NL9420020A - Werkwijzen en samenstellingen voor het reguleren van de ontwikkeling van planten. - Google Patents

Description

Titel I WrKwljzen_en iaman»t«lllna«n voor het reguleren xan_de_ontwikkeling_yen planten.

ACHTERGROND VAH DE UITVINDING

De structuur en de genetische coderende sequenties van een familie van ontwikkelingseiwitten in planten hebben homologie met QM-eiwitten van zoogdieren en met de genen die voor deze eiwitten coderen. Recombinante moleculen die coderende regionen van plante-QM en geschikte promotors omvatten, worden toegepast om een getransformeerde plant met veranderde ontwikkeling te bereiden. De veranderde ontwikkeling veroorzaakt mannelijke steriliteit.

De expressie van de meeste, zo niet alle, plantegenen kan worden beschouwd als zijnde op één of andere wijze betrokken bij planteontwikkeling. Van veel genklassen is bekend dat deze reageren op ontwikkelingssignalen die zijn betrokken bij celdifferentiatie, vorming van weefsels en organen of bij reguleren van plantegroei. Er zijn verscheidene goed-gekarakteriseerde voorbeelden: genen die worden gereguleerd d.m.v. licht (zoals rbcS- en cab-genfamilies) of d.m.v. hormonen en genen die specifiek tot expressie worden gebracht in helmknoppen, wortels, zaden of bladeren, of in specifieke celtypes in deze weefsels. Zie Edwards e.a., 1990, en

Kuhlmeier e.a., 1987, voor overzichtsartikels. Van andere gen-types is bekend dat deze de expressie van weer andere genen reguleren, zoals het regulatie-gen "Opaque-2* van mals, welk codeert voor een transcriptie-activator die de expressie van 22 kd-zein-genen (Schmidt e.a., 1992, Ueda e.a., 1992) reguleert, en de Cl- en R-genen bij mals die voor de transcriptie-activators coderen die de expressie van Al en BZ1 (Klein e.a., 1989) reguleren. Een nieuw gebied van onderzoek heeft betrekking op de identificatie en isolatie van plantegenen waarvan, gebaseerd op de homologie ervan met genen afkomstig van dier- en gist-systemen, wordt aangenomen dat deze zijn betrokken bij de regulatie van basale celprocessen zoals celdeling. Zie Jocaobs, 1992, voor een overzichtsartikel. Een voorbeeld van een dergelijk gen is het homoloog van het gist- cdc2-gen dat is gekloneerd uit maïs (Colasantie e.a., 1991). In de toekomst zullen er zeker verdere, in plante geïdentificeerde genen zijn die andere basale cellulaire of ontwikkelingsprocessen reguleren.

Bij zoogdieren zijn ontwikkelingseiwitten in verband gebracht met abnormale celdeling, zoals die die de maligne toestand karakteriseert. Wilms' tumor is een pediatrische tumor van de nier die naar voren komt in embryo-blastomacellen en zowel in sporadische als erfelijke vormen optreedt. Drie groepen hebben het kloneren van twee verschillende genen gerapporteerd die zijn geassocieerd met Wilms' tumor. Het eerste, WT1, codeert een zinkvinger-eiwit dat tot de vroege-groeiresponsie- (EGR) -genfamilie behoort en bij mensen op de llpl3-locus mapt, welke bij tumorgene cellen is gedeleteerd (Call e.a., 1990, Gessler e.a., 1980). Het tweede gen, aangeduid als "QM", werd gekloneerd door Dowdy e.a., 1991, via de toepassing van subtractieve hybridisaties met toepassen van cDNA's en RNA dat respectievelijk werd afgeleid van tumorgene cellen en niet-tumorgene Wilms’ microcel-hybridecellen. Van dit gen werd aangetoond dat dit tot expressie werd gebracht op het RNA-niveau in nagenoeg alle normale weefsels die werden onderzocht bij de muis, maar miste bij Wilms' tumorgene cellijnen.

Het eiwit dat wordt gecodeerd door het QM-gen, is 25 kD in grootte en is zeer basisch met een pi van ongeveer 11,0. Dowdy demonstreerde tevens dat QM een lid is van een genfamilie aanwezig bij een aantal zoogdieren, in het bijzonder primaten. Van den Ouweland e.a. (1992) kloneerden het QM-gen uit een menselijke Xqter-chromosoombibliotheek en lieten zien dat dit gen voor 100% hetzelfde was aan het eerder gekloneerde QM-gen. De expressie van het QM-gen is aangetoond in de muis (Dowdy e.a., 1991). Informatie en het in het hoen gekloneerde gen, met gegevens afkomstig van van den Ouweland e.a., suggereert dat dit gen in een groot fylogenetisch bereik is geconserveerd.

Er is gepostuleerd dat QM betrokken kan zijn bij het onderhouden van het niet-tumorgene fenotype (Dowdy e.a., 1991). Recente experimenten suggereren dat QM mogelijk kan werken als een negatieve regulator van de transcriptie-activator Jun door met andere eiwitten (Fos) te concurreren die aan Jun binden, wat leidde tot speculatie dat gebrek aan QM-eiwit tot niet-gereguleerde celgroei en uiteindelijk tot tumorvorming leidt (Monteclaro e.a., 1993). Deze resultaten suggereerden niet dat er een QM-gen zou kunnen bestaan voor welk er niet fenotypes zijn die vergelijkbaar zijn met diegene die zijn geassocieerd met het QM-gen bij dieren.

Ontdekking van genen die plante-ontwikkeling veranderen, kan toepasbaar zijn bij ontwikkelen van genetische werkwijzen voor induceren van mannelijke steriliteit, aangezien andere, momenteel beschikbare werkwijzen, zoals ontpluimen, cytoplasmatische mannelijke steriliteit en zelf-onverenigbaarheid, aanzienlijk tekortkomingen hebben. Mannelijk-steriele planten zijn toepasbaar voor bereiding van hybride zaad.

Bereiding van hybride -zaad voor commerciële verkoop vormt een grote industrie. Uit hybride zaad geteelde planten profiteren van de heterosis-effecten van kruizen van twee genetisch verschillende teellijnen. De agronomische prestatie van dit nageslacht is superieur t.o.v. beide ouders, karakteristiek in vitaliteit, opbrengst en uniformiteit. De betere prestatie van hybride zaadvariëteiten in vergelijking met vrij-bestoven variëteiten maakt het hybridezaad aantrekkelijker voor boeren bij het planten en biedt dus uitzicht op een meerprijs op de markt.

Om hybride zaad te bereiden dat niet-gecontamineerd is met zelf-zaad, moeten bestuivingsbeheerswerkwijzen worden geïmplementeerd om kruis-bestuiving en geen zelf-bestuiving te verzekeren. Bestuivingsbeheermechanismen kunnen mechanisch, chemisch of genetisch zijn.

Een mechanische werkwijze voor hybride-zaadbereiding kan worden toegepast als de plantesoort in kwestie ruimtelijk gescheiden mannelijke en vrouwelijke bloemen of gescheiden mannelijke en vrouwelijke planten heeft. De mais-plant heeft bijvoorbeeld pollen producerende mannelijke bloemen in een bloeiwijze aan de apex van de plant en vrouwelijke bloemen in de oksels van bladeren langs de stam. Uitkruizen wordt verzekerd d.m.v. mechanisch ontpluimen van de vrouwelijke ouder om zelfbevruchten te voorkomen. Ook al wordt ontpluimen momenteel toegepast bij hybride-zaadbereiding, de werkwijze is niet alleen arbeidsintensief, maar ook kostbaar, aangezien verlies aan opbrengst wordt opgelopen.

De meeste produktiegewas-planten van interesse hebben echter zowel functionele mannelijke als vrouwelijke organen binnen dezelfde bloem, zodat emasculatie geen eenvoudige werkwijze is. Het is mogelijk vóór het afvallen van pollen, de pollen vormende organen met de hand te verwijderen, deze vorm van hybride-zaadbereiding is echter uiterst arbeidsintensief en dus duur. Zaad wordt alleen op deze manier bereid als de waarde en de hoeveelheid teruggewonnen zaad de moeite loont.

Een tweede algemene werkwijze voor bereiden van hybride zaad bestaat uit toepassen van chemicaliën die pollenvorming vernietigen of blokkeren. Deze chemicaliën, gametociden genoemd, worden toegepast om een tijdelijke mannelijke steriliteit te verlenen. Commerciële bereiding van hybride zaad d.m.v. toepassing van gametociden wordt beperkt door de kosten en de beschikbaarheid van de chemicaliën en de betrouwbaarheid en werkingsduur van de toedieningen . Deze chemicaliën zijn niet effectief voor gewassen met langere bloeiperioden, aangezien nieuwe bloemen zullen worden geproduceerd die niet beïnvloed zullen zijn. Een ander probleem is dat herhaalde toediening van de chemicaliën onpraktisch is vanwege de kosten.

Veel commerciële systemen voor breiding van hybride zaad voor veldgewassen berusten op een genetische werkwijze voor bestuivingsbeheersing. Planten die worden toegepast als vrouwelijk exemplaren kunnen of geen pollen maken, kunnen pollen niet laten afvallen of produceren pollen die biochemisch niet in staat zijn om zelfbevruchting te bewerkstelligen. Planten die biochemisch niet in staat tot zeifbestuiven, worden "zelf-onverenigbaar" [self-incompatible] (SI) genoemd. Tot moeilijkheden in verband met de toepassing van een zelf-onverenigbaarheidssysteem behoren (i) beschikbaarheid en vermeerdering van de zeif-onverenigbare vrouwelijke lijn en (ii) stabiliteit van de zelf-onverenigbaarheid. In een aantal gevallen kan zelf-onverenigbaarheid chemisch te niet worden gedaan of kunnen onvolwassen knoppen met de hand worden bestoven voordat het bio-chemische mechanisme dat pollen blokkeert, wordt geactiveerd. Helaas zijn zelf-onverenigbare systemen die kunnen worden geïnactiveerd, vaak gevoelig voor belastende klimatische omstandigheden die de werkzaamheid van de biochemische blokkade voor zelfbestuiving doorbreken of verminderen.

Van meer wijdverbreide interesse voor commerciële zaadbereiding zijn systemen van op pollen-beheersing gebaseerde, genetische mechanismen die mannelijke steriliteit veroorzaken. Deze systemen behoren tot twee algemene types: (a) mannelijke nucleaire-genensteriliteit, veroorzaakt door het achterwegge blijven van pollenvorming vanwege één of meer nucleaire genen en (b) cytoplasmatische genetische mannelijke steriliteit, gewoonlijk "cytoplasmatische mannelijke steriliteit" of C.M.S. genoemd, waarbij pollenvorming wordt geblokkeerd of afgebroken vanwege een defect in een cytoplasmatisch organel, dat in het algemeen een mitochondrion is.

Kern-genen-steri1iteit kan ofwel dominant ofwel recessief zijn. Een dominante steriliteit kan alleen worden toegepast voor hybridezaadvorming als vermeerdering van de vrouwelijke lijn mogelijk is, bijvoorbeeld via klonale in vitro-vermeerderina. Een recessieve steriliteit zou kunnen worden toegepast als steriele en vruchtbare planten eenvoudig kunnen worden onderscheiden. Commerciële toepasbaarheid van genen-steriliteitssystemen wordt echter beperkt door de kosten van klonale vermeerdering en polijsten van de vrouwelijke rijen zelf-vruchtbare planten.

Hoewel er rapporten bestaan betreffende hybridisatieprogramma's die de toepassing van C.M.S. behelzen, zijn er veel problemen die de commerciële waarde ervan beperken. Bij deze systemen kan een specifieke mutatie in het cytoplasmatisch gelokaliseerde mitochondrion, indien met de juiste nucleaire achtergrond, leiden tot achterwege blijven van vorming van volwassen pollen. In een aantal gevallen kan de nucleaire achtergrond voor de cytoplasmatische mutatie compenseren en treedt normale pollenvorming op. De nucleaire eigenschap die pollenvorming mogelijk maakt bij planten met C .M.S.-mitochondria, wordt restauratie [restoration] genoemd en is de eigenschap van specifieke “restauratie-genen" In het algemeen behelst de toepassing van C.M.S. voor commerciële zaadbereiding de toepassing van drie teellijnen, de mannel ijke-steri1iteitslijn (vrouwelijke ouder), een onderhouds-lijn die isogeen is t.o.v. de mannelijke-steriliteitslijn maar volledig functionele mitochrondriën bevat, en de mannelijke ouderlijn.

De mannelijke ouderlijn kan de specifieke restauratiegenen, gewoonlijk aangeduid als "restauratielijn“, dragen die dan vruchtbaarheid aan het hybride zaad kan verlenen. Voor gewassen, zoals groentegewassen waarvoor zaadterugwinning van de hybride onbelangrijk is, zou een C .M. S.-systeem kunnen worden toegepast zonder restauratie. Voor gewassen waarvoor de vruchten of zaad van de hybride het commerciële produkt is, moet de vruchtbaarheid van het hybride zaad worden hersteld d.m.v. specifieke restauratiegenen in de mannelijke ouder of moet de mannelijk-steriele hybride worden bestoven. Bestuiving van niet-gerestaureerde hybriden kan worden bereikt door een klein percentage mannelijke vruchtbare planten op te nemen om bestuiving te bewerkstelligen. Bij de meeste soorten wordt de C.M.S.-eigenschap maternaal overgeërfd (omdat alle cytoplasmatische organellen alleen van de eicel worden geërfd), wat de toepassing van het systeem kan beperken.

