BRPI0011101B1 - Vetor, e, métodos para produzir embriões derivados assexualmente, para modificar a capacidade regenerativa de uma planta, para produzir uma planta apomíctica e para selecionar uma planta modificada - Google Patents

Description

“VETOR, E, MÉTODOS PARA PRODUZIR EMBRIÕES DERIVADOS ASSEXUALMENTE, PARA MODIFICAR A CAPACIDADE REGENERATIVA DE UMA PLANTA, PARA PRODUZIR UMA PLANTA APOMÍCTICA E PARA SELECIONAR UMA PLANTA MODIFICADA!’ FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Uma semente angiosperma típica consiste de três componentes principais, o embrião, o endosperma e o revestimento de semente maternal. O desenvolvimento da semente começa com um evento de dupla fertilização, em que um núcleo de célula de esperma se funde com o núcleo de célula do óvulo para formar o embrião, e um segundo núcleo de célula de esperma se funde com dois núcleos de célula central para formar o endosperma. O próprio desenvolvimento do embrião pode ser separado em três fases de desenvolvimento. A primeira fase do desenvolvimento do embrião é um de divisão de célula e morfogênese, que serve para estabelecer os tipos de tecido principais e sistemas de órgãos da planta madura. A segunda fase engloba um período de rápida expansão da célula e é caracterizado pela síntese de reservas de armazenagem que sustentam o embrião durante a germinação e desenvolvimento da muda prematura. Na fase final do desenvolvimento do embrião, o embrião se torna dessecado e entra em um período de parada do desenvolvimento ou dormência. Todos os eventos acima normalmente ocorrem enquanto a semente permanece fixada à planta maternal.

Muitas espécies de plantas são capazes de produzir embriões na ausência de fertilização. Este processo de desenvolvimento de embrião assexual pode ocorrer naturalmente, por exemplo nas margens da folha de Bryophyllum (Yarborough, 1923), e Malaxis (Taylor, 1967), ou dentro do óvulo de plantas apomícticas (Koltunow, 1995). Apomixia se refere à produção de uma semente a partir dos tecidos do óvulo maternal na ausência de fertilização da célula do óvulo. O desenvolvimento do embrião assexual pode ser induzido in vitro a partir de tecido gametofítico ou somático (Mordhorst et al, 1997) ou, como mostrado recentemente, pode ser induzido por modificação genética de expressão do gene (Ogas et al, 1997; Lotan et al, 1998).

Três mecanismos principais de apomixia, diplosporia, aposporia e embrione adventício foram observados. Cada mecanismo difere com relação à fonte da célula que dá lugar ao embrião e com relação ao tempo durante o desenvolvimento do óvulo em que o processo apomítico é iniciado. A diplosporia e aposporia são consideradas formas gametofíticas de apomixia como eles envolvem a formação de sacos de embrião diplóide. Embrione adventício não envolve a produção de um saco de embrião mitoticamente derivado.

Em diplosporia, a célula mãe megaesporo não sofre meiose normal, mas ao contrário divide mitoticamente para produzir um saco de embrião diplóide em vez de saco de embrião haplóide normal. Uma das células do saco do embrião funcional com a célula de óvulo e divide partenogeneticamente (sem fertilização) para formar um embrião. Em algumas espécies, os núcleos polares não reduzidos do saco do embrião podem fundir para formar o endosperma (produção de endosperma autônoma), o tecido nutritivo da semente, enquanto em outras espécies a polinização é necessária para produção de endosperma (pseudogamia).

Em apomictos aposporosos, embriões partenogênicos são produzidos a partir de células adicionais, os iniciais aposporosos, que diferenciam do nucelo. Como com o megagametofito de espécies diplosporosas, o inicial aposporoso sofre divisões mitóticas para produzir um saco de embrião diplóide. Os embriões aposporosos não são derivados de megagametofito e podem assim co-existir em um óvulo único com embriões sexualmente derivados. A produção autônoma de endosperma é rara em espécies aposporosas. Os apomictos aposporosos assim dependem da fertilização dos núcleos polares em um saco de embrião meioticamente derivado para a produção de endosperma.

Com embrione adventício, embriões são formados diretamente a partir de tecido de óvulo esporofítico, como integumentos ou nucelos, via partenogenese. As sementes derivadas de espécies demonstrando embrione adventício geralmente contém embriões assexualmente derivados múltiplos e também podem conter um único embrião sexualmente derivado. As plantas demonstrando embrião adventício também se baseiam na presença de um saco de embrião meioticamente derivado dentro do mesmo óvulo para formação de endosperma.

Na maior parte das espécies de plantas, o traço apomíctico aparece estar sob o controle de um único local dominante. Este local pode codificar um ou mais reguladores do desenvolvimento, como fatores de transcrição, que em plantas se reproduzindo sexualmente funciona para iniciar as cascatas de expressão de genes levando ao saco de embrião e/ou embriogenese, mas que são heterocronicamente ou ectopicamente expressas em plantas apomícticas (Peacock, 1995, Koltunow, 1993; Koltunow et al, 1995).

Apomixia é um traço valioso para a melhora da cultura porque as sementes apomícticas dão lugar a prole clonal clonais e podem ser assim usadas para fixar geneticamente linhagens híbridas. A produção de semente híbrida é um procedimento oneroso e consumidor de mão de obra como envolve a manutenção de populações de linhagens parentais geneticamente puras, o uso de doador de pólen separado e linhagens estéreis masculinas, e isolamento da linhagem. A produção de sementes através de apomixia evita estes problemas em que, uma vez que um híbrido foi produzido, ele pode ser mantido clonalmente, assim eliminando a necessidade de manter e cruzar linhagens parentais separadas. O uso de semente apomíctica também provê um processo de custo mais efetivo de multiplicação de culturas vegetativamente propagadas, como elimina o uso de cortes ou técnicas de cultura de tecido para propagar linhagens, reduzir a difusão de doenças que são facilmente transmitidas através de tecidos vegetativamente propagados, e em muitas espécies reduz o tamanho do propágulo levando a menores custos de expedição e plantio.

Apesar de apomixia ocorrer em uma ampla faixa de espécies de plantas, algumas espécies de cultura são apomícticas. As tentativas para introduzir traços apomícticos em espécies de cultura por introgressão a partir de parentes selvagens (Ozias-Akins et al, 1993; WO 97/ 10704, WO 97/ 11167) ou através de cruzamentos entre espécies sexuais parentes, mas divergentes de modo de desenvolvimento, (WO 98/ 33374), não deram produtos comercializáveis. Outras abordagens tem focalizado na identificação de sequências de genes que podem ser usados para identificar ou manipular processos apomícticos (WO 97/ 43427, WO 98/ 36090), no entanto, estas abordagens não levaram a métodos para a produção de rotina de plantas apomícticas.

As abordagens de mutagenese também foram tentadas para converter plantas se reproduzindo sexualmente como Arabidopsis thaliana (arabidopse), em plantas apomícticas (Peacock et al, 1995). Por exemplo, vários mutantes de "semente independente da fertilização" recessivos (fis) foram identificados que iniciam embrião parcial e/ou endosperma em uma baixa frequência na ausência de fertilização (Chaudhury et al, 1997). No entanto, vários parâmetros adicionais precisam ser modificados a fim de obter semente apomíctica diplóide verdadeira usando mutantes fis.

Os embriões assexualmente derivados podem ser induzidos para formar em cultura de muitos tecidos de planta somáticos e gametofitícos (Yeung, 1995). Os embriões somáticos podem ser obtidos de cultura de tecidos somáticos por tratamento dos mesmos com reguladores do crescimento de plantas, como auxinas, ou auxinas em combinação com citocininas. Os embriões também podem ser induzidos para formar em cultura dos tecidos gametofitícos do óvulo (ginogenese) e o antero (androgenese, pólen ou embriogenese de microesporos) ou pela adição de reguladores do crescimento de plantas ou por simples tratamento do estresse. Vários mutantes foram identificados que podem ser usados para induzir produção eficiente de embriões in vitro. Estes incluem mutantes de arabidopse recessivos com alterados meristemas do broto, por exemplo primordia íiming (pt), clavata (clv) 1 e clvS, que foram mostrados como melhorando a formação de calo embriogênico quando as mudas foram germinadas na presença de auxina (Mordhorst et al, 1998). A expressão alterada de dois genes de arabidopse, LEAFY COTYLEDON (LECI, wo 98/ 37187, Lotan et al, 1998) e pickle, foram mostrados como promovendo a produção de embriões somáticos na ausência de reguladores do crescimento adicionados. O gene LECI codifica um homólogo da subunidade HAP3 de um fator de transcrição de ligação de box CCAAT (CBF). O gene LECI controla muitos aspectos de desenvolvimento de embrião zigótico incluindo tolerância a dessecação e identidade de cotiledôneas. A super- expressão ectópica de gene LECI em um fundo de mutante lecl resulta na produção de 2 linhagens transgênicas que formam ocasionalmente estruturas semelhantes a embrião em folhas. Estas estruturas semelhantes a embrião expressam genes, como os codificando proteínas de armazenagem de semente e proteínas de corpo oleoso, que são normalmente preferivelmente expressas nos embriões em desenvolvimento. As plantas contendo um gene PICKLE mutante recessivo produzem um meristema de raiz primária, espessado. As raízes pickle mutantes produzem calo formador de embrião quando o tecido da raiz é separado do resto da planta e colocado em meio mínimo sem reguladores do crescimento (Ogas et al, 1997). As raízes pickle mutantes mostram características morfológicas de sementes em desenvolvimento, como corpos oleosos e com super-expressores de LEC1 acumulam genes preferivelmente expressos em sementes em desenvolvimento. A produção eficiente de semente apomíctica é somente provavelmente realizada através da identificação e subsequente modificação de reguladores de desenvolvimento, como fatores de transcrição, que são conhecidos como ativando as cascatas de expressão de genes levando a embriogenese em tanto plantas apomícticas como de reprodução sexual. A presente invenção se dirige a esta necessidade ao prover métodos para a produção de sementes apomícticas compreendendo super-expressão ectópica de um domínio AP2 expresso no embrião contendo fator de transcrição, BNM3 ou seus homólogos. É um objeto da invenção superar as desvantagens da arte anterior. O objeto acima é encontrado pelas combinações de aspectos das reivindicações principais, as sub-reivindicações descrevem ainda formas de realização vantajosas da invenção.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a formação de embriões assexual e regeneração em plantas. Mais especificamente, refere-se a processos para produzir embriões assexualmente derivados, e para melhorar a capacidade de regeneração em plantas.

De acordo com presente invenção, provê-se uma molécula de DNA isolada, compreendendo uma sequência de nucleotídeos que • hibridiza para SEQ ID NO: 5 ou 6, não incluindo a região Repetição 1 AP2 - ligador - repetição 2 AP2 sob condições moderadas ou estringentes, • hibridiza par SEQ ID NO: 1 ou 3, não incluindo a região Repetição 1 AP2 - ligador - repetição 2 AP2 sob condições estringentes, • compreende pelo menos 27 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1,3,5 ou 6, ou que • demonstra pelo menos 70% de similaridade com a sequência de nucleotídeos definida por SEQ ID NO: 1,3,5 ou 6.

Esta invenção ainda se refere a uma molécula de DNA isolada que hibridiza para SEQ ID NO: 1,3,5 ou 6, não incluindo a região Repetição 1 AP2 - ligador - repetição 2 AP2 sob condições moderadas ou estringentes, e compreende uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína, em que a proteína quando presente em um nível suficiente dentro de uma célula de planta toma a célula embriogênica, aumenta a capacidade regenerativa da célula de planta ou tanto toma a célula embriogênica, como aumenta a capacidade regenerativa da célula de planta. Está incluída na presente invenção a molécula de DNA isolada como acima definido compreendendo uma sequência de nucleotídeos que hibridiza para nucleotídeos 1-2014 de SEQ ID NO: 1, 1-2011 de SEQ ID NO: 3, 1620- 4873 de SEQ ID NO: 5 ou nucleotídeos 2026-5035 de SEQ ID NO: 6, não incluindo a região Repetição 1 AP2 - ligador - repetição 2 AP2 sob condições moderadas ou estringentes. Também está incluído na presente invenção um vetor compreendendo a molécula de DNA isolada como definido acima, em que a molécula de DNA isolada está sob o controle do elemento regulatório que dirige a expressão de referido DNA em uma célula de planta. O elemento regulatório pode ser constitutivo, indutível, específico para tecido ou um elemento regulatório, ativo no desenvolvimento.

Esta invenção também engloba uma célula de planta transformada, uma planta transformada ou semente obtida da planta transformada, cada compreendendo o vetor como definido acima.

Esta invenção refere-se a uma proteína isolada codificada por uma molécula de DNA isolada que hibridiza para a sequência de nucleotídeos definida em SEQID NO: 1,3,5 ou 6, não incluindo a região Repetição 1 AP2 - ligador - repetição 2 AP2 sob condições moderadas ou estringentes, em que a proteína, quando presente em um nível suficiente dentro de uma célula de planta toma a célula embriogênica, ou aumenta a capacidade regenerativa da célula de planta. Também está incluída uma proteína codificada por uma molécula de DNA isolada que hibridiza par nucleotídeos 1620- 4873 de SEQ ID NO: 5, ou nucleotídeos 2026- 5035 de SEQ Π) NO: 6, não incluindo a região Repetição 1 AP2 - ligador - repetição 2 AP2 sob condições moderadas ou estringentes, ou à sequência de nucleotídeos como definida na SEQ JD NO: 1 ou 3, sob condições moderadas ou estringentes. Esta invenção também engloba uma molécula de DNA isolada que codifica uma proteína como definida em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 7. A invenção também pertence a uma proteína compreendendo pelo menos 70% de homologia com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ Π) NO: 4 ou SEQ ID NO: 7, ou compreende de cerca de 30 a cerca de 541 aminoácidos da sequência descrita em SEQ ID NO: 2, ou compreende de cerca de 30 a cerca de 561 aminoácidos da sequência descrita em SEQ ID NO: 4. A presente invenção é também dirigida a um método para produzir embriões assexualmente derivados, compreendendo: i) transformar uma célula de planta com um vetor compreendendo uma molécula de DNA isolada que hibridiza para SEQ ID NO: 1,3,5 ou 6, não incluindo a região Repetição 1 AP2 - ligador - repetição 2 AP2 sob condições moderadas ou estringentes, e que codifica uma proteína que quando presente em um nível suficiente entro da célula de planta toma a célula de planta embriogênica, ou aumenta a capacidade regenerativa da célula de planta, ou que compreende uma sequência de nucleotídeos que hibridiza para nucleotídeos 1620- 4873 de SEQ ID NO: 5, ou nucleotídeos 2026- 5035 de se 6, não incluindo a região Repetição 1 AP2 - ligador - repetição 2 AP2 sob condições moderadas ou estringentes, ou a sequência de nucleotídeos como definida na SEQ ID NO: 1 ou 3, sob condições moderadas ou estringentes; iii) selecionar o tecido transformado para ocorrência da molécula de DNA isolada, e iv) testar o tecido transformado para formação de embrião assexual. A invenção também se refere ao método acima onde a etapa de testar (etapa iv)) envolve testar alguns embriões somáticos, embriões gametofiticamente derivados, embrione adventício, displosporia, ou para partenogenese haplóide do saco do embrião. A presente invenção também engloba um método para produzir uma planta apomíctica, compreendendo: i) transformar uma policondensação com um vetor compreendendo uma molécula de DNA isolada que hibridiza para nucleotídeos 1-2014 de SEQ ID NO: 1, nucleotídeos 1-2011 de SEQ JD NO: 3, nucleotídeos 1620- 4873 de SEQ ID NO: 5, ou nucleotídeos 2026-5035 de SEQ ID NO: 6, não incluindo a região Repetição 1 AP2 -ligador - repetição 2 AP2 sob condições moderadas ou estringentes, e que codifica uma proteína que quando presente em um nível suficiente dentro da referida célula de planta toma a célula de planta embriogênica, ou aumenta a capacidade regenerativa da célula de planta; ii) selecionar a planta transformada para ocorrência da molécula de DNA isolada, e iii) testar a planta transformada para formação do embrião assexual.

Esta invenção também se refere ao método acima onde a etapa de testar (etapa iii) envolve testar embriões assexualmente derivados, embriões gametofiticamente derivados, embrione adventício, displosporia, ou para partenogenese haplóide do saco do embrião. A presente invenção também é dirigida a um método para produzir embriões assexualmente derivados compreendendo: i) transformar transientemente uma célula de planta com um vetor compreendendo uma molécula de DNA isolada que hibridiza para nucleotídeos 1-2014 de SEQID NO: 1, nucleotídeos 1-2011 de SEQ ID NO: 3, nucleotídeos 1620- 4873 de SEQ ID NO: 5, ou nucleotídeos 2026- 5035 de SEQ ID NO: 6, não incluindo a região Repetição 1 AP2 - ligador - repetição 2 AP2 sob condições moderadas ou estringentes e que codifica uma proteína que quando presente em um nível suficiente dentro da referida célula de planta toma a célula de planta embriogênica, ou aumenta a capacidade regenerativa da célula de planta; ii) cultivar a célula de planta transformada transientemente para produzir tecido transformado transientemente; iii) testar o tecido transformado transientemente para formação de embriões assexual. Esta invenção é dirigida para o método acima onde a etapa de testar (etapa iii) envolve testar embriões assexualmente derivados, embriões somáticos, embriões gametofiticamente derivados, embrione adventício, displosporia, ou para partenogenese haplóide do saco do embrião. A presente invenção também apresenta um método para modificar a capacidade regenerativa de uma planta compreendendo i) transformar uma célula de planta com um vetor compreendendo uma molécula de DNA isolada que hibridiza para SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, sob condições moderadas ou estringentes, e que codifica uma proteína que quando presente em um nível suficiente dentro da célula de planta toma a célula de planta embriogênica, ou aumenta a capacidade regenerativa da referida célula de planta, ou que compreende uma sequência de nucleotídeos que hibridiza para nucleotídeos 1620- 4873 de SEQ Π) NO: 5, ou nucleotídeos 2026-5035 de SEQ ID NO: 6, não incluindo a região Repetição 1 AP2 -ligador - repetição 2 AP2 sob condições moderadas ou estringentes, ou para a sequência de nucleotídeos como definido nos nucleotídeos 1-2014 de SEQ ID NO: 1 ou nucleotídeos 1-2011 de SEQ ID NO: 3, sob condições estringentes; ii) cultivar a célula de planta transformada para produzir tecido transformado, e iii) testar o tecido transformado para melhorada regeneração como comparado com tecido tipo selvagem. A invenção também engloba o método acima em que a etapa iii) envolve testar na ausência de regulador do crescimento. A presente invenção também se refere a um método de modificação da capacidade regenerativa de uma planta compreendendo: i) transformar transientemente uma célula de planta com um vetor compreendendo uma molécula de DNA isolada que hibridiza para SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, sob condições moderadas ou estringentes, e que codifica uma proteína que quando presente em um nível suficiente dentro da célula de planta toma a célula de planta embriogênica, ou aumenta a capacidade regenerativa da célula de planta, ou que compreende uma sequência de nucleotídeos que hibridiza para nucleotídeos 1620- 4873 de SEQ ID NO: 5, ou nucleotídeos 2026- 5035 de SEQ ID NO: 6, não incluindo a região Repetição 1 AP2 - ligador - repetição 2 AP2 sob condições moderadas ou estringentes, ou para a sequência de nucleotídeos como definida na SEQ ID NO: 1 ou 3, sob condições estringentes; ii) cultivar a célula de planta transformada transientemente para produzir tecido transformado transientemente, iii) testar o tecido transformado para melhorara regeneração como comparado com tecido tipo selvagem.

