAY E. A. Trends in Plant
Science, 1997, vol. 2, 48 [0062]
\bulletCOMAI et al. Plant. Mol.
Biol., 1991, vol. 15, 373-381 [0064]
\bulletEFSTRATIADIS et al.
Cell, 1976, vol. 7, 279 [0067]
\bulletHIGUCHI et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A., 1976, vol. 73. 3146 [0067]
\bulletMANIATIS et al. Cell,
1976, vol. 8, 163 [0067]
\bulletLAND et al. Nucleic Acids
Res., 1981, vol. 9, 2251 [0067] [0068]
\bulletOKAYAMA et al. Mol. Cell.
Biol., 1982, vol. 2, 161 [0067]
\bulletGUBLER et al. Gene,
1983. vol. 25. 263 [0067]
\bulletCOLECLOUGH et al. Gene,
1985, vol. 34, 305 [0068]
\bulletKRAWINKEL et al. Nucleic
Acids Res., 1986, vol. 14, 1913 [0068]
\bulletHAN et al. Nucleic Acids
Res., 1987, vol. 15, 6304 [0068]
\bulletDAVIDSON. Gene Activity in
Early Development. Academic Press, 1976 [0069]
\bulletPENNICA et al. Nature,
1983, vol. 301, 214 [0070]
\bulletSCHWEINFEST et al. Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1982, vol. 79,
4997-5000 [0070]
\bulletKO. Nucleic Acids Res.,
1990, vol. 18, 5705 [0071]
\bulletPATANJALI, S. R. et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 88, 1943 [0071]
\bulletSCHMID et al. J.
Neurochem., 1987, vol. 48, 307 [0071]
\bulletFARGNOLI et al. Anal.
Biochem., 1990, vol. 187. 364 [0071]
\bulletTRAVIS et al. Proc. Natl.
Acad. Sci U.S.A., 1988, vol. 85, 1696 [0071]
\bulletKATO. Eur. J. Neurosci.,
1990, vol. 2. 704 [0071]
\bulletSCHWEINFEST et al. Genet.
Anal. Tech. Appl., 1990, vol. 7, 64 [0071]
\bulletSWAROOP et al. Nucleic Acids
Res., 1991, vol. 19, 1954 [0071]
\bulletSOARES et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. U. S. A., 1994, vol. 91, 9228 [0071]
\bulletSANGER et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A., 1977, vol. 74, 5463 [0072]
\bulletMAXAM; GILBERT. Proc.
Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1977. vol. 74, 560 [0072]
\bulletCRAXTON. Methods,
1991, vol. 2, 20 [0072]
\bulletJU et al. Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A., 1995, vol. 92, 4347 [0072]
\bulletTABOR; RICHARDSON.
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1995, vol. 92, 6339
[0072]
\bulletADAMS et al. Science,
1991, vol. 252, 1651 [0073] [0074]
\bulletBOGUSKI et al. Nature
Genetics, 1993, vol. 4, 332 [0073]
\bulletMCCOMBRIE et al. Nature
Genetics, 1992, vol. 1, 124 [0074]
\bulletADAMS et al. Nature,
1992, vol. 355, 632 [0074]
\bulletNEWMAN et al. Plant
Physiol., 1994, vol. 106, 1241 [0074]
\bulletRITCHIE SW et al. How a
Corn Plant Develops. Iowa State University of Science and
Technology Cooperative Exension Service, 1986, vol. IA
48,1-21 [0080]
\bulletSCHENA et al. Science,
1995, vol. 270, 467 [0084] [0084]
\bulletRUAN et al. The Plant
Journal, 1998, vol. 15, 821 [0084]
\bulletCOULSON. Trends in
Biotechnology, 1994, vol. 12, 76 [0085]
\bulletBIRREN et al. Genome
Analysis, 1997, vol. 1, 543 [0085] [0088]
\bulletCOULSON. Trends in
Biotechnology, 1994, vol. 12, 76-80
[0088]
\bulletPRESTRIDGE, D.S. CABIOS.
