-
Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist die Identifikation neuer Gene, die
für Zellbestandteile
codieren, die in der Regulation der Angiogenese impliziert sind.
Genauer gesagt, betrifft sie ein Verfahren, das die Identifikation
dieser Gene gestattet; die von den identifizierten Genen codierten
Faktoren zur klinischen Untersuchung des Angiogenesevorgangs, zur
Diagnostik und zur Behandlung von Pathologien, die mit diesem Vorgang
zusammenhängen,
sowie für pharmakologische,
pharmakogenomische oder Pharmakosignal-Tests.
-
Angiogenese
ist ein grundlegender Vorgang, durch den sich neue Blutgefäße bilden.
Dieser Vorgang ist wesentlich für
viele normale physiologische Phänomene,
wie Reproduktion, Entwicklung oder auch Narbenbildung. Bei diesen
normalen biologischen Phänomenen
steht die Angiogenese unter strikter Kontrolle, d.h. sie wird für einen
kurzen Zeitraum, einige Tage, ausgelöst und dann vollständig gehemmt.
Mehrere Pathologien hängen
jedoch mit einer invasiven und unkontrollierten Angiogenese zusammen.
Arthritis ist beispielsweise eine Pathologie, die auf einer Knorpelschädigung durch
invasive neugebildete Gefäße beruht.
Bei diabetischer Retinopathie führt
die Invasion der Retina durch neugebildete Gefäße zu Erblindung der Erkrankten;
die Neuvaskularisation des Augenapparates stellt den Hauptgrund für Blindheit
dar, und diese Neuvaskularisation herrscht bei etwa zwanzig Augenerkrankungen
vor. Schließlich
hängen
Wachstum und Metastasierung von Tumoren direkt mit der Neuvaskularisation
zusammen und hängen
von der Angiogenese ab. Der Tumor stimuliert das Wachstum neuer Gefäße für sein eigenes
Wachstum. Außerdem
stellen diese neuen Gefäße Wege
zum Entkommen der Tumore dar, so dass diese in die Blutzirkulation
gelangen und Metastasen an entfernten Stellen, wie der Leber, der Lunge
oder dem Knochen, hervorrufen.
-
Bei
anderen Pathologien, wie kardiovaskulären Erkrankungen, Erkrankungen
der peripheren Arterien, vaskulären
oder zerebralen Läsionen,
kann die Angiogenese eine wichtige therapeutische Basis darstellen.
Tatsächlich
kann das Fördern
der Angiogenese in geschädigten
Bereichen zur Bildung neuer lateraler Blutgefäße alternativ zu den geschädigten Gefäßen führen, die
somit das Blut und folglich Sauerstoff und andere Nährstoff-
und biologische, für
das Überleben
der betreffenden Gewebe notwendige Faktoren zuführen.
-
Die
Bildung neuer Gefäße durch
endotheliale Zellen beinhaltet die Wanderung, das Wachstum und die
Differenzierung der Endothelzellen. Die Regulation dieser biologischen
Phänomene
hängt direkt mit
der genetischen Expression zusammen. Hinsichtlich der Angiogenese
zeigt eine ständig
zunehmende Zahl an Studien, dass die Regulation der Angiogenese über ein
Gleichgewicht zwischen Faktoren ausgeübt wird, die direkt auf die
endotheliale Zelle einwirken. Diese Faktoren können einerseits Stimulantien sein,
wie VEGF, die FGFs, IL-8, HGF/SF, PDGF usw.; sie können auch
Inhibitoren sein, wie IL-10, IL-12, gro-α und -β, Plättchenfaktor 4, Angiostatin,
von humanen Chondrozyten abgeleiteter Inhibitor, Thrombospondin,
Leukämie
inhibierender Faktor usw. (Jensen, Surg. Neural., 1998, 49, 189–195; Tamatani
et al., Carcinogenesis, 1999, 20, 957–962; Tanaka et al., Cancer
Res., 1998, 58, 3362–3369;
Ghe et al., Cancer Res., 1997, 57, 3733–3740; Kawahara et al., Hepatology,
1998, 28, 1512–1517;
Chandhuni et al., Cancer Res., 1997, 57, 1814–1819; Jendraschak und Sage,
Semin. Cancer Biol., 1996, 7, 139–146; Majewski et al., J. Invest.
Dermatol., 1996, 106, 1114–1119).