Esta invenção também engloba o método acima em que a etapa iii) inclui testar na ausência de um regulador de crescimento. A presente invenção também se refere a um método para selecionar uma planta transformada compreendendo: i) transformar uma planta normalmente não regenerativa com um vetor compreendendo uma molécula de DNA isolada que hibridiza para SEQID NO: 5 ou SEQ Π) NO: 6, sob condições estringentes moderadas, e que codifica uma proteína que quando presente em um nível suficiente dentro da célula de planta toma a célula de planta embriogênica, ou aumenta a capacidade regenerativa da referida célula de planta, ou que compreende uma sequência de nucleotídeos que hibridiza para nucleotídeos 1620- 4873 de SEQ ID NO: 5, ou nucleotídeos 2026- 5035 de SEQ ID NO: 6, não incluindo a região Repetição 1 AP2 - ligador - repetição 2 AP2 sob condições moderadas ou sob condições estringentes, para a sequência de nucleotídeos como definida na SEQ ID NO: 1 ou 3, sob condições estringentes e ii) determinar se a planta transformada é capaz de regenerar sob condições em que a planta normalmente não regenerativa não regenera. A presente invenção é também dirigida a uma molécula de DNA isolada compreendendo uma sequência de DNA que demonstra pelo menos cerca de 70% de similaridade com nucleotídeos 1-1619 de SEQ ID NO: 5, ou nucleotídeos 1-2025 de SEQ ID NO: 6, ou que compreende pelo menos 22 nucleotídeos contíguos dentro de nucleotídeos 1-1619 de SEQ ID NO: 5, ou 1-2025 de SEQ ID NO: 6. Também está incluído no escopo da presente invenção um vetor compreendendo a molécula de DNA isolada como acima definido, associado de modo operativo a um gene de interesse, em que a molécula de DNA isolada dirige a expressão do gene de interesse dentro de uma célula de planta. O gene de interesse pode ser heterólogo com relação à molécula de DNA isolada. O gene de interesse pode ser selecionado dentre o grupo consistindo de proteína farmaceuticamente ativa, anticorpo, enzima industrial, suplemento de proteína, nutracêutico, proteína de armazenagem, ração animal e suplemento para ração animal. Esta invenção também inclui uma célula de planta transformada, uma planta transformada, ou semente obtida da planta transformada, compreendendo o vetor acima definido.

Além disso, a presente invenção inclui um método para dirigir a expressão de um gene de interesse dentro de um embrião em desenvolvimento de uma planta compreendendo transformar referida planta com um vetor contendo uma molécula de DNA isolada que demonstra pelo menos cerca de 70% de similaridade com nucleotídeos 1-1619 de SEQ ID NO: 5, ou nucleotídeos 1-2025 de SEQ ID NO: 6, ou que compreende pelo menos 22 nucleotídeos contíguos com nucleotídeos 1-1619 de SEQ ID NO: 5 ou nucleotídeos 1- 2025 de SEQ ID NO: 6.

Esta invenção também pertence a um método para produzir uma proteína de interesse compreendendo i) transformar uma planta com pelo menos um vetor, compreendendo uma molécula de DNA isolada que hibridiza para SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, sob condições moderadas ou estringentes, e que codifica uma proteína que quando presente em um nível suficiente dentro da célula de planta toma a célula de planta embriogênica, ou aumenta a capacidade regenerativa de referida célula de planta, ou que compreende uma sequência de nucleotídeos que hibridiza para nucleotídeos 1620- 4873 de SEQ ID NO: 5, ou nucleotídeos 2026-5035 de SEQ ID NO: 6, não incluindo a região Repetição 1 AP2 - ligador - repetição 2 AP2 sob condições moderadas ou estringentes ou à sequência de nucleotídeos como definida na SEQID NO: 1 ou 3 sob condições estringentes para produzir uma planta transformada, ii) selecionar a planta transformada para ocorrência de molécula de DNA isolada e iv) cultivar a planta transformada a fim de produzir a proteína de interesse, em que a expressão da proteína de interesse é induzida pelo produto de expressão de referido DNA isolado.

Este método também compreende transformar a planta com um segundo vetor compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificando a proteína de interesse sob o controle de um elemento regulatório, em que o elemento regulatório induzido pelo produto de expressão de DNA isolado. Além disso, este método também pode ser usado para produzir uma proteína de interesse em que a proteína de interesse é uma proteína nativa.

Este sumário da invenção não descreve necessariamente todos os aspectos necessários da invenção mas que a invenção também pode residir em uma sub-combinação dos aspectos descritos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Estes e outros aspectos da invenção serão evidentes a partir da seguinte descrição em que referência é feita aos desenhos anexos, em que A figura 1 mostra uma representação esquemática do efeito de temperatura na cultura sobre o declínio do desenvolvimento de microesporos isolados e pólen de Brassica napus. Os microesporos uninucleados tardios e pólen binucleado prematurado cultivados a 25 °C ou menos continuam a se dividir e formar grãos de pólen funcionais (gametofíticos), enquanto os mesmos microesporos e pólen cultivado a 32 °C sofrem de numerosas divisões esporofíticas, levando à formação de embriões haplóides (embriogênicos). Os microesporos uninucleados tardios e pólen binucleado prematuro cultivados durante um dia a 25 °C, seguido por cultivo a 32 °C podem sofrer divisões gametofíticas, mas não formam nem embisões nem grãos de pólen maduros (não embriogênicos).

Figura 2 mostra o alinhamento de sequências de DNA mostradas em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3,. Os códons de terminação de transdução e iniciação de tradução ATG e TAG são mostrados em negrito. Nucleotídeos idênticos são identificados por (*) e intervalos gap são indicados Por (-)■ Figura 3 mostra o alinhamento de sequências de proteína previstas codificadas por DNA de SEQ ID NO: 1 e SEQ Π) NO: 3. A sequência de aminoácidos da primeira repetição de domínio AP2 (repetição 1) e a segundo repetição de domínio AP2 (repetição 2) são mostrados em negrito. Aminoácidos idênticos são indicados por um asterístico (*) e desajustes por um ponto (.) abaixo do alinhamento da sequência.

Figura 4 mostra a presença de dois genes BNM3 no genoma de Brassica napus. Um blot de gel DNA contendo digestos de restrição de DNA genômico de Brassica napus c.v. Topas foi hibridizado em um fragmento de cDNA BNM3A sob condições de alta estringência. O cDNA de BNM3A hibridiza para dois fragmentos de DNA sob estas condições. Estes fragmentos correspondem aos genes BNM3A e BNM3B. A posição de marcadores de tamanho molecular (fragmentos de restrição Lambda DNA Hindllí) é indicado à esquerda na figura. As enzimas de restrição usadas para digerir o DNA são indicadas acima do blot. A figura 5 mostra o alinhamento da sequência de proteína prevista codificada pelo DNA de SEQ ID NO: 1 (BNM3A) com as sequências de proteína previstas de outras proteínas de domínio AP2. A sequência de aminoácidos de BNM3A, começando na posição 208, e se abrindo na primeira repetição de domínio AP2 (repetição de domínio 1 AP2), a segunda repetição de domínio AP2 (repetição de domínio 2 AP2) e a região de ligador estando entre as duas repetições (ligador) foi alinhada com a sequência de aminoácidos de outras proteínas contendo dois domínios AP2. A similaridade de aminoácido nesta região está na faixa de 53% para APETALA2 a 80% para ZMMHCF1. Os aminoácidos idênticos são indicados por (*) e intervalos são indicados por (-). Os nomes das proteínas são indicados à esquerda e são abreviados como a seguir: ANT, AINTEGUMENTA (número de acesso U41339); ZM, ZMMHCF1 (número de aceso Z47554); GL15, GLOSSY15 (número de acesso U41466); AP2, APETALA2 (número de acesso U12546). A figura 6 mostra os resultados de análise de blot de gel com um fragmento de cDNA BNM3A realizado em RNA extraído de tecidos indicados. Os blots de gel de RNA contém ou 5 pg (a) ou 20 pg (b,c) de RNA total. A figura 6A mostra o padrão de expressão de BNM3 em culturas de embrião de microesporos. RNA foi isolado de microesporos uninucleados tardios e pólen binucleado prematuro no momento de coleta (pólen Od), após quatro dias em cultura a 32 °C (+ embrião), após quatro dias em cultura a 25 0 C (pólen 4d), após um dia de cultura a 25 °C, seguido por três dias de cultura a 32 °C (- embrião), e embriões derivados de microesporos no estágio de desenvolvimento globular, coração, torpedo, cotiledônea de 21 dias de idade (21 d cot.), cotiledônea de 18 dias de idade (28 d cot) e cotiledônea de 42 dias de idade. A expressão de BNM3 é detectada em microesporos embriogênicos e embriões derivados de microesporos em desenvolvimento, mas está ausente de microesporos em desenvolvimento e pólen coletado antes da cultura de tecido e em amostras não embriogênicas. O tempo de exposição foi de 7 dias. A figura 6B mostra que a expressão de gene BNM3 é detectada em sementes em desenvolvimento. As sementes foram coletadas em vários dias após polinização (DAP). Estes pontos no desenvolvimento correspondem aproximadamente aos estágios de desenvolvimento globular (7 dias), coração, (14 dias), torpedo (18 dias), cotiledônea de 21 dias de idade (21 d cot.), cotiledônea média (28 dias, 35 dias) cotiledônea tardia (42 dias). O tempo de exposição foi de 14 dias. A figura 6C mostra que a expressão de gene BNM3 não é detectada em tecidos não semente. As raízes e folhas foram coletadas de plantas cultivadas em estufa com 14 dias de idade. As flores completas assim como anteros e pistilos excisados foram coletadas de botões de flores abertas logo antes da antese. Os botões pequenos e grandes se referem a botões de flor fechados com menos de 5 mm ou mais de 5 mm de comprimento, respectivamente. Silícos foram coletados 16 dias após polinização. O tempo de exposição foi de 14 dias.

Figura 7 mostra o fenótipo de Brassica napus e plantas arabidopse transformadas com construções contendo o gene BNM3 sob controle de um promotor de POLYBIQUITIN modificado (B) e promotor 35S melhorado duplo contendo um melhorador translacional AMV (A, C-E). A figura 7A mostra estruturas de embrião na borda da folha de uma muda de Brassica Tl. A figura 7B mostra estruturas de embriões no petíolo de uma muda de arabidopse T2. A figura 7C mostra estruturas de embrião no cotiledôneo de uma muda de arabidopse Tl. A figura 7D mostra uma micrografia eletrônica de varredura do lado abaxial de uma cotiledônea de arabidopse Tl. Nota-se a natureza bipolar dos embriões, assim como a emergência de um embrião secundário da superfície de um embrião primário (asterístico). A figura 7E mostra uma seção semi-fina através de uma das cotiledôneas da muda Tl mostrada na figura 7C). Nota-se presença de todos os órgãos principais e elementos de tecido do embrião, assim como o desenvolvimento de novos embriões nos flancos dos meristemas apicais de broto e as cotiledôneas.

Figura 8 mostra a aumentada capacidade regenerativa de plantas de arabidopse transformadas com uma construção contendo o gene BNM3B sob o controle de promotor POLYBIQUITIN modificado. A figura 8A mostra explantes de hipocotilas e folha transgênicas e tipo selvagem em meio contendo reguladores de crescimento. A figura 8B mostra raízes transgênicas e de tipo selvagem em meio contendo reguladores do crescimento. A figura 8C mostra explantes hipocotiledôneos e de folha transgênica e tipo selvagem em meio sem reguladores de crescimento. A figura 8D mostra explantes de raiz transgênica e tipo selvagem em meio sem reguladores do crescimento.

Figura 9 mostra caracterização de gene AtBBM, o ortólogo de arabidopse de BNM3. A figura 9A mostra a posição de sequência de AtBBM e sítios de endonuclease de restrição selecionados em aproximadamente 8 kb de DNA genômico C24 ecotipo de Arabidopsis thaliana em sobreposição. A região de codificação de proteína prevista do homólogo BNM3 de arabidopse único se espalha nas posições 3426 a 6435 de sequência genômica. Os exons da região de codificação prevista são mostrados como boxes pretos acima do mapa de restrição. Uma seta vertical na posição 7479 indica o início da sequência IXR3 (.Irregular xylem3). A barra em escala horizontal é em kilobases. A figura 9B mostra que os clones genômicos de AtBBM de arabidopse e o homólogo de arabidopse identificados através da análise de blot de gel de DNA usando uma sonda de cDNA BNM3 de Brassica napus são iguais. O DNA genômico de ecotipos de arabidopse Landsberg erecta (L) e Columbia (C) foi digerido com enzima de restrição mostrada em (A) e hibridizado em sonda de cDNA BNM3A de comprimento completo (SEQ ID NO: 1). A comparação do mapa de restrição mostrado em (A) com o padrão de fragmentos de restrição de hibridização indica que a sonda de cDNA de Brassica de comprimento completo detecta um único homólogo de Arabidopsis sob condições de lavagem de estringência moderada (0,2X SSc, 0,1% SDS, a 25 °C). O marcador de tamanho molecular (em kilobases) é indicado à direita do blot.

DESCRIÇÃO DA FORMA DE REALIZAÇÃO PREFERIDA A presente invenção refere-se à formação de embrião assexual e regeneração de plantas. Mais especificamente, refere-se a processos para a produção de embriões assexualmente derivados e para melhorar a capacidade de regeneração em plantas. A presente invenção também se refere a sistemas de produção de proteína heteróloga em plantas, e ao uso dos mesmos. A seguinte descrição é uma forma de realização preferida a título de Exemplo apenas e sem limitação à combinação de aspectos necessários para realizar a invenção.

Os genes preferivelmente expressos durante a indução de embriogenese de microesporos de Brassica napus c.v. Topas foram isolados via triagem subtrativa. Sete clones de cDNA independentes, compreendendo seis sequências de DNA singulares, foram verificados como diferencialmente expressados entre bibliotecas de cDNA preparada a partir de culturas de microesporos embriogênicas e não embriogênicas. Vários destes clones BNM (para Brassica napus microspore embryo), BNM3A SEQ Π) NO: 1, e BNM3B (SEQ ID NO: 3) foram caracterizados como descrito. BNM3A e BNM3B codificam a sequência de aminoácidos descrita em SEQ K) NO: 2 e SEQ ID NO: 4, respectivamente. A sequência genômica de BNM3A (SEQ ID NO: 5) incluindo a região reguladora (nucleotídeos 1-1619 de SEQ ID NO: 5) foi também obtida. O ortólogo de arabidopse de gene BNM3, chamado AtBBM, foi também identificado. A sequência genômica de AtBBMé mostrada em SEQ ID NO: 6, enquanto a sequência de aminoácido prevista é mostrada em SEQ ID NO: 7. "Regeneração" como usada aqui se refere a uma resposta morfogenética que resulta na produção de novos tecidos, órgãos, embriões, plantas completas ou fragmentos de plantas completas que são derivadas de célula única ou um grupo de células. A regeneração pode prosseguir indiretamente via uma fase de calo ou diretamente, sem uma fase de calo interveniente. "Capacidade regenerativa" se refere à capacidade de uma célula de planta de sofrer regeneração.

Por "célula embriogênica" significa uma célula que completou a transição de uma célula somática ou gametofítica em um estado onde não são necessários outros estímulos aplicados para produzir um embrião.

Por "elemento regulatório", significa-se os que incluem elementos regulatórios constitutivos, indutíveis, específicos para tecido, regulados de modo de desenvolvimento. Um elemento regulatório que é regulado no desenvolvimento, ou controla a expressão diferencial de um gene sob seu controle, é ativado em alguns órgãos ou tecidos de um órgão em tempos específicos durante o desenvolvimento deste órgão ou tecido. No entanto, alguns elementos regulatórios que são regulados no desenvolvimento podem preferivelmente ser ativos em alguns órgãos ou tecidos em estágios de desenvolvimento específicos, eles também podem ser ativos em um modo regulado de modo de desenvolvimento, ou em um nível basal em outros órgãos ou tecidos dentro de uma planta também, como os elementos regulatórios são considerados "específicos para tecido". Os elementos regulatórios podem ser encontrados ou a montante, dentro, a jusante, ou uma combinação dos mesmos, da região de codificação de um gene.

Um elemento regulatório indutível é um que é capaz de ativar direta ou indiretamente a transcrição de uma ou mais sequências de DNA ou genes em resposta a um indutor. Na ausência de um indutor, as sequências de DNA ou genes não serão transcritos. Tipicamente, o fator proteína, que liga especificamente para um elemento regulatório indutível para ativar transcrição, está presente em uma forma inativa que é então convertida de modo direto ou indireto à forma ativa pelo indutor. O indutor pode ser um agente químico como uma proteína, metabólito, regulador do crescimento, herbicida ou composto fenólico ou um estresse fisiológico imposto diretamente por calor, frio, sal ou elementos tóxicos ou indiretamente através da ação de um patógeno ou agente de doença, como um vírus. Uma célula de planta contendo um elemento regulatório indutível pode ser exposto a um indutor por aplicação externa do indutor à célula ou planta, como por pulverização, aguada, aquecimento ou processos similares.