Hoewel C.M.S.-systemen zijn gerapporteerd, bezitten deze beperkingen die deze uitsluiten als een oplossing voor bereiding van mannelijke steriele planten. Één bijzonder C.M.S.-type bij maïs (T-cytoplasma) brengt bijvoorbeeld gevoeligheid over voor infectie door een bepaalde schimmel. Hoewel nog steeds toegepast voor een aantal gewassen, hebben C.M.S.-systemen de neiging om bij langere toepassing instorten. Algemeen is mannelijke steriliteit lager dan 100%.

Een zoektocht naar werkwijzen voor veranderen van ontwikkeling bij planten, bijvoorbeeld om mannelijke steriele planten te bereiden, onthulde bij planten een uitzonderlijk geschikte familie van ontwikkelingseiwitten, de QM-familie. De werkwijzen en samenstellingen van de onderhavige uitvinding verschaffen een nieuwe nucleaire basis voor manipuleren van mannelijke vruchtbaarheid.

SAMENVATTING VAN DE UITVINDING

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op werkwijzen en samenstellingen voor veranderen van plante-ontwikkeling. De werkwijzen passen genetische constructen toe met inbegrip van de uit planten geïsoleerde QM-familie.

Het werd niet verwacht dat een QM-gen zou worden gevonden bij planten. Het QM-gen is beschreven bij zoogdieren in verband met tumoren, waarbij dit tot expressie wordt gebracht in normale cellen, maar niet tot expressie wordt gebracht bij tumorcellen. Het gen wordt bij tumoren waarschijnlijk neer-gereguleerd, bijvoorbeeld bij tumor van Wilms bij mensen. Van een gen dat in verband staat met oncogenese bij zoogdieren, zou niet te verwachten zijn dat het een homoloog zou hebben bij planten, aangezien vergelijkbare ontwikkelingsabnormaliteiten zich niet voordoen. Van tumoren is bekend dat deze bij bepaalde plantesoorten voorkomen, maar deze worden specifiek veroorzaakt door infectie door exogene agentia, zoals Agrobacterium of andere pathogenen. Desalniettemin werd een polynucleotide geïsoleerd uit het maïsgenoom dat verrassenderwijs homologie vertoonde met de nucleotidesequentie van het zoogdier-QM-gen. Dat polynucleotide afkomstig van maïs wordt hier aangehaald als "QMn,·. Een QM-gen werd ook in tabak gekloneerd (QMt> .

Het door de maïs-nucleotide gecodeerde eiwit is een ontwikkelingseiwit. Tot ontwikkelingseiwitten behoren eiwitten die tot expressie worden gebracht tijdens ontwikkeling in responsie op een regulatiesignaa1, zoals een hormoon, en eiwitten die ontwikkelingsroutes reguleren. Het QM-gen bij planten is dienovereenkomstig toepasbaar in de context van beheersen van ontwikkeling, bijvoorbeeld van pollenontwikkeling. Storen bij pollenontwikkeling geeft een mannelijke steriele plant. Ontwikkelingseiwitten worden herkend door het vermogen ervan om het resultaat van normale ontwikkelingsstructuur of -functie te veranderen.

Een cDNA bereid van een QMiïl-polynucleotide bestaat in principe uit 800-950 nucleotiden, waarbij een open leesraam [open reading frame] (O.R.F.) en flankerende regionen behoren. Het vergelijkbare zoogdier-cDNA is in het algemeen minder dan 800 nucleotiden. Het enkelvoudige open leesraam in het maïs-cDNA codeert voor een polypeptide van ongeveer 220 aminozuren. Bij andere soorten codeert een open afleesraam in het QM-cDNA dat wordt geïsoleerd bij mensen, een familie van QM-eiwitten van ongeveer 214 aminozuren. Een QM-familie genen bij planten (QMp) codeert in het algemeen een eiwit dat wordt gekarakteriseerd door een primaire sequentie van ongeveer 200-250 aminozuren, en heeft de hier beschreven eigenschappen.

Meer in het bijzonder coderen genen van de QM-familie een eiwitfamilie die wordt gekarakteriseerd door de aanwezigheid van drie geconserveerde regionen in de aminozuursequentie van de eiwitleden van de familie. Bij een maïs-QM-eiwit behoort tot de eerste geconserveerde regio de eerste vanaf de aminoterminus geplaatste 10 aminozuren; tot de tweede geconserveerde regio behoort de aminozuursequent ie van groepen 50 tot 60 en vormt een amfifiele helixregio in het QM-eiwit; de derde geconserveerde regio is gelokaliseerd op groepen 98-135. Deze drie geconserveerde regionen vertonen een hoge mate van homologie met corresponderende regio's die karakteristiek zijn voor de tegenhangers ervan bij zoogdieren. "Hoge mate van homologie" wordt hier gedefinieerd aan te geven dat ten minste 80% van de aminozuren op corresponderende posities, als gedefinieerd t.o.v. van de aminozuurterminus van de sequentie, identiek zijn.

De algehele homologie van een plante-QM-aminozuursequentie t.o.v. een zoogdier-tegenhanger is in het algemeen ten minste 50%. (Het verschil tussen planten en zoogdieren doet zich voor in de regio ongeveer vanaf groep 135 (t.o.v. de N-terminus) tot het C-terminale uiteinde van het eiwit.

De posities van de nucleotidesequenties vanaf de N-terminus, die de geconserveerde regio in het maïs-QM-gen coderen, zijn gelokaliseerd ongeveer op posities 30-100, posities 210-250 en posities 330-400. Hybridisatie-sondes bereid uit deze regio's, zullen hybridiseren aan de vergelijkbare zoogdier-QM-sequenties bij stringente omstandigheden. Oligonucleotidesondes bereid uit de geconserveerde regio, zijn toepasbaar voor aantonen van nieuwe QM-genen bij planten, bij omstandigheden van lage stringentie, met toepassen bijvoorbeeld van 50% formamide, 5X SSC (0,75 M NaCL), bij 37'C. De coderende regio's van de maïssequentie vertonen algeheel homologie van 54% met de menselijke QM-sequentie.

Vanwege "wobble" ["schommeling"] op de derde positie van elk codon in de nucleotidesequentie, kan een functioneel vergelijkbaar eiwit worden gecodeerd met zo veel als 36% algehele afwijking tussen de coderende nucleotideregio's. Binnen dezelfde soort wordt van een sequentie die ten minste de drie geconserveerde regio's codeert, verwacht dat deze een functioneel gelijkwaardig eiwit codeert. Dit is niet noodzakelijkerwijs waar bij vergelijkingen tussen soorten onderling, waarbij eiwitfunctie onderling in verband staat met biochemische routes die karakteristiek zijn voor de soort. Zowel de plante- als de zoogdier-QM-eiwitten hebben belangrijke effecten op ontwikkelingsprocessen.

Ten minste twee QM-polynucleotiden, en zoveel als zes, zijn te onderscheiaen d.m.v. Northern-blot-analyse van maïspreparaten. Een illustratieve uitvoeringsvorm van een polynucleotide die een QM-eiwit codeert, wordt voor maïs in FIG. 1 getoond. De aminozuursequentie die correspondeert met FIGUUR 1, wordt getoond in FIGUUR 2. Oligonucleotide-initiators [primers] die zijn ontwikkeld vanuit deze sequentie, worden toegepast om het DNA in het open afleesraam te amplificeren. Oligonucleotide-initiators worden toegepast om het DNA in het open afleesraam van conclusie 2 te amp 1ificeren, waarbij genoemde initiators de nucleotidesequenties hebben: Links: 5'- ATGGGCAGAAGGCCTGCTAGATGC / Rechts: 5'-CAACGGCATCGAGGAAAGCCTTCC. Tot initiators die toepasbaar zijn bij aantonen van de tabakshomo 1 oog behoren GCGAGATCTAAACCATGGGCAGAAGGCC en GCGAAGCGGCCGCTTAAGCAACGGCATCGAGGAAAGCC. PCR-oligonucleotiden werden toegepast om het tabaks-QM-gen te amplificeren vanuit generische tabak (sp. xanthi), door middel van Taq-polymerase (Perkin Elmer), bij een hybridisatietemperatuur van 55’C en geamplificeerd produkt werd gedigereerd met Bai-II en Not-I. geëlektroforeerd op 0,8 LMA, gesubkloneerd in Bluescript-SK+ en vervolgens werd de sequentie ervan bepaald.

Een geïsoleerd en gezuiverd plante-QM-maïseiwit heeft een geschat molecuulgewicht van ongeveer 25 kD en een pi van ongeveer 11,0. Een van de cDNA-sequent ie afgeleid eiwit zal vrij zijn van andere eiwitten, indien dit synthetisch wordt bereid d.m.v. recombinante werkwijzen. Geïsoleerde en gezuiverde QM-eiwitten en epitoopfragmenten daarvan zijn toepasbaar bij bereiden van antilichamen. Deze antilichamen op hun beurt zijn toepasbaar voor diagnose van ontwikkelingsproblemen en de analyse van ontwikkelingsroutes bij planten. De plaats en het niveau van expressie van het QM-eiwit is toepasbaar bij bepalen hoe de ontwikkeling te veranderen. De antilichamen die werden ontwikkeld tegen QM, zijn bijvoorbeeld toepasbaar voor bepalen of en wanneer het eiwit wordt aangezet in specifieke cellen of weefsels van de plant. Deze informatie is toepasbaar bij ontwikkelen van werkwijzen voor storen met, of versterken van ontwikkelingSroutes, waartoe diegene behoren die in verband staan met pollenontwikkeling. Dergelijke informatie is toepasbaar bij ontwikkelen van hoogwaardiger planten, of bijvoorbeeld van mannelijke steriele planten.

Geïsoleerde en gezuiverde QM-eiwitten bij planten zijn tevens toepasbaar bij analyseren van eiwit-eiwit-interacties . Hiervoor worden gemerkte eiwit-sondes ontwikkeld. Een fusie-eiwit dat het QM-eiwit bevat, wordt bereid in bijvoorbeeld co 1 i. geïsoleerd, gemerkt en toegepast bij aantonen van eiwitinteracties tijdens ontwikkeling. Zie Smith & Johnson, 1988, en Ron & Dressier, 1992 .

Een recombinant DNA-molecuul wordt bereid dat het QM-gen in de aflees[sense]-oriëntatie , d.w.z., een zodanige oriëntatie dat het normale mRNA wordt getranscribeerd en wordt gebruikt als een blauwdruk [template] voor transleren van het normale QM--gen-eiwit), en een promotor die in staat is transcriptie van genoemd DNA in een plantecel te reguleren, omvat. Het recombinante DNA-molecuul kan anderzijds het QM-gen in de anti-aflees-oriëntatie coderen. Dit molecuul bevat het QM-gen dat in de tegengestelde richting is gekloneerd zodanig dat de min- of niet-coderende streng wordt getranscribeerd. Geen QM-genprodukt wordt getransleerd, maar een RNA-transcript dat complementair is aan het QM-mRNA wordt geproduceerd dat inhiberend is voor de translatie van het QM-mRNA van de plant zelf, waarmee de hoeveelheid geproduceerd QM-eiwit wordt verminderd.

De promotor in het construct kan een cel- of weefsel-specifieke promotor zijn, zodat het gen in specifieke cellen of weefsels tot expressie wordt gebracht. Bij een werkwijze voor bereiden van een mannelijke steriele plant heeft bijvoorbeeld een helmknop-specifieke of tapetum-specifieke promotor de voorkeur. De TA39-promotors waarin de onderhavige uitvinding voorziet, zijn geschikte promotors. Helmknopweefsel en tapetumcellen zijn voorbeelden van een weefsel of een cel die cruciaal zijn voor pollenontwikkeling. Tot helmknopweefsel behoren steuncellen en ontwikkelende microsporen en daartoe behoort geen rijpe pollen. Een QM-genconstruct kan werkzaam zijn bij veranderen van ontwikkeling, ongeacht of dit tot expressie wordt gebracht in een aflees- of anti-aflees-oriëntatie. Als er genen of processen zijn in helmknopweefsel die worden, of kunnen worden gereguleerd door QM, zou een af lees-QM-construct de ontwikkeling kunnen beïnvloeden d.m.v. veranderen van de timing van regulatie door QM of ontwikkeling kunne beïnvloeden d.m.v. overexpressie van het QM-eiwit. Dienovereenkomstig zou, als QM of alle andere genen die door QM kunnen worden gereguleerd, essentieel zijn voor normale helmknopontwikkeling, expressie van een anti-aflees-QM-construct ontwikkeling beïnvloeden door te storen met normale QM-expressie.

De promotor in het construct kan een induceerbare promotor zijn, zodat expressie van het aflees- of anti-aflees-molecuul in het construct kan worden beheerst d.m.v. blootstelling aan de inductor. Alsen voorbeeld van een dergelijke inductor dient een plantehormoon dat wordt toegepast om een hormoon-gevoelige promotor te beheersen. Een gedeelte van de sequentie van een QM-promotor die werd geïsoleerd uit maïs, wordt in FIGUUR 3 getoond.

Veranderen van ontwikkeling is in het bijzonder toepasbaar voor bereiden van een mannelijke-steriele plant. Een werkwijze voor bereiden van een mannelijk-steriele plant is transformeren van een plantecel met een recombinant molecuul dat de aflees-gen voor het plante-QM-eiwit omvat, of een anti-aflees-molecuul gericht tegen het QM-gen. Een geschikte promotor wordt gekozen in afhankelijkheid van de strategie voor ontwikkelingsbeheersing. Een strategie is bijvoorbeeld selectief in helmknopweefsel tot over-expressie brengen van het QM-gen door toepassen van een helmknop-specifieke promotor. Om een mannelijk-steriele plant te bereiden, zou de getransformeerde cel tot een plant worden geregenereerd, volgens conventionele methodologie.

