DE10061931A1 - Nukleinsäuresequenz "M73791" als humanes Gen und deren Derivate, sowie deren Transkriptions- und Translationsprodukte, zur kommerziellen Verwendung in Diagnostik und Therapie - Google Patents

Abstract

Die Erfindung beschreibt die Nukleinsäuresequenz M73791 (mRNA, cDNA; Anlage 1), die aus kultivierten, menschlichen, epithelialen Zellen isoliert wurde. Die DNA Sequenz M73791 ist zu 100% auf dem Abschnitt q28 des Chromosoms X im Bereich der Gene FLNA und G6DH lokalisiert. Es handelt sich um ein während der Evolution stark konserviertes Gen. Das aus der Sequenz vorhergesagte Protein besteht aus 214 Aminosäuren (AS) und befindet sich am C-terminalen Ende einer mit "Genscan" vorhersagbaren Peptidsequenz Nr. 5, 484 AS des humanen X-Chromosoms (Anlage 2) und ist identisch mit 2 weiteren Genprodukten (QM und RPL 10). DOLLAR A Die in dieser Patentschrift beschriebene Nukleinsäuresequenz wird in physiologischen und pathologischen Geweben unterschiedlicher Herkunft differentiell transkribiert. Im Rahmen eines Projektes wurde die Sequenzierung und erste Auswertung bereits 1990 durchgeführt; 1991 wurde die hier genannte Sequenz von M. Kröpelin genauer mit elektronischen Medien untersucht. Ergebnis: Die Sequenz M73791 oder Teile davon, können in positiver oder in negativer 5'-3' Orientierung vorliegen. Wie vorhergesagt, wird die Gensequenz als Protein exprimiert; ein Beweis dafür, daß es sich um ein in dieser Schrift neu beschriebenes Gen handeln muß. Die Erfindung beinhaltet die Nukleinsäuresequenz, bestehend aus 722 Nukleotiden und Derivaten davon. Translationsprodukte (Peptide, Proteine) können sowohl aus dem Sense Plus(+)- als auch dem Antisense Minus(-)-Strang gebildet werden, oder ...

Description

Die Deoxynukleinsäure (deutsch: DNS, international: DNA) kann als das Molekül des Lebens bezeichnet werden. In ihren Strukturen steckt die Information von Peptiden und Proteinen als wichtige Bestandteile aller Organismen und Lebewesen; ferner enthalten sie direkte und indirekte "Anweisungen" zur Zellteilung, Modifikation und Differenzierung von Zellen und Geweben.

Die Kombinationsmöglichkeiten der Nukleinsäuren bilden die Grundlage für den Evolutionsprozeß, der auf der Erde vor ca. drei bis vier Millionen Jahren begonnen hat, und der Millionen von Lebensformen auf diesem Planeten hervorgebracht hat. Entdeckt wurde die DNA 1869 als Hauptbestandteil des Zellkerns durch den Schweizer Wissenschaftler Friedrich Miescher.

1944 wurde die DNA erstmals als Träger der Erbinformation nachgewiesen. 1953 wurde von James Watson und Francis Crick die dreidimensionale Doppelhelixstruktur der DNA entdeckt und ein Replikationsmechanismus postuliert.

DNA ist in Zellen enthalten; diese wurden vor 300 Jahren durch den Einsatz des ersten Mikroskops entdeckt. Alle lebenden Organismen bestehen aus Zellverbänden. Bei nichtbakteriellen Zellen ist der innere Bereich zweigeteilt, in ein membranumhülltes, kugeliges Gebilde, den Zellkern oder Nucleus, und in das ihn umgebende Zytoplasma. Dieser Zelltyp wird als Eukaryot bezeichnet. Zellen ohne abgegrenzten Zellkern heißen Prokaryoten; in ihnen ist die zelluläre DNA zu Stäbchen aufgerollt; die Chromosomen befinden sich im Zellplasma.

DNA und RNA bestehen aus vielen kleinen, linear verketteten Bausteinen, den Nukleotiden A, G, C und T (U). Nukleotide bestehen aus Purin-/Pyrimidinbasen und Phosphatgruppen, die über ein Zuckermolekül miteinander verknüpft sind.

Mehrere verknüpfte Nucleotide bilden eine Polynukleotidkette. Das Zucker-Phosphat- Rückgrat der DNA enthält eine Deoxyribose, während RNA im Zuckeranteil Ribose enthält. DNA wird in einem sogen. Replikationsprozeß durch spezifische Polymerasen vermehrt; RNA-Ketten werden wiederum an doppelsträngigen DNA-Matrizen synthetisiert, dabei wird die in der DNA vorkommende Base Thymin(T) in der RNA durch Uracil(U) ersetzt. Den Vorgang der RNA-Synthese an DNA-Matrizen nennt man Transkription. Die RNA dient als Vorlage für die Anordnung von Aminosäuren in den Polypeptidketten der Proteine. Der Vorgang der Übersetzung von genetischer Information in ein Protein heißt Translation.