1991, vol. 7, 203-206 [0089]
\bulletHIGO et al. Nucleic Acids
Research, 1999, vol. 27 (1). 297-300
[0089]
\bulletHEINEMEYE. X. et al. Nucleic
Acid Research, vol. 27 (1), 318-322 [0089]
\bulletBURGE, C; KARLIN, S.
J. Mol. Biol., 1997, vol. 268, 78-94
[0089]
\bulletMULLIS et al. Cold Spring
Harbor Symp. Ouant. Biol., 1986. vol. 51, 263 [0092]
\bulletLAGERSTROM M. et al, PCR
Methods Applic., 1991, vol. 1, 111 [0092]
\bulletPARKER, JD et al. Nucleic
Acids Res, 1991, vol. 19, 3055 [0092]
\bulletKANEHISA. Nucl. Acids
Res., 1984, vol. 12, 203-213 [0094]
\bulletWETMUR; DAVIDSON. J.
Mol. Biol., 1968, vol. 31, 349-370
[0094]
\bulletCurrent Protocols in Molecular
Biology. John Wiley & Sons, 1989,
6.3.1-6.3.6 [0094]
\bulletSAMBROOK et al. Molecular
Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press,
1989 [0097]
\bulletHAYMES et al. Nucleic
Acid Hybridization, A Practical Approach. IRL Press,
1985 [0097]
\bulletMolecular Cloning: A Laboratory
Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, vol.
1-3 [0102]
\bulletCurrent Protocols in Molecular
Biology. Greene Publishing and
Wiley-Interscience, 1992 [0102]
\bulletINNIS et al. PCR
Protocols: A Gulde to Methods and Applications. Academic
Press. 1990 [0102]
\bulletVASIL. Cell Culture and Somatic
Cell Genetics of Plants. Laboratory Procedures and Their
Applications Academic Press. 1984. vol.
1-11I [0108]
\bulletDELLA-CIOPPA et al. Bio/Technology, 1987, vol. 5-6
[0108]
\bulletPOUWELS et al. Cloning
Vectors: A Laboratory Manual, 1985 [0109]
\bulletWEISSBACH; WEISSBACH.
Methods for Plant Molecular Biology. Academic Press,
1989 [0109]
\bulletGELVIN et al. Plant
Molecular Biology Manual. Kluwer Academic Publishers,
1990 [0109]
\bullet R.R.D. CROY. Plant Molecular
Biology LabFax. BIOS Scientific Publishers, 1993
[0109]
\bulletODEL et al. Nature,
1985, vol. 313, 810 [0110]
\bulletDEKEYSER et al. Plant
Cell, 1990, vol. 2, 591 [0110]
\bulletTERADA; SHIMAMOTO.
Mol. Gen. Genet., 1990. vol. 220, 389 [0110]
\bulletAN et al. Plant
Physiol., 1988, vol. 88, 547 [0110]
\bulletFROMM et al. Plant Cell,
1989, vol. 1, 977 [0110]
\bulletCALLIS et al. Plant
Physiol., 1988, vol. 88, 965 [0111]
\bulletKUHLEMEIER et al. Plant
Cell, 1989, vol. 1, 471 [0111]
\bulletSCHAFFNER; SHEEN.
Plant Cell, 1991, vol. 3, 997 [0111]
\bulletSIMPSON et al. EMBO J.,
1985, vol. 4, 2723 [0111]
\bulletMARCOTTE et al. Plant
Cell, 1989, vol. 1, 969[01111
\bulletSIEBERTZ et al. Plant
Cell. 1989, vol. 1, 961 [0111]
\bulletROSHAL et al. EMBO J.,
1987, vol. 6. 1155 [0111]
\bulletSCHERNTHANER et al. EMBO
J., 1988, vol.7,1249 [0111]
\bulletBUSTOS et al. Plant
Cell, 1989, vol. 1, 839 [0111]
\bulletTHORNBURG et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 1987, vol. 84, 744 [0112]
\bulletAN et al. Plant Cell,
1989, vol. 1, 115 [0112]
\bulletBIRD et al. Biotech. Gen.
