JP2003501093A - 植物胚形成を制御するためのｂｎｍ３転写活性化剤の使用、および再生方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、小胞子胚形成性の誘発中に得られた遺伝子を提供する。この遺伝子によってコードされたたんぱく質は、植物細胞を胚形成性とし、植物細胞の再生能力を増大させる。また、この遺伝子の調節領域、およびその適切な宿主細胞内での興味ある遺伝子の発現を特異化させるための使用も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 (背景技術) 典型的な被子植物の種子は、3つの主要成分である胚、胚乳および母体種子被
覆物からなっている。種子発生は2重受精現象によって始まり、１つの精子細胞
核が卵細胞核と融合して胚を形成し、第2の精子細胞核が2つの中心細胞核と融合
して胚乳を形成する。胚発生自体は、3つの発生期に分けることができる。胚発
生の第１期は、細胞分裂および形態形成の期間であり、成熟植物の主要組織タイ
プと器官系を確立するように働く。第２期は、急速細胞膨張の期間であり、発芽
および早期実生発生期において胚を維持する貯蔵物質の合成に特徴を有する。胚
発生の最終期においては、胚は、乾燥状態となり発育停止または休眠の期間に入
る。上記の事象は、種子が母体植物に付着している間はすべて正常に起こる。

【０００２】 多くの植物種は、受精のないままで胚を産生することが可能である。この無性
胚発生プロセスは、例えば、ブリオフィラム(Bryophyllum) (Yarborough,1923)
およびマラキス(Malaxis) (Taylor,1967)の葉の縁上でまたはアポミクト(単性生
殖)植物の胚珠(Koltunow,1995)内で自然に生ずる。アポミクシス(単性生殖)は、
卵細胞受精なしでの母体胚珠組織からの種子の産生を称する。無性胚発生も、配
偶子性または体性組織から生体外(インビトロ)で誘発させることができ(Mordhor
st et al., 1997)、或いは、最近開示されているように、遺伝子発現の遺伝子変
性によって誘発できる(Ogas et al., 1997；Lotan et al., 1998)。 アポミクシス、ジプロスポリー(diplospory、倍数生殖)、アポスポリー(無子
生殖)および不定胚生殖の3つの主要メカニズムは、観察されている。各メカニズ
ムは、胚を生ずる細胞源に関して、さらにアポミクトプロセスが開始される胚珠
発生の時間長に関して異なる。ジプロスポリーとアポスポリーは、倍数胚嚢の形
成に関連するときのアポミクシスの配偶子形とみなされている。不定胚生殖は、
有糸分裂誘導性胚嚢の産生に関連しない。

【０００３】 ジプロスポリーにおいては、大芽胞母体細胞は、通常の減数分裂を受けず、む
しろ有糸分裂して通常の単数胚嚢の代わりに倍数胚嚢を産生する。胚嚢細胞の1
つは、卵細胞として機能し、単為生殖的に(受精なしで)分裂して胚を形成する。
幾つかの種においては、胚嚢の未退化極核が融合して胚乳(自発胚乳産生)、種子
の栄養組織を形成するが、他の種においては、受粉が胚乳産生には必要である(
偽受精)。 アポスポリーアポミクトにおいては、単為生殖胚は、さらなる細胞、即ち、胚
珠心から分化するアポスポリー始原細胞から産生される。ジポロスポリー種の大
配偶体におけるように、アポスポリー始原細胞は、有糸分裂を受けて、倍数胚嚢
を産生する。アポスポリー胚は、大配偶体からは誘導されず、従って、単一胚珠
内に有性誘導胚と共存する。胚乳の自発産生は、アポスポリー種においては稀で
ある。従って、アポスポリーアポミクトは、胚乳産生のためには、有糸誘導胚嚢
の極性核の受精に依存している。

【０００４】 不定胚生殖においては、胚は、外皮または胚珠心のような胞子体胚珠組織から
単為生殖により直接形成される。不定胚生殖を示す種から誘導された種子は、複
数無性誘導胚を一般に含有し、さらに1個の有性誘導胚も含有し得る。不定胚を
示す植物も、胚乳形成のためには、同じ胚珠内の有糸誘導胚嚢の存在に依存して
いる。 殆どの植物種において、アポミクト特性は、単一の支配因子座の制御下にある
ようである。この因子座は、有性再生植物において、遺伝子発現カスケードを開
始させて胚嚢および/また胚形成に導くように機能するが、アポミクト植物内で
異時的にまたは異所的に発現する転写因子のような1種以上の発生性調節剤をコ
ードし得る(Peacock, 1995；Koltunow, 1993；Koltunow et al., 1995)。

【０００５】 アポミクシスは、アポミクト種子がクローン性後代を生じ、従って、ハイブリ
ッド系を遺伝子的に固定するのに使用できるので、作物改良に当って価値ある特
性を有する。ハイブリッド種子の生産は、遺伝子的に純粋な親系個体群の維持、
別々の花粉供与体および雄性不稔系、並びに系の分離を含むので、労働集約性で
費用高な手順である。アポミクシスによる種子の生産は、一度ハイブリッドが産
生されると、ハイブリッドはクローン的に維持され、それによって別々の親系を
維持し交配させる必要がなくなるので、この問題を回避する。アポミクト種子の
使用は、系を繁殖させるための挿木または組織培養の使用をなくし、栄養繁殖組
織を介して容易に伝播する疾病の拡大を低減し、且つ多くの種において球芽サイ
ズを小さくして輸送および植付けコストを節減するので、栄養繁殖作物のよりコ
スト効率性の繁殖方法も提供する。

【０００６】 アポミクシスは広範囲の植物種において生ずるけれども、作物種は、少数しかア
ポミクト性でない。アポミクト特性を作物種に野生相対物からの遺伝質浸透によ
り導入する試み(Ozias-Akins, et al., 1993；WO 97/10704；WO 97/11167)、ま
たは関連するが発生的に相離(divergent)する有性種間の交配による試み(WO 98/
33374)においては、顕著な生成物は得られていない。他の試みは、アポミクシス
プロセスを特定または操作することのできる遺伝子配列の同定に焦点が当てられ
ているが(WO 97/43427；WO 98/36090)、これらの試みは、アポミクト植物の一般
的生産方法までには至っていない。 アラビドプシス タリアナ(Arabidopsis thaliana) (アラビドプシス)のような
有性再生性植物をアポミクト植物に転換するための変異誘発法も試みられている
(Peacock et al., 1995)。例えば、部分的な胚および/または胚乳形成を受精な
しで低頻度で開始する多くの劣性“受精非依存性種子”(fis)変異体が同定され
ている(Chaudhury et al., 1997)。しかしながら、fisを用いて真の倍数生殖ア
ポミクト種子を得るためには、多くの追加のパラメーターを修正する必要がある
。

【０００７】 無性誘導胚は、多くの配偶体性および体性植物組織から培養で誘発形成させ得
る(Yeung, 1995)。体性胚は、体性組織の培養により、体性組織をオーキシンま
たはオーキシンとシトキニンの組合せのような植物成長調節剤で処理することに
よって得ることができる。胚は、胚珠(雌性生殖)および葯(雄性生殖、花粉また
は小胞子胚形成)の配偶体組織から、植物成長調節剤の添加により或いは単純な
応力処理により、培養で誘発形成させ得る。

【０００８】 生体外(インビトロ)で胚の有効な産生を誘発させるのに使用できる幾つかの変
異体が特定されてきている。これらの変異体としては、改変苗条分裂組織を有す
る劣性アラビドプシス変異体、例えば、プリモージア タイミング(primordial t
iming) (pt)、クラバタ(clavata) (clv)1およびclv3があり、これらは、実生を
オーキシンの存在下に発芽させたときに胚形成性カルス形成を促進させることが
開示されている(Mordhorst et al., 1998)。2種のアラビドプシス遺伝子、リー
フィコチレドン(LEAFYCOTYLEDON) (LEC1；WO 98/37184, Lotan et al., 1998)と
ピックル(pickle)の改変発現は、添加成長調節剤の不存在下に体性胚の産生を促
進させることが開示されている。LEC1遺伝子は、CCAATボックス結合性転写因子(
CBF)のHAP3サブユニットのホモログをコードする。LEC1遺伝子は、乾燥許容性お
よびコチレドン同一性のような接合性胚発生の多くの局面を制御する。lec1変異
体背景においてのLEC1遺伝子の異所性過発現は、葉の上に胚状構造体を時折形成
させる２つのトランスジェニック系の産生を生ずる。これらの胚状構造体は、胚
発生において通常優先的に発現される種子貯蔵たんぱく質および油脂体たんぱく
質をコードするような遺伝子を発現する。劣性変異体ピックル(PICKLE)遺伝子を
含有する植物は、肥大化した1次根分裂細胞を産生する。変異体pickle根は、根
組織が植物残遺から分離させ成長調節剤を含まない最少培地に入れたときに、胚
形成性カルスを産生する(Ogas et al., 1997)。変異体ピックル根は、油脂体の
ような種子発生の形態学的特徴を示し、LEC1過発現におけるように、種子発生に
おいて優先的に発現される遺伝子を蓄積する。

【０００９】 アポミクト種子の効率的な産生は、遺伝子発現カスケードを活性化して有性再
生性植物およびアポミクト植物の両方において胚形成に導くことが知られている
転写因子のような発生調節剤の特定およびその後の修正によって実現されている
だけのようである。本発明は、転写因子であるBNM3またはそのホモログを含有す
る胚発現性AP2ドメインの異所性過発現を特徴とするアポミクト種子の製造方法
を提供することによって、この要求に対処する。 本発明の目的は、従来技術の欠点を克服することである。 上記の目的は、本発明のさらに有利な実施態様を開示している特許請求に範囲
の各特徴を組合せることによって満たされる。

【００１０】 （発明の開示） 本発明は、植物における無性胚形成および再生に関する。さらに詳細には、本
発明は、無性誘導胚の産生方法、および植物の再生能力の促進方法に関する。 本発明によれば、 ・AP2ドメイン繰返し1-リンカー-AP2ドメイン繰返し2領域を含まないSEQ ID N
O：5または6に、中庸または緊縮条件下でハイブリッド化し； ・AP2ドメイン繰返し1-リンカー-AP2ドメイン繰返し2領域を含まないSEQ ID N
O：1または3に、緊縮条件下でハイブリッド化し； ・SEQ ID NO：1、3、5または6の少なくとも27個の連続ヌクレオチドを含み；
または、 ・SEQ ID NO：1、3、5または6によって構成されたヌクレオチド配列と少なく
とも70％の類似性を示す； ヌクレオチド配列を含む分子DNA分子が提供される。

【００１１】 本発明は、さらに、AP2ドメイン繰返し1-リンカー-AP2ドメイン繰返し2領域を
含まないSEQ ID NO：1、3、5または6に、中庸または緊縮条件下でハイブリッド
化し；たんぱく質をコードする核酸配列を含み、このたんぱく質が、植物細胞内
に十分量で存在するとき、その植物細胞を胚形成性とし、その植物細胞の再生能
力を増大させ、またはその植物細胞を胚形成性とし且つその植物細胞の再生能力
を増大させることの両方を行う分離DNA分子に関する。本発明には、AP2ドメイン
繰返し1-リンカー-AP2ドメイン繰返し2領域を含まない、SEQ ID NO：1のヌクレ
オチド1-2014、SEQ ID NO：3のヌクレオチド1-2011、SEQ ID NO：5のヌクレオチ
ド1620-4873またはSEQ ID NO：6のヌクレオチド2036-5035に、中庸または緊縮条
件下でハイブリット化するヌクレオチド配列を含むまさしく上記で定義したよう
な分離DNA分子も属する。また、本発明には、上記で定義したような分離DNA分子
を含み、その分離DNA分子が植物細胞内の上記DNAの発現に特異性である調節要素
の制御下にあるベクターも属する。この調節要素は、構成性、誘導性、組織特異
性または発生的に活性な調節要素であり得る。

【００１２】 本発明は、各々上記で定義したようなベクターを含む形質転換植物細胞、形質
転換植物、または形質転換植物から得られた種子にも関する。 本発明は、AP2ドメイン繰返し1-リンカー-AP2ドメイン繰返し2領域を含まない
SEQ ID NO：1、3、5または6によって構成されたヌクレオチド配列に、中庸また
は緊縮条件下でハイブリッド化する分離DNA分子によってコードされた分離たん
ぱく質に関し、このたんぱく質は、植物細胞内に十分量で存在するとき、その植
物細胞を胚形成性とし、或いはその植物細胞の再生能力を増大させる。また、AP
2ドメイン繰返し1-リンカー-AP2ドメイン繰返し2領域を含まないSEQ ID NO：5の
ヌクレオチド1620-4873またはSEQ ID NO：6のヌクレオチド2026-5035に、中庸ま
たは緊縮条件下でハイブリット化する、或いはSEQ ID NO：1または3内に構成さ
れるようなヌクレオチド配列に、中庸または緊縮条件下でハイブリッド化する分
離DNA分子によってコードされたたんぱく質も包含する。本発明は、SEQ ID NO：
2、SEQ ID NO：4またはSEQ ID NO：7によって構成されるようなたんぱく質をコ
ードする分離DNA分子も包含する。また、本発明は、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：
4またはSEQ ID NO：7のアミノ酸配列との少なくとも70％相同性を含むたんぱく
質にも関し、或いはSEQ ID NO：２において開示される配列の約30〜約541個のア
ミノ酸を含み、またはSEQ ID NO：4において開示される配列の約30〜約561個の
アミノ酸を含む。

【００１３】 また、本発明は、 i) 植物細胞を、AP2ドメイン繰返し1-リンカー-AP2ドメイン繰返し2領域を含
まないSEQ ID NO:1，3、5および6に中庸または緊縮条件下でハイブリッド化し；
植物細胞内に十分量で存在するとき植物細胞を胚形成性にするか或いは植物細胞
の再生能力を増大させるたんぱく質をコードし；またはAP2ドメイン繰返し1-リ
ンカー-AP2ドメイン繰返し2領域を含まないSEQ ID NO：5のヌクレオチド1620-48
73またはSEQ ID NO：6のヌクレオチド2026-5035に、中庸または緊縮条件下でハ
イブリット化するかまたはSEQ ID NO：1または3内に構成されるようなヌクレオ
チド配列に中庸または緊縮条件下にハイブリッド化するヌクレオチド配列を含む
分離DNA分子を含むベクターで形質転換させること； ii) この植物細胞を増殖して形質転換組織を産生させること； iii) この形質転換組織を上記分離DNA分子の出現について選択すること；およ
び、 iv) 上記形質転換植物を無性胚形成についてアッセイすること； を特徴とする無性誘導胚の産生方法にも関する。 本発明は、アッセイ工程(工程iv))が体性胚、配偶体誘導胚、不定胚性、ジプ
ロスポリーまたは胚嚢の単相単為生殖についてアッセイすることを含む上記方法
にも関する。

【００１４】 また、本発明は、i) 植物細胞を、AP2ドメイン繰返し1-リンカー-AP2ドメイン
繰返し2領域を含まない、SEQ ID NO：1のヌクレオチド1-2014、SEQ ID NO：3の
ヌクレオチド1-2011、SEQ ID NO：5のヌクレオチド1620-4873またはSEQ ID NO：
6のヌクレオチド2026-5035に中庸または緊縮条件下でハイブリット化し、さらに
植物細胞内に十分量で存在するとき植物細胞を胚形成性にするか或いは植物の再
生能力を増大させるたんぱく質をコードする分離DNA分子を含むベクターで形質
転換させること； ii) 得られた形質転換組織を上記分離DNA分子の出現について選択すること；
および、 iii) 上記形質転換植物を無性胚形成についてアッセイすること； を特徴とするアポミクト植物の生産方法も包含する。 本発明は、アッセイ工程(工程iii))が無性誘導胚、体性胚、配偶体誘導胚、不
定胚性、ジプロスポリーまたは胚嚢の単相単為生殖についてアッセイすることを
含む上記方法にも関する。

【００１５】 また、本発明は、i) 植物細胞を、AP2ドメイン繰返し1-リンカー-AP2ドメイン
繰返し2領域を含まない、SEQ ID NO：1のヌクレオチド1-2014、SEQ ID NO：3の
ヌクレオチド1-2011、SEQ ID NO：5のヌクレオチド1620-4873またはSEQ ID NO：
6のヌクレオチド2026-5035に中庸または緊縮条件下でハイブリット化し、さらに
植物細胞内に十分量で存在するとき植物細胞を胚形成性にするか或いは植物の再
生能力を増大させるたんぱく質をコードする分離DNA分子を含むベクターで一時
的に形質転換させること； ii) 得られた一時的に形質転換した組織を増殖させて一時的に形質転換した組
織を産生させること；および、 iii) 上記一時的に形質転換した植物を無性胚形成についてアッセイすること
； を特徴とする植物の無性誘導胚の産生方法にも関する。 本発明は、アッセイ工程(工程iii))が無性誘導胚、体性胚、配偶体誘導胚、不
定胚性、ジプロスポリーまたは胚嚢の単相単為生殖についてアッセイすることを
含む上記方法にも関する。

【００１６】 また、本発明は、i) 植物細胞を、SEQ ID NO：5またはSEQ ID NO：6に中庸ま
たは緊縮条件下でハイブリッド化し且つ植物細胞内に十分量で存在するとき植物
細胞を胚形成性にするか或いは植物の再生能力を増大させるたんぱく質をコード
し；或いはAP2ドメイン繰返し1-リンカー-AP2ドメイン繰返し2領域を含まないSE
Q ID NO：5のヌクレオチド1620-4873またはSEQ ID NO：6のヌクレオチド2026-50
35に、中庸または緊縮条件下でハイブリット化するか、またはSEQ ID NO：1のヌ
クレオチド1-2014またはSEQ ID NO：3のヌクレオチド1-2011内に構成されるよう
なヌクレオチド配列に緊縮条件下にハイブリッド化するヌクレオチド配列を含む
分離DNA分子を含むベクターで形質転換させること； ii) 得られた形質転換植物細胞を増殖させて形質転換組織を産生させること；
および、 iii) 上記形質転換組織を、野生タイプの組織と比較したときの改善された再
生についてアッセイすること； を特徴とする植物の再生能力の改変方法も提供する。 本発明は、工程iii)が成長調節剤の不存在下でアッセイすること含む上記方法
も包含する。