Bereits gegen Ende des 19. Jahrhunderts hatte man in Zellen den zweiten Nukleinsäuretyp, die Ribonukleinsäuren (RNA) gefunden. Im Gegensatz zur DNA ist RNA hauptsächlich im Zytoplasma einer Zelle enthalten (Mitochondrien enthalten zusätzlich zur DNA des Zellkerns auch noch eigene DNA und RNA). Ihren Aufgaben und Strukturen entsprechend werden RNA Moleküle in 3 Gruppen eingeteilt: kurzlebige Boten = messenger RNA (mRNA), ribosomale RNA (rmA) und transfer RNA (tRNA), an die sich jeweils eine Aminosäure speziefisch anheften kann, um an den Ort der Proteinbiosynthese - dem Ribosomenkomplex, transportiert zu werden. Ribosomen bestehen im Wesentlichen aus 2 Untereinheiten (bei Eucaroyten 60S u. 405; S steht für Sedimentationskoeffizient), diese wiederum aus Proteinen und sRNA.

Ribosomale RNA (rmA) macht ca. 97% der gesamten RNA einer Zelle aus, der Rest - ca. 3%, besteht aus mRNA, die von "aktiven" Genen (dsDNA dient als Matrix) durch spezielle Enzyme transkribiert wird.

DNA gibt ihre Information über die lineare Sequenz der vier Basen Adenin(A), Thymin(T), Cytosin(C) und Guanin(G) weiter, deshalb werden diese als Buchstaben des genetischen Alphabets bezeichnet. Bei Genmutationen muß es sich deshalb um Veränderungen in der Basensequenz handeln, diese können entweder durch Ersatz eines Basenpaares (Substitution), durch Einfügen (Insertion), Verlust (Deletion) oder Verstümmelung (Depletion) eines oder mehrerer Basenpaare erfolgen. Sense- und Antisense-Strang enthalten jeweils komplementäre Basenpaare (A/T oder G/C).

Die Richtung jeder Nukleinsäurekette ist durch die Orientierung ihres Zucker-Phosphat- Rückgrats definiert. Das über das 5'-Kohlenstoffatom der CH2-Gruppe des Zuckers abschließende Strangende wird 5'- genannt, das über das 3'-C-Atom 3'-Ende. Alle RNA- und DNA-Ketten wachsen vom 5'- zum 3'-Ende. Die Translation erfolgt ebenfalls in 5'-3'- Richtung.

Jeweils 3 Nukleotide codieren für eine Aminsoäure, daher ist die Anzahl der Basenpaare (bp) in einem Gen mindestens dreimal so groß im Vergleich zur Anzahl der Aminosäuren des entsprechenden Polypeptids. Die Sequenz ATG (Methionin) ist im allgemeinen die 1. Aminosäure am Anfang eines Gens, während es mehrere Stopp Codons gibt. Eine komplette Gensequenz enthält meistens an ihrem 3'-Ende eine Poly-A-Kette unterschiedlicher Länge. Die Genprodukte (Proteine) von Mutanten weisen in ihrer Aminosäuresequenz entsprechende Veränderungen auf.

Das Studium der Gene begann mit Gregor Mendel, der diese als Träger von vererblichen Eigenschaften postulierte. Man schätzt heute die Anzahl der menschlichen Gene auf 60 000 bis 110 000.

Die hier beschriebene Gensequenz M73791 wurde von M. Kröpelin innerhalb eines Projektes zur Tumorsuppression in Boston gefunden. Nach Subklonierung von cDNA aus einer Lambda gt10 Genbank (M. Stampfer, R. Sager, USA) in das Phagemid Vektor System pCDM8, wurde aus einer Reihe von Klonen die Insert-DNA eines Klones eingehender untersucht. Ausgangspunkt war eine DNA Probe von 300 bzw. 210 Basenpaarlänge, die aus einer subtraktiven Hybridisierung eines Zellpaares (Normal und Tumor) gleichen Ursprungs stammte und im Labor zur Verfügung stand.

Northern Blots wurden mit Gesamt-RNA aus unterschiedlichen Zellen oder Geweben beschickt und mit markierten DNA "Proben", die aus cDNA gewonnen wurden, hybridisiert. Die oben genannte Sequenz ist sowohl in normalem als auch in malignen Zellen vorhanden, jedoch unterschiedlich stark (differentiell) transkribiert.