Engin, Rev., 1991, vol. 9, 207 [0114]
\bulletGIBSON; SHILLITOE.
Mol. Biotech., 1997, vol. 7, 125 [0114]
\bulletATCHISON. Ann. Rev. Cell
Biol., 1988, vol. 4, 127 [0116]
\bulletGELVIN. Transgenic Plants.
Academic Press, 1988, 49-87
[0116]
\bulletMIN NI et al. The Plant
Journal, 1995, vol. 7. 661 [0116]
\bulletSAMBROOK et al. Molecular
Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press,
1989 [0116]
\bulletMAILGA et al. Methods in
Plant Molecular Biology. Cold Spring Harbor Press. 1995
[0116]
\bulletBIRREN et al. Genome
Analysis. Analyzing DNA, 1997, vol. 1 [0116]
\bulletDetecting Genes, 1998,
vol. 2 [0116]
\bulletCloning Systems, 1999,
vol. 3 [0116]
\bullet Mapping Genames. Cold Spring
Harbor, 1999, vol. 4 [0116]
\bulletZHOU et al. Plant Cell
Reports, 1993, vol. 12, 612 [0117]
\bulletSETHI et al. J. Crop
Sci., 1983, vol. 52, 152 [0117]
\bulletSHEEN. J. The Plant
Cell, 1991, vol. 3, 225 [0117]
\bulletPOTRYKUS. Ann. Rev. Plant
Physlol. Plant Mot. Biol., 1991, vol. 42, 205 [0120]
\bulletMCCABE et al.
Bio/Technology, 1988, vol. 6, 923 [0121]
\bulletCHRISTOU et al. Plant
Physiol., 1988, vol. 87, 671 [0121]
\bulletCHENG et al. Plant Cell
Rep., 1996, vol. 15, 653 [0121]
\bulletBYTEBIER et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A., 1987. vol. 84, 5345 [0122]
\bullet WAN AND LEMAUX. Plant
Physiol., 1994, vol. 104, 37 [0122]
\bulletRHODES, C.A. et al.
Science, 1988. vol. 240. 204 [0122]
\bulletGORDON-KAMM et al. Plant Cell, 1990, vol. 2, 603 [0122]
\bulletFROMM et al.
Bio/Technology, 1990, vol. 8, 833 [0122]
\bulletKOZIEL et al.
Bio/Technology, 1993, vol. 11, 194 [0122]
\bulletSOMERS et al.
Bio/Technology, 1992, vol. 10. 1589 [0122]
\bulletHORN et al. Plant Cell
Rap., 1988, vol. 7, 469 [0122]
\bulletTORIYAMA et al.
Bio/Technology, 1988, vol. 6, 10 [0122]
\bulletZHANG et al. Plant Cell
Rep., 1988, vol. 7, 379 [0122]
\bulletLUO; WU. Plant Mal.
Biol. Rep., 1988, vol. 6. 165 [0122]
\bulletZHANG; WU. Theor.
Appl. Genet.,. vol. 76, 835 [0122]
\bulletCHRISTOU et al.
Bio/Technology, 1991, vol. 9, 957 [0122]
\bulletCASAS, A.M. et al. Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1993, vol. 90, 11212 [0122]
\bulletBOWER; BIRCH. Plant
J., 1992, vol. 2, 409 [0122]
\bulletWANG, Z.Y. et al.
Bio/Technology, 1992, vol. 10. 691 [0122]
\bulletZHONG et al. Plant Cell
Rep., 1993. vol. 13, 1 [0122]
\bulletVASIL et al.
Bio/Technology, 1992, vol. 10, 667 [0122]
\bulletWEEKS T. et al. Plant
Physiol., 1993. vol. 102.1077 [0122]
\bulletBECKER et al. Plant,
1994, vol. J. 5, 299 [0122]
\bulletMASOUD, S.A. et al.
Transgen. Res., 1996, vol. 5, 313 [0122]
\bulletCHRISTOU et al. Plant
Physiol., 1989, vol. 87, 671 [0161]
\bulletKLEIN et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1988, vol. 85, 4305 [0161]
\bulletYE, G.-N. et al. Plant Mol.