Um elemento regulatório constitutivo dirige a expressão de um gene através de várias partes de uma planta e continuamente através do desenvolvimento da planta. Exemplos de elementos regulatórios constitutivos conhecidos incluem promotores associados com o transcrito de CaMV 35S. (Odell et al., 1985, Nature, 313: 810 - 812), a actina de arroz 1, (Zhang et al, 1991, Plant Cell, 3: 1155 - 1165) e genes triosefosfato isomerase 1 (Xu et al, 1994, Plant Physiol 106:459 - 467) o gene ubiquitina 1 de milho (Comejo et al, 1993, Plant Mol Biol 29: 637 - 646), os genes 1 e 6 ubiquitina de Arabidopsis, (Holtorf et al, 1995, Plant Mol. Biol. 29: 637 -646), e o gene 4A de fator de iniciação translacional de tabaco (Mandei et al, 1995 Plant Mol. Biol. 29:995 - 1004).

Por "gene de interesse", significa-se qualquer gene que deve ser expresso em uma planta transformada . Este gene de interesse pode incluir, mas não é limitado a um gene que codifica uma proteína farmaceuticamente ativa, por exemplo fatores de crescimento, reguladores de crescimento, anticorpos, antígenos, seus derivados utilizáveis para imunização ou vacinação e outros. Estes proteínas incluem, mas não são limitadas a interleucinas, insulina, G-CSF, GM-CSF, hPG-CSF, M-CSF ou combinações das mesmas, interferons, por exemplo interferon-a, interferon-β, interferon τ, fatores de coagulação do sangue, por exemplo Fator VIII, fator IX ou tPA ou combinações dos mesmos. Um gene de interesse também pode codificar uma enzima industrial, suplemento de proteína, nutracêutico, ou um produto aumentado em seu valor para ração, alimentos ou para uso em rações como alimentos. Exemplos destas proteínas incluem, mas não são limitadas a proteases, oxidases, fitases quitinases, invertases, lipases, celulases, xilanases, enzimas envolvidas em biossíntese de óleo, etc. Outros suplementos de proteínas, nutracêuticos, ou produtos aumentados em valor incluem proteínas de armazenagem de sementes nativas ou modificadas e outras. A presente invenção é ainda dirigida a uma construção de gene quimérico contendo um DNA de interesse, ligado de modo operativo a um elemento regulatório da presente invenção. Qualquer gene exógeno, ou gene de interesse, pode ser usado e manipulado de acordo com a presente invenção para resultar na expressão de um gene exógeno. A ativação da expressão de um gene de interesse também pode estar sob o controle de um elemento regulatório que é ele mesmo ativado por uma proteína BNM3. Por exemplo, que não deve ser considerado limitativo, um gene de interesse pode ser fundido para o promotor napin, e o promotor napin pode ser induzido por BNM3. Além disso, um gene de interesse pode ser expresso dentro de tecidos somáticos sob o controle de um ou mais elementos regulatórios induzidos por BNM3, de modo que, como será descrito em detalhes abaixo, o tecido somático desenvolve em ma estrutura semelhante a semente compreendendo células embriogênicas, e estas estruturas semelhantes a semente produzem os produtos do gene de interesse. A construção de gene quimérico da presente invenção pode ainda compreende uma região não traduzida 3'. A região não traduzida 3'se refere à por de um gene compreendendo um segmento de DNA que contém um sinal de poliadenilação e quaisquer outros sinais regulatórios capazes de efetuar o processamento de mRNA ou expressão do gene. O sinal de poliadenilação é geralmente caracterizado para efetuar a adição de trilhas de ácido poliadenílico para a extremidade 3' do precursor de mRNA. Os sinais de poliadenilação são comumente reconhecidos pela presença de homologia para a forma canônica de 5ΆΑΤΑΑΑ-31 apesar de variações não serem incomuns. Exemplos de regiões 3' apropriadas são as regiões não traduzidas transcritas 3' contendo um sinal de poliadenilação de genes de plasmídeo (Ti) indutor de tumor de Agrobacterium, como os genes de planta e nopalina sintase (genes Nos), como os genes de proteína de armazenagem de soja e a subunidade pequena de gene ribulose-1,5- bisfosfato carboxilase (ssRUBISCO). A região não traduzida 3' de gene estrutural da presente construção pode assim ser usada para construir genes quiméricos para expressão em plantas. A construção de gene quimérico da presente invenção também pode incluir outros melhoradores, melhoradores de transcrição ou tradução, como pode ser requerido. Estas regiões de melhorador são bem conhecidas dos versados na arte e podem incluir o códon de iniciação de ATG e sequências adjacentes. O códon de iniciação pode estar em fase com o quadro de leitura da sequência de codificação para assegurar tradução da sequência completa. Os sinais de controle de tradução e códons de iniciação podem ser de várias origens, tanto naturais como sintéticas. As regiões de iniciação de tradução podem ser providas a partir da fonte da região de iniciação de transcrição, ou do gene estrutural. A sequência também pode ser derivada do elemento regulatório selecionado para expressar o gene e pode ser especificamente modificada de modo a aumentar a tradução de mRNA.

Para auxiliar na identificação das células de planta transformadas, as construções desta invenção podem ser ainda manipuladas para incluir marcadores selecionáveis de plantas. Os marcadores selecionáveis utilizáveis incluem enzimas que provêem para resistência a um antibiótico como gentamicina, higromicina, canamicina e outros. Similarmente, enzimas provendo para a produção de um composto identificável por mudança de cor como GUS (β- glucuronidase), fluorescência, ou luminescência, como luciferase, são utilizáveis.

Também são consideradas partes desta invenção as plantas transgênicas contendo um gene ou construção de gene quimérico da presente invenção compreendendo um gene BNMS, um elemento regulatório obtido a partir de BNMS, ou a região de codificação de BNMS em associação operativa com um elemento regulatório indutível, ou de desenvolvimento, constitutivo, ou uma combinação dos mesmos. Os métodos para regenerar plantas totais de células de plantas são bem conhecidos dos versados na arte. Geralmente, as células de plantas transformadas são cultivadas em um meio apropriado, que pode conter agentes seletivos como antibióticos, onde os marcadores selecionáveis são usados para facilitar a identificação de células de planta transformadas. Uma vez que o calo se forma, a formação de broto pode ser encorajado por emprego de hormônios de planta apropriados de acordo com métodos conhecidos e os brotos transferidos para meio de formação de raiz para regeneração de plantas. As plantas podem então ser usadas para estabelecer gerações repetitivas, ou de sementes ou usando técnicas de propagação vegetativas. As construções da presente invenção podem ser introduzidas em células de plantas usando plasmídeos Ti, plasmídeos Ri, vetores de vírus de planta, transformação de DNA direta, micro- injeção, eletroporação, biolística, etc. Para revisões destas técnicas ver por exemplo Weissbach e Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, New York VIII, pp. 421 - 463 (1988); Geierson e Corey, Plant Molecular Biology, 2a. Ed. (1988); e Miki e Iyer, Fundamentais of Gene Transfer in Plants. In Plant Metabolism, 2a. Ed. DT. Dennis, DH Turpin, DD Lefebrve, DB Layzell (eds), Addison Wesly, Langmans Ltd. London, pp. 561 - 579 (1997). A presente invenção ainda inclui um vetor apropriado compreendendo o gene ou a construção de gene quimérico.

Uma classe de genes foi isolada de culturas de embrião de microesporos de Brassica napus. Verificou-se que estes genes são importantes reguladores de embriogenese por sua capacidade para induzir a fomação de embriões assexualmente derivados quando ectopicamente expressos em tecidos vegetativos de plantas. Estes genes são a seguir indicados como genes BNM3 (para (para Brassica napus microspore embryo), SEQ ID NO: 1 mostra cDNA de BNM3A, a sequência genômica para BNM3A é dada na SEQ ID NO: 5. A região reguladora de BNM3A está dentro dos nucleotídeos 1-1619 de SEQ ID NO: 5. As sequências de proteína previstas codificadas pelos DNAs de SEQ ID NO: 1 e 3 são dadas em SEQ ID NO: 2 e 4, respectivamente. O ortólogo do gene BNM3 também foi identificado em arabidopse e é a seguir referido como AtBBM. A SEQ ID NO: 6 mostra a sequência genômica para AtBBM. A região reguladora de AtBBM está dentro dos nucleotídeos 1-2025 de SEQ ID NO: 6. A sequência de aminoácidos prevista é dada em SEQ D NO: 7.

Os produtos de tradução de BNM3 contém duas cópias de um domínio AP2 separado por uma região de ligador (figura 3, aminoácidos 208-378 de SEQ ID NO: 2, e SEQ Π) NO: 4, nucleotídeos 2694- 4252 de SEQ ID NO: 5, nucleotídeos 2938- 4416 de SEQ ID NO: 6), que é seguir referido como "domínio AP2" ou repetição 1 domínio AP2- ligador- repetição 2 domínio AP2". O domínio AP2 media, como se pensa, as interações proteína-proteína. A capacidade de várias proteínas contendo domínio AP2 de ligar DNA, copulada com a presença de sinais de localização nuclear putativa e regiões ácidas que podem funcionar como ativadores transcripcionais sugere que esta píoteínas funcionam como fatores de transcrição. A repetição 1 domínio AP2-ligador- repetição 2 domínio AP2 de BNM3 demonstra cerca de 99% de homologia com o domínio AP2 de AtBBM (95% de similaridade de nucleotídeo entre BNM3 e AtBBM), assim como um alto grau de similaridade com outras proteínas compreendendo AP2, por exemplo, ANT cerca de 85% (76% de similaridade de nucleotídeos), MOE17 (cromossomo 3) cerca de 85% (78% de similaridade de nucleotídeos), se os íntrons forem incluídos na comparação, por exemplo a região AP2 de SEQ ID NO: 5, então MOE17 demonstra cerca de 63% de similaridade de nucleotídeo sobre uma região de 285 bp dentro do segundo domínio AP2). ZMMHCF1, 88%, ou GLOSSY15, 66%. No entanto, fora dos dois domínios de AP2, a similaridade da sequência de BNM3 e as outras proteínas contendo AP2 diminui de modo significante.

Por "BNM3" ou "gene BNM3' significa-se a sequência de oligonucleotídeos como descrito em SEQ ID NO: 1,3,5, ou 6, ou fragmentos, derivados ou mutações dos mesmos, ou sequências de oligonucleotídeos que demonstram pelo menos i) 70% de homologia ou similaridade, com um fragmento ou derivado das sequências descritas em SEQID NO: 1,3, 5 ou 6, não incluindo a região de repetição 1 de domínio AP2- ligador- repetição 2 de domínio AP2 como definidos por nucleotídeos 741- 1257 de SEQ ID NO: 1, nucleotídeos 672-1188 de SEQ ID NO: 3, a seqüência correspondente dentro da região de codificação de nucleotídeos 2694 - 4252 de SEQ ID NO: 5, ou nucleotídeos 2938 - 4416 de SEQ ID NO: 6 (as regiões definidas por nucleotídeos 2694 - 4252 de SEQ ID NO: 5 ou nucleotídeos 2938 - 4416 ou SEQ ID NO: 6, são interrompidas por 7 introns; ver figura 9); ou ii) 70% de homologia ou similaridade, com o comprimento completo de seqüências descritas nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5 ou 6 incluindo a região repetição 1 de domínio AP2- ligador- repetição 2 de domínio AP2.

Estas determinações de homologia podem ser usadas usando algoritmos de alinhamento de oligonucleotídeos por exemplo mas não são limitados a BLAST (GenBank URL: www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/, usando parâmetros de default: Programa blastn; Base de dados: nr, Expect 10; filtro: default; Alinhamento: em pares, Query Genetic Codes, Padrão (1)) ou FASTA, novamente usando parâmetros de default. Usando buscas de similaridade de sequência, AtBBMdemonstra cerca de 85% de homologia com o comprimento completo de BNM3 e, assim AtBBM é um gene BNM3 . Além disso, um gene BNM3 também pode ser definido em termos de sua capacidade para hibridizar com sequências descritas na presente invenção. Assim,"BNM3" ou "gene BNM3" também inclui: iii) oligonucleotídeos de maios do que cerca de 15 nucleotídeos de comprimento, preferivelmente 20 a 35 nucleotídeos de comprimento, que se associam com a SEQ ID NO: 1, 3, 5 ou 6, ou um fragmento ou derivados das sequências descritas em SEQ ID NO: 1, 3, 5 ou 6, não incluindo a região de codificação para o domínio AP2 (repetição 1 de domínio AP2- ligador- repetição 2 de domínio AP2, como definido acima, sob condições de alta estringência, por exemplo, mas não são limitados a hibridização usando blots de gel (hibridização Southern) em cerca de 65 °C a 5XSSC, seguido por condições de lavagem a 0,1X SSC, a 65 °C; ou iv) sequências de nucleotídeos de comprimento substancialmente completo, ou sequências de nucleotídeos maiores do que cerca de 1000 nucleotídeos de comprimento, que se associam com SEQ Π) NO: 1, ou 3, ou um fragmento ou derivados das sequências descritas em SEQ ID NO: 1, 3 de um comprimento maior do que 1000 nucleotídeos, não incluindo a região de codificação para o domínio AP2 (repetição Ide domínio AP2- ligador- repetição 2 de domínio AP2), como definido acima, sob condições de estringência moderada ou elevada, por exemplo, mas não são limitados a hibridização usando blots de gel (hibridização Southern), a cerca de 25 °C a 0,2XSSC, 0,1% SDS, ou 65 °C 5XSSC, respectivamente, seguido por condições de lavagem a 0,2XSSC, 0,1% SDS a 25 °C.

Sob condições de estringência moderada, o cDNA de BNM3 de comprimento completo somente hibridiza com fragmentos de AtBBM (ver figura 9B) e assim AtBBM é um gene BNM3. A análise de sequência de clones genômicos de AtBBM na extremidade 5' de gene IRREGULAR XYLEM3 (IXR3) a jusante de região de codificação AtBBM putativa (posição 7479, figura 9A). IXR3 foi previamente mostrado para mapear uma região de 150 kg de cromossomo 5 entre os marcadores ngal06 (33,26 cM) e mi438 (33,34 cM) (Taylor et al., 1999). Estes dados indicam que o ortólogo de arabidopse de gene BNM3 de Brassica é codificado por um gene único que mapea o cromossomo 5. Uma sequência altamente similar para AtBBM, TAMU BAC clone T10B6 (número de acesso AP002073; Nakamura, 18 de maio de 2000) também foi mapeada para cromossomo 5. "Gene BNM3" também inclui moléculas de DNA que compreendem pelo menos 27 nucleotídeos contíguos de SEQID NO: 1, 3,5, ou 6, ou pelo menos 22 nucleotídeos contípos dentro da região reguladora de nucleotídeos 1-1619 de SEQ ID NO: 5, ou nucleotídeos 1-2025 de SEQ ID NO: 6. Um fragmento de BNM3, como definido, pode ser usado como uma sonda para a identificação de nucleotídeos relacionados com BNM3 regulatório, ou codificação, regiões dentro de um organismo, ou como iniciadores para a amplificação destas sequências de nucleotídeos. Além disso, molécula compreendendo pelo menos 27 nucleotídeos contípos, e preferivelmente mais que cerca de 30 a cerca de 35 nucleotídeos, da sequência de SEQ ID NO: 1,3,5 ou 6, e que codificam uma proteína, ou um fragmento ativo da mesma, que quando presentes em um nível suficiente dentro de uma célula de planta toma a célula embriogênica, aumenta a capacidade regenerativa da célula da planta; ou toma a célula embriogênica e aumenta a capacidade regenerativa da célula da planta, são também considerados como sendo genes BNM3. Preferivelmente, um gene BNM3 compreende de cerca de 50 a cerca de 1981 nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou 3, de cerca de 50 a cerca de 3538 nucleotídeos da região de codificação (1620- 4858) de SEQ ID NO: 5, ou de cerca de 50 a cerca de 3009 nucleotídeos da região de codificação (2025-5035) de SEQ ID NO: 6.

As sequências de BNM3 genômico obtidas de Brassica napus e arabidopse são caracterizadas como compreendendo 8 íntrons. Estes íntrons são encontrados em nucleotídeos 1846 - 2298, 2720 - 2952, 3036 - 3160, 3170 - 3314, 3404 - 3553, 3628 - 3797, 3849 - 3961, e 4039 - 4148, de SEQ ID NO: 5, e nucleotídeos 2249 - 2578, 2994 - 3220, 3304 - 3420, 3429 -3521, 3611 - 3770, 3845 - 3969, 4020 - 4151 e 4229 - 4310 de SEQ ID NO: 6.0 códon de partida de SEQ ID NO: 5 e 6 são em nucleotídeos 1620 e 2026, respectivamente, enquanto os códons de parada são encontrados em posições 4856 e 5035, respectivamente.

Por "região reguladora de BNM3", significa-se a sequência de oligonucleotídeos que demonstra a propriedade de regular a expressão (ou positivamente, por exemplo uma região de promotor ou melhorador, ou negativamente, por exemplo uma região de silenciador), e estão em associação operativa com um gene BNM3 . tipicamente, a região reguladora de BNM3 compreende nucleotídeos a montante do sítio de partida do gene BNM3, no entanto, sequências residindo dentro de outras regiões do gene também podem demonstrar propriedades reguladoras e ser considerada uma região reguladora de BNM3, por exemplo mas não são limitados a sequências dentro de íntrons. Um exemplo de uma região reguladora de BNM3, que não deve ser considerada limitativa inclui: • uma sequência ligada de modo operativo com um gene BNM3 que demonstra uma função reguladora, por exemplo mas não limitada a uma região reguladora a montante do sítio de partida de um gene BNM3 ou dentro de um íntron, ou um fragmento, derivado, ou mutação do mesmo; • nucleotídeos de cerca de 1 e a cerca de 619 na SEQID NO: 5 ou um fragmento ou derivado do mesmo; • nucleotídeos de cerca de 1 e a cerca de 2025 de SEQ ID NO: 6 ou um fragmento ou derivado do mesmo; • uma seqüência de nucleotídeos que associa com uma seqüência de nucleotídeo de cerca de 1000 e a cerca de 619 de SEQ ID NO: 5 ou de cerca de 1500 e a cerca de 2025 de SEQ ID NO: 6, ou um fragmento ou derivado do mesmo, sob condições de alta estringência, por exemplo, mas não são limitadas a hibridização para blots de gel a cerca de 65 °C em 5XSSC, seguido por condições de lavagem de 0,1X SSC, 65 °C; • uma seqüência de nucleotídeos que associa com uma seqüência nucleotídeo de cerca de 1 e a cerca de 1000 de SEQ ID NO: 5 ou de cerca de 1 e a cerca de 1500 de SEQ ID NO: 6, ou um fragmento ou derivado do mesmo, sob as condições de estringência moderada ou elevada, por exemplo, mas não são limitadas a hibridização em blots de gel a cerca de 25 °C em 0,2XSSC, 0,1% de SDS, ou 65 °C em 5XSCC, respectivamente, seguido por condições de lavagem de 0,1 X SSC, a 65 °C;ou • uma seqüência de nucleotídeos que demonstra pelo menos 70% similaridade com a seqüência de nucleotídeos de cerca de 1000 e a cerca de 1619 de SEQ ID NO: 5 ou de cerca de 1500 e a cerca de 2025 de SEQ ID NO: 6, ou um fragmento do mesmo de pelo menos a cerca de 22 nucleotídeos, como determinado usando alinhamento de oligonucleotídeos (por exemplo, mas não limitados a uma busca BLAST ou FASTA, usando parâmetros de default; ver acima).