【００１７】 また、本発明は、i) 植物細胞を、SEQ ID NO：5またはSEQ ID NO：6に中庸ま
たは緊縮条件下でハイブリッド化し且つ植物細胞内に十分量で存在するとき植物
細胞を胚形成性にするか或いは植物の再生能力を増大させるたんぱく質をコード
し；或いはAP2ドメイン繰返し1-リンカー-AP2ドメイン繰返し2領域を含まないSE
Q ID NO：5のヌクレオチド1620-4873またはSEQ ID NO：6のヌクレオチド2026-50
35に、中庸または緊縮条件下でハイブリット化するか、またはSEQ ID NO：1また
は3内に構成されるようなヌクレオチド配列に緊縮条件下でハイブリッド化する
ヌクレオチド配列を含む分離DNA分子を含むベクターで一時的に形質転換させる
こと； ii) 得られた一時的に形質転換した植物細胞を増殖させて一時的に形質転換し
た組織を産生させること；および、 iii) 上記形質転換組織を、野生タイプの組織と比較したときの改善された再
生についてアッセイすること； を特徴とする植物の再生能力の改変方法にも関する。 本発明は、工程iii)が成長調節剤の不存在下でアッセイすることを含む上記方
法も包含する。

【００１８】 また、本発明は、i) 通常は非再生性の植物を、SEQ ID NO：5またはSEQ ID NO
：6に中庸または緊縮条件下でハイブリッド化し且つ植物細胞内に十分量で存在
するとき植物細胞を胚形成性にするか或いは植物細胞の再生能力を増大させるた
んぱく質をコードし；或いはAP2ドメイン繰返し1-リンカー-AP2ドメイン繰返し2
領域を含まないSEQ ID NO：5のヌクレオチド1620-4873またはSEQ ID NO：6のヌ
クレオチド2026-5035に、中庸または緊縮条件下でハイブリット化するか、また
はSEQ ID NO：1または3内に構成されるようなヌクレオチド配列に緊縮条件下に
ハイブリッド化するヌクレオチド配列を含む分離DNA分子を含むベクターで形質
転換させること；および、 ii) 上記形質転換植物が、上記通常は非再生性の植物が再生しない条件下で再
生し得るかどうかを決定すること； を特徴とする形質転換植物の選択方法にも関する。

【００１９】 また、本発明は、SEQ ID NO：5のヌクレオチド1-1619またはSEQ ID NO：6のヌ
クレオチド1-2025を少なくとも約70％の類似性を示し、或いはSEQ ID NO：5のヌ
クレオチド1-1619またはSEQ ID NO：6のヌクレオチド1-2025内の少なくとも22個
の連続ヌクレオチドを含む分離DNA分子にも関する。また、本発明の範囲には、
興味ある遺伝子と操作的に会合させたまさしく上記したような分離DNA分子を含
み、その分離DNA分子が植物細胞内の上記興味ある遺伝子の発現に特異的である
ベクターも属する。この興味ある遺伝子は、分離DNA分子に対して非相同性であ
り得る。この興味ある遺伝子は、製薬的に活性なたんぱく質、抗体、工業酵素、
たんぱく質補充物、栄養補助食品(nutraceutical)、貯蔵たんぱく質、動物飼料
および動物飼料補充物からなる群から選ばれ得る。本発明は、上記で定義したベ
クターを含む形質転換植物細胞、形質転換植物、または形質転換植物から得られ
た種子も包含する。 さらにまた、本発明は、植物を、SEQ ID NO：5のヌクレオチド1-1619またはSE
Q ID NO：6のヌクレオチド1-2025を少なくとも約70％の類似性を示し、或いはSE
Q ID NO：5のヌクレオチド1-1619またはSEQ ID NO：6のヌクレオチド1-2025内の
少なくとも22個の連続ヌクレオチドを含む分離DNA分子を含有するベクターで形
質転換させることを含む植物の発生性胚内の興味ある遺伝子の発現を特異化する
方法も包含する。

【００２０】 また、本発明は、i) 植物を、SEQ ID NO：5またはSEQ ID NO：6に中庸または
緊縮条件下でハイブリッド化し且つ植物細胞内に十分量で存在するとき植物細胞
を胚形成性にするか或いは植物細胞の再生能力を増大させるたんぱく質をコード
し；或いはAP2ドメイン繰返し1-リンカー-AP2ドメイン繰返し2領域を含まないSE
Q ID NO：5のヌクレオチド1620-4873またはSEQ ID NO：6のヌクレオチド2026-50
35に、中庸または緊縮条件下でハイブリット化するか、またはSEQ ID NO：1また
は3内に構成されるようなヌクレオチド配列に緊縮条件下にハイブリッド化する
ヌクレオチド配列を含む分離DNA分子を含む少なくとも１つのベクターで形質転
換させて、形質転換植物を産生させること； ii) 上記形質転換植物を上記分離DNA分子の出現について選択すること；およ
び、 iii) 上記形質転換植物を成長させて興味あるたんぱく質を産生させること、
この興味あるたんぱく質の発現を上記DNAの発現産生物によって誘発させること
； を特徴とする興味あるたんぱく質の産生方法にも関する。 この方法は、植物を、上記興味あるたんぱく質を調節要素の制御下にコードす
るヌクレオチド配列を含みその調節要素は上記分離DNAの発現産生物によって誘
発される第2のベクターで形質転換させることも含む。さらにまた、この方法は
、その興味あるたんぱく質が生来(ネイティブ)のたんぱく質であるような興味あ
るたんぱく質を産生させるのにも使用できる。

【００２１】 上記の要約は、本発明の必要な特徴のすべてを必ずしも説明していないが、本
発明は、上述の特徴の下位の組合せにも存在する。 本発明の上記および他の特徴は、添付図面を参照してなされる以下の説明から
明らかとなるであろう。

【００２２】 （発明の好ましい実施形態） 本発明は、植物中での無性胚形成および再生に関する。さらに詳細には、本発
明は、無性誘導胚の産生方法、および植物の再生能力の増進方法に関する。また
、本発明は、植物の非相同性たんぱく質産生系およびその使用にも関する。 以下の説明は、例としてのみの、本発明を効果的に実施するための必要な各特
徴の組合せに限定するものではない実施態様を含む。 ブラシカ ナプスc.v.トーパス小胞子胚形成誘発中に優先的に発現する遺伝子
を、消去式スクリーニングにより分離した。６つの特異的なDNA配列を含む7つの
個々のcDNAクローンが、胚形成性および非胚形成性小胞子培養物から調製したcD
NAライブラリー間で分化的に発現していることを見出した。これらBNM(ブラシカ
ナプス小胞子胚(Brassica napus microspore embro))クローン、BNM3A(SEQ ID
NO：1)およびBNM3B(SEQ ID NO：3)の幾つかを、本明細書に記載のようにして特
性決定した。BNM3AおよびBNM3Bは、それぞれ、SEQ ID NO：2およびSEQ ID NO：4
に開示されているアミノ酸配列をコードする。調節領域(SEQ ID NO：5のヌクレ
オチド1-1619)を含むBNM3A(SEQ ID NO：5)のゲノム配列も得られた。BNM3遺伝子
、いわゆるAtBBMのアラビドプシスオルソログ(orthologue)も得られた。AtBBMの
ゲノム配列はSEQ ID NO：6内で示され、一方、その予想アミノ酸配列は、SEQ ID
NO:７内で示される。

【００２３】 本明細書において使用するとき、“再生”とは、単細胞または細胞群から誘導
される新しい組織、器官、胚、植物全体または植物のフラグメントの産生を生ず
る形態学的応答を称する。再生は、カルス相を介して間接的に或いは介入カルス
相なしで直接進行し得る。“再生能力”とは、植物細胞が再生を受ける能力を称
する。 “胚形成性細胞”とは、体性細胞または配偶子体性細胞から胚を産生させるの
にさらなる刺激を与える必要がない状態への転移を完了させる細胞を意味する。 “調節要素”とは、発生的に調節された組織特異性で誘発性且つ構成性の調節
要素のような要素を意味する。発生的に調節され、その制御下に遺伝子の分化発
現を制御する調節要素は、ある種の器官または組織の発生中の特定の時間におい
てその器官または器官組織内で活性化される。しかしながら、発生的に調節され
るある種の調節要素は、特異的な発生段階においてある種の器官または組織内で
優先的に活性であり得るか、或いは発生的に調節された方法においてまたは植物
内の他の器官もしくは組織においては基礎レベルにおいても活性であり得、その
ような調節要素は“組織特異性”とみなされる。調節要素は、遺伝子コード領域
の上流、領域内、下流またはこれらの組合せにおいて見出され得る。

【００２４】 誘導性調節要素は、誘発剤に応答して1つ以上のDNA配列または遺伝子の転写を
直接または間接的に活性化させ得る要素である。誘発剤が存在しない場合、それ
らDNA配列または遺伝子は転写されない。典型的には、誘発性調節要素に特異的
に結合して転写を活性化するたんぱく質因子は、不活性形で存在し、後で、誘発
剤により直接または間接的に活性形に転化される。誘発剤は、たんぱく質、代謝
物、成長調節剤、除草剤またはフェノール化合物のような化学剤；或いは熱、冷
気、塩もしくは毒性要素によって直接的に、またはウィルスのような病原体また
は病原因子の作用により間接的に加えられる物理的応力であり得る。誘発性調節
要素を含有する植物細胞は、誘発剤を細胞または植物にスプレー、散水、加熱ま
たは同様な方法によるような外的に塗布することによって誘発剤に暴露させ得る
。

【００２５】 構成性調節要素は、植物の各種部分の全体に亘って、また植物発生の全体に亘
って連続的に遺伝子発現に特異的である。公知の構成性調節要素の例としては、
CaMV 35S転写体(Odell et al., 1985, Nature, 313:810-812)、米アクチン1(Zha
g et al., 1991, Plant Cell, 3:1155-1165)およびトリオースホスフェート イ
ソメラーゼ1(Xu et al., 1994, Plant Physiol. 106:459-467)遺伝子、とうもろ
こしユビキチン1遺伝子(Cornejo et al., 1993, Plant Mol. Biol. 29:637-646)
、アラビドプシスユビキチン1および6遺伝子(Holtorf et al., 1995, Plant Mol
. Biol. 29:637-646)、およびタバコ転写開始因子4A遺伝子(Mandel et al., 199
5, Plant Mol. Biol. 29:995-1004)と会合させたプロモーター類がある。

【００２６】 “興味ある遺伝子”とは、形質転換植物内で発現させるべき任意の遺伝子を意
味する。そのような興味ある遺伝子としては、限定するものではないが、製薬上
活性なたんぱく質、例えば、成長因子、成長調節剤、抗体、抗原、免疫化または
ワクチン接種において有用なそれらの誘導体等をコードする遺伝子がある。その
ようなたんぱく質としては、限定するものではないが、インターロイキン類；イ
ンシュリン；G-CSF、GM-CSF、hPG-CSF、M-CSFまたはこれらの組合せ；インター
フェロン類、例えば、インターフェロン-α、インターフェロン-β、インターフ
ェロン-γ；血液凝固因子、例えば、ファクターVIII、ファクターIX；tPAまたは
これらの組合せがある。興味ある遺伝子は、工業酵素、たんぱく質補充物、栄養
補助食品、または飼料、食品もしくは飼料-食品併用物用の付加価値製品もコー
ドし得る。そのようなたんぱく質の例としては、限定するものではないが、プロ
テアーゼ類、オキシダーゼ類、フィターゼ類、キチナーゼ類、インバーターゼ類
、リパーゼ類、セルラーゼ類、キシラナーゼ類、油生合成に関連する酵素類等が
ある。他のたんぱく質補充物、栄養補助食品または付加価値製品としては、未変
性または変性種子貯蔵たんぱく質等がある。

【００２７】 本発明は、さらに、本発明の調節要素に活動的に結合させた興味あるDNAを含
有するキメラ遺伝子構築物にも関する。任意の外因性遺伝子、即ち、興味ある遺
伝子を本発明に従って使用し、操作して外因性遺伝子の発現を生じさせることが
できる。 興味ある遺伝子発現の活性化も、調節要素(それ自体、BNM3たんぱく質によっ
て活性化される)の制御下にあり得る。例えば、限定するものではないが、興味
ある遺伝子をナピン(napin)プロモーターに融合させ、ナピンプロモーターをBNM
3により誘発させ得る。さらにまた、興味ある遺伝子を、BNM3により誘発させた1
種以上の調節要素の制御下に、体性組織内で発現させ、後でさらに詳細に説明す
るように、体性組織が胚形成性細胞を含む種子状構造体に発育し、これらの種子
状構造体が興味ある遺伝子の産生物を産生するようにすることができる。

【００２８】 本発明のキメラ遺伝子構築物は、3’未翻訳領域をさらに含み得る。3’未翻訳
領域とは、mRNA加工または遺伝子発現に作用し得るポリアデニル化シグナルおよ
び任意の調節シグナルを含有するDNAセグメントを含む遺伝子のその部分を称す
る。ポリアデニル化シグナルは、通常、ポリアデニル酸トラックをmRNA先駆体の
3’末端に付加させるように作用することに特徴を有する。ポリアデニル化シグ
ナルは、標準形の5’AATAAA-3’に対する相同性の存在によって一般に認識され
ている(変形も稀ではないが)。適切な3’領域の例は、ノパリンシンターゼ(Nos
遺伝子)のようなアルゴバクテリウム(Argobacterium)腫瘍誘発性(Ti)プラスミド
遺伝子、並びに大豆貯蔵たんぱく質遺伝子およびリブロース-1,5-ビスホスフェ
ートカルボキシラーゼの小サブユニット(ssRUBISCO)遺伝子のような植物遺伝子
のポリアデニル化シグナルを含有する3’転写非翻訳領域である。従って、本発
明構築物の構造遺伝子からの3’未翻訳領域は、植物内での発現用のキメラ遺伝
子を構築するのに使用できる。

【００２９】 本発明のキメラ遺伝子構築物は、必要に応じ、翻訳または転写エンハンサーの
いずれかのエンハンサーをさらに含み得る。これらのエンハンサー領域は、当業
者にとって周知であり、ATG開始コドンおよび隣接配列を含み得る。開始コドン
は、コードする配列の読取りフレームを有する相内にあって配列全体の翻訳を確
実にするものでなければならない。翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然
および合成両方の各種起源由来であり得る。翻訳開始領域は、転写開始領域源か
ら或いは構造遺伝子から調製できる。その配列もその遺伝子を発現させるのに使
用した調節要素から誘導でき、そのmRNAの翻訳を増大させるように特異的に修飾
し得る。 形質転換植物細胞の同定を促進させるためには、本発明の構築物をさらに操作
して植物選択性マーカーを含ませることができる。有用な選択性マーカーとして
は、ゲンタマイシン、ヒグロマイシン、カナマイシン等の抗生剤に対する耐性を
与える酵素がある。同様に、GUS(β-グルクロニダーゼ)のような色変化、蛍光、
またはルシフェラーゼのような発光により同定可能な化合物の産生を可能にする
酵素も有用である。

【００３０】 また、本発明の1部は、BNM3遺伝子、BNM3から得られた調節要素、または構成
性、発生性もしくは誘導性調節要素またはこれらの組合せと操作上関連するBNM3
由来のコード領域を含む本発明の遺伝子またはキメラ遺伝子構築物を含有するト
ランスジェニック植物とみなし得る。植物細胞から植物全体を再生させる方法は
、当該技術において公知である。一般的には、形質転換植物細胞を、抗生剤のよ
うな選択性薬剤を含有させ得さらに選択性マーカーを用いて形質転換植物細胞の
同定を容易にした適切な培地中で培養する。カルスが形成するとすぐに、適切な
植物ホルモンを公知の方法に従って使用することによって苗条形成を促進させ、
植物再生用の根付け用培地に移し得る。次いで、この植物を用いて、種子からの
或いは植物成長繁殖法を用いての繰返しの再生を確立し得る。本発明の構築物は
、植物細胞中に、Tiプラスミド、Riプラスミド、植物ウィルスベクター、直接DN
A形質転換、ミクロ注入、エレクトロポレーション、バイオリスチックス(biolis
tics)等を用いて導入し得る。そのような方法を検討するためには、例えば、Wei
ssbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press
, New York VIII, pp.421-463(1988)；Geierson and Corey, Plant Molecular B
iology, 2d Ed. (1988)；およびMiki and Iyer, Fundamentals of Gene Transfe r in Plant . In Plant Metabolism, 2d Ed. DT. Dennis, DH Turpin, DD Lefebr
ve, DB Layzell(eds), Addison Wesly, Langmans Ltd. London, pp. 561-579 (1
997)を参照されたい。本発明は、上記遺伝子またはキメラ遺伝子構築物を含む適
切なベクターをさらに含む。