Die Sequenzierung von Klonen, die in solchen Blots ein positives Signal ergaben, erfolgte nach der Dideoxy-Methode und einem Sequenase Kit. Aus einer Reihe von Sequenzierungs­ daten wurde die Sequenz M73791 ausgewählt, da sie auf ein vollständiges, noch nicht bekanntes Gen schließen ließ. Die DNA mit 722 bp enthält eine Startseite (Pos. 10-18) und ein Poly-A-Ende (nicht gezeigt), sowie Bindungsstellen für bekannte Bindungsproteine (SPi- RAS1.2; AP2-CS4; NFKb-TNFa-K.1) und regulatorische Sequenzen (CCAAT; EBP-20) (Anlage 1).

Der Genabschnitt, der für QM kodiert, befindet sich auf dem langen Arm des X-Chromosoms (Xq28); Kaneko K, et al.: Genomic organization of a cDNA (QM) demonstrating an altered mRNA level in nontumorigenic Wilms' microcell hybrid cells and its localization to Xq28. Hum Mol Genet 1: 529-533 (1992).

Es wurde neu gefunden, daß auf dem Chromosom 19 eine 90%ige Übereinstimmung mit der hier angegebenen Proteinsequenz besteht (Anlage 3).

Eine Nukleinsäuresequenz im Abschnitt 19q13.3-q13.4 könnte mit dem familiären Wilms Tumor 2 (FWT2) in einem Zusammenhang stehen. In dieser Region befindet sich u. a. auch das Gen für den SP1-Transkriptionsfaktor (vergl. Anlage 1) und für BCL2-assoziiertes X Protein. Eine weitere Sequenzübereinstimmung (<90%) mit M73791 befindet sich auf Chromosom 21.

Die kodierenden DNA Sequenzen und die daraus abgeleiteten Proteine von HUMQM (744 bp) und HUMNOVGEN (722 bp) sind zu 100% identisch; seit 1992 sind auch die Peptid Sequenzen des 60S ribosomalen Proteins bekannt, die ebenfalls den beiden Proteinsequenzen entsprechen.

Im Rahmen des internationalen Sequenzierungs Programms für das humane Genom wurde auf dem langen Arm des X Chromosoms (Xq28) ein Abschnitt zwischen dem Filamin Gen (FLNA) bis zum Glucose-6-Phosphate-Dehydrogenase Gen (G6PD) lokalisiert, der offensichtlich auch die 2 Gene HUMNOV und QM (vergl. oben) und damit auch das Gen für das ribosomale Protein L10 enthält (Anlage 4).

Abweichend von diesen beiden Sequenzen hat die 886 bp lange Sequenz AX015398 zwei Insertionen im Bereich der hier patentierten M73791 Sequenz, die im Vergleich zum HUMNOVGENE durch Verschiebung des Peptid Leserasters zu einem Frameshift von 3 nach 1 am C-terminalen Ende führen. Die Nukleotidsequenz ist zu 97,9% identisch in 720 bp von M73791 (Anlage 5).

Dowdy u. a. isolierten 1991 aus einem Zellhybrid aus Wilms Tumor und normaler Zell Linie nach subtraktiver cDNA/RNA Hybridisierung einen einzelnen, neuen cDNA Klon, der als QM bezeichnet wurde. Die cDNA hat 745 Nukleotide und kodiert für ein vorhergesagtes hydrophiles, 25 kd schweres, basisches Protein. Das QM Protein wird in embryonalen und reifen Gewebezellen exprimiert und bewirkt eine Herunter-Regulierung der Expression in reifen Nieren- und Herzzellen Linien. QM ist Mitglied einer Multigenfamilie (Dowdy SF, et al.: The isolation and characterization of a novel cDNA demonstrating an altered mRNA level in nontumorigenic Wilms' microcell hybrid cells. Nucleic Acid Res 1991 Oct 25; 19(20): 5763-9).

Bisher wurden für "M73791" (HUMINOVGENE) als Synonym verwendet HUMQM (M64241; DXS648) und RPL10 Human (60S ribosomal protein L10).

Die Auswertung der primären Sequenz ergab, dass es sich um ein neu beschriebenes Gen handeln muß, das jedoch auch als ribosomales Protein im Zytosol humaner Zellen vorkommt. Hierbei handelt es sich um ein stark konserviertes Protein, das in Maus und Ratte zu 99% mit dem humanen RPL10 identisch ist.

Eine japanische Gruppe fand im Rahmen eines Sequenzierungs Projektes eine 869 bp lange DNA Sequenz (AK026568; Anlage 6), die aus "Signet-Ring Carcinoma" Zell Linien stammt und im Vergleich zum HUMNOVGENE eine nicht-konservative Basensubstitution enthält; daraus läßt sich ein Peptid ableiten, das in Frame 1 für 222 Aminosäuren kodiert, die auf Grund der Mutation einen Austausch der Aminosäure Phenylalanin (F) in Pos. 152 von M73791 zu Leucin (L) in Pos. 283 in der Sequenz AK026568 aufweist (Anlage 7).