Een transgene plant die het QM-genconstruct bevat, kan worden geregenereerd vanuit een culture die is getransfecteerd met datzelfde construct, als betrokken plantesoort maar ontvankelijk is voor regeneratie. "Culture* in deze context behelst een aggregatie van cellen, een callus, of derivaten daarvan die geschikt zijn voor culture.

Een plant wordt geregenereerd vanuit een getransformeerde cel of culture, of vanuit een explantaat, d.m.v. hier geopenbaarde werkwijzen die bekend zijn aan deskundigen van het vakgebied. Werkwijzen variëren in overeenstemming met de plantesoort. Zaad wordt verkregen van de geregenereerde plant of van een kruising tussen de geregenereerde plant en een geschikte plant van dezelfde soort met toepassen van kweekwerkwi j zen die bekend zijn aan deskundigen van het vakgebied.

Mannelijke-steriele tabaksplanten werden bereid door regenereren van planten afkomstig van tabaksbladexplantaten die waren getransformeerd met ofwel een QMrn-aflees-gen ofwel een QMm-anti-aflees-construct. Een waarschijnlijke verklaring is dat de exogene QMm-genexpressie het normale ontwikkelingsevenwicht van mannelijke vruchtbaarheid van tabak ontwrichtte.

KORTE BESCHRIJVING VAN PB TEKEHINCEN

De bijgaande tekeningen, welke dienen te worden beschouwd als zijnde ingelast in- en deel uit makende van de beschrijving, illustreren de voorkeursuitvoeringsvormen van de uitvinding van het moment. Samen met de voorgaande algemene beschrijving en de volgende, gedetailleerde beschrijving van de voorkeursuitvoeringvormen, dienen de hier onder toegelichte tekeningen voor uitleggen van de grondslagen van de uitvinding: FIGUUR 1. Nucleotidesequentie en de gecodeerde aminozuursequent ie van de cDNA-kloon 10-15, welke het QM-homoloog van maïs codeert.

FIGUUR 2. Aminozuur-centreeranalyse van het maïs-QM-homoloog (bovenste sequentie) met de menselijke QM-aminozuursequentie.

FIGUUR 3. Een gedeeltelijke nucleotidesequentie van een QM-promotor van maïs.

FIGUUR 4. Een plasmide-kaart van het plasmide aangeduid als pPHI3621, dat een QM;n-af lees-gen bevat.

FIGUUR 5. Een plasmide-kaart van het plasmide dat wordt aangeduid als pPHI2622, dat een anti-aflees tegen QMm bevat.

FIGUUR 6. Een plasmide-kaart van het plasmide dat wordt aangeduid als pPHI1285, een selecteerbaar bar-plasmide voor tabak.

FIGUUR 7 . Een plasmide-kaart van het plasmide dat wordt aangeduid als pPHI4722, dat een menselijk anti-aflees-gen bevat.

FIGUUR 8. Een plasmide-kaart van het plasmide dat wordt aangeduid als pPHI4723, dat een menselijk aflees-gen bevat.

FIGUUR 9. Een plasmide-kaart van het plasmide dat wordt aangeduid als pPHI4719.

FIGUUR 10. Een plasmide-kaart van het plasmide dat wordt aangeduid als pPHI4720.

FIGUUR 11. Een plasmide-kaart van het plasmide dat wordt aangeduid als pPHI687.

FIGUUR 12. Een plasmide-kaart van het plasmide dat wordt aangeduid als pPHI610 FIGUUR 13. Een plasmide-kaart van het plasmide dat wordt aangeduid als pPHI460, dat een uidA-gen bevat.

FIGUUR 14. Een plasmide-kaart van het plasmide dat wordt aangeduid als pPHI1952, dat een uidA-gen bevat.

FIGUUR 15. Een plasmide-kaart van het plasmide dat wordt aangeduid als pPHI2125, dat een uidA-gen bevat.

FIGUUR 16. Een plasmide-kaart van het plasmide dat wordt aangeduid als pPHI1527, dat een luciferase-gen bevat.

FIGUUR 17. Een plasmide-kaart van het plasmide dat wordt aangeduid als pPHI3620, dat een QMm-aflees-gen bevat.

FIGUUR 18. Een plasmide-kaart van het plasmide dat wordt aangeduid als pPHI1493, dat een GUS-gen bevat.

FIGUUR 19. Een plasmide-kaart van het plasmide dat wordt aangeduid als pPHI4745 (TA39 (14B1)), dat een aflees-gen bevat.

FIGUUR 20. Een plasmide-kaart van het plasmide dat wordt aangeduid als L62 (TA39 (14B1)), dat een anti-aflees tegen QMjp, bevat.

FIGUUR 21. Een plasmide-kaart van het plasmide dat wordt aangeduid als pPHI4855 (TA39 (8B3)), dat een GUS-gen bevat.

FIGUUR 22. Een plasmide-kaart van het plasmide dat wordt aangeduid als L59 (TA39 (8B3)), dat een QM^-aflees-gen bevat.

FIGUUR 23. Een plasmide-kaart van het plasmide dat wordt aangeduid als L61 (TA39 (8B3)), dat een anti-afleesstreng tegen QMjr, bevat.

FIGUUR 24. De nucleotidesequentie van de TA39 (8B3) - promotor.

FIGUUR 25. De nucleotidesequentie van de TA39 (14B1) -promotor.

GEDETAILLEERDE BESCHRIJVING VAN VOORKEURSUITVOERINGSVORMEN

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op werkwijzen en samenstellingen voor veranderen van ontwikkeling bij planten. De uitvinding heeft tevens betrekking op een plantegen-homoloog van een bij mensen constitutief tot expressie gebracht gen waarvan wordt aangenomen dat het een rol speelt bij het onderhouden van de niet-tumorgene toestand en waarvan is aangetoond dat het afwezig is in Wilms'-tumorgene cellijnen. Van dit gen, dat aanwezig is als een genfamilie bij mensen en knaagdieren, is aangetoond in een aantal uiteenlopende zoogdiersoorten.

Volgens de onderhavige uitvinding is een gen gekloneerd vanuit maïs en tabak dat een eiwit codeert dat een hoge mate van homologie heeft met het menselijke QM-eiwit (ongeveer 67%) .

Het tnaïs-gen codeert een polypeptide van 25 kD waarvan basische groepen 22% van het eiwit omvatten. Dit gen wordt tot expressie gebracht in alle maïsweefsels die werden onderzocht d.m.v.. Northern-blot-analyse, en is een lid van een plante-genfamilie.

De onderhavige uitvinding heeft voorts betrekking op een werkwijze voor bereiden van mannelijk-steriele planten en hybride zaad, op genetisch materiaal dat wordt toegepast om de mannelijke-steriliteitseigenschap te verlenen, en op nieuwe produkten die worden bereid d.m.v. de werkwijze, namelijk genetisch getransformeerde planten die de eigenschap van mannelijke steriliteit dragen, mannelijk-steriele planten en hybride zaad dat wordt geproduceerd door genoemde planten te bestuiven met pollen afkomstig van mannelijk-vruchtbare planten.

FIGUUR 1 illustreert de nucleotide- en afgeleide aminozuur-sequentie van een kloon die wordt aangeduid als 10-15. De cDNA-kloon was 936 nucleotiden lang en bevatte een enkelvoudig open af leesraam dat een polypeptide codeerde van 25.138 dalton. Dit polypeptide is zeer basisch, waarbij dit een berekende pi van 11,0 heeft, waarbij de basische groepen over het gehele eiwit zijn verdeeld. Bij onderzoek naar homologie met andere eerder gekarakteriseerde genen werd de aminozuursequentie die wordt gecodeerd door kloon 10-15, toegepast om de GenBank-gegevensbank te inspecteren d.m.v. het TFASTA-programma van de Genetic Computer Group (G.C.G., Devereux e.a., 1984). Deze analyse leverde een score van 716 met het menselijke QM-gen. Als de aminozuursequentie die door kloon 10-15 wordt gecodeerd, werd gecentreerd t.o.v. de aminozuursequentie van het menselijke gen (FIGUUR 2), zijn verscheidene regio’s van interesse op te merken. De eerste is de hoge mate van conservering van de aminoterminale regio, waar de eerste tien aminozuurgroepen zijn geconserveerd. De tweede regio, wederom geconserveerd bij de twee eiwitten, bevindt zich tussen groepen 50 en 61, wat een theoretische amfifiele helix vormt. Er is een derde geconserveerde regio van groepen 98-135.

Met verwijzing naar de drie geconserveerde regio's samen, impliceert de aanwezigheid van een 59-groepig stuk van uiterst geconserveerd aminozuur een geconserveerde functie bij deze regio’s van het eiwit. De carboxy-terminale regio is slecht geconserveerd en is mogelijk niet zo belangrijk bij de functie van het eiwit. Northern-blot-analyse van RNA dat wordt geïsoleerd uit blad- en wortel-weefseis van zevendaags oude maïs-zaailingen, demonstreert dat cDNA van kloon 10-15 in beide tot expressie wordt gebracht, waarbij wortels en bladeren ruwweg hetzelfde niveau van expressie vertonen. Bij verdere Northern-blots bleek dit gen tot expressie te worden gebracht in helmknoppen en aarscheuten.

Southern-blot-analyse laat zien dat het maïshomoloog bij maïs een lid is van een kleine familie van ongeveer 4 tot 6 leden.

De volgende voorbeelden illustreren werkwijzen voor uitvoeren van de uitvinding. De beschermingsomvang van de uitvinding wordt niet beperkt tot de uitvoeringsvormen die in deze presentaties worden toegelicht.

Voorbeeld ls Storen bij normale ontwikkeling van tabaksplanten d.m.v. transformatie met bet QMffi-gen

Tabakszaden (cv. xanthi) werden gekiemd onder steriele omstandigheden. Na ongeveer 7 tot 10 dagen onder licht en bij 28'C werden de cotylen en de eerste bladeren aseptisch verwijderd en in vieren gesneden (vierkante stukjes van ongeveer 1-2 mm) en op steriele papieren filterschijven aangebracht die waren verzadigd met medium dat 0,25 M sorbitol bevatte. De schijven werden overnacht bij 28 *C in het donker geïncubeerd. De volgende morgen werden de weefselstukjes gebombardeerd door middel van een biolistics-toestel om cellen te transformeren met een gelijk mengsel van het QMm-construct (pHI3621-aflees-construct, FIGUUR 4, of pPHI3622-anti-aflees-construct, FIGUUR 5) en een plasmide dat de selecteerbare merker (BAR-gen) bevat. Totaal DNA van 0,1 μg werd ingebracht d.m.v. vijf bombardementen.

Na bombardement werd het weefsel teruggevoerd naar incubatie bij 28*C in het donker. Na 48 uur werd het gebombardeerde weefsel overgebracht naar een selectiemedium (BASTA) en bij 28'C onder lampen geplaatst. Na ongeveer 2 weken begonnen kleine kolonies te verschijnen en bleven verschijnen gedurende ongeveer 1 week. De bladstukjes werden overgebracht naar regeneratiemedium, wat het mogelijk maakte dat zich bladeren en plantjes vormden. Na vorming van de planten werden de jonge plantjes overgebracht naar een wortelschiet-medium om wortelvorming mogelijk te maken. Na ongeveer 1-2 weken werden de planten naar de kas gebracht voor planten.

Het aflees-construct pHI3621 (FIGUUR 4) gaf niet zo veel kolonies als de controle (alleen selecteerbare merker). Er vormden zich namelijk veel kolonies, maar deze stierven vervolgens. Diegene die in leven bleven, groeiden met een veel lagere snelheid dan de controles. De meeste van de overlevende calli die waren gegenereerd vanuit de kolonies, leidden niet tot planten. De meeste van degene die planten produceerden, deden dit via groei van een afzonderlijk gedeelte van de calli, wat op een revertante sector (verlies van het plasmide) duidde. De resulterende planten waren negatief voor het maïs-gen bij PCR-analyse. Waarnemingen van de calli geven aan dat deze moeite hadden een meristeem voor produceren van een plant te vormen of te organiseren. Een plant bleek positief te zijn voor het plasmide en produceerde toch een plant. Deze plant groeide echter zeer langzaam en produceerde geen wortels tegen de tijd dat deze werd overgebracht naar de kas. Deze groeide in de kas enige tijd (ongeveer 1 maand) uiterst langzaam waarna deze met een normale snelheid groeide en er normaal uitzag. De plant bloeide en maakte zaad op een mannier die vergelijkbaar is met die van normale planten, de zaden die werden geproduceerd, zagen er echter abnormaal uit en namen bij kiemstests meer dan twee weken in beslag om te kiemen, vergeleken met 4-6 dagen voor normaal zaad.

De calli die werden afgeleid van de met anti-aflees (pPHI3622) (FIGUUR 5) gebombardeerde weefsels, vertoonden volledig andere groeikarakteristieken. In verscheidene gevallen groeiden de calli met een zeer verhoogde snelheid en produceerden een overvloed aan vegetatieve aanwas. Deze calli produceerden planten met een bijna normale snelheid. De plantjes die naar regeneratie- en wortelschiet-medium werden verplaatst, produceerden wortels met een hogere snelheid dan controles. De resulterende planten zagen er normaal uit, bloeiden en gaven zaad op een normale manier. De geproduceerde zaden kiemden normaal en de planten zagen er normaal uit.

Deze resultaten suggereren dat het QM -gen een rol speelt bij ontwikkeling. Bij getransformeerde tabak voorkomt of remt de aanwezigheid ervan zeer waarschijnlijk de vorming van meristeem. Als deze tot expressie worden gebracht, kunnen QM' s een cel “fixeren" in een specifiek ontwikkelingsstadium. Nadat het gen is aangezet, zal de cel niet meer differentiëren. Overexpressie van het gen in tabakscalli remde de vorming van meristeem voor genereren van planten. Overexpressie kan bij hogere concentraties letaal zijn.