Biol., 1990. vol. 15, 809 [0161]
\bulletJEFFERSON et al. EMBO
J., 1987. vol. 6, 3901 [0161] [0166]
\bulletDITTA et al. Proc. Natl
Acad. Sci USA. 1980, vol. 77, 7347 [0163]
<110> Monsanto Technology LLC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Secuencias reguladoras para el
control selectivo de la expresión de genes en plantas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
REN-001-EP-DIV1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> Documento US 60/151.892
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
01-09-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtaatacgac tcactatagg gc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactatagggc acgcgtggt
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagggcaagct tggtcgacgg cccgggctgg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggcagggtt ttcccagtca cga
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcggataac aatttcacac agga
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagaagcct ccattcctta tcaggca
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgagaggaag tgcctggcgt aatcaaa
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctcatcaga gttgccgtcg ttgcta
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcggatcca gatctactcg tctgacccat ccgttatcac tccg
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtgaggcga tccattcacg cgccta
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatcgcttgc actctctgcc tctctg
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctccccgca aggcgcgtat ctgatga
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcggatcca gatctggcgc gtcggggcac cggccggcgc ag
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgccgaccc ctccttcacc ttctcct
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtccttcgc cttcaccttc gctgtct
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaatctcca cgttctggca cgacga
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtctctcgc aaagtcgcaa tgtctg
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgaggctgga cggtttgatc tcccactt
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcggatcca gatctgaaga agaagaaccc gagtcgccac cc
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagctctcgat gaacatcttg cctttcctc
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcggatcca gatctgaatg gaatgcgaag cgaggtagcg agc
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacgacacctc tcgccatagc aaactctcc
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcggatcca gatctcattc atctgatcca tccgtcacca ctcc
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggagatgtgg ttgagcgcca tcatcgg
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtcgcagtc ctggcctctt tggggtg
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaaatcactc ggagaaagaa atatgcttgg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggctactact gactgtgacg atggtgctc
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccagaagcag gaggaggacg aagaagg
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaacgaact ccagagcttg ccgagg
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacaagacgat tcccagacaa gggacca
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcccacacct cacggcatcc atattt
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacgagcgcca cttgtcttga acttgttgg
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcggatcca gatctagcgc gaactgccgg cggcgctgct c
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtcggttaga ccgaacaaaa attcagc
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcggatcca gatctgtcgg ttagaccgaa caaaaattca gcc
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 654
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 277
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 476
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 344
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 547
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 856
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1137
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 753
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 684
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1025
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 910
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 734
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1129
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1129)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N = cualquier nucleótido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 571
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(571)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N = cualquier nucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 579
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 193
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (11)
1. Una molécula de ADN aislada que comprende un
polinucleótido que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia
nucleotídica con la SEQ ID Nº: 38.
2. Molécula de ADN aislada según la
reivindicación 1, que comprende además una segunda molécula de ADN
no asociada normalmente con dicha Molécula de ADN aislada.
3. Molécula de ADN aislada según la
reivindicación 2, en la que el polinucleótido es un promotor
híbrido.
4. Molécula de ADN aislada según la
reivindicación 3, que comprende además una secuencia promotora
mínima.
5. Molécula de ADN aislada según la
reivindicación 1, en la que dicho polinucleótido está
caracterizado por la SEQ ID Nº: 38.
6. Una construcción de ADN recombinante que
comprende un polinucleótido tal como se define en la reivindicación
1, en el que dicho polinucleótido aislado está unido operativamente
a un segundo polinucleótido que codifica una proteína de interés y
una región no traducida en 3'.
7. Construcción de ADN recombinante según la
reivindicación 6, en el que dicho polinucleótido está
caracterizado por la SEQ ID Nº: 38.
8. Una Planta monocotiledónea transgénica o
célula de planta monocotiledónea transgénica que comprende la
construcción de ADN recombinante según la reivindicación 5.
9. Planta transgénica según la reivindicación 8,
en la que dicha planta es maíz.
10. Un método para obtener una planta
monocotiledónea transgénica que comprende:
- i.