Ferner ist von Bedeutung, daß die 3'-Lamin Rezeptor homologe DNA Sequenz (S35960; 739 BP), zu 99,9% identisch mit M73791 ist, dessen Protein jedoch auf Grund einer G- Deletion in der DNA Sequenz bei Pos. 383 (Anlage 8) nur zu 57% mit dem vorhergesagten HUMNOVGENE Protein übereinstimmt.

Die DNA Sequenz M73791 wurde 1990 in Boston (USA) als Teil eines Projektes zur Isolierung von humanen Tumor-Suppressorgenen nach Sequenzierung mehrerer Klone erhalten und genauer charakterisiert. - Die Auswahl dieses und weiterer Klone erfolgte nach Einsatz einer "Probe", die aus einer subtraktiven Hybridisierung stammte.

Zur Überprüfung der Transkription wurde RNA aus Tumor- und Nicht-Tumorzellen oder Geweben isoliert und in Northern Blots mit radioaktiv-markierten "Probes" auf Hybridisierungssignale getestet. Zusätzlich zu einer intensiven Hybridisierungsbande, die bei allem Material auftrat, ergab RNA aus nicht malignen Zellen eine weitere, aber schwache Bande im Blot. Nach Amplifizierung (RT-PCR), Klonierung und Sequenzierung wurde die Sequenz M73791 erhalten.

Die erste Computeranalyse der primären Sequenz (cDNA) erfolgte 1990/91 und wurde später ausgedehnt. Die Ergebnisse aus Experimenten und elektronischer Analyse werden jetzt erstmalig auch zu kommerziellen Zwecken genutzt.

ANLAGE 1

ANLAGE 2

Die mit GENSCAN ermittelte Peptidsequenz 5 auf Chromosom Xq28 (FLNA/G6PD; L44140) ist im terminalen Bereich in 214 Aminosäuren zu 100% mit HUMINOVGENE identisch (siehe Unterstreichung).

ANLAGE 3

Die mit GENSCAN ermittelte Peptidsequenz 4 auf Chromosom 19 ist in 214 Aminosäuren des terminalen Bereiches zu 90% mit HUMNOVGENE identisch (siehe Unterstreichung)

ANLAGE 4

ANLAGE 5

ANLAGE 6

ANLAGE 7

ANLAGE 8

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (11)

1.

• A) Nukleinsäuresequenz M73791 (HUMNOVGENE), Länge 722 Basen ohne Poly-A(n):
  
• B) Translationsprodukt von A) 214 Aminosäuren:
  

Eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Genprodukt oder ein Teil davon kodiert umfassend "M73791", HUMNOVGENE - synonyme Beschreibung für HUMQM und RPL10 Human

• a) eine Nukleinsäuresequenz wie oben (A) aufgeführt
• b) eine allelische Variation
• c) derivative Formen

wie im Header der Patentansprüche durch Nukleotidbasensequenz und Aminosäuresequenz im Translationsprodukt eindeutig gekennzeichnet.

2. Verwendung der Nukleinsäuresequenz M73791 in in positiver und negativer 5'-3' Orientierung des Plus(+)Sensestranges oder des Minus(-)Antisensestranges, respektive der Produkte dieser Varianten.

3. Verwendung der Nukleinsäuresequenz M73791 oder Teile davon als therapeutisches Agens (Antisens/Sens).

4. Verwendung der Nukleinsäuresequenz M73791 oder Teile davon zur Gewinnung von cDNA und/oder Polypeptiden, Proteinen.

5. Mutationen wie z. B. Insertionen, Deletionen, Substitutionen, SNPs (= Single Nucleotide Polymorphism) in der Nukleinsäuresequenz oder eines seiner Derivate werden in der Diagnostik eingesetzt.

6. In fötalem Gewebe wird im Vergleich zum adulten Gewebe/Zellen häufiger der Minus- im Vergleich zum Plus-Strang exprimiert. Es wird angenommen (zum Teil bestätigt), daß beide Transskript- und Proteinarten auch nebeneinander vorkommen können (Koexistenz von Sense und Antisense).

7. Die Suppressorfunktion geht im Tumor verloren, bzw. wird weniger stark exprimiert; Punktmutationen spielen hierbei eine wichtige Rolle.

8. Während der Tumorgenese wird die fetalen Entwicklung in teilweise wiederholt (Analogie).

9. Durch Punktmutationen entstandene Derivate von HUMNOVGENE sind benannt worden (2× Insertionen; 1× Deletion, 1× Substitution).

10. Therapeutische Wirkung von aus der obigen Sequenz abgeleiteten Peptide.

11. Verwendung von M73791 bzw. Teile davon als "Molekulare Probes" in der Gen- bzw. Tumordiagnostik.