【００３１】 1群の遺伝子を、ブラシカ ナプス小胞子胚培養物から分離した。これらの遺伝
子は、植物の成長組織内で異所的に発現させたときに無性誘導胚の形成を誘発さ
せるその能力故に、胚形成の重要な調節剤であることが判明した。これらの遺伝
子は、以下、BNM3遺伝子(Brassica napus microspore eｍbryo)として表示する
。SEQ ID NO：1は、BNM3AのcDNAを示し；SEQ ID NO：3は、BNM3BのcDNAを示し；
BNM3Aのゲノム配列は、SEQ ID N：5内に示している。BNM3Aの調節領域は、SEQ I
D NO：5のヌクレオチド1-1619内にある。SEQ ID NO：1および3の各DNAによって
コードされる予想たんぱく質配列は、それぞれ、SEQ ID NO：2および4内に略記
している。 BNM3遺伝子のオルソログもアラビドプシス内で同定しており、以下、AtBBMと
称する。SEQ ID NO：6は、AtBBMのゲノム配列を示す。AtBBMの調節領域は、SEQ
ID NO:６のヌクレオチド1-2025内にある。予想アミノ酸配列は、SEQ ID NO:７内
に示す。

【００３２】 BNM3翻訳産生物は、リンカー領域によって分離されたAP2ドメインの２つのコ
ピーを含有しており(図3；SEQ ID NO：2のアミノ酸208-378、およびSEQ ID NO：
4、SEQ ID NO：５のヌクレオチド2694-4252、SEQ ID NO：6のヌクレオチド2938-
4416)、本明細書においては、“AP2ドメイン”または“AP2ドメイン繰返し1-リ
ンカー-AP2ドメイン繰返し2”と称する。AP2ドメインは、たんぱく質-たんぱく
質相互作用を介在するものと考えられる。多くのAP2ドメイン含有たんぱく質のD
NAを結合する能力は、転写活性剤として機能し得る推定核局在シグナルおよび酸
性領域の存在と合わせると、これらたんぱく質が転写因子として機能することを
示唆している。BNM3のAP2ドメイン繰返し1-リンカー-AP2ドメイン繰返し2は、At
BBMのAP2ドメインとの約99％の相同性(BNM3とAtBBM間の95％のヌクレオチド類似
性)、並びに他のAP2含有たんぱく質との高度の類似性、例えば、ANT約85％(76％
ヌクレオチド類似性)、MOE17(染色体3)約85％(78%ヌクレオチド類似性；イント
ロンを、例えば、SEQ ID NO5からのAP2領域を比較として含ませた場合、MOE17は
、第2のAP2領域内の285 bp領域に亘って約63％のヌクレオチド類似性を示す)、Z
MMHCF1、88％またはGLOSSY15、66％を示す。しかしながら、上記2つのAP2ドメイ
ン以外では、BNM3配列と上記他のAP2含有たんぱく質の類似性は、有意に低下す
る。

【００３３】 “BNM3”または“BNM3遺伝子”とは、SEQ ID NO：1、3、5および6内に開示さ
れたオリゴヌクレオチドまたはそのフラグメント、誘導体もしくは変異体の配列
、即ち、少なくとも下記を示すオリゴヌクレオチド配列を意味する： i) SEQ ID NO：1のヌクレオチド741-1257、SEQ ID NO：3のヌクレオチド672-1
188、SEQ ID NO：5のヌクレオチド2694-4252のコード領域内の相応する配列また
はSEQ ID NO：6のヌクレオチド2938-4416(SEQ ID NO：5のヌクレオチド2694-425
2またはSEQ ID NO：6のヌクレオチド2938-4416によって構成される領域は、7個
のイントロンによって遮断されている；図9参照)によって構成されるような、AP
2ドメイン繰返し1-リンカー-AP2ドメイン繰返し2を含まないSEQ ID NO：1、3、5
または6内に開示された配列のフラグメントまたは誘導体との70％の相同性また
は類似性；または、 ii) AP2ドメイン繰返し1-リンカー-AP2ドメイン繰返し2を含むSEQ ID NO：1、
3、5または6に開示された配列の全長と70％の相同性または類似性。

【００３４】 そのような相同性測定は、オリゴヌクレオチド配列アルゴニズム、例えば、限
定するものではないが、BLAST(GenBank URL：www.ncbi.nlm.nih.gov/cgibin/BLA
ST、既設定パラメーター：プログラム：ブラスン(blastn)；データベース：nr；
エクスペクト10；フィルター：既設定；アレンジメント：ペアーワイズ(pairwis
e)；キュアリー遺伝子コード：スタンダード(1)を使用する)、または同じく既設
定パラメーターを使用するFASTAを用いて行い得る。配列類似性試験を用いて、A
tBBMは、BNM3の全長と約85％の相同性を示し、従って、AtBBMはBNM3遺伝子であ
る。さらにまた、BNM3遺伝子は、本発明において開示する配列とハイブリッド形
成する点でも定義し得る。従って、“BNM3”または“BNM3遺伝子”も下記を含む
： iii) 上述したようなAP2ドメイン(AP2ドメイン繰返し1-リンカー-AP2ドメイン
繰返し2)をコードする領域を含まないSEQ ID NO：1、3、5または6或いはSEQ ID
NO：1、3、5または6に開示された配列のフラグメントまたは誘導体のいずれかと
、高緊縮条件下、例えば、限定するものではないが、約65℃、5X SSCでゲルブロ
ットを用いるハイブリッド形成(サウザンハイブリッド形成)その後の0.1X SSC、
65℃での洗浄条件下で会合させた長さ約15個以上のヌクレオチド、好ましくは長
さ20〜25個のヌクレオチド由来のオリゴヌクレオチド；または、 iv) 上述したようなAP2ドメイン(AP2ドメイン繰返し1-リンカー-AP2ドメイン
繰返し2)をコードする領域を含まないSEQ ID NO：1または3或いは長さ約1000個
のヌクレオチドを有するSEQ ID NO：1または3に開示された配列のフラグメント
または誘導体と、中または高緊縮条件下、例えば、限定するものではないが、そ
れぞれ、約25℃、0.2X SSC、0.1％SDSまたは約65℃、5X SSCでゲルブロットを用
いるハイブリッド形成(サウザンハイブリッド形成)その後の0.2X SSC、0.1%SDS
、25℃での洗浄条件下で会合させた実質的に全長のヌクレオチド配列、または長
さ約1000個以上のヌクレオチド配列。

【００３５】 中緊縮条件下においては、全長BNM3 cDNAのみがAtBBMのフラグメントとハイブ
リッド化し(図9参照）、従って、AtBBMはBNM3の遺伝子である。AtBBMゲノムクロ
ーンの配列分析によれば、IRREGULAR XYLEM3 (IXR3)遺伝子の5’末端は、推定At
BBMコード領域の下流に位置付けされている(位置7479、図9A)。IXR3は、以前に
、マーカーnga106 (33.26 cM)とmi438 (33.34 cM)間の染色体5の150 kp領域にマ
ッピングすることが開示されている(Taylar et al., 1999)。このデータは、ブ
ラシカBNM3遺伝子のアラビドプシスオルソログが染色体5にマッピングする単一
遺伝子によってコードされていることを示している。AtBBM、TAMU BACクローン
：T10B6 (取得番号AP002073；Nakamura, May 18, 2000)に高度に類似する配列も
染色体5にマッピングされている。

【００３６】 “BNM3遺伝子”は、SEQ ID NO：1、3、5または6の少なくとも27個の連続ヌク
レオチド、またはSEQ ID NO：5のヌクレオチド1-1619もしくはSEQ ID NO：6のヌ
クレオチド1-2025の調節領域内の少なくとも22個の連続ヌクレオチドを含むDNA
分子も含む。定義したようなBNM3のフラグメントは、BNM3調節に対するヌクレオ
チドの同定または生体内の領域のコード化用のプローブとして、或いはこれらヌ
クレオチド配列増幅のためのプライマーとして使用できる。さらにまた、SEQ ID
NO：1、3、5または6配列の少なくとも27個の連続ヌクレオチド、好ましくは約3
0個以上で約35個までのヌクレオチドを含み、たんぱく質またはその活性フラグ
メントをコードし、さらに、植物細胞内に十分量で存在するとき、その植物細胞
を胚形成性にし、その植物細胞の再生能力を増大させ、或いはその植物細胞を胚
形成性とし且つその植物の再生能力を増大させる分子も、BNM3遺伝子であるとみ
なされる。好ましくは、BNM3遺伝子は、SEQ ID NO：1または3の約50〜約1981個
のヌクレオチド、SEQ ID NO：5のコード領域(1620-4858)からの約50〜約3538個
のヌクレオチド、またはSEQ ID NO:６のコード領域(2025-5035)からの約50〜約3
009個のヌクレオチドを含む。

【００３７】 ブラシカ ナプスおよびアラビドプシスから得られたゲノムBNM3配列は、8個の
イントロンを含むものとして特徴を有する。これらのイントロンは、SEQ ID NO
：5のヌクレオチド1846-2298、2720-2952、3036-3160、3170-3314、3404-3553、
3628-3797、3849-3961および4039-4148、およびSEQ ID NO：6のヌクレオチド224
9-2578、2994-3220、3304-3420、3429-3521、3611-3770、3845-3969、4020-4151
および4229-4310において見出されている。SEQ ID NO：5および6の開始コドンは
、それぞれ、ヌクレオチド1620および2026にあり、一方、停止コドンは、それぞ
れ、位置4856および5035において見出される。

【００３８】 “BNM3調節領域”とは、発現を調節する性質(例えばエンハンサーまたはプロ
モーター領域を正に、または例えばサイレンサー領域を負に)を示し、さらに、B
NM3遺伝子と操作上関連するオリゴヌクレオチドの配列を意味する。典型的には
、BNM3調節領域は、BNM3遺伝子の開始部位から上流のヌクレオチドを含むが、遺
伝子の他の領域内にある配列、例えば、限定するものではないが、イントロン内
の配列も、調節特性を示し得、BNM3調節領域とみなされる。BNM3調節領域の例は
、限定するものではないが、下記がある： ・調節機能を示すBNM3遺伝子と操作可能に結合させた配列、例えば、限定する
ものではないが、BNM3遺伝子の開始部位上流またはイントロン内の調節領域、ま
たはそのフラグメント、誘導体もしくは変異体； ・SEQ ID NO：5内の約1から約1619までのヌクレオチド、またはそのフラグメ
ントもしくは誘導体； ・SEQ ID NO：6内の約1から約2025までのヌクレオチド、またはそのフラグメ
ントもしくは誘導体； ・SEQ ID NO：5の約1000から約1619までまたはSEQ ID NO：6の約1500から約20
25までのヌクレオチド配列、またはそのフラグメントもしくは誘導体と、高緊縮
条件下、例えば、限定するものではないが、5X SSC中で約65℃でのゲルブロット
へのハイブリッド形成その後の0.1X SSC、65℃での洗浄条件下で会合するヌクレ
オチド配列；または、 ・SEQ ID NO：5の約1から約1000までまたはSEQ ID NO：6の約1から約1500まで
のヌクレオチド配列、またはそのフラグメントもしくは誘導体と、中または高緊
縮条件下、例えば、限定するものではないが、0.2X SSC、0.1% SDS中で約25℃ま
たは5X SSC中で約65℃でのゲルブロットへのハイブリッド形成、その後の0.1X S
SC、65℃での洗浄条件下で会合するヌクレオチド配列； ・オリゴヌクレオチド配列アルゴリズム(例えば、限定するものではないが、既
設定パラメーターを用いてのBLASTまたはFASTA調査；前述参照)を用いて決定し
たとき、SEQ ID NO：5の約1000から約1619までまたはSEQ ID NO：6の約1500から
約2025までのヌクレオチド配列、またはその少なくとも約22個のヌクレオチドフ
ラグメントと少なくとも70％の類似性を示すヌクレオチド配列。

【００３９】 “BNM3たんぱく質”とは、植物細胞を胚形成性にし、その植物細胞の再生能力
を増大させ、またはその植物細胞を胚形成性にし且つその植物細胞の再生能力を
増大させ、さらに、上記で定義したように、BNM3遺伝子によってコードされたた
んぱく質またはその生物学的に活性なフラグメントを意味する。好ましくは、BN
M3たんぱく質は、SEQ ID NO：2に開示された配列の約30個から約579個までのア
ミノ酸、SEQ ID NO：4に開示された配列の約30個から約579個までのアミノ酸、
またはSEQ ID NO：7に開示された配列の約30個から約581個までのアミノ酸を含
む。しかしながら、BNM3たんぱく質は、AP2ドメイン繰返し1-リンカー-AP2ドメ
イン繰返し2領域(SEQ ID NO：2および3のアミノ酸208-378、SEQ ID NO：7のアミ
ノ酸205-375)を含まないSEQ ID NO:２、4または7のいずれかとの少なくとも70％
相同性を有するたんぱく質としても定義し得る。

【００４０】 配列データベースの調査は、BNM3翻訳産生物がAP2ドメインの2つのコピーを含
有することを示した(図3；また、BNM3AにおけるSEQ ID NO：2、BNM3BにおけるSE
Q ID NO：4、およびAtBBMにおけるSEQ ID NO：7も参照されたい)。AP2ドメイン
は、APETALA2、即ち、分裂細胞同一性、花器官細目、種子皮発生および花同形(h
omeotic)遺伝子発現を調節するアラビドプシスたんぱく質において先ず同定され
たが(Jofuku et al., 1994)、それ以来、種々の機能を有する広範囲のたんぱく
質において同定されている。 AP2ドメインは、長さ58〜68個のアミノ酸間に通常存在し、両親媒性αへリッ
クス、即ち、たんぱく質-たんぱく質相互作用を介在すると考えられている構造
を形成させる能力に特徴を有する18個のアミノ酸の保存中心コアを含有する。多
くのAP2ドメイン含有たんぱく質のDNAを結合する能力は、転写活性剤として機能
し得る推定核局在シグナルおよび酸性領域の存在と合わせると、これらたんぱく
質が転写因子として機能することを示唆している。

【００４１】 系統学的に異なる2群のAP2ドメインたんぱく質が同定されている：1つのAP2ド
メインを含むたんぱく質(EREBP様)および2つのAP2ドメインを含むたんぱく質(AP
2様；(Zhou, 1997))。本発明の遺伝子によってコードされるたんぱく質は、後者
の群のたんぱく質の特異なメンバーを代表している。 従って、本発明の1つの局面は、２つのAP2ドメインを含有するたんぱく質をコ
ードする配列を含む分離DNA分子を提供する。このたんぱく質は、植物細胞内に
十分量で存在するとき、植物細胞を胚形成性にし、その植物細胞の再生能力を増
大させ、またはその植物細胞を胚形成性にし且つその植物細胞の再生能力を増大
させる。

【００４２】 ノーザン法を用いての小胞子誘導胚発生、種子発生または非種子組織発生中の
BNM3発現分析によれば(図6)、BNM3遺伝子は胚形成性小胞子培養物、小胞子誘導
胚および種子中で優先的に発現されることが示された。BNM3転写体は、試験した
いずれの非種子組織においても検出されなかった。 BNM3 mRNAは、胚形成性を受けるよう誘発された小胞子培養物中、並びにその
後の小球、心部、トーピード(torpedo)および子葉発生中に検出されている(例え
ば、図6A)。RANは、胚発生の心部段階に相当する受粉後14日(14DAP)の発生中の
種子においても検出されている。BNM3発現は、胚発生の早期(21DAP)および中期
子葉(28DAP)段階において増大し、その後一定したままである(図6Ｂ)。

【００４３】 BNM3の構成性発現は、植物の子葉、葉柄、葉身および苗条先端分裂細胞のよう
な生長構造体上に体性胚の形成をもたらもたらした(図7)。これらの実験におい
て、BNM3 cDNAは、2種の別々の構成性プロモーター構築物、即ち、変性ひまわり
ポリユビキチン(POLYUBIQUITIN)プロモーター構築物とAMV転写エンハンサーを含
有する二重増強35Sプロモーター構築物の制御下に置かれた；しかしながら、任
意の適切な構成性プロモーターを本目的においては使用できることを理解すべき
である。そのようなBNM3誘導異所性胚は、これらの胚が2極性である点で、発生
中の接合性胚において見出される器官系および組織層のすべてを含有し(図7E)、
軸、胚軸および図7E)、軸、胚軸および幼根領域、苗条および根分裂組織、およ
び子葉からなっている。さらに、各器官系は、接合性胚において見出される特徴
的な放射状配列の3つの特化された組織層(表皮、基礎柔組織および前脈管組織)
を含んでいた。発生中の異所性胚内でのBNM3遺伝子の継続発現は、胚形成プロセ
スの繰返しをもたらし、新たな胚がその前に存在している胚の表面上に連続的に
形成されるという結果を伴う(図7E)。

【００４４】 BNM3の構成性発現は、植物が苗条を添加成長調節剤の存在下に生体外で再生さ
せる能力の増大をもたらす。BNM3を異所的に発現させるトランスジェニック植物
からの根植外体は、野生タイプの植物から得られた根植外体に比較したとき、ホ
ルモンの存在下で少なくとも5倍の苗条再生の増大を示す(図8A、B)。苗条も、ト
ランスジェニック植外体において、野生タイプに比較して早く発生した。野生タ
イプの葉および葉軸植外体は、葉柄(図8B)の切断端上にカルスを発生させ、次い
で葉柄の長さに沿ってカルスを形成させることにより、初期において応答した。
対照的に、トランスジェニック系からの植外体は、葉柄の切断端から直ぐに新た
な苗条(図8B)または根を発生させた。初期に根を発生させた植外体は、結果とし
て苗条も発生させた。