Por proteína "BNM3" significa-se uma proteína ou um fragmento biologicamente ativo da mesma que toma uma célula de planta embriogênica, aumenta a capacidade regenerativa de célula de planta, ou toma a célula embriogênica, aumenta a capacidade regenerativa de célula de planta e que é codificada por um gene BNM3 como definido acima. Preferivelmente, uma proteína BNM3 compreende de cerca de 30 e a cerca de 579 aminoácidos da seqüência descrita na SEQ ID NO: 2, de cerca de 30 e a cerca de 579 aminoácidos da seqüência descrita na SEQ ID NO: 4, ou de cerca de 30 e a cerca de 581 aminoácidos da seqüência descrita na SEQ ID NO: 7. No entanto, a proteína BNM3 também pode ser definida como uma proteína tendo pelo menos 70% de homologia com ou SEQ ID NO: 2,4, ou 7 não incluindo repetição 1 de domínio AP2- ligador- repetição 2 de domínio ΑΡ2 (aminoácidos 208 - 378 de SEQID NOs: 2, e 3, aminoácidos 205 - 375 de SEQID NO: 7). A busca das bases de dados da sequência indicaram que os produtos de tradução BNM3 contém duas cópias de domínio AP2 (Figura 3; ver também SEQ ID NO: 2 para BNM3A, SEQ ID NO: 4 para BNM3B, e SEQ ID NO: 7 para AtBBM). O domínio AP2 foi primeiro identificado em APETALA2, uma proteína de arabidopse que regula a identidade de meristema, especificação de órgão floral, desenvolvimento da capa da semente, e expressão do gene homeótico floral (Jofiiku et al, 1994), mas foi desde então identificada em uma ampla faixa de proteínas com funções diversas. O domínio AP2 está geralmente entre 58 a 68 aminoácidos de comprimento e contém um núcleo central conservado de 18 aminoácidos, caracterizado por sua capacidade de formar uma α-hélice anfipática, uma estrutura que se pensa media as interações proteína-proteína. A capacidade de várias proteínas contendo domínio AP2 para ligar DNA, copulada com a presença de sinais de localização nuclear putativa e regiões ácidas que podem funcionar como ativadores transcripcionais sugere que estas proteínas funcionam como fatores de transcrição.

Duas classes fílogeneticamente distintas de proteínas de domínio AP2 foram identificadas, proteínas com um único domínio AP2 (como EREBP), e proteínas com dois domínios AP2 (como AP2, (Zhou, 1997)). As proteínas codificadas pelos genes desta invenção representam membros únicos da última classe de proteínas.

Consequentemente, um aspecto da presente invenção provê uma molécula de DNA isolada que compreende uma sequência codificando uma proteína que contém dois domínios AP2. A proteína, quando presente em um nível suficiente em uma célula de planta, toma a célula embriogênica, aumenta a capacidade regenerativa de célula ou tanto toma a célula embriogênica, que aumenta a capacidade regenerativa de célula.

Análise de expressão de BNMS durante o desenvolvimento de embrião derivado de microesporos, desenvolvimento de semente ou desenvolvimento de tecido não semente, usando Northems (figura 6) indicou que os genes BNMS são preferivelmente expressos em culturas de microesporos embriogênicas, embriões derivados de microesporos e sementes. Os transcritos de BNMS não foram detectados em qualquer um dos tecidos não semente testados. MRNA BNMS é detectado em culturas de microesporos induzidas para sofrer embriogenese, assim como nos estágios globulares, coração, torpedo e cotiledônea subsequentes, de desenvolvimento de embrião derivado de microesporos (por exemplo figura 6A). RNAs são também detectados dentro de sementes em desenvolvimento, 14 dias após polinização (14 DAP) correspondendo ao estágio de coração do desenvolvimento do embrião. A expressão de BNMS aumenta durante os estágios prematura (21 DAP) e meio-cotiledôneo (28 DAP) de desenvolvimento de embrião e permanece constante a seguir (figura 6B). A expressão constitutiva de BNMS resultou na formação de embriões somáticos em estruturas vegetativas como cotiledôneas, petíolos, lâminas de folha e o meristema apical de broto de plantas (figura 7). Nestas experiências, cDNAs de BNMS foram colocados sob o controle de duas construções de promotor constitutivo separadas, uma construção de promotor de POLIUBIOUITIN de girassol modificada, e uma construção de promotor S5S melhorada dupla contendo um melhorador de tradução AMV, no entanto, deve-se entender que qualquer promotor constitutivo apropriado pode ser usado para este fim. Estes embriões ectópicos derivados de BNMS contém todos os sistemas de órgãos e camada de tecido encontrados no embrião zigótico em desenvolvimento em que estes embriões são bipolares (figura 7E), consistem de um eixo, uma região de radículo e hipocotiledônea, meristemas de broto e raiz, e cotiledôneos. Além disso, cada sistema de órgão continha a disposição radical característica de três camadas de tecido especializadas (epidermes, parenquima do chão, e tecido provascular) encontradas em embriões zigóticos. A expressão continuada de gene BNM3 dentro do embrião ectópico em desenvolvimento leva a uma reiteração do processo formador de embrião, com o resultado que novos embriões são continuamente formados na superfície de embriões pré-existentes (figura 7E). A expressão constitutiva de BNM3 resulta na capacidade aumentada de uma planta para regenerar brotos in vitro na presença de reguladores de crescimento adicionados. Os explantes de raiz de plantas transgênicas ectopicamente expressando BNM3 mostram pelo menos um aumento de 5 vezes em regeneração de brotos na presença de hormônios como comparado com os explantes de raízes obtidos de plantas tipo selvagem (figura 8A, B). Os brotos também desenvolveram mais rápido nos explantes transgênicos, comparado com tipo selvagem. Explantes de hipocotilas e folha de tipo selvagem inicialmente responderam por produção de calos na extremidade cortada do petíolo (figura 8B) seguido por formação de calo ao longo do comprimento do petíolo. Em contraste, explantes de linhagens transgênicas imediatamente produziram novos brotos (figura 8B) ou raízes da extremidade cortada do petíolo. Explantes que inicialmente produziram raízes eventualmente também produziram brotos.

Explantes transgênicos, constitutivamente expressando BNM3 também foram capazes de regenerar na ausência de reguladores do crescimento adicionados. Estes explantes, quando colocados em meio faltando reguladores do crescimento regeneraram brotos ou da extremidade cortada da folha e explantes hipocotilos ou de estruturas semelhantes a nódulos de explantes de raízes (Figuras 8C, D). Em todos os casos, brotos regenerados se desenvolveram, criaram raízes, floresceram e deram sementes. Inversamente, explantes de hipocotilos e folha de tipo selvagem colocados em meio faltando reguladores do crescimento ocasionalmente produziram calos ou raízes na extremidade cortada do petíolo da folha, no entanto, não se formaram brotos destas estruturas (figura BC, D).

Também se considerada no escopo da presente invenção que a expressão de BNM3 pode ser usada para iniciar uma cascata de desenvolvimento dentro de uma planta transformada ou célula de planta. Esta cascata pode surgir como um resultado de integração estável de um vetor à base de DNA expressando BNM3 dentro de uma planta transformada, no entanto, esta cascata também pode surgir como resultado de expressão transiente de BNM3, mas não requer a integração estável de vetor à base de BNM3 dentro de uma célula de planta. Estas abordagens transientes podem ser utilizáveis para induzir embriogenese somática, embriogenese gametofiticamente derivada, ou aumenta da capacidade regenerativa de uma planta ou célula de planta.

As plantas em que um gene BNM3 é ectopicamente expresso demonstra qualidades vantajosas incluindo • formação de embriões assexualmente derivados, • aumentada capacidade regenerativa de explantes de tecidos. • a capacidade de explantes de tecido de regenerar na ausência de reguladores do crescimento de plantas adicionados, e • a expressão de componentes de semente em órgãos não semente em que BNM3 é ectopicamente expresso.

Além disso, plantas que ectopicamente expressam pelo menos um gene BNM3 podem ser usadas para a produção de proteínas recombinantes usando elementos regulatórios específicos para semente.

Para as aplicações de BNM3 como descrito acima, será vantajoso obter um alto nível de transcrito BNM3 e/ou proteína BNM3 a fim de obter plantas em que o fenótipo é altamente penetrante. Isto pode ser obtido por uso de elementos genéticos como introns, melhoradores de transcrição, ou melhoradores translacionais, que são conhecidos como melhorando os níveis de expressão de proteína ou gene.

As sequências BNM3 da presente invenção podem ser usadas para várias aplicações incluindo, mas não são limitadas ao controle de processos de embrião, o controle de processos de regeneração, o uso de sequências reguladoras para expressão de genes marcados, o uso de sequências BNM3 como marcadores selecionáveis de plantas transformadas, ou para células embriogênícas. Estas aplicações são descritas em maiores detalhes abaixo.

Uso de sequências BNM3 para controlar processos embriogênicos Como descrito acima, genes BNM3 desempenham um papel importante de iniciação e manutenção de desenvolvimento de embrião. Genes BNM3 foram verificados em uma ampla faixa de membros do reino das plantas. As regiões reguladoras obtidas destes genes podem ser usadas para controlar a transcrição de BNM3 ou um derivado ou fragmento do mesmo, ou qualquer gene de interesse, usando processos bem conhecidos dos versados na arte. A expressão ectópica de um gene BNM3 é suficiente para induzir formação recorrente de embriões assexualmente derivados nos tecidos vegetativos de plantas (ver exemplo 4). Dependendo do promotor usado, a super-expressão ectópica de genes BNM3 pode ser usada para produzir embriões somáticos ou gametóficos. Os embriões gametófitos ou somáticos podem ser obtidos por expressão de um gene BNM3 sob o controle de elemento regulador constitutivo, como é mostrado no exemplo 5, ou pode ser também obtido por expressão de um gene BNM3 sob o controle de elementos regulados no desenvolvimento ou específicos para tecido, elementos indutíveis derivados de genes de plantas ou não planta, ou através de expressão transiente. Neste aspecto, os sistemas de indução químicos (por exemplo, ver Gatz e Lenk, 1998, que é incorporado por referência) ou uma expressão transiente sob processos que não resultam em integração estável do gene BNM3, ou que fazem uso direto de proteína BNM3, por exemplo bombardeio de microprojéteis de DNA ou proteína também podem ser empregados. A restrição espacial e/ou temporal de expressão de BNM3 usando elementos regulados no desenvolvimento ou específicos para tecido, indutíveis, é preferido quando embriogenese recorrente não é um traço desejável. Os elementos regulatórios usados para limitar BNM3 a um estágio de desenvolvimento específico ou tipo de célula irá depender da aplicação. Por exemplo, elementos regulatórios que podem ser usados para expressar BNM3 para a produção de embriões derivados de microesporos incluem, mas não são limitados aos de gene indutível por choque térmico de baixo peso molecular classe I, GMHSP17.3B (Zarsky et al, 1995, que é incorporado por referência), ou genes expressados em pólen/ microesporos como NTM19 (Custers et al, 1997, EP 790.311, que são incorporados por referência), BCP1 (Xu et al, 1995, que é incorporado por referência), LAT52 (Twell et al, 1989, que é incorporado por referência), BNM1 (Treacy et al 1997, que é incorporado por referência) e APG (Roberts et al, 1993, que é incorporado por referência).

Exemplos de elementos regulatórios que podem ser usados para expressar BNM3 para a produção de embriões somáticos incluem, mas não são limitados aos genes ativados por reguladores do crescimento de plantas que são usados como rotina para induzir a embriogenese somática em cultura de tecido. Exemplos específicos, que devem ser considerados não limitativos, incluem os genes IB6 e CK11 indutíveis por citocinina (Brandstatter e Kieber, 1998; Kakimoto, 1996, que são incorporados por referência) e o elemento indutível por auxina, DR5 (Ulmasov et al, 1997, que é incorporado por referência). No entanto, deve-se entender que outros elementos regulatórios podem ser incluídos para a expressão de BNM3 em plantas.

Além disso, exemplos de elementos regulatórios de genes apropriados para dirigir a expressão de BNM3 para obter embrione adventício incluem, mas não são limitados aos obtidos de gene SERK expresso em embrião e óvulos (Schmidt et al, 1997 que é incorporado por referência), o gene AGL11 expresso em óvulos (Roundsley et al., 1995, que é incorporado por referência), o gene NUC1 expresso em nucelos (Doan et al, 1996; WO 98/08961, que são incorporados por referência), ou os genes expressos por integumentos internos, genesFBP7 (Angenent et al, 1995, que é incorporado por referência) e SC4 (pedido US 09/059.909, depositado em 13 de abril de 1998, que é incorporado por referência).

De acordo com um aspecto da presente invenção, provê-se um método para a produção eficiente de embriões derivados de microesporos em plantas. Este método envolve: i) transformando uma planta de interesse, por exemplo, Brassica napus (usando técnicas de transformação conhecidas dos versados na arte, por exemplo, DeBlock et al, 1989, Clough e Bent 1998, Vergunst et al. 1998, Klein et al 1987, que são incorporadas aqui por referência) com uma construção de vetor, ou DNA isolado, consistindo de um gene BNM3 sob controle de elemento regulatório apropriado, que pode ser constitutivo, específico para tecido, regulado no desenvolvimento, ou indutível e, opcionalmente, um gene marcador para seleção de transformantes, ii) selecionar plantas transformadas; iii) produzir linhagens que ectopicamente expressam o gene BNM3 ou proteína BNM3; iv) isolar microesporos e pólen de linhagens transgênicas e cultivo de microesporos e pólen para induzir embriogenese. A embriogenese pode ser induzida por qualquer protocolo apropriado, por exemplo, que não deve ser considerado limitativo, cultivando microesporos e pólen durante cerca de 4 dias em de cerca de 28° e a cerca de 35 °C, preferivelmente a cerca de 32 °C, então transferindo células embriogênicas ou embriões a cerca de 25 °C.

Usando o método acima, cultivares de Brassica napus ectopicamente expressando BNM3 mostram um aumento na porcentagem de células embriogênicas ou embriões sobre os observados quando microesporos ou pólen são preparados de plantas de tipo selvagem que não expressam ectopicamente BNM3.

Exemplos de elementos regulatórios que podem ser usados para expressar BNM3 para a produção de embriões derivadas de microesporos incluem, mas não são limitados aos de gene indutível por choque térmico de peso molecular baixo classe I GMHSP17.3B (Zarsky et al, 1995, que é incorporado por referência), ou genes expressos por pólen/ microesporos como NTM19 (Oldenhof et al, 1996, EP 790.311, que são incorporados por referência), BCP1 (Xu et al, 1995, que é incorporado por referência), LAT52 (Twell et al, 1989, que é incorporado por referência), BNM1 (Treacy et al 1997, que é incorporado por referência), e APG (Roberts et al, 1993, que é incorporado por referência). Também são utilizáveis elementos regulatórios indutíveis, por exemplo mas não são limitados a promotor indutível por tetraciclina (Gatz 1997, que é incorporado por referência), promotor indutível por esteróides (Aoyama e Chua 1997, que é incorporado por referência) e promotor indutível por etanol (Slater et al 1998, Caddick et al. 1998, que são incorporados por referência).

Em um modo similar, embriões derivados de microesporos também podem ser produzidos em plantas por introdução em uma planta de interesse de uma proteína BNM3 (por exemplo via biolística; Klein et al 1987) e selecionando para plantas que demonstram melhorada embriogenese de microesporos.

Esta invenção também provê um método para a produção efetiva de embriões somáticos in vitro. Este método envolve: i) transformar uma planta, por exemplo arabidopse usando técnicas de transformação bem conhecidas dos versados na arte (por exemplo, mas não limitado a DeBlock et al, 1989, Clough e Bent 1998, Vergunst et al. 1998, que são incorporados por referência), ou uma célula de planta também pode ser transformada de modo transiente usando métodos bem conhecidos dos versados na arte (por exemplo, biolistica; Klein et al 1987) com uma construção de vetor contendo um gene BNM3 sob controle de elemento regulatório apropriado, que pode ser constitutivo, indutível ou regulado no desenvolvimento, e opcionalmente um gene marcador para seleção de transformantes é transformado em várias arabidopses. ii) selecionar plantas transformadas, e iii) cultivar o explante desejado de plantas transformadas selecionadas, por exemplo, mas não são limitados a raízes, folhas ou mudas in vitro, em meio com ou sem reguladores do crescimento apropriados, por exemplo mas não são limitados a 2,4-D (por exemplo, Mordhorst et al, 1998) para produzir embriogenese direta ou calos embriogênicos, e iv) transferir embriões, calos não embriogênicos, ou tanto embriões e calos não embriogênicos, para meios apropriados para a produção de embriões, plântulas, ou tanto embriões ou plântulas.

Por exemplo, quando os resultados do método acima são comparados com a produção de embriões somáticos in vitro usando vários ectotipos de arabidopse, dirigida embriogenese ou calos embriogênicos é iniciada em uma maior frequência de linhagens transgênicas ectopicamente super expressando BNM3 do que em controles de tipo selvagem.