De plantecellen met constructen die de anti-aflees-moleculen bevatten, waren in een aantal gevallen in staat met verhoogde snelheden te groeien. Een interpretatie van deze resultaten is dat het anti-aflees-molecuul de werking van het tabaks-QM-genprodukt aan het beëindigen was en het mogelijk maakte dat differentiatie gemakkelijker plaatsvond en dat de op de calli waargenomen overvloed van loof werd geproduceerd. Het experiment werd 3 keer herhaald en bij elk experiment werden in essentie dezelfde waarnemingen gedaan. Deze resultaten zijn in overeenstemming met de waarneming dat QM kan functioneren als een repressor-molecuul. Zie Monteclaro e.a., 1993.

Voorbeeld 2: Aantonen van microepore-specifieke genexpressie d.m.v. in situ-hvbridisatie

Dit voorbeeld illustreert een werkwijze voor tonen dat een geïsoleerd DNA een gen omvat dat microspore-specifieke expressie vertoont. In het bijzonder demonstreren de resultaten hier dat expressie van roRNA's die verwant zijn met een bijzondere tabaks-cDNA-kloon, is gelokaliseerd in microsporen van tabakshelmknoppen. "Microspore-specifiek", zoals hier gebruikt, verwijst naar genexpressie in elke cel of elk weefsel die cruciaal zijn voor pollenontwikkeling. Helmknoppen en tapetum zijn voorbeelden van dergelijke cellen of weefsels.

Een helmknop-specifieke tabaks-cDNA-kloon, aangeduid als TA39, werd verkregen van Dr. Robert B. Goldberg van de Department of Biology, University of California, Los Angeles, Californië. De kloon werd vervolgens toegepast om de TA39-promotor terug te winnen die met het QM-gen toegepast zou worden. (Zie Voorbeeld 3). Dit cDNA hybridiseert met mRNA van tabakshelmknoppen en niet met mRNA van de stamper, het petalum, blad of stam (Koltunow e.a., 1990). Het cDNA is 490 bases lang, inclusief een poly-A+-staart van 42 bases. Dit cDNA hybridiseert aan twee transcripten van 550 bases en 680 bases bij Northern-blots van RNA dat werd geïsoleerd uit helmknoppen. RNA-stipblots [dot blots) hebben aangetoond dat TA39-verwante transcripten accumuleren en vervallen met dezelfde tijdelijke opeenvolging als vijf andere helmknop-specifieke transcripten, welke alle zijn gelokaliseerd binnen het tapetum (Koltunow e.a., 1990).

Helmknoppen van Nicotinia tabacum (cv. Kyl7) werden genomen in het tetradestadium en bewerkt d.m.v. cytologische standaardmethoden (Berlyn e.a., 1976). Helmknoppen werden gedehydrateerd in t-butanol en ingebed in paraffine, vervolgens in 8 |un dikte coupes gesneden in aan objectglaasjes geplakt. DNA-fragmenten van kloon TA39 en een andere cDNA-kloon (LA2: een epidermis-specifiek mRNA) werden uit plasmiden geknipt, gezuiverd d.m.v. gel-elektroforese en gemerkt d.m.v. nick-translatie met biotine-14-dATP, met toepassen van de BioNick Labeling System (BRL) volgens de aanwijzingen van de fabrikant. In situ-hvbridisatie van gefixeerde helmknop-coupes met biotine-gemerkte sondes werd uitgevoerd en aangetoond met toepassen van de DNA Detection System van BRL. Bij dit systeem bindt streptavidine gebiotinyleerd sonde-DNA en gebiotinyleerde alkalische fosfatase, wat resulteert in neerslaan van nitroblauw-tetrazolium in cellen waarin de sonde hybridiseert aan doelwit-nucleinezuren.

Analyse van deze in situ-hvbridisatieanalvses liet zien dat de helmknoploculli van de geteste soorten microsporen in het tetradestadium bevatten. Bij helmknop-coupes die werden gesondeerd met TA39-DNA, accumuleerde alleen de tetraden tetrazolium-kleurstof. In tegenstelling hiermee accumuleerden helmknop-coupes die werden gesondeerd met een controle-DNA (LA2) kleurstof in de epidermale laag. Deze weefsel-specifieke beheersing demonstreert dat het waargenomen neerslaan van kleurstof in microsporen van helmknop-coupes die werden gesondeerd met TA39-DNA, niet het gevolg is van niet-specifieke retentie van DNA van aantoon-systeemcomponenten door de microsporen.

Voorbeeld 3: Isolatie van genomische T39-klonen die sequentiehomologie omvatten met microspore-specifiek mRNA; T3 9-promotors

Dit voorbeeld verschaft werkwijzen van isolatie van genomische DNA-klonen die sequenties omvatten die homoloog zijn aan elk microspore-specifiek mRNA waarvoor een nucleïnezuursonde beschikbaar is. De beschreven benadering is toepasbaar voor isoleren van microspore-specifieke regulatiesequenties van elke plantesoort die microspore-specifiek mRNA heeft dat homoloog is aan een dergelijke beschikbare sonde.

Een tabakshelmknop-specifieke cDNA-kloon, TA39, werd verkregen van Dr. Robert Golgberg van de U.C.L.A. TA39 hybridiseert aan mRNA van helmknoppen met een vergelijkbaar tijdspatroon als wordt gezien met verscheidene tapetum-specifieke transcripten (Kultunow e.a., 1990).

In. ..situ-hybridisaties lieten zien dat TA39 met geringe niveaus in microsporen en bindweefsel aanwezig is tijdens stadium -1 tot +1 en daarna in het tapetum met hogere niveaus vanaf stadium 1 tot en met 6 (Goldberg e.a., 1993).

Een genoombibliotheek van een gekozen plant, bijvoorbeeld een commercieel verkrijgbare bibliotheek van DNA-fragment van N. trabacum. Var. NK326 (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, Californië; catalogus FL1070D) , werd gedeeltelijk gedigereerd met Mbo-I en in het plasmide EMBL-3 gekloneerd, werd getest op klonen die homologie hebben voor cDNA-kloon TA39. Standaard-hybridisatiewerkwijzen werden toegepast, zoals worden beschreven in Sambrook e.a., 1989. Kandidaat-klonen werden gezuiverd d.m.v. drie rondes van plaque-oppikken, opnieuw uitplaten en opnieuw sonderen met TA39-cDNA-insert ie, totdat consistent hybridiserende plaques ofwel werden gezuiverd ofwel daarvan werd aangetoond dat deze niet aanwezig waren.

Twee te onderscheiden families van genomische tabaks-DNA-klonen die waren verwant met de TA39-cDNA-kloon, werden geïdentificeerd, elk vertegenwoordigd door twee overlappende klonen binnen elke familie. Één kloon van elke familie werd gekozen voor gedetailleerde karakterisering, klonen met de toegekende namen 8B3 (FIG. 24) en 14B1 (FIG.25). De regio van homologie met TA39 in elk van deze genomische klonen, alsmede de regio's onmiddellijk stroomopwaarts en stroomafwaarts van deze homologieregio's, werden in kaart gebracht d.m.v. restrictieenzym-splitsingsanalyse en DNA-hybridisatie.

Deze coderende sequenties en geassocieerde veronderstelde 5'-regulatie-regio's werden geïsoleerd als subklonen en daarna verder gesubkloneerd voor sequentie-bepalen. Dienovereenkomstig werden geneste sets van deleties van elke genomische kloon bereid door toepassen van exo-III en mung-bean-nuclease die door Stratagene werden geleverd in een kit. Van de geneste deleties werd de sequentie bepaald d.m.v. de didesoxy-terminatie-werkwijze van Sanger, met een automatische DNA-sequentiebepaIer (Applied Biosystems 373A) aan de Nucleic Acid Facility van de Iowa State University. Van de cDNA-insertie van TA39 werd ook de sequentie bepaald ter vergelijk. Binnen de regio van homologie met het TA39-cDNA van een microspore-specifiek mRNA is genomische kloon 8B3 volledig homoloog met TA39, terwijl het vergelijkbare gedeelte van genomische kloon 14B1 ongeveer 90% homoloog is met TA39.

De startpunten voor transcriptie van de 14B1- en 8B3-klonen werden in kaart gebracht d.m.v. primer-verlengingsexperimenten op een enkelvoudige nucleotide, 83 bases stroomopwaarts van de veronderstelde translatie-startplaats. Een perfecte TATA-box [TATA-doos] verschijnt 31 bp stroomopwaarts van de in kaart gebrachte transcriptie-start in elke kloon en een belangrijk open afleesraam van 110 aminozuren is intact aanwezig stroomafwaarts van de transcriptie-start in beide klonen (d.w.z., op de positie die wordt aangeduid als “ + 83" t.o.v. de transcriptieinitiatieplaats) . Beide klonen hebben ook een polyadenyleringsherkenningsplaats, 29 bp en 37 bp stroomafwaarts van een translatie-stopcodon, respectievelijk in klonen 14B1 en 8B3.

Voorbeeld 4: Isolatie van een DNA-segment dat een mlcrospore-specifieke sequentie voor genetische regulatie omvat

Nieuwe cDNA-klonen die geschikt zijn voor sondes, kunnen worden geïdentificeerd door klonen te testen op hybridisatie met een oligonucleotidesonde die een gedeelte van een TA39-sequentie omvat, gevolgd door bepalen van de sequentie van een hybridiserende kloon om de mate van identiekheid te bepalen van de volledige sequentie ervan met die van cDNA-kloon TA39. Hiervoor hebben stringente hybridisatie-omstandigheden de voorkeur. Hoewel stringente hybridisatie kan worden uitgevoerd bij de onderhavige uitvinding volgens een verscheidenheid van in de stand van de techniek bekende omstandigheden (zie bv. J. Sambrook, 1989), omvat één bijzondere set van stringente hybridisatie-omstandigheden die zijn toegepast bij de isolatie van de toegelichte regulatiesequenties, ongeveer 12 uur laten verlopen van begin-hybridisatiereactie bij ongeveer 65'C in 6 SSP, 0,1% SDS -oplossing, gevolgd door wassen bij ongeveer 65‘C met 1 x SSC, 0,1% SDS -oplossing en door wassen bij kamertemperatuur met 0,2 x SSC, 0,1% SDS -oplossing.

Voor cDNA-klonen die slecht gedeeltelijke homologie hebben met kloon TA39, zoals een cDNA-kloon die werd geïsoleerd uit een niet-tabaksplant, kan worden bepaald of de mRNA waarvan het nieuwe cDNA is afgeleid, een microspore-specifiek mRNA is, door tijds- en, nauwkeuriger, d.m.v. ruimtelijk analyses van expressie van dat mRNA in mannelijke-bloemweefseis. Zie bijvoorbeeld analytische werkwijzen in Klutonuw e.a. (1990); Domon e.a. (1990), welke helmknop-specifieke cDNA's van zonnebloem (He 1ianthus annuus) openbaren; Roberts e.a. (1991), welke een Brass ica naous -mRNA beschrijft waarvan gezegd wordt dat deze specifiek tot expressie wordt gebracht in zich ontwikkelende microsporen; Scott e.a., (1991), welke cDNA-bibliotheken beschrijft die zijn gemaakt van zich ontwikkelende helmknoppen, met inbegrip van isolatie van zowel tapetum-specifieke als microspore-specifieke cDNA-klonen; en Albani e.a. (1990), welke een pollen-specifieke gen-familie uit Brass ica naous beschrijft die wordt geactiveerd tijdens vroege microspore-ontwikkeling.

De bijzondere vorm van de sonde voor een mcirospore-specifiek mRNA dat is verwant aan kloon TA39, behelst elke vorm polynucleotide, een DNA- of een RNA-molecuul, enkel- of dubbel-strengig, die de fysische eigenschappen hebben die nodig zijn voor hybridiseren met een DNA-molecuul dat codeert voor de aminozuursequentie die wordt gecodeerd door TA39. Algemene vereisten voor effectieve nucleïnezuursondes, inclusief grootte, basesaroenstelling en mate van homologie, zijn algemeen bekend en beschreven in de stand van de techniek. (Zie bijvoorbeeld J. Sambrook e.a., (1989). Een voorkeurssonde is echter, in het bijzonder als wordt gezocht naar DNA-segmenten die nucleotidesequenties hebben die niet identiek zijn aan de sequenties van de sonde, een sonde die de volledige sequentie omvat van ten minste één streng van een cDNA dat is afgeleid van een microspore-specifiek mRNA. Een dergelijke sonde van volledige lengte verschaft een betere gelegenheid om een gedeeltelijk homoloog DNA-molecuul aan te tonen dan een sonde die alleen een gedeelte van een van mRNA afgeleide sequentie bevat. Dienovereenkomstig is elke gedeelte van een gegeven mRNA-sequentie mogelijk minder geconserveerd in verwante microspore-specifieke genen dan andere gedeeltes van die mRNA-sequentie, ongeacht of deze verwante genen afkomstig zijn van dezelfde plantesoort waaruit de mRNA voorkomt, of van andere soorten.

Tot de werkwijze voor isoleren van een DNA-segment dat een microspore-specifieke genetische-regulatiesequentie omvat, behoort voorts een stap van isoleren van één of meer fragmenten van genomisch plante-DNA die hybridiseren met de nucleïnezuursonde van hierboven, onder standaard-omstandigheden voor stringente hybridisatie. Deze fragmenten kunnen worden verkregen van dezelfde plantesoort waaruit het aan de sonde verwant mRNA voorkwam, of van een andere angiospermsoort. Tot bijzondere planten die geschikt zijn voor uitvoering van deze werkwijze van isoleren van microspore-specifieke gen-regulatiesequenties van deze uitvinding, behoren zowel monocotylen, in het bijzonder graangewassen zoals maïs, als dicotylen, bijvoorbeeld Canola en zonnebloem.