【００４５】 BNM3を構成的発現させるトランスジェニック植外体は、添加成長調節剤の不存
在下でも再生することができた。これらの植外体は、成長調節剤を含まない培地
上に置いたとき、葉および胚軸植外体の切断端からまたは根植外体の結節状構造
体から苗条を再生させた(図8C、D)。すべての場合において、再生苗条は、発育
し、根付き、開花し、結実した。逆に、成長調節剤を含まない培地上に置いた野
生タイプの葉および胚軸植外体は、時には、葉柄の切断端でカルスまたは根を生
じたが、苗条はこれらの構造体から生成しなかった(図8C、D)。 また、BNM3発現を用いて形質転換植物または植物細胞内の発生カスケードを開
始させることも本発明の範囲内に属するものとみなされる。このカスケードは、
形質転換植物内でBNM3を発現するDNA系ベクターの安定な取込みの結果として生
じ得るが、そのようなカスケードBNM3の一時的な発現の結果としても生じ、植物
細胞内でのBNM3系ベクターの安定な取込みを必要としない。これらの一時的な手
法は、体性胚形成、配偶子誘導胚形成を誘発させるのに或いは植物または植物細
胞の再生能力を増大させるのに有用である。

【００４６】 BNM3遺伝子を異所的に発現させる植物は、下記の有利な性質を有する： ・無性誘導胚の形成； ・組織植外体の再生能力の増大； ・組織植外体が添加植物成長調節剤の不存在下で再生する能力；および、 ・BNM3を異所的に発現させる非種子器官内での種子成分の発現。 さらにまた、少なくとも1つのBNM3遺伝子を異所的に発現させる植物は、種子
特異性調節要素を用いる組換えたんぱく質の製造において使用できる。 後で説明するようなBNM3の応用においては、高レベルのBNM3転写体および/ま
たはBNM3たんぱく質を得てフェノタイプが高度に浸透した植物を得るのが有利で
ある。これは、遺伝子またはたんぱく質発現レベルを増進させるのに公知である
イントロン、転写エンハンサーまたは翻訳エンハンサーのような遺伝子要素を使
用することによって達成できる。 本発明のBNM3配列は、限定するものではないが、胚プロセスの制御再生プロセ
スの制御、ターゲット遺伝子発現における調節配列の使用、形質転換植物の選択
性マーカーとしてのBNM3配列の使用、または胚形成性細胞用のような幾つかの用
途において使用できる。これらの用途は、後でさらに詳細に開示する。

【００４７】 胚形成プロセス制御のためのBNM3の使用 本明細書において説明するように、BNM3遺伝子は、胚発生の開始および維持に
おいて重要な役割を発揮する。BNM3遺伝子は、広範囲の多くの植物界において見
出されている。これらの遺伝子から得られた調節領域は、当業者に公知の方法を
用いて、BNM3またはその誘導体もしくはフラグメント、または任意の興味ある遺
伝子の転写を制御するのに使用できる。 BNM3遺伝子の異所性発現は、植物の成長組織での無性誘導胚の再発形成を誘発
させるのに十分な能力がある(実施例4参照)。使用するプロモーターにもよるが
、BNM3の異所性過発現は、体性または配偶体性胚を産生させるのに使用できる。
体性または配偶体性胚は、実施例5において示すように、構成性調節要素の制御
下でBNM3遺伝子を発現させることにより得ることができ、或いは組織特異的また
は発生的に調節された要素、植物もしくは非植物遺伝子からまたは一時的発現に
より誘導された誘発性要素の制御下にBNM3遺伝子を発現させることによって得る
ことができる。この点においては、化学誘発系(例えば、Gatz and Lenk, 1998参
照)、またはBNM3遺伝子の安定な取込みを生じない方法またはBNM3たんぱく質を
直接使用する方法、例えば、DNAまたはたんぱく質の微注入ボンバードメントを
使用する一時的発現法も使用できる。

【００４８】 誘発性、組織特異性または発生調節性要素を用いるBNM3発現の一時的および/
または空間的制限は、再現性胚形成が所望の特性でない場合に好ましい。BNM3を
特異的発生段階または細胞タイプに制限するのに使用する調節要素は、その用途
に依存するであろう。例えば、小胞子誘導胚の産生用BNM3を発現させるのに使用
し得る調節要素としては、限定するものではないが、クラスIの低分子量ヒート
ショック誘導性遺伝子の要素であるGMHSP17.3B (Zarsky et al., 1995)、または
NTM19 (Custers et al., 1997, EP 790,311)、BCP1 (Xu et al., 1995)、LAT52
(Twell et al., 1989)、BNM1 (Treacy et al., 1997)およびAPG (Roberts et al
., 1993)のような小胞子/花粉発現性遺伝子がある。

【００４９】 体性胚の産生用のBNM3を発現させるのに使用できる調節要素の例としては、限
定するものではないが、組織培養において体性胚形成を誘発させるのに一般的に
使用している植物成長調節剤によって活性化された遺伝子がある。特異的な例と
しては、限定するものではないが、シトキニン誘発性IB6およびCKI1遺伝子(Bran
dstatter and Kieber, 1998；Kakimoto, 1996)およびオーキシン誘発性要素であ
るDR5 (Ulmasov et al., 1997)がある。しかしながら、他の調節要素も植物での
BNM3発現において含ませ得ることは理解すべきである。 さらにまた、BNM3発現を不定胚と生殖を得るために、BNM3を特異化させるのに
適する遺伝子調節要素の例としては、限定するものではないが、胚珠および胚発
現性SERK遺伝子(Schmidt et al, 1997)、胚珠発現性AGL11遺伝子(Roundsley et
al., 1995)、胚珠心発現性NUC1遺伝子(Doan et al., 1995；WO 98/08961)または
内珠皮発現性遺伝子、FBP7(Angenent et al., 1995)から得られた要素、およびS
C4遺伝子(米国特許出願第09/059,909号)がある。

【００５０】 本発明の1つの局面によれば、植物内での小胞子誘導胚の効率的な産生方法が
提供される。この方法は、下記を含む： i) 興味ある植物、例えば、ブラシカ ナプスを、BNM3遺伝子からなるベクター
構築物または分離DNAで、適切な調節要素(構成性、組織特異性、発生調節性また
は誘発性であり得る)および必要に応じての形質転換体の選択用マーカー遺伝子
の制御下に形質転換させること(当業者に公知の、例えば、DeBlock et al., 198
9、Clough and Bent, 1998、Vergunst et al., 1998、Klein et al., 1987の形
質転換方法を用いて)； ii) 形質転換植物を選択すること； iii) BNM3遺伝子またはBNM3たんぱく質を異所的に過発現させる系を産生させ
ること； iv) 得られたトランスジェニック系から小胞子および花粉を分離し、小胞子お
よび花粉を培養して胚形成を誘発させること。

【００５１】 胚形成は、任意の適切なプロトコール、例えば、限定するものではないが、小
胞子と花粉を約4日間約28℃〜約35℃、好ましくは32℃で培養し、その後胚形成
性細胞または胚を約25℃に移すことによって誘発させることができる。この方法
を使用することにより、BNM3を異所的に過発現するブラシカ ナプス培養物は、
小胞子および花粉がBNM3を異所的に発現しない野生タイプ植物から調製されたと
きに観察される割合を凌ぐ胚形成性細胞または胚の割合増大を示した。 小胞子誘導胚の産生用のBNM3を発現させるのに使用できる調節要素の例として
は、限定するものではないが、クラスIの低分子量ヒートショック誘導性遺伝子
の要素であるGMHSP17.3B (Zarsky et al., 1995)、またはNTM19 (Oldenhof et a
l., 1996, EP 790,311)、BCP1 (Xu et al., 1995)、LAT52 (Twell et al., 1989
)、BNM1 (Treacy et al., 1997)およびAPG (Roberts et al., 1993)のような小
胞子/花粉発現性遺伝子がある。また、誘発性調節要素、例えば、限定するもの
ではないが、テトラサイクリン誘発性プロモーター(Gatz 1997)、ステロイド誘
発性プロモーター(Aoyama and Chua 1997)およびエタノール誘発性プロモーター
(Slater et al., 1998、Caddick et al. 1998)も有用である。

【００５２】 同様な方式において、小胞子誘導胚は、興味ある植物中にBNM3たんぱく質を導
入し(例えば、バイオリスチックスにより；Klein et al. 1987)、増大した小胞
子胚形成性を示す植物を選択することによっても植物内に産生させ得る。 本発明は、生体外での体性胚の効率的な産生方法も提供する。この方法は、下
記を含む： i) 植物、例えば、アラビドプシスを、当業者に公知の形質転換方法(例えば、
限定するものではないが、DeBlock et al., 1989、Clough and Bent 1998、Verg
unst et al. 1998)を用い、BNM3遺伝子を含有するベクター構築物で、適切な調
節要素(構成性、誘発性または発生調節せいであり得る)および必要に応じてのマ
ーカー遺伝子(数種のアラビドプシスに形質転換された形質転換体の選択のため
の)の制御下に、形質転換させること、植物細胞もまた当業者に公知の方法(例え
ば、バイオリスチックス；Klein et al. 1987)を用いて一時的に形質転換させ得
ること； ii) 形質転換植物を選択すること； iii) 選択された形質転換植物からの所望植外体、例えば、限定するものでは
ないが、根、葉または実生を、適切な成長調節剤、例えば、限定するものではな
いが、2,4-D(例えば、Mordhorst et al., 1998)を含むまたは含まない培地中で
生体外培養して直接胚形成または胚形成性カルスを産生させること；および、 iv) 胚、非胚形成性カルス、または胚と非胚形成性カルスの両方を、胚、苗木
または胚と苗木の両方の産生のための適切な培地に移すこと。

【００５３】 例えば、上記の結果を多くのアラビドプシス生態型を用いて体性杯の生体外産
生と比較したとき、特異性胚形成または胚形成性カルスが、野生体の対照物にお
けるよりも、BNM3を異所的に過発現するトランスジェニック系からのほうが高頻
度で開始されている。 体性胚産生用のBNM3を発現させるのに使用できる調節要素の例としては、限定
するものではないが、組織培養において体性胚形成を誘発させるのに一般的に使
用している植物成長調節剤によって活性化された遺伝子がある。特異的な例とし
ては、限定するものではないが、シトキニン誘発性IB6およびCKI1遺伝子(Brands
tatter and Kieber, 1998；Kakimoto, 1996)およびオーキシン誘発性要素である
DR5 (Ulmasov et al., 1997)がある。また、誘発性調節要素、例えば、限定する
ものではないが、テトラサイクリン誘発性プロモーター(Gatz 1997)、ステロイ
ド誘発性プロモーター(Aoyama and Chua 1997)およびエタノール誘発性プロモー
ター(Slater et al., 1998、Caddick et al. 1998)も有用である。

【００５４】 胚発生の異所性開始は、アポミクシスにおける最重要段階である。実施例4で
示すように、BNM3遺伝子の異所性発現は、他の非胚形成性組織内で胚形成を開始
させるのに十分な能力がある。従って、BNM3遺伝子は、発生中の胚珠の胞子体ま
たは配偶体組織中でBNM3遺伝子を発現させることによって退化または未退化胚嚢
細胞の不定胚生殖または単為生殖を開始させるのに使用できる。 不定胚生殖は、発生中の胚嚢に隣接して或いは密接して存在する胚珠心、内珠
皮または他の組織のような胞子体胚珠組織内でBNM3を発現させることによって達
成される。この方法は、下記を含む： i) 所所望の植物(上記の各方法参照)を、BNM3遺伝子からなるベクター構築物
で、構成性、誘発性または発生調節性であり得る適切な調節要素および必要に応
じての形質転換体選択用のマーカー遺伝子の制御下に、当該技術において公知の
方法を用いて形質転換させること； ii) 形質転換植物を選択すること； iii) 形質転換植物を除雄すること； iv) 形質転換植物を1種以上の優性選択性マーカー、例えば、GUSまたはカナマ
イシン耐性を担持する花粉で受粉させること；および、 v) クローン性子孫の産生についてアッセイすること。

【００５５】 上記方法の結果を、優性選択性マーカーを担持する花粉による野生タイプアラ
ビドプシス植物の受粉と比較したとき、この交配から得られるすべてのF1胚は上
記優性マーカーを継承するのに対し、BNM3遺伝子またはたんぱく質を異所的に過
発現する植物から誘導された胚は、有性胚形成によりクローン的に誘導され、上
記優性選択性マーカーを継承しない。

【００５６】 胚嚢成分の不定胚生殖、ジプロスポリー、または単相単為生殖を得るためにBN
M3の発現を特異化するのに適する遺伝子調節要素の特異的例としては、胚珠発現
性SERK遺伝子(Schmidt et al., 1997)、減数分裂発現性AtDMC1遺伝子(Klimyuk a
nd Jones, 1997；WO 98/28431)、胚珠発現性AGL11遺伝子(Roundsley et al., 19
95)、胚珠心発現性NUC1遺伝子(Doan et al., 1996；WO 98/08961)、並びに内珠
皮発現性遺伝子、FBP7(Angenent et al, 1995)およびSC4(1998年4月13日に出願
された米国特許出願第09/059.909号)遺伝子がある。さらにまた、誘発性系、例
えば、限定するものではないが、テトラサイクリン誘発性プロモーター(Gatz 19
97)、ステロイド誘発性プロモーター(Aoyama and Chua 1997)およびエタノール
誘発性プロモーター(Slater et al., 1998、Caddick et al. 1998)も使用できる
。胚嚢細胞からの単為生殖は、雌配偶体またはその先駆体の1種以上の細胞中で
活性である調節要素を必要とする。減数分裂誘導極性核の受精は、種子の発生が
胚乳の存在に依存している場合に望ましい。

【００５７】 再生プロセス制御のためのBNM3配列の使用 BNM3遺伝子を異所的に過発現する植物は、添加成長調節剤なしで再生能力の増
大および植物全体の再生能力を示す(実施例5参照)。従って、BNM3遺伝子発現は
、生体内または生体外での植物組織の再生能力を増強または誘発させるのに使用
できる。BNM3を発現させるのに使用する調節要素は、部分的には、再生に使用す
るターゲット組織に依存する。植物組織の再生は、BNM3遺伝子を構成性調節要素
、例えば、限定するものではないが、35Sの制御下に発現させることにより、BNM
3遺伝子を組織特異性または発生調節性要素、植物または非植物遺伝子から誘導
された誘発性要素(例えば、Gatz and Lenk, 1998)の制御下に発現させることに
より、或いはBNM3遺伝子の安定な取込みを生じない一時的発現方法またはBNM3た
んぱく質の使用を特異的にする方法((例えば、DNAまたはたんぱく質の微注入可
能なボンバードメント)により得ることができる。例えば、シトキニン(Brandsta
tter and Kieber, 1998；Kamimoto, 1996)またはオーキシン(Ulmasov et al., 1
997)、または組織植外体の癒傷部位で発現させた遺伝子(Xu et al., 1993)のよ
うな化学誘発系(Gatz and Kenk, 1998参照)または再生を誘発させるのに使用す
る植物成長に応答する遺伝子調節要素も使用可能である。

【００５８】 さらなる応用は、トランスジェニック植物回収用の選択性マーカーとしてBNM3
遺伝子を使用することである。いかなる形でも限定するものではないこの応用の
例としては、実生、例えば、アラビドプシス生態型C24実生の根を、下記の2種の
バイナリー構築物を含有する単一アグロバクテリウム チュメフェイシエンス株
と一緒に共培養させる(Vergunst et al., 1998による；すべての工程を添加成長
調節剤なしで実施することを除く)： ・第1のバイナリーベクターは、レポーター遺伝子融合体、例えば、限定する
ものではないが、35S:GUSを担持する； ・第2のバイナリーベクターは、適切な調節要素の制御下にBNM3遺伝子を含有
する。

【００５９】 BNM3遺伝子発現は、上記構築物の取込み時にアラビドプシスゲノム中に活性化
され、トランスジェニック植物を、野生タイプの植物が再生することのできない
条件、例えば、限定するものではないが、成長調節剤の不存在下での再生能力に
基づいて選択する。多くの場合、BNM3遺伝子を担持するT-DNAと興味ある遺伝子
を担持するT-DNAは、未結合座において統合する。従って、導入したBNM3配列を
含有するT-DNAおよびその会合再生能力増大フェノタイプは、単純な分離により
後代植物内で除去できる(Daley et al., 1998)。しかしながら、当業者において
明らかなように、BNM3遺伝子の安定な取込みを生じない或いはBNM3たんぱく質の
使用を特異化する一時的発現のような他の方法も使用できる。

【００６０】 遺伝子発現を胚にターゲットさせるためのBNM3配列の使用 BNM3遺伝子は発生中の胚において優先的に発現するので(実施例3参照)、本発
明の更なる用途は、任意の目的、例えば、限定するものではないが、種子生育力
またはサイズ、種子の構成成分の組成、疾病耐性のような胚および種子特性の改
変、またはワクチン、抗体、バイオ薬品または他の特質化学品のような高価値製
品の生産において、少なくとも１つの興味ある非相同性遺伝子の発現を発生中の
胚にターゲットさせるためにBNM3調節領域を使用することである。

【００６１】 胚形成性細胞用のマーカーとしてのBNM3配列の使用 実施例3および4において示すように、BNM3遺伝子発現は、植物胚形成性の最早
期において検出され、それ自体で、シグナル形質導入カスケードを活性化して胚
発生に導く十分な能力がある。従って、BNM3遺伝子発現は、植物細胞の胚形成性
通路への入込みのための特異的マーカーである。 BNM3発現は、生体内および生体外での胚形成性細胞分裂に関連し、従って、生
体外で組織の胚形成性能力を改変する培養条件を限定するのに使用できる。胚形
成性能力を有する細胞または限られた数の胚形成性分裂しか受けない細胞は、形
態学的に胚に類似する構造体の不存在下では同定するのが困難である、しかしな
がら、これらの細胞は、BNM3発現に基づき同定できる。この用途においては、レ
ポーター遺伝子に融合させたBNM3調節領域を含有するベクター、例えば、限定す
るものではないが、GUS(Jefferson et al. 1987)、ルシフェラーゼ(Luciferase)
(Ow et al., 1987)またはGFP(Haselhoff and Amos, 1995)を興味ある植物に形質
転換させる。高レベルのレポーター遺伝子発現を胚内で示す同型接合トランスジ
ェニック系を、生体外条件下で培養する。胚形成性細胞、または胚形成性細胞の
形成を容易にするまたは増進させる培養条件を培養組織内のレポーター遺伝子発
現に基づいて同定する。