Exemplos de elementos regulatórios que podem ser usados para expressar BNM3 para a produção de embriões somáticos incluem, mas não são limitados os genes ativados por reguladores do crescimento de plantas que são usados como rotina para induzir embriogenese somática em cultura de tecidos. Exemplos específicos que devem ser considerados como não limitativos, genes IB6 e CKJ1 indutíveis por citocinina, não limitativos (Brandstatter e Kieber, 1998; Kakimoto, 1996, que são incorporados por referência) e elemento indutível por auxina DR5 (Ulmasov et al, 1997, que é incorporado por referência). Também utilizáveis são elementos regulatórios indutíveis, por exemplo mas não limitados a um promotor indutível para tetraciclina (Gatz 1997, que é incorporado por referência), um promotor indutível para esteróide (Aoyama e Chua 1997, que é incorporado por referência), e um promotor indutível para etanol (Slater et al 1998, Caddick et al. 1998, que são incorporados por referência). A iniciação ectópica de desenvolvimento de embrião é uma das etapas chaves em apomixia. Como no exemplo 4, a expressão ectópica de um gene BNM3 é suficiente para iniciar a formação de embrião em tecido de outra forma não formador de embrião. Um gene BNM3 pode assim ser usado para iniciar a embrione adventícia ou partenogenese de uma célula de saco de embrião não reduzida ou reduzida do gene nos tecidos esporofíticos ou gametofíticos do óvulo em desenvolvimento. A embrione adventícia é obtida por expressão de BNM3 em tecidos de óvulos esporofíticos como nucelos, os integumentos internos ou depositando tecidos adjacentes a ou em proximidade com o saco do embrião em desenvolvimento. Este método envolve: i) transformar uma planta desejada (ver métodos acima) com uma construção de vetor consistindo de um gene BNM3 sob controle de elemento regulatório apropriado, que pode ser constitutivo, indutível ou regulado no desenvolvimento, e opcionalmente um gene marcador para seleção de transformantes, usando métodos bem conhecidos dos versados na arte, ii) selecionar plantas transformadas, iii) emascular a planta transformada, iv) polinizar as plantas transformadas com um pólen contendo um ou mais marcadores selecionáveis dominantes, por exemplo GUS ou resistência a canamicina, e v) testar para a produção de prole clonal.

Quando os resultados do método acima são comparados com a polinização de uma planta arabidopse de tipo selvagem com pólen transportando o marcador selecionável dominante, todos os embriões F1 resultantes deste cruzamento herdam o marcador dominante enquanto os embriões derivados de plantas ectopicamente super-expressando o gene BNM3 ou proteína são clonalmente derivados via formação de embrião sexual e não herdam o marcador selecionável dominante.

Exemplos específicos de elementos regulatórios de genes apropriados para dirigir expressão de BNM3 para obter embrione adventícia, diplosporia ou partenogenese de haplóide de componentes do saco do embrião incluem o gene SERK expresso em óvulo (Schmidt et al. 1997, que é incorporado por referência), o gene SERK expresso em óvulo (Klimyuk e Jones, 1997; WO 98/28431, que são incorporados por referência), o gene AGL11 expresso em óvulo (Roundsley et al., 1995, que é incorporado por referência), o gene NUC1 expresso no nucelo (Doan et al, 1996; WO 98/08961, que são incorporados por referência), e os genes expressos em integumentos internos, FBP7 (Angenent et al, 1995, que é incorporado por referência) e genes SC4 (pedido US 09/059.909, depositado em 13 de abril de 1998, que é incorporado por referência). Além disso, sistemas indutíveis, por exemplo, mas não limitados a promotor indutível por tetraciclina (Gatz 1997, que é incorporado por referência), promotor indutível por esteróide (Aoyama e Chua 1997, que é incorporado por referência), promotor indutível por etanol (Slater et al 1998, Caddick et al. 1998, que são incorporados por referência) também podem ser usados. A partenogenese de células do saco do embrião requer um elemento regulatório que é ativo em uma ou mais células de gametofito fêmea ou seus precursores. A fertilização de núcleos polares derivados meioticamente é desejável quando o desenvolvimento de semente é dependente da presença de endosperma.

Uso de sequências de BNMS para controlar processos de regeneração As plantas ectopicamente super-expressando os genes BNMS demonstram melhorada capacidade regenerativa e a capacidade de regenerar plantas totais na ausência de reguladores do crescimento adicionados (ver exemplo 5), A expressão de genes BNMS pode ser assim usada para melhorar ou induzir a capacidade regenerativa de tecidos de plantas in vivo ou in vitro. Os elementos regulatórios usados para expressar BNMS irão depender, em parte, do tecido de marcação usado para regeneração. A regeneração de tecidos de plantas pode ser obtida por expressão de um gene BNMS sob o controle de elemento regulatório constitutivo, por exemplo, mas não limitado a 35S, ou expressando um gene BNMS sob o controle de elementos regulados no desenvolvimento ou específicos de tecidos, elementos indutíveis derivados tanto de genes de planta como não de planta (por exemplo, Gatz e Lenk, 1998, que é incorporado por referência), ou através de métodos de expressão transiente que não resultam em integração estável do gene BNM3 ou que fazem uso direto da proteína BNMS (por exemplo, bombardeio de microprojétil de DNA ou proteína). Sistemas de indução química (ver Gatz e Lenk, 1998) ou elementos regulatórios de genes que respondem a reguladores de crescimento de plantas usados para induzir regeneração, como, por exemplo, citocinina (Brandstatter e Kieber, 1998; Kakimoto, 1996) ou auxina (Ulmasov et al., 1997), ou genes expressados no sítio de feridas de explantes de tecido (Xu et al., 1993), podem ser usados.

Uma outra aplicação é o uso de um gene BNM3 como um marcador selecionável para a recuperação de plantas transgênicas. Como um exemplo desta aplicação, que não deve ser, de modo algum, considerado como limitativo, raízes de um arbusto, por exemplo, um arbusto C24 do ecotipo Arabidopsis, são co-cultivadas com uma cepa de Agrobacterium tumefaciens única (por Vergunst et al., 1998; exceto que todas as etapas são realizadas na ausência de reguladores de crescimento adicionados) contendo duas construções binárias. • um primeiro vetor binário contém uma fusão de gene repórter, por exemplo, mas não limitada a, S5S:GUS; • um segundo vetor binário contém um gene BNM3 sob o controle de elementos regulatórios apropriados.

Expressão do gene BNM3 é ativada quando da integração da construção acima no genoma de arabidopsis e plantas transgênicas são selecionadas na base de sua capacidade de regenerar- se em condições em que explantes do tipo selvagem são incapazes de regenerar- se, por exemplo, mas não limitados a, à ausência de reguladores de crescimento. Em muitos casos, o T-DNA contendo o gene BNM3 e o T-DNA contendo o gene de interesse serão integrados em local não ligado. O T-DNA contendo a sequência de BNM3 introduzida, e seu fenótipo de capacidade regenerativa aumentado associado, podem, assim, ser removidos nas plantas de progênie por segregação simples (Daley et al., 1998). No entanto, como será evidente aos versados na arte, outros métodos como expressão transiente, que não resultam na integração instável do gene BNM3 ou que fazem uso direto da proteína BNM3, também podem ser empregados.

Uso de sequências de BNM3 para expressão de gene de marcacão no embrião Uma vez que genes BNM3 são preferivelmente expressados em embriões em desenvolvimento (ver exemplo 3), uma outra aplicação desta invenção é o uso de regiões reguladoras de BNM3 para marcar expressão de pelo menos um gene heterólogo de interesse no embrião em desenvolvimento para qualquer fim, por exemplo, mas não limitado a, traços de embrião e semente como tamanho e viabilidade da semente, de constituintes da semente, resistência a doença, ou a produção de produtos de alto valor como anticorpos para vacinas, biofarmacêuticos ou outros produtos químicos característicos.

Uso de expressão de BNM3 como um marcador nara células embriogênicas Como mostrado nos exemplos 3 e 4, expressão do gene BNM3 é detectado durante a fase prematura de embriogênese de planta e é por si mesma suficiente para ativar cascatas de transdução levando ao desenvolvimento de embriões. Expressão do gene BNM3 é, assim, um marcador específico para a entrada de uma célula de planta na via embriogênica.

Expressão de BNM3 é associada com divisões de células formando embrião in vitro e in vivo e como tal pode ser usada para definir condições de cultura que alteram a capacidade de formação de embriões de um tecido in vitro. Células com capacidade embriogênica ou células que passam somente por um número limitado de divisões de formação de embriões são difíceis de identificar na ausência de estruturas que assemelham-se morfologicamente a embriões. No entanto, estas células podem ser identificadas na base da expressão de BNM3. Nesta aplicação, um vetor contendo a região reguladora de BNM3, fundido a um gene repórter, por exemplo, mas não limitado a, GUS (Jefferson et al., 1987), Luciferase (Ow et al., 1987) ou GFP (Haselhoff e Amos, 1995) é transformado em uma planta de interesse. Linhagens transgênicas homozigóticas demonstrando altos níveis de expressão de gene repórter no embrião são cultivadas em condições in vitro. Células embriogênicas, bem como condições de cultura que facilitam ou melhoram a formação de células embriogênicas são identificadas na base de expressão do gene repórter no tecido de cultura.

Uma aplicação relacionada é o uso do gene BNM3 como um marcador em espécies apomícticas para a identificação de células individuais que estão em processo de formação de embriões assexualmente derivados. Nesta aplicação, células que entram na via autônoma do embrião são identificadas por hibridização in situ de mRNA usando uma sonda de RNA derivada da sequência do gene BNM3 por imunocitoquímica usando um anticorpo dirigido contra uma proteína BNM3. transformando plantas com uma construção de DNA contendo uma fusão de gene entre regiões reguladoras de BNM3 e um gene repórter, ou por qualquer técnica similar conhecida dos versados na arte.

Identificação de componentes de transducão de sinal Componentes de transdução de sinal que ativam ou são ativados por expressão do gene BNM3 podem ser elucidados identificando proteínas e sequências de DNA que interagem com um gene BNM3 e seu produto de proteína. Estes componentes de transdução de sinal podem ser identificados usando técnicas conhecidas dos versados na arte, incluindo por exemplo, mas não limitadas a: • mutagênese para identificar supressores intra- e/ou extragênicos ou melhoradores do fenótipo de ganho de função de BNM3\ • triagens para um híbrido de levedura para o isolamento de proteínas que ligam-se às regiões reguladoras de BNM3 para influenciar expressão do gene BNM3; • seleção genética em levedura para identificar genes que são marcações diretas de ligação de BNM3\ • redes de DNA ou proteômicos para identificar genes que são ativados em uma cascata de transdução de sinal de BNM3; e • triagens para dos híbridos de levedura para identificar proteínas que interagem com BNM3 para influenciar expressão de genes de marcação a jusante. Técnicas para a análise dos componentes de transdução de sinal e componentes de sinalização são bem conhecias (ver, por exemplo, Meijer et al. (1998), Lipshutz et al. (1999), e Anderson e Anderson (1998)).

Plantas super- expressando o gene BNM3 sob o controle de um elemento regulatório constitutivo forte como, por exemplo, mas não limitado a, ao promotor 35S do vírus mosaico de couve- flor demonstram formação de embriões ectópicos, regeneração melhorada via organogênese ou uma combinação dos mesmos (exemplos 4 e 5). A capacidade da super-expressão ectópica de BNM3 para induzir ambos os processos de regeneração melhorada e formação de embriões podem ser usados para identificar mutantes alterados em sua capacidade regenerativa ou de formação de embriões. Nesta aplicação, uma construção de vetor consistindo de uma região codificando proteína BNM3 sob o controle de um elemento regulatório que é suficiente para promover sua formação de embriões ectópicos ou fenótipo de regeneração melhorada é feita e introduzida em uma planta de interesse. Linhagens transgênicas homozigóticas demonstrando uma alta penetração de formação de embriões ectópicos, fenótipo de regeneração melhorada ou uma combinação dos mesmos são identificadas. Estas linhagens sofrem mutagenese por qualquer técnica disponível bem conhecida dos versados na arte, mas que pode incluir mutagênese de EMS, mutagenese de nêutrons rápida, mutagênese de transposon ou mutagênese de T-DNA. Plantas mutagenizadas são então tríadas para alterações na formação de embriões ectópicos ou fenótipo de regeneração. Estas alterações incluem, por exemplo, mas não estão limitadas a, eliminação ou melhora da capacidade de promover formação de embriões assexuados ectópicos ou para regenerar- se na ausência de reguladores de crescimento adicionados.

Sistema de expressão de proteína heteróloeo O controle genético da via de transdução de sinal que leva a embriogênese e organogênese em órgãos não semente de plantas transgênicas pode ser ativado por expressão ectópica de um gene BNM3. A expressão de um gene BNM3 em associação com um promotor heterólogo pode ser usada para produzir componentes de sementes alteradas incluindo, por exemplo, proteínas, óleos e outros metabólitos. A biotransformação de órgãos desejados também pode incluir alterar o valor nutritivo de, por exemplo, folhas de culturas de forragens, ou pode ser usada para criar usos alternativos para culturas. O uso de promotores que são induzidos pela cascata de transdução de sinal iniciada por expressão de BNM3 pode ser empregado j>ara expressar proteínas recombinantes de alto valor em órgãos diferentes de sementes. Um exemplo de um promotor é o promotor napin, obtido da proteína napin de armazenamento de semente 2S. A produção de proteínas iniciada de uma cascata induzida por BNM3 pode ser obtida em órgãos demonstrando biomassa maior do que sementes. Consequentemente, esta tecnologia pode ser usada para criar alternativas para plantas como culturas.

Assim, a presente invenção refere-se ainda a um sistema binário em que a proteína BNM3 liga-se diretamente ou indiretamente a uma sequência reguladora expressada no embrião (sequência de marcação) e ativa transcrição de uma construção de gene quimérica em qualquer célula, tecido ou órgão da planta. Consequentemente, BNM3 pode ser usada para ativar diretamente ou indiretamente transcrição de uma construção de gene quimérica. Esta abordagem envolve BNM3 interagindo tanto diretamente com pelo menos uma sequência de marcação de um gene expressão em embriões, como indiretamente iniciando uma cascata de sinal embriogênico que ativa um fator de transcrição que, por sua vez, liga-se a e ativa a transcrição de pelo menos uma sequência de marcação. Este sistema binário pode ser usado para a expressão de proteínas em tecidos somáticos com as propriedades de expressão em sementes.

Nesta aplicação, plantas transgênicas contendo o gene BNM3 sob o controle de um elemento regulatório constitutivo, por exemplo, mas não limitado ao promotor 35S (35S:BNM3) são criadas para produzir uma linhagem ativadora de BNM3. Expressão de BNM3 pode ser demonstrada em uma ampla faixa de tecidos nas linhagens ativadoras de BNM3 por análise blot de gel de RNA. Linhagens ativadoras homozigóticas estáveis com altos níveis de expressão de BNM3 são identificadas. Tecidos somáticos super-expressando BNM3 podem ser examinados para expressão de outros genes expressados nos embriões, como arabina (Guercge et al., 1990), cruciferina (Pang et al., 1988) ou oleosina, ou para propriedades morfológicas que são normalmente características de sementes, como a presença de corpos lipídicos ou proteínicos.

Plantas transgênicas da mesma espécie que as usadas para gerar as linhagens ativadoras de BNM3 descritas acima também são criadas, as quais contêm um promotor expressado no embrião fundido a um gene de interesse, para produzir um gene de linhagem de interesse. A fim de ajudar a descrever esta forma de realização, o gene de linhagem de interesse expressa um gene repórter, como GUS, e exemplos dessas linhagens, que não devem ser considerados como limitativos, incluem gene de proteína de armazenamento de semente albumina 2S, de Brassina napus, fusão BngNAPl.GUS (Baszczynski et al., 1994) ou uma fusão SERK:GUS (Schmidt et al., 1997; uma construção repórter não expressada em semente como BNMliGUS (Treacy et al., 1997) pode ser usada como um controle negativo). A fidelidade de expressão do gene de interesse nos órgãos específicos e tecidos deste gene de linhagens de interesse é demonstrada para cada construção. Linhagens homozigóticas estáveis com altos níveis de expressão do gene de expressão de interesse são criadas.

Linhagens transgênicas contendo linhagens ativadoras de BNM3 e gene de linhagens de interesse são cruzadas e as sementes de progênie coletadas. Expressão do gene BNM3, e, neste exemplo, atividade de GUS, expressão de outros genes expressados no embrião, bem como as características morfológicas de tecidos transformados, são examinados.

Expressão de BNM3 em tecidos não semente ativa tipicamente tanto o desenvolvimento do embrião como a expressão do gene de interesse (por exemplo, GUS), no entanto, ativação da expressão do gene de interesse na ausência de embriões morfologicamente discemíveis também podem ser observados. Expressão do gene de interesse, na ausência de embriões morfologicamente discemíveis provê evidência inicial para interação direta de BNM3 com a sequência de marcação.

Interação direta de BNM3 com uma sequência de marcação também pode ser demonstrada usando expressão transiente de BNM3 em protoplastos de planta, junto com a co-expressão transiente de um promotor expressado no embrião fundido a um gene de interesse (isto é, um gene de construção de interesse). DNA de 35S:BNM3 e o gene de construção de interesse são introduzidos nos protoplastos derivados de células não semente, como células de mesofílos de folha, por eletroporação. A expressão do gene de interesse é examinada após várias horas para confirmar ativação da sequência de marcação. Interação direta de BNM3 com a sequência de marcação pode ainda ser demonstrada co- introduzindo a sequência de marcação sozinha como DNA competidor. A fim de determinar se tecidos de espécies de plantas diferentes podem ser transativados por BNM3, DNA de 35S:BNM3 e uma construção de gene repórter (por exemplo, mas não limitado a GUS), pode ser introduzido por bombardeio de microprojétil em tecidos somáticos de uma planta. Se BNM3 interage diretamente com uma sequência de marcação, então a expressão do gene repórter deve coincidir com a expressão transiente de BNM3 em todas as espécies de tecidos.

Evidência direta para interação da sequência de marcação de BNM3 também pode ser obtida por isolamento da proteína BNM3 expressada em bactérias, inseto ou levedura. BNM3 é expressado em bactérias, inseto ou levedura usando sistemas de expressão comercialmente disponíveis e isolado para purificação. Ensaios de deslocamento de mobilidade em gel (Gustavson et al., 1991) são realizados usando uma sequência de marcação de BNM3, por exemplo uma sequência de marcação expressada em embriões, para demonstrar ligação direta de BNM3 à sequência de marcação de BNM3. Análise de impressões digitais também pode ser realizada para localizar a região de ligação de BNM3. Fragmentos da sequência de marcação que ligam BNM3 podem então ser subclonados e usados como competidores para ligação de BNM3 em ensaios transientes como descrito acima. A seguinte descrição é de uma forma de realização preferida, somente para fins de exemplo e sem limitação à combinação de aspectos necessários para a realização da invenção. A presente invenção será ainda ilustrada nos seguintes exemplos. No entanto, deve ser entendido que estes exemplos são somente para fins ilustrativos, e não devem ser usados para limitar o escopo da presente invenção de algum modo.