DNA-fragmenten die worden onderzocht op microspore-specifieke regulatiesequenties worden karakteristiek bereid d.m.v. kloneren in een vector die geschikt is voor dergelijk testen van grote genomische DNA-fragmenten die open afleesrammen en geassocieerde regulatiesequenties omvatten. Bereiding en hybridisatietesten van bibliotheken van genomisch plante-DNA kan hiervoor bijvoorbeeld worden uitgevoerd als beschreven in één van Albani e.a., 1991), welke genen van Brassica napus beschrijft; Brown e.a., 1990, welke genen van Oenothera araanesis openbaart; Guerrero e.a., 1990 en Hamilton e.a., 1989, welke maisgenen openbaren; of Twell e.a., 1989, welke een helmknop-specifiek gen uit tomaat beschrijft. Anderzijds kan een commercieel verkrijgbare bibliotheek van genomische plante-DNA-klonen worden aangeschaft en getest.

De nucleotidesequentie van elk geïsoleerd fragment van genomisch plante-DNA dat hybridiseert met een sonde volgens deze uitvinding, wordt gevestigd d.m.v. standaard-DNA-sequentie-bepaalwerkwijzen. Vervolgens wordt deze sequentie onderzocht om te bepalen of deze een eerste DNA-fragment omvat dat hybridiseert met de sonde op een sequentie van het eerste fragment dat ten minste een 5'-uiteinde van een volledig open afleesraam codeert. Dit 5'-uiteinde van een open af leesraam wordt geïdentificeerd d.m.v. een translatie-startcodon gevolgd door een sequentie die een open afleesraam bevat en met de sonde van deze werkwijze hybridiseert.

Tot een genomisch DNA-fragment dat geschikt is voor isolatie van microspore-specifieke regulatiesequenties behoort voorts een tweede DNA-fragment dat een sequentie omvat naast het 5'-uiteinde van het volledige open af leesraam dat met de sonde hybridiseert. In deze context behoort tot een sequentie die zich "naast" het 5'-uiteinde van het volledige open af leesraam bevindt, elk gedeelte van een sequentie die zich stroomopwaarts bevindt van dit open af leesraam in een genomisch DNA-fragment van deze uitvinding. In het algemeen kunnen regulatiesequenties die expressie reguleren van een aangrenzend open afleesraam, worden gelokaliseerd tot binnen een paar honderd basenparen van dit open af leesraam; maar in een aantal gevallen kunnen bepaalde regulatie-elementen die zich aangrenzend van een open af lees raam bevinden, tot verscheidene kilobases weg van dat af leesraam zijn gelokaliseerd. In ieder geval vormen, dankzij dat deze zich aangrenzend van de microspore-specifieke mRNA-verwante sequenties van een genomisch DNA-fragment van deze uitvinding bevinden, de sequenties van het tweede segment van een dergelijk genomisch DNA-fragment veronderstelde microspore-specifieke regulatiesequenties.

De werkwijze van isoleren van een DNA-segment dat microspore-specifieke regulatiesequenties omvat, omvat voorts een stap van testen van elk tweede DNA-segment van een genomisch DNA-fragment op inductie van microspore-specifieke expressie van een DNA-sequentie die werkend is gekoppeld aan het tweede DNA-segment.

Dit testen van segmenten die veronderstelde microspore-specifieke regulatiesequenties bevatten, dient om DNA-segmenten te identificeren die functionele microspore-specifieke genetische-regulatiesequenties omvatten die geschikt zijn voor manipuleren vau microspore-specifieke regulatie van heterologe sequenties in transgene planten volgens de onderhavige uitvinding.

Testen van de veronderstelde microspore-specifieke regulatiesequenties wordt bewerkstelligd door meten van expressie van een geschikte “verslaggever"-sequentie die functioneel is gekoppeld aan veronderstelde microspore-specifieke regulatiesequenties in microsporen en andere planteweefseis. Het algemene vereiste voor deze verslaggever-sequent ie bestaat eruit dat het niveau van expressie van deze sequentie gemakkelijk kan worden bevestigd in microsporen en afgeleide weefsels (bv. pollen), alsmede in andere weefsels (bv. blad) waarin microspore-specifieke regulatiesequenties geen expressie zouden moeten induceren van een functioneel gekoppelde verslaggever-sequentie.

Voorbeeld 5: Testen van microspore-specifieke expressie van een heteroloog gen dat functioneel is gekoppeld aan veronderstelde regulatiesequenties van genomische DNA-klonen

Dit voorbeeld illustreert de toepassing van microspore-specifieke regulatiesequenties van genomische DNA-klonen voor verschaffen van microspore-specifieke beheersing van expressie van een heteroloog verslaggever-gen in een transitore-genexpressietest.

De putatieve promotors van 8B3 (FIG. 24) en 14B1 (FIG. 25) werden elk gefuseerd aan een open afleesraam van een verslag-gen (uidA) dat codeert voor bèta-glucoronidase (GUS), gevolgd door de niet-getransleerde 3'-regio van het proteinase-II (pinll) -gen van aardappel. Bij één versie, die een "translatie-"fusie omvatte, werd elke promotor gekloneerd vanuit het begin van de beschikbare stroomopwaartse sequenties tot de translatiestart op nucleotide + 83. Bij een andere variatie die werd aangeduid als een “transcriptie-" fusie, werd elke promotor gekloneerd vanuit het begin van de beschikbare stroomopwaartse sequenties tot net na de transcriptiestart, op nucleotide +4. De laatste constructen bevatten de niet-getransleerde gids [leader] van Tabaksmozaïekvirus (omega') tussen de promotor_ en uidA-sequenties. Translatiegen-fusies analoog aan degene die het GUS-verslag-gen bevatten, werden ook geconstrueerd voor een ander model-gen, de coderende regio van luciferase van de vuurvlieg.

De uidA-genfusies werden getest in transitore-genexpressietests op plakjes van stadium-3-4-helmknoppen van tabak (cv. Petite Havana), die waren gebombardeerd d.m.v. een deelt jeskanon met DNA dat op 1,8 μπι wolf raam-bol let j es was neergeslagen. Zie bijvoorbeeld Twel e.a. 1989. Elk schot bevatte 0,5 μg DNA. Donkerblauw kleurende vlekken werden waargenomen op helmknop-plakjes en in afzonderlijk microsporen, wat aangaf dat transitore expressie van het GUS-gen had plaatsgevonden in microsporen. Van de bron van vlekken die zo nu en dan werden waargenomen op de helmknop-oppervlakte, kon niet worden onderscheiden of deze voortkwamen van helmknopcellen of verdwaalde microsporen. Bij toegevoegde test met geïsoleerde microsporen en bladeren werd echter transitore expressie in microsporen bevestigd voor uidA- en luciferase-genfusies. Transitore tests van de luciferase-constructen in bladstukjes demonstreerden dat geen genexpres s i ea c t i v i t e i t van de microspore-specifieke regulatiesequenties werd waargenomen in bladeren, met toepassen van de gevoeligste test die beschikbaar was (luciferase-gekatalyseerde luminescentie-detectie).

Voorbeeld 6: Bereiding van genetische constructen voor microspore-specifieke expressie van genen voor insecten-beheersing of mannelijke steriliteit

Dit voorbeeld illustreert genetische manipulatiewerkwijzen voor bereiden van constructen die microspore-specifieke genexpressie verschaffen van heterologe genen, zoals genen die insecten-beheersing of mannelijke steriliteit bewerkstelligen, bij transgene planten.

Om constructen te verschaffen voor microspore-specifieke expressie van genen die coderen voor gewenste eiwitten, bijvoorbeeld een gekozen insecten-beheersgen of een mannelijke-steriliteitsgen, wordt een DNA-segment dat microspore-specifieke regulatiesequenties van deze uitvinding omvat, functioneel gekoppeld aan een heteroloog gen en, indien nodig, aan niet-getransleerde 31-sequenties voor verschaffen van translatie- en transcriptie-beheersing die geschikt is voor het gekozen heterologe gen. De regulatiesequenties worden gefuseerd met heterologe gensequenties, bijvoorbeeld d.m.v. modificeren van het begin van het open af leesraam van het heterologe gen zodanig dat een splitsingsplaats van een restrictie-enzym wordt opgenomen. Het strekt tot voordeel als deze splitsingsplaats een Nco-I-olaats is of een andere plaats die verenigbaar is met ligatie met een Nco-I-plaats, aangezien de sequenties van dergelijke plaatsen een ATG-translatie-startcodon omvatten.

Een verscheidenheid van genotypes werden toegepast voor dit voorbeeld waarbij xanthi-tabakstransformaties werden uitgevoerd ten tijde het 10e-dags-kiemingsstadium.

De constructen worden als volgt beschreven: -- PPHI3621 (FIG. 4) + pPHI1285 (FIG. 6) [QM, maïs-afleesstreng + BAR] -- pH 13 622 (FIG. 5) + pPHI1285 (FIG. 6) (QM, maïs-anti- afleesstreng + BAR] -- PPHI4722 (FIG. 7) + pPHI1285 (FIG. 6) [QM, menselijke afleesstreng + BAR] -- pPHl4723 (FIG. 8) + pPHI1285 (FIG. 6) [QM, menselijke afleesstreng + BAR] -- pPHI265 + pPHI1285 [GUS + BAR] -- pPHil285 [BAR]

Om transformatie te bewerkstelligen werd een deeltjeskanonbombardement toegepast, een GE-helium-kanon en 650PSI- bezwijkschijven. Één bombardement werd uitgevoerd per monster, voor een totaal van 0,1 μ9·

Tabak werd ontkiemd en 10-14 dagen voorafgaand aan de volgende stappen in vitro op 272-medium geobserveerd. Één dag vóór het experiment werden de cotylen en de eerste bladeren in helften gesneden en op steriele filters aangebracht die 1,5 ml 530-medium + 0,25 M sorbitol bevatten. Incubatie werd overnacht bij 28'C gedaan in het donker uitgevoerd. Bladmateriaal werd versneden onder vloeibaar medium om uitdrogen te voorkomen. Acht blad-delen werden per plaat gekweekt, 5 platen werden bereid per QM-transformatie en 3 platen werden bereid per controle-transformatie.

In navolging van bombardement werden alle monster 2 dagen op de oorspronkelijke filter gehouden alvorens deze over te brengen naar selectiemedium.

Na 48 uur werd weefsel overgebracht naar 526+BASTA- (526H) -medium, terwijl bladweefsel op de filters achter werd gelaten. Kolonie-terugwinning vond in het algemeen 2-3 weken na bombardement plaats.

Na 4 weken werden cotylen/kolonies overgebracht naar 528S-medium. Plantjes afkomstig van getransformeerde kolonies werden afgesneden van de fundamentcallus en overgebracht naar 272N-medium om wortelvorming te laten plaatsvinden. Als wortels goed waren gevestigd, werden planten overgebracht naar de kas voor volgroeien.

De resultaten waren als volgt: 126 kolonies werden teruggewonnen uit alle DNA-behandelingen van dit onderzoek. PCR-analyse werd voltooid op een totaal van 50 kolonies d.m.v. willekeurig bemonsteren van 12 van elk van de DNA-behandelingen. Gegeven uit deze analyse worden onder getoond:

Verschillen in groeisnelheden werden waargenomen op 6 weken na bombardement. De opmerkelijkste waarneming was dat kolonies werden teruggewonnen uit transformaties met pPHl3621/pPHI1285 en pPHI3622/1285 vertoonde gevestigde koloniedood, in het bijzonder door behandeling met pPH13622/pHI1285. Geen opmerkelijke verschillen in groei werden opgemerkt voor de andere transformaties vergeleken met de controle-, pHI265/pHI1285-kolonies.

Voorbeeld 7: Stabiele BMS-transformatie voor evalueren van het effect en de expressie van QM-gen in aflees- en anti-aflees-oriëntatie en in het induceerbare GRP/GRE-gensysteem

Het in maïssuspensies toegepaste genotype was BMS P-38. DNA-constructen waren: pPHI4719 (FIG.> 9) + pPHI1285 (FIG. 6) {35S-QM-afleesstreng + 35S-BAR] pPHI4720 (FIG. 10) + pPHI1285 (FIG.> 6) [ 35S-QM-anti- afleesstreng + 35-BAR].

Dee 11jeskanonbombardement werd toegepast (een GE-heliumkanon en 650PSI- gescheurde schijven). Één bombardement werd per monster gedaan.

Één dag na sub-culture werd vloeistof van de cellen af gevacuümd en 2 gram materiaal werd opnieuw gesuspendeerd in 20 ml 237 + 0,25 M sorbitol-medium. Cellen werden 2-4 uur bij 28'C

geïncubeerd op een schudapparaat.

0,5 ml cellen werden uitgeplaat op dubbele lagen van Whatman-fliters die waren bevochtigd met 1,5 ml 237 + 0,25 M

-sorbitolmedium. De celdichtheid per plaat was ongeveer 50 mg.

6 monsters werden verbruikt voor elke DNA-behandeling, inclusief 2 monsters als niet-beschoten controles.

Na bombardement werden filters met cellen overgebracht naar 115-medium en 48 uur teruggezet in het donker bij 28‘C.

Cellen werden overgebracht naar 306E-selectiemedium na 48 uur d.m.v. van de filters schrapen van de cellen, deze te resuspenderen in 2 ml 237-medium en deze uit te platen in 1 ml per plaat voor elk monster.

Terugwinning van kolonies werd gecontroleerd. Als een kolonie werd geïdentificeerd, werd deze van de anderen gescheiden om identiteit ervan te behouden.