【００６２】 関連する用途は、無性誘導胚の形成過程にある個々の細胞の同定のためのアポ
ミクト種におけるマーカーとしてのBNM3遺伝子の使用である。この用途において
は、自律性胚通路に入る細胞を、BNM3遺伝子配列から誘導されたRANプローブを
用いるmRNA現場(in situ)ハイブリッド形成により、BNM3たんぱく質に対して特
異性の抗体を用いる免疫化学により、BNM3調節領域とレポーター遺伝子との遺伝
子融合体を含有するDNA構築物で植物を形質転換させることにより、或いは当業
者にとって公知の任意の同様な方法により同定する。

【００６３】 シグナル形質導入成分の同定 BNM3遺伝子発現を活性化し或いはそれによって活性化されるシグナル形質導入
成分は、BNM3遺伝子およびそのたんぱく質産生物と相互作用するたんぱく質およ
びDNA配列を同定することによって明らかにできる。これらのシグナル形質導入
成分は、例えば、限定するものではないが、下記のような当業者にとって公知の
方法を用いて同定できる： ・BNM3機能獲得フェノタイプの遺伝子内および/または遺伝子外サプレッサー
またはエンハンサーを同定するための変異誘発； ・BNM3調節領域に結合してBNM3遺伝子発現に影響を及ぼすたんぱく質の分離の
ための酵母1個ハイブリッド(yeast one hybrid)スクリーン； ・BNM3結合の特異的ターゲットである遺伝子を同定するための酵母内での遺伝
子選択； ・BNM3シグナル形質導入カスケード内で活性化される遺伝子を同定するための
DNAアレーまたはプロテオミックス(proteomics)；および、 ・BNM3と相互作用して下流ターゲット遺伝子発現に影響を及ぼすたんぱく質を
同定するための酵母2個ハイブリッド(yeast two hybrid)スクリーン。 シグナル形質導入成分およびシグナル成分の分析方法は周知である(例えば、M
eijer et al. (1998)；Lipshutz et al. (1999)およびAnderson and Anderson (
1998)を参照)。

【００６４】 例えば、限定するものではないが、カリフラワーモザイクウィルス(Cauliflow
er Mosaic Virus) 35Sプロモーターのような強構成性調節要素の制御下でBNM3遺
伝子を過発現する植物は、異所性胚形成、器官形成からの増強された再生または
その両方を示す(実施例4および5)。BNM3の異所性過発現が胚形成の誘発および再
生プロセスの増強の両方を行う能力は、胚形成性または再生能力において改変さ
れた変異体を同定するのに使用できる。この用途においては、異所性胚形成性ま
たは再生フェノタイプの増強を促進させるのに十分である調節要素の制御下のBN
M3たんぱく質コード領域からなるベクター構築物を調製して、興味ある植物中に
導入できる。高割合の異所性胚形成性、増強された再生フェノタイプ、またはそ
の両方を示す同型接合トランスジェニック系を同定する。これらの系は、当業者
にとって周知の任意の利用できる方法によって変異形成させるが、これらの方法
は、EMS変異誘発、高速中性子変異誘発、トランスポゾン変異誘発またはT-DNA変
異誘発を含み得る。その後、変異化植物を、異所性胚形成または再生フェノタイ
プの変化についてスクリーニングする。これらの変化としては、例えば、限定す
るものではないが、異所性無性胚形成を促進させる能力または添加成長調節剤な
しで再生する能力の低減または増進がある。

【００６５】 非相同性たんぱく質発現系 トランスジェニック植物の非種子器官内での胚形成および器官形成をもたらす
シグナル形質導入通路の遺伝子制御は、BNM3遺伝子の異所性発現によって活性化
できる。非相同性プロモーターに関連するBNM3遺伝子の発現は、例えば、たんぱ
く質、油脂分および他の代謝物のような改変された種子成分を産生させるのに使
用できる。所望器官の生形質転換は、例えば、食用作物の葉の栄養価を改変する
ことも含み得、或いは作物の別の用途を創生するのにも使用できる。BNM3の発現
により開始されるシグナル形質導入カスケードによって誘発されるプロモーター
の使用は、種子以外の器官において高価値組換えたんぱく質を発現させるのに使
用できる。１つのそのようなプロモーターの例は、2S種子貯蔵たんぱく質ナピン
から得られるナピンプロモーターである。BNM3誘発性カスケードから開始される
たんぱく質の産生は、種子よりも大きい生物量を示す器官内で達成し得る。従っ
て、この技術は、作物としての植物の代替物を創生するのに使用できる。

【００６６】 従って、本発明は、さらに、BNM3たんぱく質が胚発現性調節配列(ターゲット
配列)に直接または間接的に結合し、任意の植物細胞、組織または器官内のキメ
ラ遺伝子構築物の転写を活性化するバイナリー系に関する。従って、BNM3は、キ
メラ遺伝子構築物の転写を直接または間接的に活性化させるのに使用できる。こ
の方法は、胚発現性遺伝子からの少なくとも1つのターゲット配列と直接相互作
用するか、または少なくとも１つのターゲット配列に結合しこのターゲット配列
からの転写を活性化する転写因子を活性化させる胚形成性シグナルカスケードを
開始させることにより間接的に相互作用するBNM3を含む。このバイナリー系は、
種子内で発現特性を有する体性組織内のたんぱく質の発現において使用できる。 この用途においては、構成性調節要素、例えば、限定するものではないが、35
Sプロモーター(35S:BNM3)の制御下にあるBNM3遺伝子含有トランスジェニック植
物は、BNM3活性化剤系を産生するように創生される。BNM3発現は、RANゲルブロ
ット分析により、BNM3活性化剤系の広範囲の組織において見出され得る。高レベ
ルのBNM3発現を含む安定な同型接合活性化剤系を同定する。BNM3を過発現する体
性組織は、アラビン(Guerche et al., 1990)、クルシフェリン(Pang et al., 19
88)またはオレオシンのような他の胚発現性遺伝子の発現について、または脂質
体またはたんぱく質体のような種子の通常の特性である形態学的特性について試
験できる。

【００６７】 上述のBNM3活性化剤系を産生させるのに使用したのと同じ種のトランスジェニ
ック植物も、興味ある遺伝子に融合させた胚発現性プロモーターを含有し興味あ
る遺伝子系を産生するように創生する。この実施態様の説明を補うためには、上
記興味ある遺伝子系はGUSのようなレポーター遺伝子を発現し、そのような系に
限定するものでない例としては、ブラシカ ナプス2Sアルブミン種子貯蔵たんぱ
く質遺伝子、BngNAP1:GUS融合体(Baszczynski et al., 1994)またはSERK:GUS融
合体(Schmidt et al., 1997；陰性対照として使用できるBNM1:GUS(Treacy et al
., 1997)のような非種子発現性レポーター構築物)がある。これら興味ある遺伝
子系の特異的な器官および組織内での興味ある遺伝子発現の群生適合度(fidelit
y)を、各構築物において証明する。興味ある遺伝子の高レベルの発現を有する安
定な同型接合系を創生する。

【００６８】 BNM3活性剤系および興味ある遺伝子系を含有するトランスジェニック系を交配
させ、得られた後代種子を採取する。BNM3遺伝子発現、並びに、この例において
は、GUS活性、他の胚発現性遺伝子の発現、および形質転換組織の形態学特性を
試験する。非種子組織内でのBNM3発現は、胚発生と興味ある遺伝子(例えば、GUS
)の発現の両方を典型的に活性化するが、形態学的に認識し得る胚の不存在下で
の興味ある遺伝子発現の活性化も観察できる。形態学的に認識し得る胚の不存在
下における興味ある遺伝子の発現は、BNM3とターゲット配列との直接相互作用に
ついての初期の証拠を提供している。 ターゲット配列を有するBNM3の直接相互作用も、植物プロトプラスト内でのBN
M3の一時的発現を使用して、興味ある遺伝子（例えば、興味ある遺伝子構築物に
融合させた胚発現性プロモーターの一時的共発現に沿って証明し得る。35S:BNM3
DNAと興味ある遺伝子構築物を、葉肉細胞のような非種子細胞から誘導したプロ
トプラスト中にエレクトロポレーションによって導入する。その興味ある遺伝子
の発現を数時間後に試験してターゲット配列の活性化を確認する。BNM3とターゲ
ット配列との直接相互作用は、コンペチターDNAとしてターゲット配列のみを共
導入することによってさらに証明できる。

【００６９】 異なる植物種からの組織をBNM3によってトランス活性化できるかどうかを確認
するためには、35S:BNM3 DNAとレポーター遺伝子(例えば、限定するものではな
いが、GUS)構築物を微注入可能なボンバードメントにより植物の体性組織に導入
する。BNM3がターゲット配列と直接相互作用している場合には、レポーター遺伝
子の発現は、すべての種および組織内でのBNM3の一時的発現と一致すべきである
。 BNM3-ターゲット配列相互作用の直接の証拠は、バクテリア、昆虫または酵母
内で発現させたBNM3たんぱく質の分離によっても得ることができる。BNM3は、商
業的に入手可能な発現系を用いてバクテリア、昆虫または酵母内に発現させ、分
離精製する。ゲル移動度シフトアッセイ(Gustavson et al., 1991)を、BNM3-タ
ーゲット配列、例えば、胚-発現ターゲット配列を用いて行い、BNM3のBNM3-ター
ゲット配列への直接結合を証明する。フットプリント分析もBNM3結合の領域を証
明するのに行い得る。その後、BNM3を結合するターゲット配列のフラグメントを
サブクローン化して、上述した一時的アッセイにおけるBNM3結合のコンペチター
として使用できる。

【００７０】 以下の説明は、例としてのみの、本発明を有効に実施するのに必要な特徴の組
合せに限定するものではない好ましい実施態様を含む。 本発明を以下の実施例によりさらに具体的に説明する。しかしながら、これら
の実施例は、例示のみを目的とし、本発明の範囲を如何なる形においても限定す
るように使用すべきではないことを理解すべきである。

【００７１】 （実施例） 一般的方法：小胞子胚の培養 ブラシカ ナプスc.v.ターパスを小胞子胚培養用のすべての植物材料源として
使用した。小胞子培養用のドナー植物は、繁殖キャビネット内で、VHO冷白色蛍
光灯(165W、Sylvania社)と白熱電球(40W、Duro-test社)を用いた照光期間16時間
(400μE/m/s)、20℃/15℃(昼/夜)で成長させた。発芽4週間後に、植物を、同じ
照光条件であるが10℃/5℃(昼/夜)にセットした繁殖キャビネットに移植した。
小胞子と花粉を分離し、Keller等(1987)に記載されているようにして培養した；
但し、培養21日後に、子葉段階の胚を、1/2X NLN塩、1％サクロース、0.35 Mマ
ンニトールおよび5μM ABAからなる成熟培地に移した。未誘発培養物(小胞子と
花分は配偶体性発生を続けている)と加熱応力処理非胚形成性培養物(消去(subtr
acted)プローブ構築用に使用)を、胚形成培養の開始に使用したのと同じ出発物
質から培養した。未誘発サンプルは、小胞子と花粉を25℃で4日間培養すること
によって得た。加熱応力諸理非胚形成性サンプルは、小胞子と花粉を25℃で1日
、その後、32℃で3日間培養することによって得た。 10日間以内で培養した小胞子と花粉のサンプルは、遠心処理により集めた。小
球、心部、トーピードおよび子葉段階の小胞子誘導胚を含むそれ以上経過したサ
ンプルは、Ouellet等(1992)に記載されているようにして各種の孔サイズのナイ
ロンメッシュによる濾過によって集めた。他の植物組織は、すべて温室成長材料
から採取した。種子材料は、花を開花日に手受粉させ受精後の各種日数(DAP)の
発育中の種子から採取した。

【００７２】 核酸の分離と分析 全RNAを、塩化セシウム/グアニジニウムイソチオシアネート法(Ouellet, 1992
)またはTRIZOL試薬(Gibco-BRL社)を用いて分離した。RNAゲルブロット分析は、
本質的にSambrook等(1989)におけるようにして、0.62 Mホルムアルデヒドを含有
する1.5％アガロースゲルによるレーン当り5〜20μgの全RNA分離、その後のHybo
nd-Nナイロン膜(Amersham社)への毛細転移によって実施した。Poly(A)⁺ RNAは、
オリゴ(dT)-セルロースクロマトグラフィー(Sambrook, 1989)によって全RNAから
分離した。 ゲノムDNAは、Fobert等(1991)に記載されているようにして葉組織から分離し
、標準方法(Sambrook, 1989)を用いて特異化した制限酵素によって消化させた。
DNAゲルブロット分析は、0.8％のアガロースゲルによる10μg DNAの電気泳動、
その後のHybond-Nへの毛細転移によって実施した。 部分1.2 kb BNM3A cDNA挿入物をDNAおよびRNAゲルブロットのプローブとして
使用した。ゲルブロットへのハイブリッド化は、Hybond-Nプロトコールに従って
65℃で実施した。最終洗浄条件は、0.1X SSC、65℃であった。

【００７３】 消去式プローブの構築およびcDNAライブラリースクリーニング Poly(A) mRNAは、32℃で4日間培養し胚形成を誘発させた後期単核小胞子およ
び早期2核花粉(胚形成性サンプル)から分離し、最初のストランドcDNAを合成す
るのに使用した(リボクローンcDNAキット；Promega社)。次いで、このcDNAを、2
5℃で1日、その後32℃で3日間培養して胚形成を活性化していない後期単核小胞
子および早期2核花粉(非胚形成性サンプル；Pechan et al., 1991) からの5倍過剰(重量で)のPoly(A)⁺ RNAにハイブリッド化させた。この消去式ハ
イブリッド形成は、本質的にSambrook等(1989)に記載されているようにして実施
した。消去後回収した単ストランドcDNAを、ランダムプライマーキット(BRL社)
を用いて[α-³²P] dCTPによりラベル化し、上述したのと同じ胚形成性サンプル
から構築したラムダ(Lambda)ファージcDNAライブラリーをスクリーニングするた
めの消去式プローブとして使用した(Boutilier, 1994)。このライブラリーのお
よそ1.5 x 10⁵のプラーク形成性ユニットからのトリプリケートナイロンフィル
ターリフト(Hybond-N)を、上記消去式プローブ、ランダムプライマーラベル化第
１ストランド非胚形成性プローブ、およびランダムプライマーラベル化ナピン種
子所蔵たんぱく質cDNAプローブ(pN2；(Crouch, 1983))によってスクリーニング
した。ナピンnRNAは胚形成性小胞子ライブラリー(Boutilier, 1994)において一
般的であり、従って、ナピンプローブへのプラークハイブリッド形成はその後の
スクリーニング工程から除外した。非胚形成性またはナピンプローブでない上記
消去式プローブへのプラークハイブリッド形成を選択し、その後の段階の上記消
去式および非胚形成性cDNAの両プローブを用いる２つの示差スクリーニングに供
した。選択したラムダクローンからのDNAを分離し(Sambrook, 1989)、Eco RIお
よびXba Iで部分消化し、pGEM-4Z(Promega社)にサブクローン化した。

【００７４】 6つの特異な遺伝子を含む7つのcDNA(そのうちの１つは、端を切り取ったBNM3A
cDNAを含む)を同定した。その後、2種の明確な全長BNM3 cDNAクローン(BNM3Aお
よびBNM3B)を、ブラシカ ナプスc.v.トーパスの10日経過小球ないし心部段階の
小胞子誘導胚からのmRNAで構築したcDNAライブラリーのcirca 2.5 x 10⁵プラー
ク形成性ユニット(UniZAPII cDNA合成キット)の緊縮スクリーニングによって得
られた。BNM3A cDNA挿入物は、ブルースクリプト(Blueskript） SK(-) (Atratag
ene社)中に生体内刺激によってレスキューさせた。

【００７５】 ブラシカ ナプスゲノムDNA配列の分離 ユニバーサルゲノムウォルカーキット(Universal Genome Walker Kit；Clonet
ech社)を用いてBNM3 ATG出発コドンの上流にあるゲノムDNAフラグメントを分離
した。未クローン化アダプター連結ブラシカ ナプスc.v.トーパスゲノムDNAフラ
グメントのプールを構築し、繰込み(nested)PCRによりBNM3ゲノム配列を分離し
た。基本PCRは、製造業者から供給された外的アダプタープライマー(AP1)と下記
の配列を有するBNM3特異性プライマーを使用した： 5’-GAGGCAGCGGTCGGATCGTAACAGTACTCT-3’ (SEQ ID NO:8) 繰込みPCRは、製造業者から供給された繰込みアダプタープライマー(AP2)と下記
の配列を有するBNM3特異性プライマーを使用した： 5’-CATAAGGAGAGAGAGAAAAGCCTAACCAGT-3’ (SEQ ID NO:9) その後、基本PCR混合物を1：50に希釈し、繰込みPCR用のテンプレートとして使
用した。基本PCRと繰込みPCRは、共に製造業者の推奨に従って実施した。繰込み
PCR生成物をpGEMT-Easyベクター(Promega社)中にクローン化し、シーケンシング
した。BNM3AおよびBNM3B cDNA両方の5’未翻訳ゲノム領域に相応するPCR生成物
を同定した。