Exemplos Métodos gerais: Cultura de embriões de microesporos Brassica napus c.v. Topas foi usado como a fonte de todo material de planta para cultura de embriões de microesporos. Plantas doadoras para cultura de microesporos foram cultivadas em uma estante de cultivo a 20°C/ 15°C (dia/ noite) com um fotoperíodo de 16 h (400 μΕ/m/s) provido por lâmpadas fluorescentes brancas frias VHO (165W, Sylvania) e bulbos incandescentes (400W, Duro-test). Quatro semanas após germinação, as plantas foram transferidas para estantes de crescimento nas mesmas condições de luz, mas fixadas em 10°C/ 5°C (diaI noite). Microesporos e pólen foram isolados e cultivados como descrito em Keller et al. (1987), exceto que após 21 dias de cultura, embriões no estágio cotiledôneo foram transferidos para um meio de maturação consistindo de sais NLN 1/2X, 1% de sacarose, manitol 0,35 M e 5 μΜ de ABA. Culturas não induzidas (microesporos e pólen continuando o desenvolvimento gametofítico) e estressadas por calor, culturas não embriogênicas (usadas para construção da sonda subtraída), foram cultivadas do mesmo material de partida como usado para o início de culturas embriogênicas. Amostras não induzidas foram obtidas cultivando microesporos e pólen durante quatro dias a 25°C. Amostras não embriogênicas estressadas por calor foram obtidas cultivando microesporos e pólen durante um dia a 25°C, seguido por três dias a 32°C.

Amostras de microesporos e pólen cultivadas durante menos de 10 dias foram coletadas por centrifugação. Amostras mais antigas contendo embriões derivados de microesporos no estágio globular, coração, torpedo e cotiledôneo foram coletadas por filtragem através de malhas de náilon de vários tamanhos de poros como descrito em Ouellet et al. (1992). Todos os outros tecidos de planta foram coletados de material cultivado em estufa. Material semeado foi obtido por polinização manual de flores no dia de antese e coletando sementes em desenvolvimento em vários dias após polinização (DAP).

Análise e isolamento de ácido nucleico RNA total foi isolado usando tanto um procedimento de cloreto de césio / isotiocianato de guanidínio (Ouellet, 1992) ou reagente TRIZOL (Gibco-BRL). Análise blot de gel de RNA foi realizada por separação de 5 a 20 pg de RNA total por trilha através de 1,5% de géis agarose contendo formaldeído 0,62 M, essencialmente como em Sambrook et al. (1989), seguido por transferência capilar para membranas de náilon Hybond-N (Amersham). RNA poli (A)+ foi isolado de RNA total por cromatografia de oligo (dT)- celulose (Sambrook, 1989). DNA genômico foi isolado de tecido de folha como descrito em Fobert et al. (1991) e digerido com as enzimas de restrição especificadas usando procedimentos padrões (Sambrook, 1989). Análise blot de gel de DNA foi realizada por eletroforese de 10 pg de DNA através de 0,8% de géis agarose seguido por transferência capilar de membranas Hybond-N. O inserto de cDNA de BNM3A de 1,2 kb parcial foi usado como uma sonda para blots de gel de RNA e DNA. Hibridização em blots de gel foi realizada a 65°C de acordo com o protocolo Hybond-N. As condições de lavagem finais foram 0,1X SSC, 65°.

Construção de sonda subtrativa e triagem de biblioteca de cDNA maRNA poli (A) foi isolado de microesporos uninucleados tardios e pólen binucleado prematuro que foram cultivados durante quatro dias a 32°C a fim de induzir embrogênese (amostra embriogênica) e usados para sintetizar cDNA de primeiro filamento (kit Riboclone cDNA; Promega). O cDNA foi então hibridizado em um excesso de cinco vezes (em peso) de RNA poli (A)+ de microesporos uninucleados tardios e pólen binucleado prematuro que foram cultivados durante um dia a 25°C, seguido por três dias a 32°C para inativar embriogênese (amostra não embriogênica: Pechan et al., 1991). A hibridização subtrativa foi realizada essencialmente como descrito em Sambrook et al. (1989). O cDNA de filamento único recuperado após subtração foi rotulado com [α- P] dCTP usando um kit de iniciadores randômicos (BRL) e usado como a sonda subtraída para triar uma biblioteca de cDNA de fago lambda construída doa mesma amostra embriogênica acima (Boutilier, 1994). Elevações de filtro de náilon em triplicata (Hybond-N) de aproximadamente 1,5 x 105 unidades de formação de placas da biblioteca foram tríadas com a sonda subtraída, com uma sonda não embriogênica de primeiro filamento rotulada com iniciadores randômicos e com uma sonda de cDNA de proteína com armazenagem semeada em napin rotulado com iniciadores randômicos (pN2; (Crouch, 1983). mRNAs de napin prevalecem na biblioteca de microesporos embriogênicos (Boutilier, 1994) e, assim, placas hibridizando na sonda de napin foram removidas das etapas de triagem subsequentes. Placas hibridizando na sonda subtraída, mas não nas sondas de napin ou não embriogênicas, foram selecionadas e submetidas a dois ciclos subsequentes de triagem diferencial usando ambas as sondas subtraída e não embriogênica. DNA de clones lambda selecionados foi isolado (Sambrook, 1989), parcialmente digerido com Eco RI e Xba I e subclonado em pGEM-4Z (Promega).

Sete cDNAs compreendendo 6 genes únicos, um dos quais compreendia um cDNA de BNM3A truncado, foram identificados. Dois clones de cDNA de BNM4 de comprimento completo (BNM3A e BNM3B) foram subsequentemente obtidos por triagem estringente de cerca de 2,5 x 105 unidades de formação de placa de uma biblioteca de cDNA (kit de síntese de cDNA UniZAPII, Stratagene) construída com mRNA de embriões de microesporos de B. napus c.v. Topas no estágio de globular para coração de 10 dias de idade. Os insertos de cDNA de BNM3 foram resgatados por excisão in vivo em Bluescript SK (-) (Stratagene).

Isolamento de sequências de DNA genômico de Brassica napus O kit Universal Genome Walker (Clonetech) foi usado para isolar fragmentos de DNA genômico estendendo-se a montante do códon de partida ATG de BNM3. Poças de fragmentos de DNA genômico de Brassica napus cv Topas ligados ao adaptador, não clonados, foram construídos e usados para isolar sequências genômicas de BNM3 por PCR abrigado. O PCR primário fez uso do iniciador do adaptador externo (AP1) fornecido pelo fabricante e um iniciador específico de BNM3 com a sequência: 5’-GAGGCAGCGGTGGATCGTAAAGTACTCT-3 ’(SEQ ID NO: 8). O PCR abrigado fez uso do iniciador do adaptador abrigado (AP2) fornecido pelo fabricante e um iniciador específico de BNM3 com a sequência: 5’-CATAAGGAGAGAGAGAAAAGCCTAACCAGT-3’(SEQIDNO: 9). A mistura de PCR primária foi então diluída 1:50 e usada como gabarito para PCR abrigado. Ambos os PCRs primários e abrigado foram realizados como recomendado pelo fabricante. Os produtos PCR abrigado foram clonados no vetor pGEMT- Easy (Promega) e sequenciados. Produtos PCR correspondendo às regiões genômicas não traduzidas 5’ de ambos cDNAS de BNM3A e BNM3B foram identificados. A sequência de DNA genômico transpondo os códons de parada translacional TAG e de partida translacional ATG de BNM3A foi isolada por PCR de DNA genômico de B. napus cv Topas usando polimerase Pfu (Stratagene) e a seguinte combinação de iniciador: 5 ’-ACCAAGAACTGCTTAGATC-3 ’ (SEQ Π) NO: 10); e 5 ’-AACGCATATAACTAAAGATC-3 ’(SEQ ID NO: 11).

Os iniciadores foram usados em condições PCR padrões. Os produtos PCR foram clonados no vetor pGEMT-Easy e sequenciados.

Análise blot de gel de DNA e mapeamento de Arabidopsis thaliana Quinhentos nanogramas de DNA genômico de arabidopsis (ecotipos Columbia e Landsberg erecta) (Shure et al., 1983) foram digeridos com 20 endonucleases de restrição diferentes, separadas por eletroforese através de 0,8% de géis agarose e blotted em membrana de náilon Hybond N1" (Amersham) usando métodos padrões. Blots foram hibridizados (NaCl 1,5 M, 65°C) com uma sonda rotulada com iniciadores randômicos 32P [dATP] (Megaprime, Amersham) correspondendo tanto a: 1) aproximadamente os primeiros 405 bp de cDNA de BNM3A (SEQ ID NO: 1), ou 2) aproximadamente os últimos 1200 nt do cDNA de BNM3A (SEQ ID NO. 1) e então lavados em condições de baixa estringência (2X SSC, 0,1% SDS a 65°C) ou estringência moderada (0,2 X SSC, 0,1% de SDS a25°C).

Um polimorfismo de fragmento de restrição (RFLP) foi identificado entre ecotipos Columbia e Landsberg erecta usando a endonuclease de restrição Cfo I. Este RFLP foi usado para mapear a posição do homólogo de BNM3 de arabidopsis no genoma de arabidopsis usando as linhagens endogâmicas recombinantes (RI) de Lister e Dean (Lister e Dean, 1993). DNA de 100 linhagens endogâmicas recombinantes gerado de um cruzamento entre ecotipos Columbia e Landsberg erecta foi digerido com Cfo I, transferido para membrana de náilon Hybond bf, hibridizado com o cDNA de BNM3A (como acima) e lavado em condições de baixa estringência. O dado de RFLP resultante foi enviado à base de dados de RI no Nottingham Arabidopsis Stock Centre para determinação da localização do mapa (Lander et al., 1987). Os resultados são discutidos no exemplo 2-2 abaixo.

Isolamento de sequências de DNA genômico de Arabidopsis thaliana Três equivalentes de uma biblioteca de fago lambda genômico C24 de arabidopse amplificada (Lambda- GEM 11, Promega) foram triados usando uma sonda de cDNA de BNM3A truncado (aproximadamente os últimos 1200 nt de SEQ ID NO: 1). Blots foram hidrolisados com a sonda rotulada com iniciadores randômicos 32P-[dATP] (como acima) e então lavadas em condições de baixa estringência (2X SSC, 0,1% de SDS a 65°C). Sete fagos lambda foram inicialmente identificados. Três clones de fago lambda de comprimento completo putativos contendo o homólogo de arabidopsis do gene BNM3 (SEQ ID NO: 6) foram subsequentemente identificados após hibridização em condições de baixa estringência com uma sonda derivada da extremidade 5’ do cDNA BNM3 de Brassica napus (nt 1-405 de SEQ ID NO: 1). Clones individuais compreendendo aproximadamente 8,0 kb de sequência de sobreposição foram identificados de cada um dos três fagos, subclonados empBR322 e sequenciados.

Construção de plasmídeo para transformação de planta A construção de vetores de plasmídeo contendo os cDNAs de BNM3 sob controle tanto de um promotor 35S de vírus POLYUBQUITIN ou mosaico de couve- flor é descrita abaixo. O plasmídeo pRAP2TUBI contém um promotor POLYUBUQUTIN de Helianthus annus (Binet et al., 1991) no plasmídeo pRAP2T, O plasmídeo pRAP2T consiste do plasmído pUCAP (Van Engelen et al., 1995) e um terminador de sintase de nopalina (nos) inserido nos sítios de restrição Sac I e Eco Rl. Um fragmento PCR do promotor POLYUBIQUTIN UbBl compreendendo a extremidade 5’ do promotor em 7 bp da extremidade 3’ do primeiro exon foi amplificado do vetor usando um iniciador reverso Ml3 e o iniciador UBIQ-3’: 5’- CCATGGATCCAGAGACGAAGCGHAAACC-3’ (SEQ IDNO: 12) que inclui sítios de restrição Bam HI e Nco I introduzidos. O fragmento do promotor POLYUBIQUITIN foi digerido com Pst I e Bam HI, purificado com gel e ligado nos sítios Pst I e Bam HI de pRAP2T, criando o vetor pRAP2TUBIHa. O cDNA de BNM3B de comprimento completo foi digerido com enzimas de restrição Eco RI e Xho I, tomado obtuso com enzima Klenow, purificado com gel e ligado no sítio Sma I de pRAP2TUBI produzindo o plasmídeo pKBIS. Um fragmento de restrição de DNA Asc VPac I contendo o promotor POLYUBIQUITIN modificado, o cDNA de BNM3B e o terminador nos foi purificado com gel e ligado ao vetor binário pBINPLUS digerido com Asc V Pac I (van Engelen et al., 1995), criando o plasmídeo pKBBIN 1S. A construção de um vetor contendo o cDNA de BNM3A sob o controle de um promotor 35S melhorado em duplicata e melhorador translacional AMV foi como se segue. Um fragmento de restrição de DNA Hind III/ Xba I contendo o promotor 35S melhorado em duplicata e melhorador translacional AMV do plasmídeo pBI525 (Datla et al., 1993) foi ligado a pRAP2T digerido com Hind III/ Xba I, criando o plasmídeo pRAP2T35S. Um sítio Nco I foi introduzido no clone de cDNA de BNM3A por mutagênese dirigida ao sítio. A sequência do iniciador BNM3ANC01 usado para mutagênese é: 5’- ACTCCATGGATAATAACTGGTTAGGC-3’ (SEQ ID NO: 13).

Um segundo iniciador, BNM3AHINDIII: 5’- AAATTCTC AAGCTTTGGTCCATCTTG-3 ’(SEQ ID NO: 14) foi usado junto com o iniciador BNM3ANC01 para amplificar um fragmento de 305 bp do cDNA de BNM3A. Este fragmento de PCR foi digerido com Nco I e Hind III e ligado ao pRAP2T35S cortado com Nco V Kpnl e um fragmento Hind III/ Κρη I contendo a região de cDNA de BNM3A a jusante do sítio Hind III, criando o vetor p35S:BNM3. p35S-BNM3 foi digerido com enzimas de restrição Asc I e Pac I e o fragmento contendo o promotor 35S em duplicata, o melhorador translacional AMV, o cDNA de BNM3A e o terminados nos foi purificado com gel e ligado ao vetor binário pBINPLUS digerido com Asc 1/ Pac I, criando o plasmídeo p35S-BNM3BIN.

Ambos os plasmídeos pKBBINIS e p35S:BNM3BIN foram transferidos para a cepa C58C1 de Agrobacterium iumefaciens contendo o plasmídeo pMP90 Ti sem braços e usados em experiências de transformação.

Transformação da planta Ecotipo C24 de Arabidopsis thaliana foi usado como o recipiente em experiências de transformação. As plantas foram transformadas usando tanto o método de imersão floral descrito em Clough e Bent (1998) ou o método de transformação de raiz descrito em Vergunst et al. (1998).

Plantas de Brassica napus c.v. “Topas” transgênicas foram produzidas por transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens de embriões derivados de microesporos. Embriões derivados de microesporos foram cultivados durante 5 semanas em uma densidade de aproximadamente 1.000 embriões por ml. Culturas noturnas de Agrobacterium foram diluídas 100 vezes em meio B5 contendo 9% de sacarose. Os embriões foram co-cultivados com as bactérias diluídas durante 48 h a 24°C no escuro, com agitação lenta. Os embriões foram então transferidos para meio NLN13 suplementado com 350 mg/1 de cefotaxim e 200 mg/1 de vancomicina durante pelo menos duas semanas no escuro a 25°C.

Os embriões foram germinados em luz fraca a 25°C durante cerca de 2 semanas em meio B5 sólido suplementado com 2% de sacarose, cefotaxim (200 mg/1) e vancomicina (100 mg/1). Hipocótilos bem desenvolvidos de embriões germinados foram isolados e transferidos para meio de germinação novo suplementado com 100 mg/1 de canamicina. Após duas semanas neste meio, explantes foram subcultivados em um meio similar suplementado com canamicina (25 mg/1). Embriões secundários, transgênicos putativos, verdes tomaram-se visíveis após um mês de seleção.

Microscopia Todo o material de planta foi fixado durante a noite a 4°C em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,0 contendo 4% de paraformaldeído. As amostras foram lavadas em tampão fosfato 0,1 M e então desidratadas em uma série de etanol graduada em 100% de etanol. Amostras para Microscopia eletrônica de varredura foram secadas no ponto crítico em C02 líquido (Balzers CPD020) e montadas em porções SEM usando cola de carbono condutora. Amostras foram revestidas com 30 nm de paládio/ ouro usando um revestidor com borrifos Polaron E5100. As amostras foram observadas em um microscópio de elétron de varredura HEOL JSM 5200 com uma voltagem de aceleração de 15 kV. Imagens digitais foram obtidas usando Orion Framegrabber. Amostras para microscopia de luz foram embutidas em Technovit 7100 (Kulzer). As seções foram coloridas durante 10 s em 1% de toluidina azul em 1% de tetraborato de sódio, enxaguadas com água e montadas em Euparal. Imagens digitais foram registradas usando uma câmera Sony 3 CCD.

Experiências de regeneração Sementes de arabidopsis transgênicas e do tipo selvagem foram esterilizadas na superfície, depositadas em placas em meio % MS contendo 20% de sacarose (½ MS-20) e cultivadas a 21°C com as placas inclinadas em um ângulo de 60°. Oito arbustos do tipo selvagem e oito arbustos de cada uma de sete linhagens transgênicas independentes foram coletados 10 dias após germinação e separados na raiz, hipocótilo e explantes de folha. Este material então foi dividido em duas bateladas. Metade dos explantes foram continuamente cultivados em meio B5 contendo 20% de glucose (B5-20). Explantes foram transferidos para meio B5-20 novo a cada duas semanas. Os explantes restantes foram cultivados em B5-20 contendo reguladores de crescimento de plantas a fim de induzir regeneração de brotos (Vergunst et al., 1998). Estes explantes foram primeiro colocados em meio induzindo calo (CIM; relação de auxila para citocinina alta) durante dois dias e então transferidos para meio induzindo brotos 9SIM; relação de citocinina para auxina alta) durante o restante do período de cultura. Os explantes foram transferidos para meio SIM novo a cada duas semanas.