Inductietests kunnen worden uitgevoerd na PCR-analyse, bevestigd de aanwezigheid van genen in transgene kolonies.

Hoewel kolonieterugwinning plaatsvond vanuit alle transformaties in dit voorbeeld, was het merendeel van terugwinning afkomstig van de positieve controle-pHI1285-behandeling. Gegevens voor kolonieterugwinning worden hier onder getoond:

*N geeft het aantal monsters weer dat per DNA-behandeling werd gebombardeerd.

Zowel de 35S-aflees- en -anti-aflees-constructen voor het QM-gen waren toxisch voor BMS-kolonieterugwinning.

Voorbeeld βι Toepaasen van een tapstum-specifieke promotor van maïs voor transformatie

Experimentprotocollen

Herhalingen 1, 2 en_5.;

Bedoeling: terugwinnen van transgene kolonies, planten en nageslacht van mais die resistent zijn voor Basta/Bialaphos en GUS tot expressie brengen dat wordt gestuurd door de tapetum-specifieke SGB6gl-promotor.

Genotype: 54-68-5 Bl-1 (Herhaling 1) of 54-68-5 161F3 (Herhaling 2) 54-68-5 161F4 (Herhaling 5)

Medium: 237-, vloeibaar suspensiemedium voor mais 115, callus-onderhoudmedium voor mais 115E, callus-selectiemedium dat 5 mg/L Bsta bevat.

115B, callus-selectiemedium dat 3 mg/L Bialaphos bevat Weefselbehandeling: - Zeef cellen door maasgrootte van 710 μπρ één dag na sub-culture - Her-suspendeer in 237+ 3% PEG met plaatdichtheid van 50 mg/ml

- Incubeer overnacht in 3% PEG

- plaat cellen uit, 0,5 ml/plaat op 934-AH-glasfilters op een Whatman-filter dat is bevochtigd met 1 ml 237 + 3% PEG -medium - Breng cellen op glasfilter over naar 115-medium in navolging van bombardement

Deeltj es-kanonbombardement:

Helium-kanon van DuPont (Herhalingen 1 en 5) 650-PSI-bezwijkschijven (Herhalingen 1 en 5) PDS-100-kanon van DuPont (Herhaling 2) 0,230"-stop-platen, acetyl-macroprojectielen (Herhaling 2) Één bombardement per monster (Herhalingen 1 en 5)

Twee bombardementen per monster (Herhaling 2)

Test voor wolfraam gemodificeerde DNA-voorschriften, specifiek voor elk kanon DNA: pPHI687 (FIG. 11) + pPHI610 (FIG. 12) PPHI460 (FIG. 13) + pPHI610 (FIG.12) ρΡΗΙ1952 (FIG. 14) + ρΡΗΙ610 (FIG. 12) ρΡΗΙ2125 (FIG. 15) + pPHI610 (FIG. 12)

Behandeling/test volgend op bombardement: - Zoek R-gen-expressie 24-48 uur na bombardement - Breng 48 uur na bombardement monsters over naar 115E (herhaling 1). Breng monsters 7 dagen na bombardement over naar 115B (herhalingen 2 en 5) - Breng cellen 2 weken volgend op overdracht vanaf filters over naar selectie - PCR-test kolonies op verslag-gen voorafgaand aan plante-regenerat ie - Houdt monster bij 28'C in het donker Herhaling 1: PCR-analyse werd uitgevoerd op 16 onafhankelijke kolonies die werden teruggewonnen na selectie met 5 mg/ml Basta. Één kolonie, lCZ-plaat Nr. 9, pPHI610 + pPHl2125, was PCR-positief voor GUS (pPHI2125) . Alle kolonies waren Type-I fenotypes, de niet-geselecteerde positieve controle werd echter ook een Type-I fenotype. Dit fenotype neigt algemeen te zijn bij de 54-68-5 Bl-1 -lijn. Na 12 weken op 5 mg/ml Basta werden alle PCR-negatieve kolonies afgevoerd samen met al het overgebleven niet-embryogene weefsel. Kolonie 2 afkomstig van Monster Nr. 9, plaat 1, werd overgebracht naar 288E (Regeneratie-medium + 5 mg/ml Basta) . Acht kolonies bleven over om te worden getest met PCR op de aanwezigheid van het GUS-gen. Van deze acht kolonies waren drie PCR-positief voor GUS van ofwel de translatie-fusie (pPHI2125) ofwel de transcriptie-fusie (pPHI1952).

Herhaling 5.:, PCR-tests werden uitgevoerd op negen onafhankelijke kolonies die werden teruggewonnen na selectie met 3 mg/L Bialaphos. Alle kolonies waren PCR-positief voor het GUS-gen, wat wees op de aanwezigheid van ofwel pPHI2125 ofwel pPHI1952. Gen-controles die bij dit experiment werden toegepast (pPHI460), hebben 9 stabiele transformanten opgebracht, waarvan alle gebieden hebben die blauw kleuren bij een cytochemische test op GUS. Groei was veel sneller bij de gen-controles dan bij de transgene exemplaren die werden teruggewonnen van de SGB6gl:GUS-constructen.

Na 12 weken onder selectiedruk werden alleen snel groeiende embryogene kolonies gehouden, al het andere materiaal werd afgevoerd. Kolonies die PCR-positief scoorden, werden overgebracht naar regeneratie-medium voor terugwinning van planten. Basta-enzym-tests werden uitgevoerd op een gedeelte van de kolonies. Getoonde resultaten wijzen niet op een hoog niveau van transgene exemplaren die actief resistentie voor Basta vertonen. Vanuit de achtergrond van eerder werk en ervaringen van andere onderzoekers met deze test, bestaat een betrouwbaardere maat van transformatie uit bepalen of de celmorfologie van de teruggewonnen kolonies veel lijkt op die van de niet-geselecteerde controles en uit vergelijken van de groeisnelheid die de teruggewonnen kolonies vertonen.

Voorbeeld 9: Samenstelling van plasmiden die het maie-QM- gen bevatten

Plasmide pPHI3621 (FIGUUR 4) die het QM-gen tot expressie brengt in de aflees-oriëntatie, werd samengesteld met toepassen van pPHI1527 als één ouderplasmide. pPHI1527 (FIGUUR 16) bevat het plasmide pUC18 als de ruggegraat (Yanisch-Perron e.a., 1985) die de restrictie-plaatsen bevat die nodig zijn voor kloneren, en het ampicilline-resistentie-gen als een selecteerbare merker. Deze bevat tevens de 35S-promotor en enhancer-sequenties [versterker-sequenties] van bloemkool-mozaïek-virus (cauliflower mosaic virus] (CaMV) (Gardner e.a., 1987), de gids-sequenties [leader-sequent ie] van het tabaksmozaïekvirus, O' {Gallie e.a., 1987), het vuurvlieg-luciferase-verslag-gen (Ow e.a., 1986) en de Pinll transcriptie-terminatiesequenties (Hynheung e.a.,1989).

De tweede ouderplasmide van pPH13621 was pPHI3620, welke het maïs-QM-gen bevatte in pBluescript-KS (FIGUUR 17) . pPHI3621 ewrd gegenereerd d.m.v. digestie van zowel pPHI3620 als pPHI1527 met Nco-I en Knp-I en isolatie van de insertieband van pPHI3620 en de grotere plasmideband van pPHI1527 op laag-smeltpunts-agarosegelen [low melting point] (L.M.P.). Deze strategie verving het luciferase-gen door het maïs-QM-gen. De banden werden samengevoegd en geligeerd om pPHI3621 te vormen.

pPHl3622 (FIGUUR 5), welke de anti-aflees-streng van het maïs-QM-gen tot expressie brengt, werd teven samengesteld met toepassen van pPHI1527 en pPHI3620 als ouderplasmiden, maar d.m.v. digestie van beide met Sal-I en Sac-I De insertieband van pPHl3620 en de grotere plasmideband van pPHI1527 werden geïsoleerd uit L .M. P.-agarose-gelen ; de fragmenten werden samengevoegd en geligeerd. Opnieuw verving deze werkwijze het luciferase-gen door het maïs-QM-gen, in een anti-aflees-oriëntatie.

Weefsel-specifieke expressievectoren werden op dezelfde manier samengesteld, behalve dat de constitutieve CaMV-promotor werd vervangen door de helmknop-specifieke TA39-promotors 14B1 en 8B3 (Garnaat e.a., 1991). pPHI1493 (FIGUUR 18) dat de 14B1-promotor bevatte, werd gedigereerd met Nco-I en Nsi-I. net als pHI3621 (ouder 2). De kleine insertieband van pPHI3621 en de grotere plasmideband werden geïsoleerd d.m.v. elektroforese op L.M.P.-agarose, werden samengevoegd en geligeerd. Dit leverde pPHI4745 (FIGUUR 19) op die het maïs-QM-gen bevatte in de aflees-oriëntatie met de 14B1-promotor. Het maïs-QM-anti-aflees-construct werd gemaakt d.m.v. digestie van pPHI4745 met Sma-I en Nsi-I en digestie van pPHl3622 met Sal-I (welke werd opgevuld met Klenow-fragment) en Nsi-I. De grote plasmideband van pPHI4745 en de insertieband van pPHI3622 werden geïsoleerd d.m.v. L.M.P.-gel, samengevoegd en geligeerd. Dit leverde de plasmide L62 (TA39 14B1) (FIGUUR 20) op.

De expressievectoren die de helmknop-specifieke 8B3-promotor bevatten, werden samengesteld d.m.v. digestie van pPHI4855 (FIGUUR 21) met Bam-HI en Not-I. pPHl4855 bevatte alle boven beschreven sequenties met de toegevoegde sequenties die het β-glucoronidase-gen coderen (Walden en Schell, 1990). De andere ouder, pPHI4745, werd ook gedigereerd met Bam-HI en Not -1. De grote plasmideband van de pPHI4855 en de insertieband van pPHI4745 werden gezuiverd uit L.P.M.-agarose, samengevoegd en geligeerd. De resulterende plasmide, L59 (FIGUUR 22) bevatte het maïs-QM in de aflees-oriëntatie, aangedreven door de helmknop-specifieke promotor 8B3. Het anti-aflees-construct werd gemaakt d.m.v. digestie van pPHI4855 met Sma-I en Nsi-I en pPHI3622 met Sal -1 (vervolgens opgevuld met Klenow-fragment) en Nsi-I. De grote plasmideband van pPHI4855 en de insertieband van pPHl3622 werden geïsoleerd uit L.M.P.-agarose-gel, samengevoegd en geligeerd. Dit gaf L61 (FIGUUR 23) de anti-aflees-oriëntatie van het maïs-QM-gen onder de beheersing van de 8B3-promotor.

Voorbeeld 10: Bereiding van manne1ijk-81erie1e tabaksplanten d.m.v. transformatie met een QM-gen, aflees- en anti-aflees-oriëntatie

Tabaksplantexplantaten werden tegelijk gebombardeerd met 35S:BAR (pPHI1285) een één van de volgende plasmiden.·

L59 : TA39(8B3(:QM

L61: TA39(8B3):anti-aflees-QM

L62: TA39(14B1):anti-aflees-QM

4745: TA39(14B1) :QM

Een BioRad-helium-biolistics-kanon (DuPont) werd toegepast om de tabaksbladexplantaten te bombarderen. Het BAR-gen werd toegepast als een selecteerbare merker om te bepalen welke cellen de plasmiden ontvingen.

Een tapetum-specifieke tabakpromotor (TA39) werd bij alle vier plasmiden toegepast. Dit is een tapetum-specifieke promotor. "8B3" en "14B1" waren isolaten van TA39.

De L59-plasmide (FIGUUR 22) is identiek aan de L61-plasmide (FIGUUR 23), behalve dat de L59-plasmide een QM-aflees-gen van maïs bevatte en de L61-plasmide een anti-aflees-gen tegen het maïs-QM-gen bevatte.

De L62-plasmide (FIGUUR 20) is identiek aan het pPHI4745-gen, behalve dat de pPHI4745-plasmide een QM-aflees-gen van maïs bevatte en de L62-plasmide een anti-aflees-gen tegen het maïs-QM-gen bevatte.

Een blad-perforatie [leaf punch] werd aangebracht en delen van het explantaat die inbouw van het BAR-gen vertoonden. De polymerase-kettingreactie [polymerase chain reaction] (perkin-Elmer, algemeen bekend aan deskundigen van het vakgebied, werd toegepast om het maïs-QM-gen te amplificeren dat was ingebouwd in de tabakscellen.

PCR + cellen werden geselecteerd vanuit bialophos-resistente calli en toegepast om tabaksplanten te regenereren (Zie Voorbeeld 1).

Vruchtbaarheid van de geregenereerde planten werd bepaald d.m.v. controleren op 1) pollen-afgifte; en het vermogen tot zeifbevruchten. Bij alle gevallen van hier onder getoonde mannelijke-steriele planten werden beide criteria vervult. Zoals is te zien, waren mannelijk-steriele planten afkomstig van cellen die werden getransformeerd met L62, en afkomstig van cellen die werden getransformeerd met pPHI4745. Geen tabaksplanten werden bereid die waren getransformeerd met L59, en slechts twee planten werden bereid die waren getransformeerd met L61. Experimentele mislukking vanwege een lage frequentie van succesvol bombardement kan mogelijk het gebrek aan mannelijk-vruchtbare planten die zijn geassocieerd met deze twee plasmiden, verklaren.

Mannelijke-steriele tabaksplanten waren geassocieerd met de aanwezigheid van zowel het maïs-QM-gen als van de anti-aflees-gen tegen het maïs-QM-gen. Een waarschijnlijke verklaring is dat een balans van QM-gen-expressie is vereist voor normale ontwikkeling.

Bij gist schijnt de QM-balans essentieel te zijn voor normale ontwikkeling.