【００７６】 BNM3A ATG翻訳開始およびTAG翻訳停止コドンを範囲とするゲノムDNA配列を、P
fuポリメラーゼ(Stratagene社)と下記のプライマー組合せを用いて、ブラシカ
ナプスc.v.トーパスゲノムDNAからのPCRによって分離した： 5’-ACCAAGAACTCGTTAGATC-3’ (SEQ ID NO:10)；および 5’-AACGCATATAACTAAAGATC-3’ (SEQ ID NO:11) 各プライマーは、標準PCR条件下で使用した。各PCR生成物をpGEMT-Easyベクタ
ー中にクローン化し、シーケンシングした。

【００７７】 アラビドプシス タリアナ内でのDNAゲルブロット分析およびマッピング 500 ngのアラビドプシスゲノムDNA(生態型コロンビアおよびランズバークエレ
クタ(erecta)) (Shure et al., 1983)を20種の制限エンドヌクレアーゼで消化し
、0.8％アガロースゲルによる電気泳動によって分離し、標準方法を用いてHybon
d N⁺ナイロン膜(Amersham社)上にブロットした。各ブロットを、下記のいずれか
に相応する³²P[dATP]ランダムプライマーラベル化プローブ(Megaprime社、Amers
ham社)でハイブリッド化させた(1.5 M NaCl、65℃)： 1)およそBNM3A cDNA(SEQ ID NO：1)の最初の405 bp、または 2)およそBNM3A cDNAの最後の1200 nt (SEQ ID NO：1)。 その後、低緊縮条件(65℃で2X SSC、0.1％SDS)または中緊縮条件(25℃で0.2X SS
C、0.1%SDS)下で洗浄した。

【００７８】 制限フラグメント長多形性物(RFLP)を生態型コロンビアおよびランズバークエ
レクタ間でCfo I制限エンドヌクリアーゼを用いて同定した。このRFLPを用い、L
isterおよびDeanの組換え近交(RI)系(Lister and Dean, 1993)を使用してアラビ
ドプシスゲノム上のアラビドプシスBNM3ホモログの位置をマッピングした。生態
型コロンビアおよびランズバークエレクタ間の交配により産生させた100種の組
換え近交系からのDNAを、Cfoで消化し、Hybond N⁺ナイロン膜に転移させ、BNM3A
cDNA(上述のような)でハイブリッド化し、低緊縮条件下で洗浄した。得られたR
FLPデータを、マップ位置決定のために、Nottingham Arabidopsis Stock Centre
のRIデータベースに送った(Lander et al., 1987)。結果は、実施例2-2に記載し
ている。

【００７９】 アラビドプシス タリアナゲノムDNA配列の分離 増幅アラビドプシス生態型C24ゲノムラムダファージライブラリー(Lambda-GEM
11、Promega社)の3つのゲノム等価物を、端部切取りBNM3A cDNAプローブ(およ
そSEQ ID NO：1の最後の1200 nt)を用いてスクリーニングした。各ブロットを、 ³² P[dATP]ランダムプライマーラベル化プローブ(上述したような)でハイブリッ
ド化し、次いで、低緊縮条件(65℃で2X SSC、0.1%SDS)で洗浄した。7つのラムダ
ファージを最初に同定した。その後、BNM3遺伝子(SEQ ID NO：6)のアラビドプシ
スホモログを含有する３つの推定全長ラムダファージクローンを、ブラシカ ナ
プスBNM3A cDNA(SEQ ID NO：1のnt 1-405)の5’末端から誘導したプローブによ
る低緊縮条件下でのハイブリッド化後に同定した。約8.0 kbの重複配列を含む個
々のクローンを、上記３つのファージの各々から同定し、pBR322中にサブクロー
ン化し、シーケンシングした。

【００８０】 植物形質転換用のプラスミド構築 ポリユビキチン(POLYUBIQUITIN)またはカリフラワーモザイクウィルス35Sプロ
モーターの制御下にあるBNM3A cDNA含有プラスミドベクターの構築を以下に説明
する。プラスミドpRAP2TUBIは、プラスミドpRAP2T中にヘリアンサス アヌス(Hel
ianthus annus)ポリユビキチンプロモーター(Binet et al., 1991)を含有する。
プラスミドpRAP2Tは、Sac 1およびEco R1制限部位中に挿入したpUCAPプラスミド
(van Engelen et al., 1995)とノパリンシンターゼ(nos)ターミネーターからな
る。最初のエクソンの3’末端から7 bpまでの5’末端を含むポリユビキチンUbB1
プロモーターのPCRフラグメントを、M13逆転プライマーと下記の導入Nco Iおよ
びBam HI制限部位を含むUBIQ-3’プライマーを用いて、上記ベクターから増幅さ
せた： 5’-CCATGGATCCAGAGACGAAGCGAAAC-3’ (SEQ ID NO:12) 上記ポリユビキチンプロモーターフラグメントをPst IおよびBam HIで消化し、
ゲル精製し、pRAP2TのPst IおよびBam HI部位に結合させ、ベクターpRAP2TUBIHa
を作成した。全長BNM3B cDNAをEco RIおよびXho I制限酵素で消化し、クレノウ(
Klenow)酵素で平滑化し、ゲル精製し、pRAP2TUBIのSma I部位に結合させてプラ
スミドpKB1Sを作成した。修飾ポリユビキチンプロモーター、BNM3B cDNAおよびn
osターミネーターを含有するAsc I/Pac I DNAをゲル精製し、Asc I/Pac消化バイ
ナリーベクターpBINPLUS(van Engelen et al., 1995)に結合させて、プラスミド
pKBBIN1Sを作成した。

【００８１】 二重増強35SプロモーターおよびAMV転写エンハンサーの制御下にあるBNM3A cD
NA含有ベクターの構築は、以下のとおりであった。プラスミドpBI525(Datla et
al., 1993)からの二重増強35SプロモーターおよびAMV転写エンハンサーを含有す
るHind III/Xba I DNA制限フラグメントをHind III/Xba I消化pRAP2Tに結合させ
、プラスミドpRAP2T35Sを作成した。Nco I部位をBNM3A cDNAクローン中に部位特
異性変異誘発により導入した。変異誘発に使用したBNM3ANCO1プライマーの配列
は、下記のとおりである： 5’-ACTCCATGGATAATAACTGGTTAGGC-3’ (SEQ ID NO:13) 第2プライマー、BNM3AHINDIII： 5’-AAATTCTCAAGCTTTGGTCCATCTTG-3’ (SEQ ID NO:14) をBNM3ANCO1プライマーと一緒に用いてBNM3A cDNAの305 bpフラグメントを増幅
させた。このPCRフラグメントをNco IおよびHind IIIで消化し、Nco I/KpnI切断
pRAP2T35SおよびHind III部位下流にBNM3A cDNA領域を含有するHind III/Kpn I
フラグメントに結合させて、ベクターp35S:BNM3を作成した。p35S:BNM3をAsc I
およびPac I制限酵素で消化し、二重35Sプロモーター、AMV転写エンハンサー、B
NM3A cDNAおよびnosターミネーターを含有するフラグメントをゲル精製し、Asc
I/Pac I消化バイナリーベクターpBINPLUSに結合させて、プラスミドp35S:BNM3BI
Nを作成した。

【００８２】 pKBBIN1Sおよびp35S:BNM3BINの両プラスミドを、無害化TiプラスミドpMP90を
担持するアルゴバクテリウム チュメファシエンスC58C1株に転移させ、形質転換
実験において使用した。 植物形質転換 アラビドプシス タリアナ生態型C24を形質転換実験における受容体として用い
た。各植物を、CloughおよびBent(1998)に記載されている花弁浸漬法またはVerg
unst等(1998)に記載されている根形質転換法を用いて形質転換させた。 トランスジェニックブラシカ ナプスc.v.“トーパス”植物は、小胞子誘導胚
のアルゴバクテリウム チュマシエンス(tumaciens)介在形質転換によって産生さ
せた。小胞子誘導胚を、ml当りおよそ1000個の胚密度で5週間培養した。アルゴ
バクテリウムの一夜培養物を9％サクロース含有B5培地中で100倍希釈した。胚を
この希釈バクテリアと一緒に暗中で24℃、48時間ゆっくり振りながら共培養した
。その後、胚を、350 mg/Lのセフォタキシンおよび200 mg/Lのバンコマイシンを
補充したNLN13培地に、25℃暗中で少なくとも2週間移植した。

【００８３】 胚を、2％サクロース、セフォタキシン(200 mg/L)およびバンコマイシン(100m
g/L)を補充した固形B5培地上で約2週間25℃の弱光中で発芽させた。発芽胚から
良好に発生した葉軸を分離し、100 mg/Lのカナマイシンを補充した新鮮な発芽培
地に移した。この倍地上で2週間後、外植体を、カナマイシン(25 mg/L)を補充し
た同様な培地に2次培養した。緑色の推定トランスジェニック2次杯が、選択1ヶ
月後に見えるようになった。

【００８４】 顕微鏡 すべての植物材料を、4％のパラホルムアルデヒドを含有するpH 7.0の0.1Mホ
スフェート緩衝液中で4℃一夜固定した。各サンプルを0.1 Mホスフェート緩衝液
中で洗浄し、次いで、100％エタノールまでの等級付けエタノール系中で脱水さ
せた。走査電子顕微鏡用のサンプルは、液体CO₂(Balzers CPD020)中で臨界点乾
燥させ、伝導性カーボン接着剤を用いてSEMスタブ上に取付けた。各サンプルを
、ポラロン(Polaron) E5100スパッターコーターを用いて、30 nmのパラジウム/
金でコーティングした。各サンプルをJEOL JSM 5200走査電子顕微鏡内で15 kVの
加速電圧で観察した。デジタル像を、オリオン フレームグラバー(Orion Frameg
rabber)を用いて得た。光学顕微鏡用のサンプルは、テクノビット(Technovit) 7
100 (Kulzer社)中に埋め込んだ。切片を、1％テトラホウ酸ナトリウム中1％トル
イジンブルー内で10秒間染色し、水洗し、ユパラル(Euparal)内に取付けた。デ
ジタル像を、ソニー(Sony) 3 CCDカメラを用いて記録した。

【００８５】 再生試験 野生タイプおよびトランスジェニックのアラビドプシス種子を表面滅菌し、20
％サクロース含有1/2MS培地(1/2MS-20)上に塗布し、60度の角度に傾斜させた塗
布物で21℃で成長させた。8種の野生タイプ実生および7つの個々のトランスジェ
ニック系の各々からの8種の実生を発芽後10日で収穫し、根、葉軸および葉植外
体に分離した。この材料を2バッチに分割した。外植体の半分は、20％グルコー
ス含有B5培地(B5-20)上で続けて培養した。外植体は、2週間毎に新鮮B5-20培地
に移した。残りの外植体は、苗条再生を誘発させるため、植物成長調節剤を含有
するB5-20上で培養した(Vergunst et al., 1998)。これらの外植体は、先ずカル
ス誘発性培地(CIM；高オーキシン/シトキニン比)上に２日間置き、その後、苗条
誘発性培地(SIM；高シトキニン/オーキシン比)に残りの培養期間移した。植外体
は、2週間毎に新鮮SIM培地に移した。

【００８６】 実施例1 ブラシカ ナプス由来のBNM3遺伝子の分離と特性決定 消去式スクリーニング方法を用いて、ブラシカ ナプスc.v.トーパス小胞子胚
形成中に優先的に発現する遺伝子を分離した(図1)。2つのタイプの小胞子培養物
を消去式プローブの構築に用いた：胚形成性および非胚形成性。胚形成性培養物
は、後期単核小胞子と早期2核花粉を4日間、32℃の加熱応力処理に供することに
よって得た。非胚形成性サンプルは、同じ出発集団の後期単核小胞子と早期2核
花粉を25℃で1日、次いで32℃で3日間培養することによって得た(Pechan et al.
, 1991)。Poly(A)ｍRNAは、胚形成性サンプルから分離し、それを用いて最初の
ストランドcDNAを合成した。次いで、このcDNAを非胚形成性小胞子/花粉サンプ
ルから分離した過剰のPoly(A)⁺RNAにハイブリッド化させた。胚形成性サンプル
中には存在するが非胚形成性サンプルには存在しないかはるかに低いレベルでし
か存在しない配列に富む非ハイブリッド形成性単ストランド化cDNAを回収し、放
射線活性ラベル化し、上述の胚形成性サンプルから誘導したcDNAライブラリーを
スクリーニングするための消去性プローブとして使用した。非胚形成性サンプル
から誘導したプローブに対してではなく、上記消去性プローブにハイブリッド化
しているプラークを選択し、その後の段階の２つの示差スクリーニングに供した
。6つの特異的なDNA配列を含む７つの個々のcDNAクローンが胚形成性サンプルお
よび非胚形成性サンプル間で特異的に発現していることを見出した。後でBNM3A( B rassica napus microspore embryoにおいて)と再命名したこれらクローンの１
つ、42A1を、さらに特性決定した。

【００８７】 実施例2-1 BNM3遺伝子は、AP2ドメイン群の転写活性化剤の新規なメンバーをコードする
単一BNM3 cDNAクローンであるBNM3Aを、胚形成性小胞子cDNAライブラリーを胚形
成性小胞子および花粉内で発現させた遺伝子に富む消去性プローブでスクリーニ
ングした後に分離した。このcDNAクローンのサイズ(1.2 kb)とRANゲルブロット
上で検出した転写体のサイズ(2.2 kb)との違いは、このクローンが全長cDNAを表
してないことを示した。最初に分離されたクローンの全長cDNAに相応するより長
鎖の２つのクローン、BNM3A(SEQ ID NO：1)と新規なBNM3B(SEQ ID NO：3)を、10
日経過ブラシカ ナプス小胞子胚cDNAライブラリーから分離した。これらのクロ
ーンのDNA配列の配列を図2に示す。これら２つのBNM3 cDNAクローンは、長さ201
1および1992 ntであり、ヌクレオチドレベルで97％類似性であり、長さとそれら
の5’および3’未翻訳領域においてほんの僅かに相違していた。両cDNAは、アミ
ノ酸レベルで97％類似する579個のアミノ酸ポリペプチド(予想分子量63.9 kDa、
pI 5.7)を潜在的にコードする(図3)。

【００８８】 各BNM3遺伝子のゲノム複合性を、ブラシカ ナプスゲノムDNA含有ゲルブロット
へ各BNM3 cDNAをハイブリッド形成させることによって測定した(図4)。各BNM3 c
DNAは2つのDNAフラグメントに対し高緊縮条件下でハイブリッド形成する。２つ
のハイブリッド形成性フラグメントは、2つのBNM3遺伝子、即ち、BNM3AおよびBN
M3Bを表す。ブラシカ ナプスは、ジプロイドブラシカ ラパ(B.rapa)およびブラ
シカ オレラセア(B. oleracea)ゲノムのハイブリッド形成により誘導された複2
倍体種であり、従って、２つのBNM3配列は、親ジプロイド後代種各々の単一コピ
ー座から誘導されたようである。

【００８９】 配列データベースの調査は、BNM3翻訳産生物がAP2ドメインの２つのコピーを
含むことを示した(図3)。AP2ドメインは、APETALA2(AP2)、即ち、分裂細胞同一
性、花器官細目、種皮発生および花恒常性遺伝子発現を調節するアラビドプシス
たんぱく質において最初に同定され(Jofuku et al., 1994；WO 98/07842)、それ
以来、種々の機能を有する広範囲のたんぱく質において同定されている。これら
の遺伝子活性化からの機能範囲は、応力(Zhou, 1997；Stockinger, 1997)、並び
に葉、花および胚珠発生の調節(Moose, 1996；Jofuka, 1994；Klucher, 1996)に
対するエチレン応答(Ohme-Takagi, 1995)に関連している。AP2ドメインは、少な
くとも2つの保存領域を含有する56〜68個のアミノ酸繰返し主要素(モチーフ)で
ある：保存YRGアミノ酸主要素およびRAYD要素を含有する高塩基性YRG要素。RAYD
要素は、両親媒性α−へリックス、即ち、たんぱく質-たんぱく質相互作用を介
在すると考えられている構造を形成すると予想されている18個のアミノ酸の保存
性中心コアを含有する。DNAを結合する多くのAP2ドメイン含有たんぱく質の能力
は、推定核局在シグナルと転写活性化剤として機能し得る酸性領域の存在と合せ
て、これらのたんぱく質が転写因子として機能していることを示唆している。

【００９０】 1つのAP2ドメイン(EREBP様)またはリンカー領域によって連結された2つのAP2
ドメイン(AP2様)のいずれかからなる２つの系統分類的に異なる群のAP2ドメイン
たんぱく質は、同定されている(Zhou, 1997)。BNM3は、後者の群に属する。2つ
のAP2ドメインに相当する領域およびBNM3のリンカー領域のデータベース調査に
おいて、BNM3は、アラビドプシスAINTEGUMENTA(ANT；Elliot, 1996；Klucher, 1
996)およびZea mayのZMMHCF1 AP2含有たんぱく質(ZM；Daniell, 1996)に最も類
似していることが判明した。図5は、２つのAP2ドメインを含有する他のたんぱく
質の配列を含むBNM3の2つのAP2ドメインの配列を示している。BNM3は、ANTとの8
5％のアミノ酸配列類似性およびこの領域におけるZMMHCF1との88％の類似性を有
するが、AP2およびこの領域におけるGLOSSY15とのアミノ酸類似性は僅かに66％
である。BNM3たんぱく質の第1AP2ドメイン中の10個のアミノ酸挿入物は、他のAP
2ドメイン含有たんぱく質(Elliot, 1996)からの上記３つのたんぱく質をさらに
区別している。BNM3、AINTEGUMENTAおよびZMMHCF1の各たんぱく質もそれぞれの
アミノ末端領域に小さな疎水性アミノ酸主要部、LG/SFSLSを有するが、一方で、
AP2ドメインおよびリンカー以外のDNAまたはアミノ酸配列中に有意の類似性を示
さない。これらの結果は、BNM3配列がAP2ドメイン群のたんぱく質の特異なメン
バーをコードしていることを示している。