Exemplo 1: Isolamento e caracterização dos genes BNM3 de Brassica napus Uma abordagem de triagem subtrativa foi usada para isolar genes preferencialmente expressados durante a indução de embriogênese de microesporos de Brassica napus c.v. Topas (figura 1). Dois tipos de culturas de microesporo foram usados na construção de uma sonda subtraída: embriogênicas e não embriogênicas. Culturas embriogênicas foram obtidas submetendo microesporos uninucleados tardios e pólen binucleado prematuro no dia 4, tratamento de estresse com calor a 32°C. Uma amostra não embriogênica foi obtida cultivando a mesma população de partida de microesporos uninucleados tardios e pólen binucleado prematuro durante 1 dia a 25°C seguido por 3 dias a 32°C (Pechan et al., 1991). mRNA poli (A) foi isolado da amostra embriogênica e usado para sintetizar cDNA de primeiro filamento. O cDNA foi então hibridizado em um excesso de RNA poli (A)+ isolado de uma amostra de pólen/ microesporo não embriogênico. O cDNA de filamento único, não hibridizante, enriquecido de sequências presentes na amostra embriogênica, mas ausente ou presente em um nível muito menor na amostra não embriogênica, foi recuperado, rotulado radioativamente e usado como uma sonda subtraída para triar uma biblioteca de cDNA derivada da amostra embriogênica descrita acima. Placas hibridizando na sonda subtraída, mas não em uma sonda derivada da amostra não embriogênica, foram selecionadas e submetidas a dois ciclos subsequentes de triagem diferencial. Verificou-se que sete clones de cDNA independentes, compreendendo seis sequências de DNA único foram expressados diferencialmente entre as amostras embriogênicas e não embriogênicas. Um destes clones, 42A1, renomeado BNM3A tardios (para embrião de microesporos de Brassica napus), foi ainda caracterizado.

Exemplo 2-1: Os genes BNM3 codificam novos membros da classe de domínio AP2 de ativadores transcricionais Um clone de cDNA de BNM3 único foi isolado após triar uma biblioteca de cDNA de microesporos embriogênicos com uma sonda subtraída enriquecida para genes expressados em microesporos embriogênicos e pólen. A discrepância entre o tamanho do clone de cDNA (1,2 kb) e o tamanho do transcrito detectado em blots de gel de RNA (2,2 kb) indicou que este clone não representa um cDNA de comprimento completo. Dois clones de cDNA mais longos, correspondendo ao cDNA de comprimento completo do clone isolado originalmente, BNM3A (SEQ ID NO: 1), e um novo clone, BNM3B (SEQ ID NO: 3), foram isolados de uma biblioteca de cDNA de embriões de microesporos de Brassica napus de 10 dias de idade. 0 alinhamento da sequência de DNA destes clones é mostrado na figura 2. Os dois clones de cDNA de BNM3 são 2011 e 1992 nt de comprimento, e são 97% similares ao nível de nucleotídeo, diferindo somente levemente no comprimento e sequência de suas regiões 5’ e 3’ não traduzidas. Ambos os cDNAs codificam potencialmente 579 polipeptídeos de aminoácidos (massa molecular prevista de 63,9 kDa, PI de 5,7) que são 97% similares ao nível de aminoácidos (figura 3). A complexidade genômica dos genes BNM3 foi determinada por hibridização dos cDNAs de BNM3 em blots de gel contendo DNA genômico de B. napus (figura 4). Os cDNAs de BNM3 hibridizam em dois fragmentos de DNA em condições de alta estringência. Os dois fragmentos hibridizantes representam os dois genes BNM3, BNM3A e BNM3B. B. napus é uma espécie anfidiplóide derivada da hibridização dos genomas de B. rapa e B. oleracea, assim as duas sequências de BNM3 são provavelmente derivadas de um local de cópia única em cada um dos progenitores diplóides parentais.

Pesquisa das bases de dados das sequências indicou que os produtos da tradução de BNM3 contêm duas cópias de um domínio AP2 (figura 3). O domínio AP2 foi primeiro identificado em APETALA2 (AP2), uma proteína de arabidopsis que regula a identidade do meristema, especificação de órgãos florais, desenvolvimento da capas de sementes e expressão de genes homeóticos florais (Jofuku et al., 1994; WO 98/07842), e foi desde então identificado em uma ampla faixa de proteínas com diversas funções. Estas funções estão na faixa de ativação de genes envolvidos em estresse (Zhou, 1997; Stockinger, 1997) e resposta de etileno (Ohme-Takagi, 1995) na regulação do desenvolvimento de folha, floral e óvulo (Moose, 1996; Jofuku, 1994; Elliot, 1996; Klucher, 1996). O domínio AP2 é um motivo repetido de aminoácido 56-68 contendo pelo menos duas regiões conservadas: um elemento YRG altamente básico, contendo um motivo de aminoácido YRG e o elemento RAYD. O elemento RAYD contém um núcleo central conservado de 18 aminoácidos que é previsto para formar uma a-hélice anfífática, uma estrutura considerada para mediar interações proteína-proteína. A capacidade de um número de proteínas contendo domínio AP2 ligar DNA, copulada com a presença de sinais de localização nuclear putativos e regiões acídicas que podem funcionar como ativadores transcricionais sugere que estas proteínas fimcionem como fatores de transcrição.

Duas classes filogeneticamente distintas de proteínas de domínio AP2, consistindo tanto de um domínio AP2 (semelhante a EREBP) ou dois domínios AP2 conectados por uma região ligadora (semelhante a AP2), são identificadas (Zhou, 1997). BNM3 pertence à última classe. Pesquisa de bases de dados com a região correspondendo aos dois domínios AP2 e região ligadora de BNM3 revela que BNM3 é mais similar à arabidopsis AINTEGUMENTA (ANT; Elliot, 1996; Klucher, 1996) e a proteína contendo o domínio AP2 ZMMHCF1 de Zhea mays. (ZM; Daniell, 1996) Figura 5 mostra um alinhamento dos dois domínios AP2 de BNM3 com os de outras proteínas que contêm dois domínios AP2. BNM3 compartilha 85% de similaridade de sequências de aminoácidos com ANT e 88% com ZMMHCF1 nesta região, mas somente 66% de similaridade de aminoácidos com AP2 e GLOSSY15 nesta região. Uma inserção de 10 aminoácidos no primeiro domínio AP2 das proteínas BNM3 distingue ainda estas três proteínas de outras proteínas contendo domínio AP2 (Elliot, 1996). As proteínas BNM3, AINTEGUMENTA e ZMMHCF1 também compartilham um motivo de aminoácido hidrófobo pequeno, LG/ SFSLS, em suas regiões terminais amino, mas de outro modo mostram nenhuma similaridade significativa em suas sequências de DNA ou de aminoácidos no exterior dos domínios AP2 e ligador. Estes resultados indicam que as sequências de BNM3 codificam membros únicos da família do domínio AP2 de proteínas.

Um alinhamento em pares de cDNA de BNM3B e aminoácido, sequências com sequências ANT ou ZMMHCF-1 indicaram que para a sequência de nucleotídeos de BNM3B: há 56% de identidade com cDNA de ANT (sobre os 1905 nucleotídeos de ANT) e uma identidade de 58% com cDNA de ZMMHCF1 (sobre a sequência de 1773 nucleotídeos de ZM); e para sequência de aminoácidos de BNM3B: há uma identidade de 41% da proteína BNM3 com proteína ANT (sobre a sequência de 555 aminoácidos de ANT), e uma identidade de 46% com a proteína ZMMHCF1 (sobre a sequência de 485 aminoácidos de ZM).

Exemplo 2-2: Os genes BNM3 de Brassica napus são representados por um ortólogo de Arabidopsis thaliana único Análise blot de gel de DNA genômico de arabidopsis hibridizado em um número de sondas de cDNA de BNM3A de Brassica napus (SEQ ID NO: 1) em condições de estringência baixa a moderada indicou a presença de um homólogo único dos genes BNM3A de Brassica napus no genoma de arabidopsis. Um RFLP também foi identificado entre ecotipos Columbia e Landsberg erecta usando a endonuclease de restrição de Cfo I. Este RFLP foi usado para mapear a posição do homólogo de BNM3 único no genoma de arabidopsis em aproximadamente 34 cM no cromossoma 5 (Lister e Dean 1993).

Triagem de três equivalentes genômicos de uma biblioteca genômica de arabidopsis identificou três clones lambda contendo o homólogo de BNM3 de arabidopsis de comprimento completo putativo (AtBBM). Análise da sequência de três clones de AtBBM indicou que eles são idênticos (SEQ ID NO: 6). Figuras 9A e B mostram respectivamente o padrão de fragmento de restrição dos clones genômicos de arabidopsis isolados e o padrão de fragmentos de restrição obtidos após hibridização de DNA genômico de arabidopsis com a sonda de cDNA de BNM3A de Brassica. A comparação das duas figuras indica que os clones genômicos de AtBBM de arabidopsis e o homólogo identificado através de análise blot de gel de DNA usando uma sonda heteróloga são os mesmos. Análise da sequência da região transpondo os dois domínios AP2 e a região ligadora estendendo-se entre os dois domínios AP2 é aproximadamente 85%. Nenhuma destas duas sequências de proteína mostra similaridade significativa em AtBBM no exterior da região do domínio AP2 da proteína.

Exemplo 3: Os genes BNM3 são preferencialmente expressados no desenvolvimento de embriões Análise blot de gel de DNA (figura 6) foi usada para determinar o padrão de expressão do gene BNM3 durante desenvolvimento de embriões derivados de microesporos, referido desenvolvimento, e em tecidos não semente. Ambas as análises indicam que os genes BNM3 são preferencialmente expressados em embriões em desenvolvimento.

Análise blot de gel de RNA indica que mRNAs de BNM3 são detectados em culturas de microesporos para sofrer embriogênese, bem como nos estágios globulares, de coração, torpedo e cotiledôneo do desenvolvimento de embriões derivados de microesporos (figura 6A). mRNAs de BNM3 não são detectados em culturas de microesporos não embriogênicos, em pólen e microesporos isolados recentemente, ou em microesporos e pólen continuando desenvolvimento gametofítico em cultura (figura 6A). Análise blot de gel de RNA de sementes em desenvolvimento mostra que expressão de BNM3 é primeiro detectada 14 dias após polinização (14 DAP), correspondendo ao estágio de coração do desenvolvimento de embriões. Expressão de BNM3 aumenta durante os estágios prematuro (21 DAP) e meio- cotiledôneo (28 DAP) do desenvolvimento de embriões e permanece constante depois (figura 6B). Transcritos de BNM3 não foram detectados em qualquer um dos tecidos não semente, refletindo o nível baixo ou ausência de transcritos nestes tecidos.

Exemplo 4: Expressão de BNM3 em tecidos vegetativos promove formação de embriões assexuados A fim de determinar a função de proteínas de BNM3 de Brassica napus, os cDNAs de BNM3 foram colocados sob o controle de duas construções separadas de promotor constitutivo, uma construção de promotor de POLYUBIQUITIN de girassol modificada (referida a seguir como UBI: BNM3) e uma construção de promotor 35S melhorada em duplicata contendo um melhorador translacional AMV (referida a seguir como 35S:BNM3), e introduzidos em Arabidopsis. A análise do fenótipo dos transformantes indica que a superexpressão ectópica dos cDNAs de BNM3 promove a formação de embriões somáticos em estruturas vegetativas tais como cotilédones, pecíolos, lâminas foliares e o meristema apical de broto (Figura 7). A frequência de transformantes que produzem embriões ectópicos, assim como a penetrância do fenótipo de embrião ectópico, foi maior quando o gene BNM3 foi expresso sob controle do promotor 35S melhorado-melhorador translacional AMV duplicado, quando comparado ao promotor POLYUBIQUITIN. Assim, um alto nível de limiar de produto proteico é requerido para aumentar a frequência e a penetrância do fenótipo do embrião ectópico.

Os embriões ectópicos derivados de BNM3 contêm todos os sistemas de órgãos e camadas de tecidos encontrados no embrião zigótico em desenvolvimento. Os embriões ectópicos derivados de BNM3 são bipolares (Figuras 7D e E) e consistem em um eixo, composto de regiões de hipocótilo e radícula, meristemas de broto e de raiz, e cotilédones (Figura 7E). Além disto, cada sistema de órgão contém o arranjo radial característico de três camadas de tecidos especializados (epiderme, parênquima de chão e tecido provascular) encontradas em embriões zigóticos (Figura 7E). A expressão continuada do gene BNM3 no embrião ectópico em desenvolvimento resulta em uma reiteração do processo de formação de embrião, com o resultado de que novos embriões são continuamente formados na superfície dos embriões pré-existentes (Figura 7D e E). Estes resultados provêm evidência conclusiva de que a expressão de um único gene, BNM3, é suficiente para iniciar uma cascata de transdução de sinal que leva à formação de embriões assexuadamente derivados completamente diferenciados.

Exemplo 5: Expressão de BNM3 aumenta a capacidade de regeneração de tecidos vegetais Nós examinamos os efeitos da expressão do gene BNM3 sobre a habilidade de plantas de Arabidopsis de regenerar brotos in vitro na presença ou na ausência da adição de reguladores de crescimento. Explantes de folha, raiz e hipocótilo de plântulas de 10 dias de idade de Arabidopsis do tipo selvagem e de linhagens de Arabidopsis transgênicas que expressam o BNM3 sob controle do promotor de POLYUBIQUITIN foram colocados em meios contendo reguladores de crescimento para primeiro induzir formação de calo e então organogênese de brotos. Explantes de raiz de linhagens transgênicas mostram pelo menos um aumento de 5 vezes na regeneração de brotos na presença de hormônios como comparado a explantes de raiz do tipo selvagem (figura 8A). Estes brotos também desenvolveram-se mais rápido nos explantes transgênicos como comparado ao tipo selvagem. Explantes de hipocótilo e folhas do tipo selvagem responderam produzindo calo na extremidade de corte do petíolo (figura 8B). Em contraste, explantes de linhagens transgênicas produziram imediatamente novos brotos (figura 8B) ou raízes da extremidade de corte do petíolo. Explantes transgênicos que produziram imediatamente raízes eventualmente também produziram brotos.

Explantes transgênicos também foram capazes de regenerar na ausência de reguladores de crescimento adicionados. Explantes de hipocótilo e de folhas do tipo selvagem colocados em meio desprovido de reguladores de crescimento produziram calo ou raízes na extremidade de corte do petíolo de folhas, no entanto brotos não se regeneram destas estruturas (figura 8C, D). Raízes do tipo selvagem tornaram-se verdes e formaram estruturas semelhantes a nódulos espessadas na junção com raízes tardias, mas não se desenvolveram ainda. Em contraste, explantes transgênicos colocados em meios desprovidos de reguladores de crescimento regeneraram raízes tanto da extremidade de corte de explantes de hipocótio e de folhas como das estruturas semelhantes a nódulos de explantes de raiz (figura 8C, D).

Todas as citações são incorporadas aqui por referência. A presente invenção foi descrita com respeito a formas de realização preferidas. No entanto, será óbvio aos versados na arte que um número de variações e modificações pode ser feito sem sair do escopo da invenção como descrito aqui.

REFERÊNCIAS

Anderson, N.L. e Anderson, N.G. (1998). Proteome and proteomics, new technologies, new concepts and new words. Electrophoresis, 19, 1853- 1861.

Angenent, G.C., Franken, 1, Busscher, M., van Dijken, A., van Went, J.L., Dons, H.J.M. e van Tunen, A.J. (1995). A novel class of MADS box genes involved in ovule development in Petunia. Plant Cell 7, 1569-1582.

Aoyama, T. and Chua, N.H. (1997). A glucocorticoid-mediated transcriptional induction. system in transgenic plants. Plant J. 2, 397-404., Baszczynski, C.L., e Fallis, L. (1990). Isolation and nucleotide sequence of a genomic clone encoding a new Brassica napus napín gene. Plant Mol. Biol. 14, 633- 635.

Binet, M.N., Lepetit, M., Weil, J.H. e Tessier, L.H. (1991). Analysis of a sunflower polyubiquitin promoter by transient expression. Plant Sei. 79, 87-94.

Boutilier, K.A., Gines, M.J., Demoor, J.M., Huang, B., Baszczynski, C.L., Iyer, V.N. e Miki, B.L. (1994). Expression of the BnmNAP subfamily of napin genes coincides with the induetion of Brassica microspore embryogenesis. Plant Mol. Biol. 26, 1711-1723.

Brandstatter, I e Kieber, J.J. (1998). Two genes with similarity to bacterial response regulators are rapidly and specifically induced by cytokinin in. Arabidopsis. Plant Cell 10, 1009-1019.

Caddick, M.X., Greenland, A.J., Jepson, I., Krause, K.P., Qu, N., Riddell, K.V., Salter, M.G., Schuch, W., Sonnewald, U., e Tomsett, A.B. (1998). An ethanol inducible gene switch for plants used to manipulate carbon metabolism. Nature Biotech. 16, 177-180.

Chaudury, A.M., Letham, D.S., Craig, S. and. Dennis, E. S. (1993). amp- 1 -a mutant with higher cytokinin leveis and ãltered embryonic pattem, faster vegetative growth, constitutive photomorphogenesis and precocious flowering. Plant J. 4, 907-916.

DeBlock, M. DeBrower, D. and Tenning, P. (1989). Transformation of Brassica napus and Brasica. oleracea using Agrobacterium tumefáciens and the expression of the bar and neo genes in the transgenic plants. Plant Physiol. 91: 694-701.

Dellaert, L.M. W. (198 1) Comparison of X-ray and fast neutron-induced mutant spectra. Experiments in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Arabidopsis Inf Ser., 18, 16-36.

Doan, D. N. P., Linnestad, C., and Olsen, 0.-A. (1996). Isolation of molecular markers from the barley endosperm coenoeyte and the surrounding nucellus cell layers. Plant Mol. Biol. 31: 877-886.

Elliot, R.C., Betzner, A.S., Huttner, E., Oakes, M.P., Tuclcer, W.Q.J., Gerentes, D., Perez, P. and Smyth, D.R. (1996). AINTEGUMENTA, an APETALA2-like gene of arabidopsis with pleiotropic roles in ovule development and floral organ growth. Plant Cell 8, 155-168.

Federoff, N., Furtek, D., e Nelson 0. (1984). Cloning of the bronze locus in maize by a simple and general procedure using the transposable controlling element Ac. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81, 3825-3829.

Feldman, K.A., Marks, M.D., Christianson, M.L., e Quatrano, R.S. (1989). A dwarf mutant Arabidopsis generated by T-DNA insertion mutagenesis. Science 243, 135 1 - 1354.

Fobert, P.R., Miki, B.L., e Iyer, V.N. (1991). Detection of gene regulatory signals in plants revealed by T-DNA-mediated fusions. Plant Mol. Biol. 17, 837-85 1.

Gatz, C. (1997). Chemical control of gene expression. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 89-108.

Gatz, C. e Lenk, I.R.P. (1998). Promoters that respond to Chemical inducers. Trends Plant Sei. 3, 352-358.

Guerche, P., Tire, C., Grossi De Sa, F., De Clercq, A., Van Montagu, M. e Krebbers, E. (1990). Differential expression of the Arabidopsis 2S albumin genes and the effect of increasing gene family size. Plant Cell 2, 469-478.