In de aanwezigheid van het maïs-QM-gen kan te veel QM-expressie plaatsvinden, een expressieprodukt van het maïs-gen kan een ontwrichtende mutant zijn in een tabakscel, of het maïs-QM-gen kan tot expressie worden gebracht op een niet-geschikt moment in de ontwikkeling.

Het maïs-QM-anti-aflees-genprodukt kan mogelijke binden aan het tabaks-QM-gen, waarbij dit wordt uitgezet op een cruciaal moment bij ontwikkeling.

Analyse van de QM-nucleotidesequenties van het tabaks- en het mais-gen suggereert dat er zoveel homologie kan zijn dat het anti-aflees-produkt dat tegen één gen is gericht, ook aan de andere kan binden.

Materialen en werkwijzen TOEPASSING VAN OM-GEN IN AFLEES-ORIËNTATIE; Het nucleotidesegment van het QM-gen dat werd geïsoleerd uit maïs of andere plantebronnen, wordt bij het stroomopwaartse (5') uiteinde gefuseerd aan een promotor die expressie van de afleesstreng mogelijk maakt in een bijzondere doelwitplantecel en wordt bij het stroomafwaartse {3') uiteinde ervan gefuseerd aan een geschikte transcriptieterminator en polyadenylatiesignalen waarvan bekend is dat deze in die cel functioneren. Tot voorkeurspromotors behoren diegene waarvan bekend is dat deze expressie sturen in de gewenste doelwitcel, waartoe "constitutieve* promotors, zoals 35S van CaMV, en de promotor van het ubiquitine-gen behoren waarvan bekend is dat deze expressie sturen in een grote verscheidenheid van planteceltypes. 35S stuurt waarschijnlijk expressie bij zowel monocotylen, zoals maïs, als bij dicotylen, zoals tabak en canola. De ubiquitine-promotor voor tabak wordt echter bij voorkeur afgeleid van een dicotyle bron. De ubiquitine-promotor voor toepassing bij monocotylen zoals maïs, wordt bij voorkeur afgeleid van een monocotyle bron. Tot andere geschikte promotors behoren diegene waarvan bekend is dat die onder specifieke omstandigheden induceerbaar zijn, zoals in responsie op bijzondere chemische behandelingen, bijvoorbeeld een herbicide.

Tot terminator/polyadenylatie-signalen behoren diegene waarvan bekend is dat die in de doelwitcel van interesse functioneren. De voorkeur hebben signalen van genen zoals pinll (proteïnase-remmer-II afkomstig van aardappel), of T-DNA-genen zoals OCS of NOS, waarvan bekend is dat die in een grote verscheidenheid van planteceltypes functioneren, inclusief die van dicotylen en monocotylen zoals maïs. Als de doelwitcel van een monocotyl als maïs afkomstig is, heeft het de voorkeur, maar is niet noodzakelijkerwijs vereist, dat een intron van een monocotyl-gen wordt ingevoegd tussen de promotor en het QM-gen. Een voorbeeld zou een intron (zoals intron 1 of 6) van het Adhl-gen van maïs zijn.

Bij een illustratieve uitvoeringsvorm wordt het nucleotidesegment van het QM-gen gefuseerd bij het stroomopwaartse (5 * ) uiteinde ervan aan een promotor waarvan bekend is dat die specificiteit heeft voor-, of een sterke voorkeur vertoont voor expressie in-, een weefsel of cel welke kritisch zijn voor pollenontwikkeling. De helmknop is een voorbeeld van een dergelijk weefsel. Een tapetumcel of zich ontwikkelende microspore is een voorbeeld van een geschikte cel. Het segment wordt aan het stroomafwaartse 13') uiteinde ervan gefuseerd aan geschikte transcriptieterminator- en polyadenylatiesignalen waarvan ook bekend is dat die in die cel functioneren. Voorkeurspromotors zouden SGB6 voor maïs en TA39 (van tabak) en de promotor Bp4A van kloon L4 (van napus. WO 90/08828) voor dicotylen zijn.

TOEPASSING VAN QM-GEN IN ANTI-AFLEES-ORIËNTATIE: De anti-aflees-vorm van het QM-gen wordt bij het stroomopwaartse (5') uiteinde ervan gefuseerd aan een promotor die expressie in een bijzondere doelwit-plantecel stuurt, en wordt bij het stroomafwaartse (3‘) uiteinde ervan gefuseerd aan geschikte transcriptieterminator- en polyadenylatiesignalen waarvan ook bekend is dat die in die cel functioneren. Een uitvoeringsvorm van een doelwitcel bij dit geval, is een cel waarbij van het QM-gen of een gen dat uiterst homoloog is aan het QM-gen, bekend is dat deze op een zodanige wijze tot expressie wordt gebracht dat de anti-afleesstreng effectief werkt. Voorkeurspromotors behelzen diegene waarvan bekend is dat die expressie in de gewenste doelwitcel sturen, tot geschikte kandidaten behoren "constitutieve" promotors, zoals 35S van CaMV en de promotor van het ubiquitine-gen, waarvan bekend is dat die expressie in een grote verscheidenheid van planteceltypes sturen. Van 35S wordt verwacht dat die in zowel monocotylen, zoals maïs, als in dicotylen, zoals tabak en canola, tot expressie komt. De ubiquitine-promotor voor tabak is echter bij voorkeur afkomstig van een dicotyle bron en de ubiquitine-promotor voor toepassing bij monocotylen, zoals maïs, is bij voorkeur afkomstig van een monocotyle bron. Tot andere voorkeurspromotors behoren diegene waarvan bekend is dat die bij specifieke omstandigheden induceerbaar zijn, zoals in responsie op een bepaalde chemische behandeling, bijvoorbeeld een herbicide. Het heeft de voorkeur dat het anti-aflees-construct het volledige QM-gen bevat of ten minste verscheidene honderden nucleotiden afkomstig van het 5'-uiteinde van het gen.

Het nucleotidesegment van de anti-aflees-vorm van het QM-gen wordt bij het stroomopwaartse (5') uiteinde ervan gefuseerd aan een promotor waarvan bekend is dat die specificiteit heeft voor-, of een sterke voorkeur vertoont voor expressie in-, een weefsel of cel die kritisch is voor pollenontwikkeling. Een voorbeeld van een geschikt weefoei is de helmknop. Een voorbeeld van een geschikte cel is een tapetumcel of een zich ontwikkelende microspore. Het segment wordt bij het stroomafwaartse (3‘) uiteinde ervan gefuseerd aan geschikte transcriptieterminator- en polyadenylatiesignalen waarvan ook bekend is dat die in de cel of het weefsel functioneren. De doelwit-cel is een cel warbij van het QM-gen of een gen dat uiterst homoloog is aan het QM-gen, bekend is dat dit expressie zodanig stuurt dat de anti-aflees-streng effectief werkt.

TRANSFORMATIE-WERKWIJZEN:

Tot trans formatiewerkwijzen voor dicotylen behoort een aantal verschillende algemeen bekende werkwijzen voor rechtstreekse DNA-afgifte. De voorkeur heeft biolistics-deeltjesbombardement van bladexplantaten. tot andere werkwijzen behoort Agrobacterium-afgifte aan explantaten; Agrobacterium-co-cultiveren van protoplasten; elektroporatie; PEG-opname of rechtstreekse DNA-afgifte tot in protoplasten en dergelijke. Een voorkeurswerkwijze voor monocotylen zoals maïs, is afgifte van DNA aan de behandelde cellen d.m.v. bombardement, maar andere werkwijzen, zoals elektroporatie, kunnen ook worden toegepast.

Cellen van een plant worden getransformeerd met de vreemd-DNA-sequentie van deze uitvinding op een conventionele manier. Als de te transformeren plant ontvankelijk is voor Agrobacterium-infecties, heeft het de voorkeur een vector toe te passen die de vreemd-DNA-sequentie bevatten, welke een uitgeschakelde Ti-plasmide is. De transformatie kan worden uitgevoerd door toepassen van werkwijzen die bijvoorbeeld worden beschreven in EP 116 718 en EP 0 270 822. Voorkeurs-Ti-plasmidevectoren bevatten de vreemd-DNA-sequentie tussen de grenssequenties, of ten minste stroomopwaarts gelokaliseerd van de rechter grenssequentie. Andere types vectoren kunne worden toegepast voor transformeren van de plantecel, met toepassen van werkwijzen als rechtstreekse genoverdracht (zie bijvoorbeeld EP 0 237 356, PCT-openbaring WO/85/01856 en EP 0 275 069); in vitro-protoplastentrans formatie. zoals bijvoorbeeld beschreven in U.S.-octrooi Nr. 4.684.611; door plante-virus verzorgde transformatie, zoals bijvoorbeeld beschreven in EO 0 067 553 en U.S.-octrooi Nr. 4.407.956; en door liposomen verzorgde transformatie, zoals onder andere beschreven in U.S.-octrooi Nr. 4.536.475.

Als de te transformeren plant mais is, zijn recentelijk ontwikkelde transformatiewerkwijzen geschikt, zoals de werkwijzen die zijn beschreven door Fromm e.a., 1990, en Gordon-Kamm e.a., 1990, voor bepaalde lijnen van maïs.

Als de te transformeren plant rijst is, kunnen recentelijk ontwikkelde trans formatiewerkwijzen worden toegepast, zoals de werkwijzen die zijn beschreven voor bepaalde lijnen van rijst, door Shimamoto e.a., 1990, Datta e.a., 1990, Cristou e.a., 1991, en Lee e.a., 1991.

Als de te transformeren plant tarwe is, kan een werkwijze die homoloog is met diegene die boven werden beschreven voor maïs of rijst, worden toegepast. Bij voorkeur wordt voor de transformatie van een monocotyle plant, in het bijzonder een graangewas zoals rijst, maïs of tarwe, een werkwijze van rechtstreekse DNA-overdracht, zoals een werkwijze van biolistic-transformatie of electroporatie, toegepast. Als een dergelijke rechtstreekse overdrachtwerkwijze wordt toegepast, heeft het de voorkeur om het DNA te minimaliseren dat wordt overgebracht, zodat in essentie alleen de DNA-sequentie van deze uitvinding, het QM-maïs-gen en geassocieerde regulatieregio's, in het plantegenoom wordt geïntegreerd. In dit opzicht heeft het de voorkeur, als een DNA-sequentie van deze uitvinding wordt samengesteld en vermeerderd in een plasmide in een bacterieel waardorganisme, dat voorafgaand aan transformatie van een plant met de DNA-sequentie, plasmidesequenties die zijn vereist voor vermeerderen in het bacteriële waardorganisme, zoals een oorsprong van replicatie, een antibioticum-resistentie-gen voor selectie van het waardorganisme en dergelijke, worden gescheiden van de delen van het plasmide die de vreemd-DNA-sequentie bevatten.

WOLFRAAM/DNA-VOORSCHRIFT VOOR HELIUM-ΚΑΝΟΝ VAN DUPONT (BIOLISTIC DEELTJESBOMBARDEMENT-WERKWIJZE VAN TRANSFORMATIE)

Weeg 60 mg 1,8 wolfraam af: doe in een 15 ml -centrif ugebuis. Voeg 2 ml 0,1 Μ Hn03 toe: soniceer 20 minuten op ijs.

Verwijder HNO3: voeg 1 ml steriel gedeïoniseerd water toe en breng monster over naar een 2 ml Sarstedt-buis. Soniceer kort.

Centrifugeer om deeltjes te sedimenteren.

Verwijder H3O: voeg 1 ml 100% EtOH toe - soniceer kort Centrifugeer om deeltjes te sedimenteren.

Verwijder H3O: voeg 1 ml 100% EtOH toe- soniceer kort Centrifugeer om deeltjes te sedimenteren.

Verwijder EtOH. Voeg 1 ml steriel gedeïoniseerd water toe. Soniceer.

Pipetteer 250 μΐ suspensie in 4 2 ml-buizen.

Voeg 750 μΐ steriel gedeïoniseerd water toe aan elke buis.

Bevries wolfraammonster tussen toepassingen door.

Pipetteer 50 μΐ wolfraam/HjO-suspensie in een 1,5 ml buis (soniceer eerst.

Voeg 10 μg DNA toe, meng.

Voeg 50 μΐ 2,5 M CaCL· toe. Meng.

Voeg 20 μΐ 0,1 M spermidine toe. Meng.

Soniceer kort. Centrifugeer 10 sekonden bij 10.000 t.p.m.

Verwijder supernatant. Voeg 250 ml 100% EtOH toe. Soniceer kort. Centrifugeer bij 10.000 t.p.m. gedurende 10 sekonden.

Verwijder supernatant. Voeg 60 μΐ 100% EtOH toe.

VOORSCHRIFT VOOR MAÏS-TRANSFORMATIE VOOR TERUGWINNEN VAN STABIELE TRANSGENE PLANTEN

DAG 1 Cellen worden in vloeibaar medium gedaan en gezeefd (710 μιη) . 100-200 mg cellen wordt opgevangen op 5,5 cm glasvezelfilter op een oppervalk van 3,5 cm. Cellen worden overgebracht naar medium en overnacht geïncubeerd.

Dag 8 Filter en cellen worden uit het medium verwijderd, gedroogd en gebombardeerd. Filter en cellen worden teruggedaan op medium.

Dag 5 Cellen op het filter worden overgebracht naar selectiemedium (3 mg bialophos).

Dag 12 Cellen op het filter worden overgebracht naar vers selectiemedium.

Dag 19 Cellen worden van het filter geschraapt en gedispergeerd in 5 ml selectiemedium dat 8,6% laag-smeltpunts-zeeagarose bevat. Cellen en medium worden uitgespreid over het oppervlak van twee 100 mm x 15 mm platen die 20 ml vast-gemaakt gel-rite-medium bevatten.