【００９１】 対配列のBNM3BのcDNAおよびアミノ酸、ANTまたはZMMHCF1を含む配列は、： −BNM3Bヌクレオチド配列において、ANT cDNAとの56％の同一性(ANTの1905個の
ヌクレオチドに亘って)およびZMMHCF1 cDNAとの58％の同一性(ZMの1773個のヌク
レオチドに亘って)が存在すること； および、BNM3Bアミノ酸配列において、 −ANTたんぱく質を含むBNM3Bたんぱく質との41％の同一性(ANTの555個のアミノ
酸配列に亘って)およびZMMHCF1たんぱく質との46％の同一性(ZMの485個のアミノ
酸配列に亘って)が存在することを示した。

【００９２】 実施例2-2 ブラシカ ナプスBNM3Bは、1個の単一アラビドプシス タリアナオルソログによ って表せる 。 低および中緊縮条件下で多くのブラシカ ナプスBNM3A cDNA(SEQ ID NO：1)プ
ローブにハイブリッド形成させたアラビドプシスゲノムDNAのDNAゲルブロット分
析は、アラビドプシスゲノム中にブラシカ ナプスBNM3遺伝子の1個のホモログの
存在を示した。RFLPも、Cfo I制限エンドヌクレアーゼを用いて、生態型コロン
ビアおよびランズバークエレクタ類において同定された。このRFLPを用いて、ア
ラビドプシスゲノム上の上記単一BNM3ホモログの位置を染色体5のおよそ34 cMに
マッピングした(Lister and Dean, 1993)。

【００９３】 アラビドプシスゲノムライブラリーの3つのゲノム等価物のスクリーニングに
より、推定全長アラビドプシスBNM3ホモログを含有する3つのラムダクローン(At
BBM)を同定した。この３つのAtBBMクローンの配列分析は、これらが同一(SEQ ID
NO：6)であることを示した。図9AおよびBは、それぞれ、分離したアラビドプシ
スゲノムクローンの制限フラグメントのパターン、およびアラビドプシスゲノム
DNAとブラシカBNM3A cDNAプローブとのハイブリッド化後に得られた制限フラグ
メントのパターンを示している。2つの図の比較は、アラビドプシスAtBBMゲノム
クローンと非相同性プローブを用いたDNAゲルブロット分析により同定したホモ
ログとが同じであることを示している。AtBBMゲノムクローンの配列分析も、IRR
EGULAR XYLEM3(IXR3)の5’末端を推定AtBBMコード領域の下流に位置付けていた(
位置7479、図9A)。IXR3は、マーカーnga106(33.26 cM)とmi438(33.34 cM；Taylo
r et al., 1999)との間の染色体5の150 kb領域にマッピングすることが以前に開
示されている。コのことと併せて、データは、ブラシカBNM3遺伝子のアラビドプ
シスオルソログが染色体5にマッピングする単一遺伝子によってコード化されて
いることを示している。AtBBM、TAMU BACクローン：T10B6 (取得番号AP002073；
Nakamura、2000年5月18日)と極めて類似している配列も染色体5にマッピングし
ている。

【００９４】 ブラシカBNM3Aゲノムクローン(SEQ ID NO：5)とアラビドプシスAtBBMゲノムク
ローン(SEQ ID NO：6)との構造比較は、予想イントロン/エクソン境界が２つの
配列間で高度に保存されていることを示している。両配列は、9個のエクソンと8
個のイントロン配列を含むものと予想される。 AtBBM遺伝子(SEQ ID NO：6)と2つのブラシカcDNA配列(SEQ ID NO：1およびSEQ
ID NO：3)とのDNA配列比較は、3つの配列が、全推定たんぱく質コード領域にお
いて85％類似し、2つのAP2ドメインとこれら2つのAP2ドメイン間のリンカー領域
に亘る546 nt領域において95％類似していることを示している。ATNのような他
の関連AP2ドメインコード遺伝子および2つのAP2ドメインとこれら2つのAP2ドメ
イン間に存在するリンカー領域に亘る領域内の染色体3上のクローンMOE17(取得
番号AB025629)上に位置する配列に対するヌクレオチド類似性は、それぞれ、76
％と78％である。ANTも染色体3上の配列も、AP2ドメインコード領域以外では、A
tBBMに対する有意のDNA類似性を示していない。

【００９５】 AtBBMの予想アミノ酸コード配列と２つのブラシカcDNA配列(SEQ ID NO：1およ
びSEQ ID NO：3)との間の類似性は、全たんぱく質コード領域において約80％、2
つのAP2ドメインとこれら2つのAP2ドメイン間に存在するリンカー領域に亘る182
個のアミノ酸領域において99％である。ANTおよび2つのAP2ドメインとこれら2つ
のAP2ドメイン間に存在するリンカー領域に亘るアミノ酸領域内の染色体3上のク
ローンMOE17上に位置する配列AP2ドメイン配列の両方に対するアミノ酸類似性は
、およそ85％である。これら２つのたんぱく質配列は、いずれも、AP2ドメイン
コード領域以外では、AtBBMに対する有意のDNA類似性を示していない。

【００９６】 実施例3 BNM3遺伝子は発生中の胚内で優先的に発現される RNAゲルブロット分析(図6)を用いて、小胞子誘導胚発生中、種子発生中および
非種子組織内でのBNM3遺伝3遺伝子発現パターンを決定した。両分析は、BNM3遺
伝子が発生中の胚において優先的に発現されることを示している。 RNAゲルブロット分析は、BNM3 mRNAを、胚形成を受けるように誘発された小胞
子培養物内で、並びに小胞子誘導胚発生のその後の小球、心部、トーピードおよ
び子葉段階において検出したことを示している(図6A)。BNM3 mRNAは、非胚形成
性小胞子培養物内、新たに分離した小胞子および花粉内、または培養物内で配偶
子体性を続けている小胞子および花粉内では検出されていない(図6A)。発生中の
種子のRNAゲルブロット分析は、胚発生の心部眼科医に相当する受粉後1後14日(1
4DAP)に先ず検出される。BNM3発現は、胚発生の早期(21DAP)および中期子葉(28D
AP)段階において増大し、その後は一定のままである(図6B)。BNM3転写体は、試
験した非種子組織のいずれにおいても検出されず、これらの組織内での転写体の
低量または不存在を反映している。

【００９７】 実施例4 成長組織内でのBNM3の発現は無性胚形成性を促進する 花BNM3たんぱく質の機能を測定するために、BNM3 cDNAを、2種の別々の構成性
プロモーター構築物、即ち、変性ヒマワリポリユビキチン(POLYYUBIQUTIN)プロ
モーター構築物(以下、UBI:BNM3と称する)およびAMV転写エンハンサーを含有す
る二重増強35Sプロモーター構築物(以下、35S:BNM3と称する)の制御下に置き、
アラビドプシス中に導入した。翻訳体のフェノタイプの分析は、BNM3 cDNAの生
態型過発現が、子葉、葉柄、葉身および苗条先端分裂細胞のような成長構造体で
の体性胚形成性を促進することを示している(図7)。生態型胚を産生する翻訳体
の頻度および生態型胚フェノタイプの浸透度は、POLYYUBIQUTINプロモーターに
比較したとき、BNM3遺伝子を35Sプロモーター-AMV翻訳エンハンサーの制御下に
おいて発現させたときのほうが大であった。即ち、高閾値のたんぱく質産生物が
、生態型胚フェノタイプの頻度および浸透度を増大させるためには必要である。

【００９８】 BNM3誘導生態型胚は、発生中の接合性胚において見出される器官系および組織
層のすべてを含有している。BNM3誘導胚は、2極性であり(図7DおよびE)、胚軸お
よび幼根領域、苗条および根分裂組織、および子葉を含む軸からなっている。さ
らに、各器官系は、接合性胚において見出される3つの特化された組織層(表皮、
基本柔組織および前脈管組織)の特徴的な放射状配列を含有している(図7)。発生
中の生態型胚内でのBNM3遺伝子の連続発現は、新たな肺が先に存在している胚表
面上に連続して形成されるという結果を伴って、胚形成性プロセスの繰返しをも
たらす(図7DおよびEおよびE)。これらの結果は、単一遺伝子、BNM3の発現が、十
分に分化された無性誘導胚の形成に導くシグナルトランス導入カスケードを開始
させるのに十分な能力を示す結論的な証拠を提供している。

【００９９】 実施例5 BNM3発現は植物の再生能力を増大させる 本発明者等は、アラビドプシス植物が添加成長調節剤の存在または不存在下に
生体外で苗条を再生する能力についてのBNM3遺伝子発現の効果を検証した。野生
タイプのアラビドプシスおよびPOLYYUBIQUTINプロモーターの制御下にBNM3を発
現するトランスジェニックアラビドプシス系の10日経過実生からの各葉、根およ
び胚軸を、成長調節剤を含有する培地上に置き、最初のカルス形成およびその後
の苗条器官形成を誘発させた。トランスジェニック系からの根植外体は、野生タ
イプの根植外体に比較したとき、ホルモンの存在下において苗条再生において少
なくとも5倍の増大を示している(図8A)。また、これらの苗条は、野生タイプと
比較したとき、トランスジェニック植外体におけるほうが早く発生した。野生タ
イプの葉および胚軸植外体は、葉柄の切断端上にカルスを産生させることによっ
て応答した(図8B)。これに対し、トランスジェニック系の植外体は、葉柄の切断
端から新たな苗条(図8B)または根を直ぐに発生させた。初期に根を発生させたト
ランスジェニック植外体は、結果として苗条も発生させた。

【０１００】 トランスジェニック植外体は、添加成長調節剤の不存在下においても再生する
ことができた。成長調節剤含まない培地上に置いた野生タイプの葉および胚軸植
外体は、葉柄の切断端でカルスまたは根を時折発生させたが、苗条はこれらの構
造体から再生しなかった(図8C、D)。野生タイプの根は、緑化し、肥大化した結
節状構造体を形成したが、それ以上発育しなかった。対照的に、成長調節剤を含
まない培地上に置いたトランスジェニック植外体は、葉および葉軸植外体の切断
端または根植外体の結節状構造体のいずれからも苗条を再生させた(図8C、D)。

【０１０１】 すべての引例は、参考として本明細書に引用する。 本発明を好ましい実施態様に関連して説明してきた。しかしながら、多くの変
形および修正を本明細書において説明した本発明の範囲を逸脱することなくなし
得ることは、当業者にとって自明であろう。

【０１０２】 参考文献 Anderson, N.L. and Anderson, N.G.(1998). Proteome and proteomics: new technologies, new concepts and new words. Electrophoresi
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【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ブラシカ ナプスの分離小胞子と花粉の発生結果に関する培養温度の効果を図
式的に示す。25℃以下で培養した後期単核小胞子と早期２核花粉は分裂し官能性
花粉粒子を形成し続けたが(配偶子体性)、32℃で培養した同じ小胞子と花分は数
多くの胞子体分裂を受け、単数胚の形成をもたらした(胚形成性)。25℃で1日、
次いで32℃で培養した後期単核小胞子と早期2核花粉は、配偶体性分裂を受けた
が、胚も成熟花粉も形成しなかった(非胚形成性)。

【図２】 SEQ ID NO：1とSEQ ID NO：3内のDNA配列を示す。ATGおよびTAGの翻訳開始お
よび翻訳終了コドンは、太字で示し、同一のヌクレオチドは星印(*)で示し、ギ
ャップは(−)で示している。

【図３】 SEQ ID NO：1とSEQ ID NO：3のDNAによるコードされる予想たんぱく質配列を
示す。第1のAP2ドメイン繰返し(繰返し1)と第1のAP2ドメイン繰返し(繰返し2)を
太字で示している。同一アミノ酸は星印(*)で示し、不整合は配列の下のドット(
．)で示している。

【図４】 ブラシカ ナプスゲノム内の2つのBNM3遺伝子を示す。B.ナプスc.v.トーパス(T
opas)ゲノムDNAの制限消化物を含有するDNAゲルブロットは、高緊縮条件下でBNM
3A cDNAフラグメントにハイブリッド化している。BNM3A cDNAは、これらの条件
下で2つのDNAフラグメントにハイブリッド化している。これらのフラグメントは
、BNM3AおよびBNM3Bの遺伝子に相当する。分子サイズマーカー(ラムダDNA Hind
III制限フラグメント)の位置は、図の左側に示している。DNAを消化するのに用
いた制限酵素は、ブロットの上に示している。

【図５】 他のAP2ドメインたんぱく質の予想たんぱく質配列を含むSEQ ID NO：1のDNA(B
NM3A)によってコードされる予想たんぱく質配列を示す。位置208で始まり、第1
のAP2ドメイン繰返し(AP2ドメイン繰返し1)、第2のAP2ドメイン繰返し(AP2ドメ
イン繰返し2)およびこの2つの繰返し間にあるリンカー領域(リンカー)を結ぶBNM
3Aのアミノ酸配列は、２つのAP2ドメインを含有する他のたんぱく質のアミノ酸
配列を一緒に配列させている。この領域内のアミノ酸類似性は、APETALA2におけ
る53％からZMMHCF1における80％までの範囲にある。同一アミノ酸は(*)で示し、
ギャップは(−)で示している。たんぱく質名は、左側に示し、次のように略記し
ている：ANT、AINTEGUMENTA (取得番号 U41339)；ZM、ZMMHCF1 (取得番号 Z4755
4)；GL15、GLOSSY15 (取得番号 U41466)；AP2、APETALA2 (取得番号 U12546)。

【図６】 表示している組織から抽出したRNA上で実施したBNM3A cDNAフラグメントによ
るゲルブロット分析の結果を示す。RNAゲルブロットは、5μg (a)または20μg (
b、c)のいずれかの全RNAを含有する。図6Ａは、小胞子胚培養物におけるBNM3の
発現パターンを示す。RNAは、後期単核小胞子と早期２核花粉から採取時(花粉 0
d)、32℃で培養4日後(+ 胚)、25℃で培養4日後(花粉 4d)、25℃で培養1日次いで
32℃で培養3日後(−胚)に、さらに、小胞子誘導胚から小球、心部、トーピード
、21日経過子葉(21d cot)、28日経過子葉(28d cot)および42日経過子葉(42d cot
)発生段階で分離した。BNM3発現は、胚形成性小胞子および発生性小胞子誘導胚
内で検出するが、組織培養前に採取した発生性小胞子と花粉、および非胚形成性
サンプルにおいては存在しない。暴露時間は7日間であった。図6Ｂは、BNM3遺伝
子発現が発生中の種子中で検出されたことを示す。種子は、受粉後の種々の日数
(DAP)で採取した。これらの発生時点は、小球(7d)、心部(14d)、トーピード(18d
)、早期子葉(21d)、中期子葉(28d、35d)および後期子葉(42d)の発生段階におよ
そ相当する。暴露時間は14日であった。図6Ｃは、BNM3遺伝子が非種子組織内で
は検出されなかったことを示す。根と葉は、14日経過温室成長植物から採取した
。花全体、および切取った葯と雌芯は、開花直前の開花芽から採取した。小芽と
大芽は、それぞれ、長さ5 mm未満または5 mm以上の閉じた花芽を称する。長角果
は、受粉後16日で採取した。暴露時間は14日であった。

【図７】 修飾POLYUBIQUITINプロモーター(B)およびAMV転写エンハンサーを含有する二
重増強35Sプロモーター(A、C〜E)の制御下にBNM3遺伝子含有構築物で形質転換さ
せたブラシカ ナプスおよびアラビドプシス植物のフェノタイプを示す。図7Ａは
、ブラシカT1実生の葉縁部上の胚構造体を示す。図7Bは、アラビドプシスT2実生
の葉柄上の胚構造体を示す。図7Cは、アラビドプシスT1実生の子葉上の胚構造体
を示す。図7Dは、アラビドプシスT1子葉の背軸面の電子顕微鏡写真を示す。胚の
2極性、並びに1次胚表面(星印)からの2次胚出現物に注目されたい。図7Eは、図7
Cで示したT1実生の１つの子葉の半薄切片を示す。胚の主要器官および組織要素
の存在、並びに苗条突端分裂細胞および子葉の脇部上の新しい胚の発生に注目さ
れたい。

【図８】 修飾POLYUBIQUITINプロモーターの制御下にBNM3B遺伝子含有構築物で形質転換
させたアラビドプシス植物の増大した再生能力を示す。図8Aは、成長調節剤を含
有する培地上での野生タイプおよびトランスジェニックの葉および胚軸植外体を
示す。図8Bは、成長調節剤を含有する培地上での野生タイプおよびトランスジェ
ニックの根を示す。図8Cは、成長調節剤を含有しない培地上での野生タイプおよ
びトランスジェニックの葉および胚軸植外体を示す。図8Dは、成長調節剤を含有
しない培地上での野生タイプおよびトランスジェニックの根植外体を示す。