- introducir en una célula vegetal monocotiledónea una construcción de ADN que comprende:
- a)
- un promotor que comprende un polinucleótido que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia nucleotídica con la SEQ ID Nº: 38, en la que el promotor está unido operativamente a, b) un segundo polinucleótido y; (c) una región no traducida en 3';
- ii.
- seleccionar dicha célula vegetal; y
- iii.
- regenerar dicha célula vegetal en una planta.
11. Método según la reivindicación 10, en el que
dicho polinucleótido está caracterizado por la SEQ ID Nº:
38.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US15189299P | 1999-09-01 | 1999-09-01 | |
| US151892P | 1999-09-01 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2308332T3 true ES2308332T3 (es) | 2008-12-01 |
Family
ID=22540689
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES00957927T Expired - Lifetime ES2241644T3 (es) | 1999-09-01 | 2000-08-30 | Secuencias reguladoras para el control selectivo de la expresion de genes en plantas. |
| ES05010470T Expired - Lifetime ES2308332T3 (es) | 1999-09-01 | 2000-08-30 | Secuencias reguladoras de plantas para el control selectivo de la expresion de genes. |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES00957927T Expired - Lifetime ES2241644T3 (es) | 1999-09-01 | 2000-08-30 | Secuencias reguladoras para el control selectivo de la expresion de genes en plantas. |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6506565B1 (es) |
| EP (2) | EP1571219B1 (es) |
| CN (1) | CN1387572B (es) |
| AR (2) | AR025485A1 (es) |
| AT (2) | ATE397083T1 (es) |
| AU (1) | AU6947700A (es) |
| BR (1) | BR0013728B1 (es) |
| DE (2) | DE60020251T2 (es) |
| DK (1) | DK1571219T3 (es) |
| ES (2) | ES2241644T3 (es) |
| HK (1) | HK1050715A1 (es) |
| PT (2) | PT1571219E (es) |
| WO (1) | WO2001016307A2 (es) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2392845C (en) * | 1999-12-02 | 2011-03-15 | Dow Agrosciences Llc | Maize mip synthase promoter |
| WO2003079769A1 (fr) * | 2002-03-22 | 2003-10-02 | Incorporated Administrative Agency National Agriculture Organization And Bio-Oriented Research | Plante fonctionnelle, promoteur servant a la production de la plante fonctionnelle et procede d'utilisation correspondant |
| US20040121360A1 (en) * | 2002-03-31 | 2004-06-24 | Hagai Karchi | Methods, platforms and kits useful for identifying, isolating and utilizing nucleotide sequences which regulate gene exoression in an organism |
| US7078234B2 (en) * | 2002-12-18 | 2006-07-18 | Monsanto Technology Llc | Maize embryo-specific promoter compositions and methods for use thereof |
| BRPI0408735A (pt) * | 2003-03-12 | 2006-03-07 | Evogene Ltd | polinucleotìdeo isolado, construção de ácido nucléico, célula transgênica, organismo transgênico, vegetal transgênico, método para produzir um vegetal transgênico, método para expressar um polinucleotìdeo de interesse em uma célula, e método para co-expressar dois polinucleotìdeos de interesse em uma célula |
| CN1836045B (zh) | 2003-03-28 | 2012-05-09 | 孟山都技术有限公司 | 用于早期种子发育的新型植物启动子 |
| US7541166B2 (en) * | 2003-09-19 | 2009-06-02 | Microfluidic Systems, Inc. | Sonication to selectively lyse different cell types |
| US7112723B2 (en) | 2004-07-28 | 2006-09-26 | Applied Biotechnology Institute | Globulin 2 regulatory region and method of using same |
| US7309589B2 (en) * | 2004-08-20 | 2007-12-18 | Vironix Llc | Sensitive detection of bacteria by improved nested polymerase chain reaction targeting the 16S ribosomal RNA gene and identification of bacterial species by amplicon sequencing |
| ATE540119T1 (de) | 2004-09-13 | 2012-01-15 | Monsanto Technology Llc | Promotormoleküle zur verwendung in pflanzen |