Dag 40 Putatieve transformanten worden opgepikt van de plaat.

Dag 61 Platen worden gecontroleerd op nieuwe kolonies.

Totaal cellulair RNA werd bereid uit B73-zaailingen, zeven dagen na planten volgens het voorschrift van Chomczynski en Sacchi (1987 ). Polu-(A)+-RNA werd gezuiverd uit bladhomogenaten met toepassen van het PolyAtrct-1000-systeem (Promega). Northern-blots werden als eerder beschreven (Thomas, 1980) uitgevoerd.

KARAKTERISERING VAN FLANKERENDE .REGIO'S

In kaart brengen m.b.v. initiator-verlenging [primer extension mapping] van de 5'-RNA-uiteinden volgde de werkwijze van McKnight (1982). 01igonucleotiden die werden toegepast voor initiator-verlengingsreacties waren 5'- en gemerkte 32-meers- en 44-meers-homologen van het TA39-cDNA vanaf de laatste nucleotide van het startcodon tot 31 nucleotiden en respectievelijk 79 en 122 nucleotiden stroomafwaarts van het startcodon. RNA werd geïsoleerd uit tabakshelmknoppen met toepassen van de guinidium-isothiocyanaat-werkwijze van Chomcynski en Sacchi (1987) en gezuiverd met toepassen van een oligo-dT-kolom.

PLASMIDEN

Positie-gestuurde mutagenese [site directed mutagenesis] (Su en Al-Gewely, 1988) werd toegepast om ofwel een Nco-1-plaat-s bij het startcodon te creëren met de oligonucleotide 51CTAATTCCACCATGGCTTTTCTTGC3' , ofwel een Pst-I-plaats 5 basen stroomafwaarts van de putatieve start van transcriptie te creëren met de oligonucleotide 5'GTTTATGTTTTCGTATCTGCAGCTTGAAAAGATATTATATC 3' .

Voor uidA-verslagconstructen werden 5'-flankerende regio's gefuseerd bij de Nco-I-plaats aan het uidA-afleesraam met een 3'-transcriptie-bewerksignaal van het protease-remmergen van aardappel (PI-II), of gefuseerd bij de Pst-I-plaats aan de niet-getransleerde TMV-gids Ω', uidA-afleesraam en PI-II. De uidA-verslag-constructen met Ω 1 werden ingevoegd in de binaire Ti-vector pALLTKRep. pALLTKRep verschilt van pBHOl.l (Jefferson, 1987) doordat de CaMV-35S-promotor die de selecteerbare NPTII-merker aandrijft, in plaats van de nopaline-synthetase-promotor. De plasmide pLAT52-7, die de pollen-specifieke tomatenpromotor en het uidA-verslag-gen bevat, werd vriendelijkerwijs verschaft door Dr. Sheila McCormick van het USDA-ARS Plant Gene Expression Center, Albany, CA.

DE lef-verslag-plasmiden werden gecreëerd door fuseren van 51 - flankerende regio’s van LAT52 of de genomische TA39-klonen, bij de Nco-l-plaats aan het vuurvlieg-luciferase-gen met PI-II 3’.

AANGEHAALDE DOCUMENTEN

De onder opgegeven referenties dienen te worden beschouwd als zijnde hier ingelast, in zoverre dat deze aanvullen, verklaren, een achtergrond verschaffen voor onderwijzen van methodologie, methoden of samenstellingen die hier worden beschreven.

Albani et al., 1990, Plant Mol. Biol. 15:605-622.

Berlyn et al., 1976, "Botanical Microtechnique and Cytochemistry." The Iowa State University Press, Ames, Iowa, Ch. 3, 4, and 5.

Brown et al., 1990, Plant Cell 2:263-274.

Call et al., 1990, "Isolation and characterization of a zinc finger polypeptide gene at the human chromosome 11 Wilms' tumor locus." Cell 60:509-520.

Chomczynski et al., 1987, "Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction." Anal. Biochem. 162:156-159.

Chomcynski, P. and Sacchi, N., 1987. Single step method for RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry 162, 156-159.

Christou et al., 1991, "Production of transgenic rice (Oryza Sativa L.) plants from agronomically important indica and Japonica varieties via electric discharge particle acceleration of exogenous DNA into immature zygotic embryos" Bio/Technology 9:957.

Colasanti, J. et al., 1991, "Isolation and characterization of cDNA clones encoding a functional p34cdc2 homologue from Zea mays," Proc. Natl. Acad. Sci. ÜSA 88:3377-3381.

Datta et ai., 1990, "Genetically engineered fertile Indica-rice recovered from protoplasts," Bio/Technology 8:736.

Devereux et al., 1984, "A comprehensive set of sequence analysis programs for the VAX." Nucleic Acids Res. 12:387-395.

Domon et al. , 1990, Plant Mol. Biol. 15:643-646.

Dowdy et al., 1991, "The isolation and characterization of a novel cDNA demonstrating an altered in RNA level in nontumorgenic Wilms' microcell hybrid cells." Nucleic Acids Res. 19:5763-5769.

Edwards et al., 1990, "Cell-specific gene expression in plants." Ann. Rev. Genet 24: 275-303.

Fromm et al. (1990) Bio/Technology 8:833.

Gallie, D.R., Slex, D.E., Watts, J.W., Turner, P.C. and Wilson, T.M.A., 1987, "The 5' leader sequence of tobacco mosaic virus RNA enhances the expression of foreign gene transcripts in vitro and in vivo." Nucleic Acids Res. 8:3257-3273.

Gardner, R.C., Howarth, A.J., Hahn, P., Brown-Luedi, M., Shepherd, R.J. and Messing, J.C., 1981, "The complete nucleotide sequence of an infectious clone of cauliflower mosaic virus by M13mp7 shotgun sequencing." NucleicAcids Res. 9:2871-2888

Garnaat, CW. and Huffman, G., 1991, "Isolation and transient assay of tobacco anther specific promoters." Abstracts: The International Society for Plant Molecular Biology. Tucson, AZ, Oct. 1991.

Gessler et al., 1990, "Homozygous deletion in Wilms' tumours of a zinc-finger gene identified by chromosome jumping." Nature, 343:774-778.

Goldberg, R.B., Beals, T.P. and Sanders, P.M., 1993.

Anther development: basic principles and practical applications. Plant Cell 5:1217-1229.

Gordon-Kamm et al., 1990, "Transformation of maize cells and regeneration of fertile transgenic plants," The Plant Cell 2:603-618.

Guerrero et al., 1990, Mol. Gen. Genet. 224:161-168.

Hamilton, et al., 1989, Sex. Plant Reprod. 2:208-212.

Hynheung, A., Mitra, A., Choi, H.K., Costa, M.A., An, K., Thornburg, R.W. and Ryan, C.A., 1989, "Functional analysis of the 3' control region of the potato wound-inducible proteinase inhibitor II gene." Plant Cell 1:115-122.

Jacobs, 1992 "Control of the cell cycle." Dev. Biol. 153:1-15.

Klein et al., 1989, "Regulation of anthocyanin biosynthetic genes introduced into intact maize tissues by microprojectiles." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6681-6685.

Koltunow et al., 1990, "Different temporal and spatial gene expression patterns occur during anther development." Plant Cell 2:1201-1224.

Kuhlmeier et al., 1987, "Regulation of gene expression in higher plants." Ann Rev. Plant Physiol. 38:221-257.

Lee et al., 1991, "Efficient transformation and regeneration of rice small cell groups," PNAS 88: 6389-6393.

McKnight, S., 1982. Cell 31:355-366.

Monteclaro et al., 1993, "A jun-binding protein related to a putative tumor suppressor," PNAS 90:6726-6730.

Ow, D., Wood, K.V., DeLuca, M., de Wet, J.R. , Helinski, D.R., and Howell, S.H., 1986, "Transient and stable expression of the firefly luciferase gene in plant cells and transgenic plants." Science 234:856-859.

Roberts, N., et al., 1991, Plant Mol. Biol. 17:295-299.

Ron & Dressier, 1992, "pGSTog-A versatile bacterial expression plasmid for enzymatic labeling of recombinant proteins." BioTech 13: 866-69.

Sambrook et al. , 1989, "Molecular Cloning". Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Schmidt et al., 1992, "Opaque2 is a transcriptional activator that recognizes a specific target site in 22-kd zein genes." Plant Cell 4:689-700.

Scott, R., et al., 1991, Plant Mol. Biol. 17:195-207.

Shimamoto et al., 1990, "Fertile transgenic rice plants regenerated from transformed protoplasts," Nature 338:274.

Smith * Johnson 1988, "Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione s-transferase." Gene 67:31-40.

Thomas et al., 1980, "Hybridization of denatured RNA and small DNA fragments transferred to nitro-cellulose." Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 77:5201- 5205.

Twell et al., 1989, "Transient expression of chimeric genes delivered into pollen by microprojectile bombardment," Plant Physiol., 91:1270-1274.

Ueda et al., 1992, "Mutations of the 22- and 27-kd zein promoters affect transactivation by the Opaque2 protein." Plant Cell 4:701-709.

van den Ouweland et a 1., 1992, "Identification and characterization of a new gene in the human Xq28 region." Human Mol. Genet., 1:269-273.

Walden, R. and Schell, J., 1990, "Techniques in plant molecular biology-progress and problems." Eur. J. Biochem. 192:563-576.

Yanisch-Perron, C., Vieira, J. and Messing J., 1985, "Improved M13 cloning vectors and host strains: Nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors." Gene 33:103-119.

EP O 116 718 EP O 270 822 EP O 237 356 EP O 275 069 EP O 067 553 WO/85/01856 WO/90/08828 U.S.-octrooi Nr. 4.407.956 U.S.-octrooi Nr. 4.536.475 U.S.-octrooi Nr. 4.684.611

Claims (24)

1. Geïsoleerd polynucleotidemolecuul dat voor een ontwikkelingseiwit codeert in een plant en dat in staat is te hybridiseren aan een zoogdier-QM-gen.

2. cDNA dat in essentie bestaat uit 800-950 nucleotiden, waartoe een enkelvoudig open afleesraam behoort voor een polypeptide dat homoloog is aan het QM-eiwit bij zoogdieren.

3. cDNA van conclusie 2, waarbij genoemd open afleesraam drie coderende regio's omvat die respectievelijk een hoge mate van homologie vertonen met corresponderende regio's die karakteristiek zijn voor zoogdier-QM-genen.

4. cDNA van conclusie 2, waarbij genoemde polypeptide ten minste 50% homologie vertoont met een zoogdier-QM-gen.

5. cDNA van conclusie 3, waarbij genoemde, geconserveerde regio's nucleotidesequenties omvatten op respectievelijk posities 30 tot 100, 210 tot 250 en 330-400 ten opzichte van het N-terminale uiteinde van genoemd cDNA.

6. cDNA van conclusie 2, waarbij de sequentie van genoemde nucleotiden in overeenstemming is met FIGUUR 1.

7. Geïsoleerd en gezuiverd eiwit dat een geschat molecuulgewicht van ongeveer 25 kD, een aminozuursequentie die een homologie heeft voor de aminozuursequentie van het QM-eiwit bij mensen, een eerste, een tweede en een derde geconserveerde aminozuursequentieregio en een pi van ongeveer 11,0 heeft.

8. Eiwit van conclusie 7, waarbij de eerste geconserveerde regio een sequentie is waartoe de eerste 10 aminozuren van het amino-uiteinde behoren, de tweede geconserveerde regio een aminozuursequentie is waartoe ongeveer groepen 51 tot 60 behoren, waarbij genoemde sequentie een amfifiele helix vormt, en tot de derde regio groepen 98-135 behoren.

9. Eiwit van conclusie 7, dat voorts wordt gedefinieerd als wordende gekenmerkt d.m.v. de aminozuursequentie volgens FIGUUR 2.

10. Recombinant DNA-molecuul dat het cDNA van conclusie 2 en een promotor die in staat is transcriptie van genoemd DNA te reguleren in een plantecel, omvat.

11. Recombinant DNA-molecuul van conclusie 10, waarbij de promotor een weefsel-specifieke promotor is.

12. Recombinant DNA-molecuul van conclusie 11, waarbij de promotor de maïs-QM-promotor is.

13. Recombinant DNA-molecuul van conclusie 10, waarbij de promotor een cel-specifieke promotor is.

14. Recombinant DNA-molecuul van conclusie 11 of 12, waarbij het weefsel of de cel cruciaal is voor de bereiding van pollen.

15. Recombinant DNA-molecuul van conclusie 11, waarbij het weefsel helmknopweefsel is.

16. Recombinant DNA-molecuul van conclusie 12, waarbij genoemde cel-specifieke promotor tot expressie wordt gebracht in een tapetum-cel.

17. Recombinant DNA-molecuul van conclusie 10, waarbij de promotor over-expressie van het cDNA veroorzaakt.

18. Recombinant DNA-molecuul van conclusie 10, waarbij de promotor een induceerbare promotor is.

19. Geïsoleerd DNA-molecuul waarvan het RNA-transcript complementair is aan het transcript van een cDNA volgens conclusie 2.

20. Werkwijze van bereiden van een mannelijk-steriele plant, waarbij genoemde werkwijze transformeren van een plantecel omvat met het recombinante molecuul van conclusie 10.

21. Werkwijze van veranderen van de normale ontwikkeling van een plant, welke transformeren van de plant met het recombinante molecuul van conclusie 10 omvat.

22. Transgene plant waartoe het recombinante molecuul van conclusie 10 behoort.

23. Promotor die wordt geïsoleerd uit maïs, die de expressie van het QM-gen bij planten beheerst.

24. Promotor van conclusie 23, volgens de nucleotidesequentie van FIGUUR 3.