【図９】 AtBBM遺伝子；BNM3のアラビドプシスオルソログの特性決定を示す。図9Aは、
重複性アラビドプシス タリアナ生態型C24ゲノムDNAのAtBBM配列とおよそ8 kb上
の選択された制限エンドヌクレアーゼ部位との位置を示す。単一アラビドプシス
BNM3ホモログの予想たんぱく質コード領域は、ゲノム配列の位置3426〜6435を結
合している。予想コード領域のエクソンは、制限マップ上の黒囲いとして示して
いる。位置7479での縦方向矢印は、IXR3(不規則キシレム3)配列の開始を示す。
横目盛りバーは、キロベースである。図9Bは、アラビドプシスAtBBMゲノムクロ
ーンとブラシカ ナプスBNM3 cDNAプローブを用いてのDNAゲルブロット分析によ
り同定したアラビドプシスホモログとが同じであること示している。アラビドプ
シス生態型ランズバーグ エレクタ(Landsberg erecta) (L)とコロンビア(Colunb
ia) (C)由来のゲノムDNAを、(A)で示す制限酵素で消化し、全長BNM3A cDNAプロ
ーブ(SEQ ID NO：1)にハイブリッド化させた。(A)で示す制限マップとハイブリ
ッド化用制限フラグメントとの比較は、全長ブラシカcDNAプローブが中緊縮洗浄
条件(25℃での0.2X SSC、0.1％SDS)下で単一アラビドプシスホモログを検出した
ことを示す。分子サイズマーカー(キロベースでの)は、ブロットの右側に示して
いる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｅ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ， ＺＷ (71)出願人 ハー マジェスティー ザ クイーン イ ン ライト オブ カナダ （ザ ミニス ター オブ アグリカルチャー アンド アグリ−フード カナダ によって代表さ れた) カナダ国 ケイ１エー ０シー６ オンタ リオ オタワ ケイ．ダブリュー． ネイ ビー ビルディング イースタン セリー ル アンド オイルシード リサーチ セ ンター (72)発明者 ボウチラー キム オランダ国 エヌ エル−6702 シー ピ ー バーニンゲン グローエン ヴァン プリンストレストラート 87 (72)発明者 オウレット ゼレーセ カナダ国 ケイ２ジェー ３エックス７ オンタリオ ネピーン ケンネヴァーレ ドライブ 115 (72)発明者 クスターズ ジャン オランダ国 エヌ エル−6702 シー ピ ー バーニンゲン ジェン． フォークス エッグ 25 (72)発明者 服部 二郎 カナダ国 ケイ１ジー １エム５ オンタ リオ オタワ ハルステッド ストリート 763 (72)発明者 ミキ ブライアン カナダ国 ケイ１エイチ ５ブイ１ オン タリオ オタワ ドーセット ストリート 1876 (72)発明者 ヴァン ルッケレン シャンパーニュ ミ ッシェル ベルギー国 ビー−9920 ローヴェンデゲ ム ライブストラート 31 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD20 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD09 4B024 AA08 AA20 BA80 CA04 DA01 EA01 FA02 GA11 HA01 4B064 AG01 AG26 CA10 CA19 CC24 DA01 DA10 DA11 4B065 AA88X AA88Y AB01 BA01 CA24 CA41 CA43 CA44 CA53 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA30 DA00 EA01 EA07 EA20 FA72 FA74

Claims (74)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 AP2ドメイン繰返し1-リンカー-AP2ドメイン繰返し2領域を除
   外したSEQ ID NO：1、3および5からなる群から選ばれたヌクレオチド配列または
   そのフラグメントもしくは誘導体に、中庸または緊縮ハイブリッド形成条件下で
   ハイブリッド化するヌクレオチド配列を含む分離DNA分子。
2. 【請求項２】 上記分離DNA分子が、SEQ ID NO：1、3および5からなる群か
   ら選ばれた少なくとも27個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む請求項
   1記載の分離DNA分子。
3. 【請求項３】 上記DNA分子が、SEQ ID NO：1、3および5からなる群から選
   ばれたヌクレオチド配列またはそのフラグメントもしくは誘導体と少なくとも70
   ％相同性である請求項1記載の分離DNA分子。
4. 【請求項４】 たんぱく質をコードする核酸配列を含み、このたんぱく質が
   、植物細胞内に十分量で存在するとき、その植物細胞を胚形成性とし、その植物
   細胞の再生能力を増大させ、またはその植物細胞を胚形成性とし且つその植物細
   胞の再生能力を増大させることの両方を行う分離DNA分子であって、SEQ ID NO：
   1、3および5からなる群から選ばれたヌクレオチド配列またはそのフラグメント
   もしくは誘導体内に少なくとも70％の相同性を有する上記分離DNA分子。
5. 【請求項５】 SEQ ID NO：5のヌクレオチド1620-4873またはそのフラグメ
   ントもしくは誘導体に、中庸または緊縮条件下でハイブリット化するヌクレオチ
   ド配列を含む請求項4記載の分離DNA分子。
6. 【請求項６】 SEQ ID NO：1のヌクレオチド配列またはそのフラグメントも
   しくは誘導体に、中庸または緊縮条件下でハイブリット化するヌクレオチド配列
   を含む請求項4記載の分離DNA分子。
7. 【請求項７】 SEQ ID NO：3のヌクレオチド配列またはそのフラグメントも
   しくは誘導体に、緊縮条件下でハイブリット化するヌクレオチド配列を含む請求
   項4記載の分離DNA分子。
8. 【請求項８】 上記DNAが、SEQ ID NO：２によって構成されるようなたんぱ
   く質をコードする請求項6記載の分離DNA分子。
9. 【請求項９】 上記DNAが、SEQ ID NO：4によって構成されるようなたんぱ
   く質をコードする請求項7記載の分離DNA分子。
10. 【請求項１０】 請求項1〜9のいずれか1項記載の分離DNA分子を含み、その
    分離DNA分子が植物細胞内での上記DNAの発現に特異性である調節要素の制御下に
    あるベクター。
11. 【請求項１１】 上記調節要素が、構成性調節要素である請求項10記載のベ
    クター。
12. 【請求項１２】 上記調節要素が、誘発性調節要素である請求項10記載のベ
    クター。
13. 【請求項１３】 上記調節要素が、組織特異性調節要素である請求項10記載
    のベクター。
14. 【請求項１４】 上記調節要素が、発生活性調節要素である請求項10記載の
    ベクター。
15. 【請求項１５】 請求項10〜14のいずれか1項記載のベクターを含む形質転
    換植物細胞。
16. 【請求項１６】 請求項10〜14のいずれか1項記載のベクターを含む形質転
    換植物。
17. 【請求項１７】 請求項16記載の形質転換植物から得られた種子。
18. 【請求項１８】 請求項4〜9のいずれか1項記載の分離DNA分子によってコー
    ドされた分離たんぱく質。
19. 【請求項１９】 i) 植物細胞を請求項10〜14のいずれか1項記載のベクター
    で形質転換させること； ii) この植物細胞を増殖して形質転換組織を産生させること； iii) この形質転換組織を上記分離DNA分子の出現について選択すること；およ
    び、 iv) 上記形質転換植物を無性胚産生についてアッセイすること； を特徴とする無性誘導胚の産生方法。
20. 【請求項２０】 上記アッセイ工程が、不定胚性についてアッセイすること
    を含む請求項19記載の方法。
21. 【請求項２１】 上記アッセイ工程が、体性胚についてアッセイすることを
    含む請求項19記載の方法。
22. 【請求項２２】 上記アッセイ工程が、配偶体性胚性についてアッセイする
    ことを含む請求項19記載の方法。
23. 【請求項２３】 上記アッセイ工程が、胚嚢の単相単為生殖についてアッセ
    イすることを含む請求項19記載の方法。
24. 【請求項２４】 上記アッセイ工程が、ジプロスポリーについてアッセイす
    ることを含む請求項19記載の方法。
25. 【請求項２５】 i) 植物細胞を請求項10〜14のいずれか1項記載のベクター
    で形質転換させること； ii) この形質転換植物細胞を増殖して形質転換組織を産生させること；および
    、 iii) この形質転換植物組織を、野生タイプの組織と比較したときの改善され
    た再生についてアッセイすること； を特徴とする植物の再生能力の改変方法。
26. 【請求項２６】 上記形質転換植物細胞の増殖工程、上記形質転換組織のア
    ッセイ工程、または上記形質転換植物細胞の増殖工程と上記形質転換組織のアッ
    セイ工程の両方を増殖調節剤の不存在下で実施する請求項25記載の方法。
27. 【請求項２７】 i) 通常は非再生の植物を請求項10〜14のいずれか1項記載
    のベクターで形質転換させること；および、 ii) この形質転換植物が上記の通常は非再生性の植物が再生しない条件下で再
    生できるかどうかを決定すること； を特徴とする形質転換植物の選択方法。
28. 【請求項２８】 SEQ ID NO：5のヌクレオチド1-1619またはそのフラグメン
    トとの少なくとも約70％の類似性を含むDNA配列を含む請求項1記載の分離DNA分
    子。
29. 【請求項２９】 上記分離分子が、SEQ ID NO：5のヌクレオチド1-1619内の
    少なくとも22個の連続ヌクレオチドを含む請求項1記載の分離DNA分子。
30. 【請求項３０】 興味ある遺伝子と操作的に会合させた請求項28または29い
    ずれかの分離DNA分子を含み、この分離DNA分子が、植物細胞内の上記興味ある遺
    伝子に特異性であるベクター。
31. 【請求項３１】 上記興味ある遺伝子が、上記分離DNA分子に対し非相同性
    である請求項30記載のベクター。
32. 【請求項３２】 上記興味ある遺伝子が、製薬上活性なたんぱく質、抗体、
    工業酵素、たんぱく質補充物、栄養補助食品、貯蔵たんぱく質、動物飼料および
    動物飼料補充物からなる群から選ばれる請求項31記載のベクター。
33. 【請求項３３】 請求項30、31または32のいずれか記載のベクターを含む形
    質転換植物細胞。
34. 【請求項３４】 請求項30、31または32のいずれか記載のベクターを含む形
    質転換植物。
35. 【請求項３５】 請求項34の形質転換植物から得られた種子。
36. 【請求項３６】 植物を請求項30、31または32のいずれか記載のベクターで
    形質転換させることを特徴とする植物の発生性胚内の興味ある遺伝子の特異化方
    法。
37. 【請求項３７】 請求項4、5、6または7のいずれか1項記載のヌクレオチド
    配列の選択性マーカーとしての使用。
38. 【請求項３８】 i) 植物細胞を請求項10〜14のいずれか1項記載のベクター
    で一時的に形質転換させるか或いは植物細胞に請求項18記載のたんぱく質を導入
    して変性植物細胞を産生させること； ii) この変性植物細胞を増殖して組織を産生させること；および、 iii) 得られた組織を無性胚形成についてアッセイすること； を特徴とする無性誘導胚の産生方法。
39. 【請求項３９】 上記アッセイ工程が、不定胚性についてアッセイすること
    を含む請求項38記載の方法。
40. 【請求項４０】 上記アッセイ工程が、体性胚についてアッセイすることを
    含む請求項38記載の方法。
41. 【請求項４１】 上記アッセイ工程が、配偶体性胚性についてアッセイする
    ことを含む請求項38記載の方法。
42. 【請求項４２】 上記アッセイ工程が、胚嚢の単相単為生殖についてアッセ
    イすることを含む請求項38記載の方法。
43. 【請求項４３】 上記アッセイ工程が、ジプロスポリーについてアッセイす
    ることを含む請求項38記載の方法。
44. 【請求項４４】 i) 植物細胞を請求項10〜14のいずれか1項記載のベクター
    で一時的に形質転換させるか或いは植物細胞に請求項18記載のたんぱく質を導入
    して変性植物細胞を産生させること； ii) この変性植物細胞を増殖して組織を産生させること；および、 iii) 得られた組織を、野生タイプの組織と比較したときの改善された再生に
    ついてアッセイすること； を特徴とする植物の再生能力の改変方法。
45. 【請求項４５】 上記変性植物細胞の増殖工程、上記組織のアッセイ工程、
    または上記変性植物細胞の増殖工程と上記組織のアッセイ工程の両方を増殖調節
    剤の不存在下で実施する請求項44記載の方法。
46. 【請求項４６】 i) 植物を請求項10〜14のいずれか1項記載のベクターで形
    質転換させて形質転換植物を産生させること； ii) この形質転換植物を上記分離DNA分子の出現について選択すること；およ
    び、 iii) 上記形質転換植物を無性胚産生についてアッセイすること； を特徴とするアポミクト植物の産生方法。
47. 【請求項４７】 上記アッセイ工程が、不定胚性についてアッセイすること
    を含む請求項46記載の方法。
48. 【請求項４８】 上記アッセイ工程が、体性胚についてアッセイすることを
    含む請求項46記載の方法。
49. 【請求項４９】 上記アッセイ工程が、配偶体性胚についてアッセイするこ
    とを含む請求項46記載の方法。
50. 【請求項５０】 上記アッセイ工程が、胚嚢の単為生殖についてアッセイす
    ることを含む請求項46記載の方法。
51. 【請求項５１】 i) 植物細胞を請求項10〜14のいずれか1項記載のベクター
    で一時的に形質転換させるかまたは植物細胞に請求項18記載のたんぱく質を導入
    すること； ii) この植物細胞を増殖して組織を形成させること；および、 iii) 得られた組織を、野生タイプの組織と比較したときの改善された再生に
    ついてアッセイすること； を特徴とする植物の再生能力の改変方法。
52. 【請求項５２】 上記植物細胞の増殖工程、上記組織のアッセイ工程、また
    は上記植物細胞の増殖工程と上記組織のアッセイ工程の両方を増殖調節剤の不存
    在下で実施する請求項51記載の方法。
53. 【請求項５３】 i) 通常は非再生性の植物を請求項10〜14のいずれか1項記
    載のベクターで一時的に形質転換させるか或いは通常は非再生性の植物に請求項
    18記載のたんぱく質を導入して変性植物を産生させること；および、 ii) この変性植物が上記の通常は非再生性の植物が発芽しない条件下で再生で
    きるかどうかを決定すること； を特徴とする変性植物の選択方法。
54. 【請求項５４】 2個のAP2 DNA結合性ドメインからなるたんぱく質をコード
    する配列を含み、そのたんぱく質を植物細胞内で十分量発現させたとき、その植
    物細胞を胚形成性とし、その植物細胞の再生能力を増大させ、またはその植物細
    胞を胚形成性とし且つその植物細胞の再生能力を増大させることの両方を行う分
    離DNA分子。
55. 【請求項５５】 i) 植物を少なくとも1つのベクターで形質転換させること
    、その少なくとも1つのベクターが請求項10〜14のいずれか1項からえらばれて形
    質転換植物を産生させること； ii) 得られた形質転換植物を上記分離DNA分子の出現について選択すること；
    および、 iii) 得られた形質転換植物を増殖して興味あるたんぱく質を産生させ、この
    興味あるたんぱく質の発現を上記分離DNAの発現産生物によって誘発させること
    ； を特徴とする興味あるたんぱく質の産生方法。
56. 【請求項５６】 上記形質転換植物を、上記興味あるたんぱく質をコードす
    るヌクレオチド配列を含む第2ベクターで調節要素の制御下に形質転換させ、こ
    の調節要素が上記分離DNAの発現産生物によって誘発される請求項55記載の方法
    。
57. 【請求項５７】 上記興味あるたんぱく質が生来(ネイティブ)なたんぱく質
    である請求項55記載の方法。
58. 【請求項５８】 上記興味あるたんぱく質が、製薬的に活性なたんぱく質、
    抗体、工業酵素、たんぱく質補充物、栄養補助食品、貯蔵たんぱく質、油脂生合
    成に関連する酵素、動物飼料および動物飼料補充物からなる群から選ばれる請求
    項55または56のいずれか1項記載の方法。
59. 【請求項５９】 上記分離DNAが、SEQ ID NO：２によって構成されたアミノ
    酸と少なくとも70％類似性であるたんぱく質をコードする請求項4〜7のいずれか
    1項記載の分離DNA分子。
60. 【請求項６０】 上記分離DNAが、SEQ ID NO：4によって構成されたアミノ
    酸と少なくとも70％類似性であるたんぱく質をコードする請求項4〜7のいずれか
    1項記載の分離DNA分子。
61. 【請求項６１】 上記たんぱく質が、SEQ ID NO：2において開示された配列
    の約30〜約541個のアミノ酸を含む請求項18記載の分離たんぱく質。
62. 【請求項６２】 上記たんぱく質が、SEQ ID NO：4において開示された配列
    の約30〜約561個のアミノ酸を含む請求項18記載の分離たんぱく質。
63. 【請求項６３】 AP2ドメイン繰返し1-リンカー-AP2ドメイン繰返し2領域を
    除外したSEQ ID NO：6に緊縮条件下でハイブリッド化するヌクレオチド配列を含
    む分離DNA分子。
64. 【請求項６４】 SEQ ID NO：6のヌクレオチド1620-4873またはそのフラグ
    メントもしくは誘導体に、中庸または緊縮条件下でハイブリッド化するヌクレオ
    チド配列を含む請求項4記載の分離DNA分子。
65. 【請求項６５】 上記DNAが、SEQ ID NO：7によって構成されるようなたん
    ぱく質をコードする請求項64記載の分離DNA分子。
66. 【請求項６６】 請求項63〜65のいずれか1項記載の分離DNA分子を含み、上
    記DNA分子が、植物中での上記DNAの発現に特異性である調節要素の制御下にある
    ベクター。
67. 【請求項６７】 上記調節要素が、構成性調節要素である請求項66記載のベ
    クター。
68. 【請求項６８】 上記調節要素が、誘発性調節要素である請求項67記載のベ
    クター。
69. 【請求項６９】 上記調節要素が、組織特異性調節要素である請求項67記載
    のベクター。
70. 【請求項７０】 上記調節要素が、発生活性調節要素である請求項67記載の
    ベクター。
71. 【請求項７１】 請求項66〜70のいずれか1項記載のベクターを含む形質転
    換植物細胞。
72. 【請求項７２】 請求項66〜70のいずれか1項記載のベクターを含む形質転
    換植物。
73. 【請求項７３】 請求項72記載の形質転換植物から得られた種子。
74. 【請求項７４】 請求項65記載の分離DNA分子によってコードされた分離た
    んぱく質。