| CA2580201A1 (en) * | 2004-09-14 | 2006-03-23 | Monsanto Technology Llc | Promoter molecules for use in plants |
| EP1791962B1 (en) | 2004-09-24 | 2012-04-25 | Monsanto Technology, LLC | Promoter molecules isolated from brassica napus for use in plants |
| AU2005334466B2 (en) * | 2004-11-05 | 2011-05-26 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Navy | Diagnosis and prognosis of infectious disease clinical phenotypes and other physiologic states using host gene expression biomarkers in blood |
| US8592662B2 (en) | 2005-02-11 | 2013-11-26 | Kalamazoo Holdings, Inc. | Capsicum variety exhibiting a hyper-accumulation of zeaxanthin and products derived therefrom |
| CA2597402A1 (en) * | 2005-02-11 | 2006-08-17 | Kalamazoo Holdings, Inc. | A capsicum variety exhibiting a hyper-accumulation of zeaxanthin and products derived therefrom |
| KR101813722B1 (ko) | 2009-03-30 | 2017-12-29 | 몬산토 테크놀로지 엘엘씨 | 벼의 17314 트랜스제닉 사건 및 이의 이용 방법 |
| CA3145660A1 (en) * | 2013-03-14 | 2014-10-02 | Monsanto Technology Llc | Plant regulatory elements and uses thereof |
| JP6692751B2 (ja) | 2013-11-26 | 2020-05-13 | イーアンドビー テクノロジーズ エルエルシー | 新規カベオリンモジュレーターを使用する自己免疫および／または炎症疾患の治療 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5352605A (en) * | 1983-01-17 | 1994-10-04 | Monsanto Company | Chimeric genes for transforming plant cells using viral promoters |
| US5322938A (en) * | 1987-01-13 | 1994-06-21 | Monsanto Company | DNA sequence for enhancing the efficiency of transcription |
| GB9118759D0 (en) * | 1991-09-02 | 1991-10-16 | Univ Leicester | Recombinant dna |
| US5593874A (en) * | 1992-03-19 | 1997-01-14 | Monsanto Company | Enhanced expression in plants |
| FR2712302B1 (fr) * | 1993-11-10 | 1996-01-05 | Rhone Poulenc Agrochimie | Eléments promoteurs de gènes chimères de tubuline alpha. |
| IN1997CH00924A (en) * | 1996-05-03 | 2005-03-04 | Syngenta Mogen Bv | Regulating metabolism by modifying the level of trehalose-6-phosphate |
| DE69731292T2 (de) * | 1996-05-17 | 2006-03-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Promotorelemente, welche wurzel-bevorzugte genexpression verleihen |
| US5955361A (en) | 1996-11-20 | 1999-09-21 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | P gene promoter constructs for floral-tissue preferred gene expression |
| CA2281487A1 (en) * | 1997-02-21 | 1998-08-27 | The Regents Of The University Of California | Leafy cotyledon1 genes and their uses |
| WO2000011177A1 (en) | 1998-08-20 | 2000-03-02 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Seed-preferred promoters |
| AU5788299A (en) | 1998-08-28 | 2000-03-21 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Seed-preferred promoters from (end) genes |
| PL204789B1 (pl) | 1999-09-16 | 2010-02-26 | Monsanto Technology Llc | Promotor, rekombinowana konstrukcja DNA, transgeniczna komórka roślinna, transgeniczna roślina i sposób wytwarzania transgenicznej rośliny |
-
2000
- 2000-08-30 EP EP05010470A patent/EP1571219B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-08-30 CN CN00815225.XA patent/CN1387572B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-08-30 DK DK05010470T patent/DK1571219T3/da active
- 2000-08-30 DE DE60020251T patent/DE60020251T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-08-30 AT AT05010470T patent/ATE397083T1/de active
- 2000-08-30 ES ES00957927T patent/ES2241644T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-08-30 BR BRPI0013728-6A patent/BR0013728B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-08-30 EP EP00957927A patent/EP1214402B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-08-30 WO PCT/US2000/023824 patent/WO2001016307A2/en active IP Right Grant