Gustavsson, RO., Ellerstrom, M., Stulberg, K., Ezeurra, I., Koman, A., Hoglund, A., Rask, L. e Josefsson, L.-G. (199 1). Distinct sequence elements in a napin promoter interact in vitro with DNA-binding proteins from Brassica.napus. Physiol. Plant 82, 205-212.

Haseloff, J. and Amos, B. (1995). GFP in plants. Trends Genet. 11,328-329.

Jefférson, R.A e Bicknell, R. (1996). The potential impacts of apomixis: a molecular geneties approach. In The Impact of Plant Molecular Genetics, B.W.S. Sobral, ed (Boston: Birkhanser), pp. 87-101.

Jeflérson, R.A., Kavanagh, T.A. e Be van, M.W. (1987). GUS fusions: glucuronidase as a sensitive and versalite gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3907.

Jofuku, K.D., den Boer, B.G.W., van Montagu/M. e Okamuro, J.K. (1994). Control of Arabidopsis flower and seed development by the homeotic gene APETALA2. Plant Cell 6, 1211-1225.

Kakamoto, T. (1996). CK17, a histidine kinase homolog implicated in cytokinin signal transduction. Science 274, 982-985.

Keller, W.A., Fan, Z., Pechan, P.,Long, N.,Grainger, J. (1987). An efficient method for culture of isolated microspores of Brassica napus. Proceedings of the 7th International Rapeseed Congress. Poznan, Poland. Vol. I, 152-157.

Klein, T.M., Wolf, E.D., Wu, R. and Sanford, J.C. (1987). High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature 327,70-73 Klimyuk, V.I. and Jones, J.D.G. (1997). AtDMC 1, the Arabidopsis homologue of the yeast DMC 1 gene: characterization, transposon-induced allelic variation and meiosis- associated expression. Plant J. 11, 1- 14.

Klucher, K.M., Chow, H., Reiser, L. and Fischer, R.L. (1996). The AINTEGUMENTA gene of Arabidopsis required for ovule and female gametophyte development is related to the floral homeotic gene APETALA2. Plant Cell 8, 137- 153.

Koltunow, A.M., Bicknell, R.A. e Chaudhury, A.M. (1995). Apomixis: molecular strategies for the generation. of geneticaily identical seeds without fertilization. Plant Physiol. 108,1345-1352.

Koltunow, A.M. (199-3 )). Apomixis: embryo sacs and embryos formed without meiosis or fertilization in ovules. Plant Cell 5, 1425-1437.

Korneef, M., Hanhart, C.J. and Thiel, F. (1989). A genetic and phenotypic description of eceriferam (cer) mutants in Arabidopsis thaliana. J. Hered. 80, 118-122.

Lander, E. S., Green, P., Abrahamson, L, Barlow, A., Day, M. J, Lincoln, S. E., e Newber, L. (1987). Mapmaker: an Interactive Computer package for constructing primary genetic linlcage maps of experimental and natural populations. Genetics 121, 174-181.

Lightner L, e Caspar, T. (1988) Seed Mutagenesis of Arabidopsis. In Arabidopsis Protocols, J.M. Martinez-Zapater and J. Salinas eds (Totowa, USA: Humana Press).

Lipshultz, R.J., Fodor, S.P.A., Gingeras, T.R. e Lockhart, D.J. (1999). High density syrithetic oligonticleotide arrays. Nature Genetics 21, 20-24.

Lister, C., e Dean, C. (1993). Recombinant inbred fines for mapping RFLP and phenotypic markers in Arabidopsis thaliana. Plant, Journal 4, 745-750.

Lotan, T., Ohto, M., Matsudaira. Yee, K., West. M.A.L., Lo, R., Kwong, R.W., Yamagishi, K., Fischer, R.L., Goldberg, R.B. e Harada, J.J. (1998). Arabidopsis LEAFY COTYLEDON I is stífficient to induce embryo development in vegetative cells. Cell 93, 1195-1205.

Meijer, A.H., Ouwerkerk, P.B.F. and. Hoge, J.H.C. (1998). Vectors for transcription fáctor cloning and target site, Identification by means of genetic selection in yeast. Yeast 14,1407-1415.

Moose, S.P. and. Sisco, P.H. (1996). Glossy 15, an APETALA2-like gene, from maize that regulates leaf epidermal cell identity. Genes Dev. 10, 3018-3027.

Mordhorst, A.P., Toonen, M.A.J. e de Yries, S.C. (1997). Plant. embryogenesis. Crit. Rev. Plant Scí. 16, 535-576.

Mordhorst, A.P., Voerman, K.J., Hartog, M.V., Meijer, E.A., van Went, J, Koomneef, M., e de Yries, S.C. (1998). Somatic embryogenesis in Arabidopsis thaliana is facilitated by mutations in genes repressing meristematic cell divisions. Genetics 149, 549-563.

Ogas, J, Cheng, J.-C., Sung, R.Z. e Somerville, C. (1997). Cellular differentiation regulated by gibberellin in the Arabidopsis thaliana pickle mutant. Science 277, 91-94.

Ohme-Takagi, M. and Shinshi, H. (1995). Ethylene-inducible DNA binding proteins that interact with an ethylene responsive element. Plant Cell 7, 173-182.

Oldenhof, M.T., de Groot, P.F.M., Visser, J.H., Schrauwen, J.A.M. e Wullems, GJ (1996). Isolation and characterization of a microspore-specific gene from tobacco. Plant Mol. Biol. 31, 213-225.

Ouellet, T., Rutledge, R.G. e Miki, B.L. (1992). Members of the acetohydroxyacid synthase multigene family of Brassica napus have divergent patterns of expression. Plant J. 2, 321-330.

Ow, D.W., Jacobs, J.D. e Howell, S.H. (1987). Functional regions of the cauliflower mosaic viras 35S RNA promoter determined by use of the firefly luciferase gene as a repórter for promoter activity. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84, 4870-4874.

Ozias-Akins, P., Lubbers, E.L., Hanna, W.W. e McNay, J.W. (199-3). Transmission of the apomictic mode of reproduetion in Pennisetum: co-inheritance of the trait and molecular markers. Theor. Appi. Genet. 85, 632-638.

Pang, P., Pruitt, R. e Meyerowitz, E. (1988). Molecular cloning, genomic organisation, expression and evolution of the 12S storage protein genes of Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 11, 805-820.

Peacock, W.J., Ming, L., Craig, S., Dennis, E., Chaudury, A.M. (1995). A mutagenesis programme for apomixis genes in Arabidopsis. In Proceedings Symposium on Induced Mutations and Molecular Techniques for Crop Improvement, (Vienna: International Atomic Energy Agency), pp, 117-125 Pechan, P.M., Bartels, D., Brown, D.C.W. e Schell, J. (199 1). Messenger-RNA and protein changes associateci with induction of Brassica microspore embryogenesis. Planta 184, 161-165.

Roberts, M.R., Foster, G.D., Blundell, R.P., Robinson, S.W., Kurnar, A., Draper, J. e Scott, R. (1993). Gametophytic and sporophytic expression of an anther-specific Arabidopsis thaliana gene. Plant J. 3, 111-120.

Rounsley, S.D., Ditta, G.S. e Yanoisky, M.F. (1995). Diverse roles for MADS box genes in Arabidopsis development. Plant Cell 7, 1259-1269.

Salter, M.G., Paine, J.A., Riddell, K.V., Jepson, I., Greenland, A.J., Cacidick, M.X., Tomsett, A.B. (1998). Characterisation of the ethanol-inducible ale gene expression system for transgenic plants. Plant Journal 16, 127-132.

Sambrook, J., Fritsch, E.F. e Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition. (Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Schmidt, E.D.L., Guzzo, F., Toonen, M.A.J. e de Vries, S.C. (1997). A leucine-rich repeat containing receptor-like kinase marks somatic plant cells competent to form embryos. Development. 124, 2049-2062.

Shure, M., Wessler, S., e Fedoroff, N. Molecular Identification and isolation of the Waxy locus in maize. Cell. 1983 Nov; 35,225-33.

Stockinger, E.J., Gilmour, S.J. e Thomashow, M.F. (1997). Arabidopsis thaliana CBF 1 encodes an AP2 domain-containing transcriptional activator that binds to the C- repeat/DRE, a cis-actíng DNA regulatory element that stimulates transcription in response to low temperature and water déficit. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94, 1035- 1040.

Taylor, R.L. (1967). The foliar embiyos of Malaxis paludosa.

Can. J. Bot. 45, 1553- 1556.

Taylor, N. G., Scheible, W. R., Cutier, S., Somervil le, C. R., e Turrier, S. R. (.1999 The irregular xylem3 locus of arabidopsis encodes a cellulose synthase required. for secondary cell wall synthesis. Plant cell 11, 769-779.

Treacy, B.K., Hattori, L, Prud'homme, I., Barbour, E., Boutilier, K., Baszczynski, C.L., Huang, B., Johnson, D.A. e Miki, B.L. (1997). Brun 1, a Brassica pollen- specific gene. Plant Mol. Biol. 34, 603-611.

Twell, D., Wing, R., Yamaguchi, J. e McCormick, S. (1989). Isolation and expression of an anther-specific gene from tomato. Mol. Gen. Genet. 217, 240-245.

Ulmasov, T., Murfett, J., Hagen, G. and. Guilfoyle, T. (1997). Aux/IAA proteins repress expression of repórter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements. Plant Cell 9, 196-31- 197 1. van Engelen, F.A., Moithoff, J.W., Conner, M., Nap, J.P., Pereira, A. e Stiekema, W.J. (1995). pBINPLUS: an improved plant transformation vector based on pBIN 19. Transgenic Res, 4, 288-290.

Yergunst, A.C., de Waal, E.C. e Hooykaas, P.M. (1998). Root transformation by Agrobacterium tumefaciens. In Arabidopsis Protocols, J.M. Martinez-Zapater and. J. Salinas, eds (Totowa, USA: Humana Press).

Xu,D.,McElroy,D.,Thomburg,R.W.eWu, R . .C.S.(1993).

Systemicinductionof a potato pin2 promoter by wounding, methyl jasmonate, and abscisic acid in transgenic rice plants.Plant Mol. Biol. 22, 573-588.

Xu, H., Knox, R.B., Taylor, P.E. e Singh, M.B. (1995). Bcp 1, a gene required for male fertility in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92.2106-2110.

Yarbrough, J.A. (193) 2). Anatomical and developmental studies of the foliar embryos of Bryophyllum calicyinum. Amer. J. Bot. 19, 443-453.

Yeung, E.C. (1995). Structural and developmental patterns in somatic embryogenesis In In Vitro Embryogenesis in Plants, T.A. Thorpe, ed (Dordrecht: Kluwer Academic Publishers), pp. 205-247.

Zarsky, V., Garrido, D., Eller, N., Tupy, J., Vicente, 0., Schffl, F. e Heberle-Bors, E. (1995). The expression of a small heat shock gene is activated during induction of tobacco pollen embryogenesis by starvation. Plant Cell Environ. 18, 139-147.

Zhou, 1, Tang, X. e Martin, G.B. (1997). The Pto kinase conferring resistance to tomato bacterial speck disease interacts with proteins that bind a cis-element of pathogenesis-related genes. EMBO J. 16, 3207-3218.

Claims (43)

1. Vetor, caracterizado pelo fato de compreender uma molécula de DNA isolada compreendendo uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre o grupo consistindo de SEQ ID NO: 1, 3 e 5 ou um fragmento das mesmas, em que referida molécula de DNA isolada está sob o controle de um elemento regulatório heterólogo que dirige expressão do referido DNA em uma célula de planta.

2. Vetor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que referido elemento regulatório é um elemento regulatório constitutivo.

3. Vetor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que referido elemento regulatório é um elemento regulatório induzível.

4. Vetor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que referido elemento regulatório é um elemento regulatório específico para tecido.

5. Vetor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que referido elemento regulatório é um elemento regulatório ativo de forma de desenvolvimento.

6. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que referida molécula de DNA isolada compreende pelo menos 27 nucleotídeos contíguos de uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre o grupo consistindo de SEQ ID NO: 1, 3 e 5.

7. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de compreende a sequência de nucleotídeos 1620-4873 de SEQ ID NO: 5, ou um fragmento do mesmo.

8. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5„ caracterizada pelo fato de compreender a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou um fragmento do mesmo..

9. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de compreender a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3 ou um fragmento do mesmo.

10. Método para produzir embriões derivados assexualmente, caracterizado pelo fato de compreender: i) transformar uma célula de planta com o vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9; ii) cultivar referida célula de planta para produzir um tecido transformado; iii) selecionar referido tecido transformado para ocorrência de referida molécula de DNA isolada; e iv) testar referida planta transformada para produção de embriões assexual.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a etapa de teste envolve um teste para embrionia adventícia.

12. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a etapa de teste envolve o teste para embriões somáticos.

13. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a etapa de teste envolve o teste para embriões gametofíticos.

14. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a etapa de teste envolve o teste para partenogênese haplóide do saco do embrião.

15. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a etapa de teste envolve o teste para diplosporia.

16. Método para modificar a capacidade regenerativa de uma planta, caracterizado pelo fato de compreender: i) transformar uma célula de planta com o vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9; ii) cultivar referida célula de planta transformada para produzir tecido transformado, e iii) testar referido tecido de planta transformado para melhorada regeneração quando comparado com tecido tipo selvagem.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a etapa de cultivar referida célula de planta transformada, a etapa de testar referido tecido de planta transformado, ou tanto a etapa de cultivar referida célula de planta transformada e a etapa de testar referido tecido de planta transformado são realizadas na ausência de um regulador do crescimento.

18. Método para selecionar uma planta transformada, caracterizado pelo fato de compreender: i) transformar uma planta normalmente não regenerativa com um vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9; e ii) determinar se referida planta transformada é capaz de regenerar sob condições em que referida planta normalmente não regenerativa não regenera.

19. Vetor, caracterizado pelo fato de compreender uma molécula de DNA isolada compreendendo uma sequência de DNA dos nucleotídeos 1-1619 de SEQ ID NO: 5, ou um fragmento do mesmo, ou compreendendo pelo menos 22 nucleotídeos contíguos dentro de nucleotídeos 1-1619 de SEQ ID NO: 5, associada de modo operativo com um gene de interesse, em que referida molécula de DNA isolada direciona a expressão do referido gene de interesse dentro de uma célula de planta.

20. Vetor de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que referido gene de interesse é heterólogo em relação à molécula de DNA isolada.

21. Vetor de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que referido gene de interesse é selecionado dentre o grupo consistindo de proteína farmaceuticamente ativa, anticorpo, enzima industrial, suplemento de proteína, nutracêuticos, proteína de armazenagem, rações animais, e suplemento de ração animal.

22. Método para produzir embriões derivados assexualmente, caracterizado pelo fato de compreender: i) transformar transientemente uma célula de planta com o vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou introduzir na referida célula de planta uma proteína para produzir uma célula de planta modificada, referida proteína sendo codificada por uma molécula de DNA isolada como definida em qualquer uma das reivindicações 1 ou 6 a 9; ii) cultivar referida célula de planta modificada para produzir tecido; e iii) testar referido tecido par formação de embriões assexual.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a etapa de testar envolve o teste para embrionia adventícia.

24. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a etapa de teste envolve o teste para embriões somáticos.

25. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a etapa de teste envolve o teste para embriões gametofíticos.

26. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a etapa de teste envolve o teste para partenogênese de haplóides do saco do embrião.

27. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a etapa de teste envolve o teste para diplosporia.

28. Método para modificar a capacidade regenerativa de uma planta, caracterizado pelo fato de compreender: i) transformar transientemente uma célula de planta com o vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou introduzir, na referida célula de planta, uma proteína para produzir uma célula de planta modificada, referida proteína sendo codificada por uma molécula de DNA como definida em qualquer uma das reivindicações 1 ou 6 a 9; ii) cultivar referida célula de planta modificada para produzir tecido; e iii) testar referido tecido para melhorada regeneração como comparado com tecido de tipo selvagem.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a etapa de cultivar referida célula de planta modificada, a etapa de testar referido tecido, ou ambas, a etapa de cultivar referida célula de planta modificada e a etapa de testar referido tecido são realizadas na ausência de um regulador de crescimento.

30. Método para produzir uma planta apomíctica, caracterizado pelo fato de compreender: i) transformar uma planta com o vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, para produzir uma planta transformada; ii) selecionar referida planta transformada para ocorrência de referida molécula de DNA isolada; e iii) testar referida planta transformada para produção de embriões assexual.

31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a etapa de teste envolve o teste para embrionia adventícia.

32. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a etapa de teste envolve testar embriões somáticos.

33. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de a etapa de teste envolve testar embriões gametofíticos.

34. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a etapa de teste envolve testar a partenogênese do saco do embrião.

35. Método para modificar a capacidade regenerativa de uma planta, caracterizado pelo fato de compreender: i) transformar transientemente uma célula de planta com o vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou introduzir, na referida célula de planta, uma proteína para produzir uma célula de planta modificada, referida proteína sendo codificada por uma molécula de DNA isolada como definida em qualquer uma das reivindicações 1 ou 6 a 9; ii) cultivar referida célula de planta para formar tecido; e iii) testar referido tecido para melhorada regeneração como comparado com um tecido de tipo selvagem.

36. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a etapa de cultivar referida célula de planta, a etapa de testar referido tecido, ou ambas, a etapa de cultivar referida célula de planta e a etapa de testar referido tecido são realizadas na ausência de um regulador de crescimento.

37. Método para selecionar uma planta modificada, caracterizado pelo fato de compreender: i) transformar transientemente uma planta normalmente não regenerativa com um vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou introduzir na referida planta normalmente não regenerativa uma proteína para produzir a referida planta modificada, referida proteína sendo codificada para uma molécula de DNA isolada como definida em qualquer uma das reivindicações 1 ou 6 a 9; e ii) determinar se referida planta modificada é capaz de regenerar sob condições em que referida planta normalmente não regenerativa não germina.

38. Vetor, caracterizado pelo fato de compreender uma molécula de DNA isolada compreendendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 6, ou um fragmento do mesmo, em que referida molécula de DNA isolada está sob o controle de um elemento regulatório heterólogo que dirige expressão de referido DNA em uma célula de planta.

39. Vetor de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que referido elemento regulatório é um elemento regulatório constitutivo.

40. Vetor de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que referido elemento regulatório é um elemento regulatório induzível.

41. Vetor de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que referido elemento regulatório é um elemento regulatório específico para tecido.

42. Vetor de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que referido elemento regulatório é um elemento regulatório ativo de modo em desenvolvimento.

43. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 42, caracterizado pelo fato de compreender a sequência de nucleotídeos 1620-4873 de SEQ ID NO: 6, ou um fragmento do mesmo.