- 2000-08-30 PT PT05010470T patent/PT1571219E/pt unknown
- 2000-08-30 AT AT00957927T patent/ATE295880T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-08-30 ES ES05010470T patent/ES2308332T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-08-30 DE DE60039079T patent/DE60039079D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-08-30 AU AU69477/00A patent/AU6947700A/en not_active Abandoned
- 2000-08-30 PT PT00957927T patent/PT1214402E/pt unknown
- 2000-08-30 US US09/651,169 patent/US6506565B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-01 AR ARP000104599A patent/AR025485A1/es active IP Right Grant
-
2002
- 2002-12-02 US US10/307,723 patent/US7034204B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-04-28 HK HK03103006.3A patent/HK1050715A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-02-06 US US11/348,220 patent/US7563945B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2013
- 2013-01-22 AR ARP130100194A patent/AR089780A2/es unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE60020251T2 (de) | 2006-05-11 |
| WO2001016307A2 (en) | 2001-03-08 |
| WO2001016307A3 (en) | 2001-12-06 |
| US20060123511A1 (en) | 2006-06-08 |
| EP1214402A2 (en) | 2002-06-19 |
| EP1571219A2 (en) | 2005-09-07 |
| HK1050715A1 (en) | 2003-07-04 |
| BR0013728A (pt) | 2002-05-07 |
| EP1571219B1 (en) | 2008-05-28 |
| DE60039079D1 (de) | 2008-07-10 |
| BR0013728B1 (pt) | 2012-10-02 |
| DK1571219T3 (da) | 2008-08-25 |
| AR025485A1 (es) | 2002-11-27 |
| PT1571219E (pt) | 2008-08-04 |
| US6506565B1 (en) | 2003-01-14 |
| EP1214402B1 (en) | 2005-05-18 |
| AU6947700A (en) | 2001-03-26 |
| CN1387572A (zh) | 2002-12-25 |
| US20030131375A1 (en) | 2003-07-10 |
| US7563945B2 (en) | 2009-07-21 |
| PT1214402E (pt) | 2005-08-31 |
| ES2241644T3 (es) | 2005-11-01 |
| ATE295880T1 (de) | 2005-06-15 |
| EP1571219A3 (en) | 2006-02-22 |
| AR089780A2 (es) | 2014-09-17 |
| CN1387572B (zh) | 2010-05-05 |
| DE60020251D1 (de) | 2005-06-23 |
| ATE397083T1 (de) | 2008-06-15 |
| US7034204B2 (en) | 2006-04-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7563945B2 (en) | Plant regulatory sequences for selective control of gene expression | |
| US8735655B2 (en) | DNA molecules from maize and methods of use thereof | |
| AU2005222559B2 (en) | Plant regulatory sequences for control of gene expression | |
| US20090133163A1 (en) | Promoter, promoter control elements, and combinations, and uses thereof | |
| AU2011354240B2 (en) | Fiber selective promoters | |
| BRPI0907501B1 (pt) | construto de vetor, método para dirigir a transcrição, método de expressão de uma região de codificação exógena, método de alteração da expressão de um gene e método de produção de uma planta transgênica | |
| BRPI0909285B1 (pt) | ácido nucleico, construção de vetor, método de condução de transcrição, método de expressão de uma região de codificação exógena em uma planta, método de alteração da expressão de um gene em uma planta, método de produção de uma planta transgênica | |
| WO2002000905A2 (en) | Plant regulatory sequences for selective control of gene expression | |
| US7256324B2 (en) | Plant regulatory sequences for selective control of gene expression | |
| EP1288302A1 (en) | Rice regulatory sequences for gene expression in defined wheat tissue | |
| ES2938850T3 (es) | Elementos reguladores de las plantas y métodos de uso de los mismos | |
| AU2005202459B2 (en) | Plant regulatory sequences for control of gene expression | |
| AU2007224398A1 (en) | Plant regulatory sequences for control of gene expression | |
| BR112013017299A2 (pt) | promotores seletivos a fibras |