-
Die
Steuerung der Angiogenese stellt somit eine strategische Achse sowohl
für die
Grundforschung, um unser Verständnis
zahlreicher, mit der Angiogenese zusammenhängender pathologischer Phänomene zu
verbessern, als auch eine Basis zur Ausarbeitung neuer Therapien
dar, die dazu bestimmt sind, mit der Angiogenese zusammenhängende Pathologien
zu behandeln.
-
Um
die Angiogenese zu steuern, haben mehrere pharmazeutische Gruppen
Therapiestrategien entwickelt, die direkt auf der Verwendung parakriner
Signale, stimulatorischer und inhibitorischer Faktoren als Mittel
zur Förderung
oder Hemmung der Angiogenese basieren. Diese Strategien basieren
im Wesentlichen auf der Verwendung dieser Faktoren in ihrer Proteinform
als die Angiogenese stimulierende oder inhibierende Mittel oder
auch seit neuestem in Form von Expressionsvektoren, die die gewählten Faktoren
codieren.
-
Die
Entdeckung neuer Moleküle,
die als Wirkstoff dienen können,
der bei der Behandlung von. mit der Angiogenese zusammenhängenden
Pathologien nützlich
ist, wird erleichtert, wenn man über Studienmodelle
verfügt,
die es gestatten, In-vitro-Experimente durchzuführen.
-
Es
ist möglich,
endotheliale Zellen in Kultur zu halten. Bei einem ersten Kulturverfahren
lässt man
die Zellen an den ebenen Boden einer Kulturflasche, eingetaucht
in ein Kulturmedium, binden und inkubiert sie dann, bis eine konfluente
Zellschicht erhalten wird. Andere Kulturverfahren sind dadurch gekennzeichnet,
dass man die Endothelzellen an den ebenen Boden einer Kulturflasche
binden lässt,
der zuvor mit einer Schicht von Proteinen bedeckt wurde, die zur
Familie der als extrazelluläre
Matrixproteine bezeichneten Proteine gehören. Bei noch anderen Verfahren
bedeckt man die endothelialen Zellen mit einem Gitter, das erhalten
wird, indem man ein Protein dieser Familie, wie Kollagen oder Fibrin,
zurückhält, das
somit ein Kollagen- bzw. Fibringitter bildet.
-
Bei
der Kultur endothelialer Zellen erhält man ungeachtet der verwendeten
Technik nach einer bestimmten Inkubationszeit eine Monoschicht aus
einer homogenen Zellpopulation. Dennoch besitzt jede so erhaltene
Population eine Organisation ohne Bezug zu derjenigen differenzierter
endothelialer Zellen, die neue Gefäße bilden.
-
Man
hat bereits gezeigt, dass es bei der Kultur endothelialer Zellen
unter einem Kollagen- oder Fibringitter nach Stimulation der Schicht
endothelialer Zellen durch eines der parakrinen Signale, die die Angiogenese
fördern,
möglich
ist, differenzierte endotheliale Zellen zu erhalten, die in vitro
Kapillarröhren
bilden (Montesano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83,
7297–7301).
Diese durch die stimulierten endothelialen Zellen in vitro gebildeten
Kapillarröhren
sind mit den neugebildeten Gefäßen vergleichbar,
die durch den gleichen Zelltyp während
der Angiogenese in vivo gebildet werden. Somit stellen sie ein Modell
dar, das für
die Forschung an neuen, an der Regulation der Angiogenese beteiligten
Faktoren geeignet ist.
-
Die
Regulation der Angiogenese erfolgt über ein Gleichgewicht zwischen
der Wirkung stimulierender Faktoren und der Wirkung inhibierender
Faktoren. Diese Faktoren, die selbst Produkte der Genexpression
sind, sind mitogen: Sie steuern die Expression mehrerer Gene, die
in der Regulation der Angiogenese impliziert sind und können auch
in anderen physiologischen oder pathologischen Vorgängen impliziert
sein. Somit sind zwei Familien von Genen an der Regulation der Angiogenese
beteiligt. Einerseits die Familie der ersten Generation von Genen,
die für stimulatorische
oder inhibitorische Faktoren codieren. Andererseits die Familie
der Gene, die für
zelluläre
Bestandteile codieren, die eng an der Regulation der Angiogenese
beteiligt sind, wie zelluläre
Rezeptoren, extrazelluläre
Matrixproteine, Ankopplungsproteine ("docking proteins"), Brückenbildungsproteine ("adapter proteins"), Kinasen, Phosphatasen,
Proteasen, Glycosyltransferasen usw. Diese Familie von Genen bildet
daher eine "Familie
der zweiten Generation von Angiogenesegenen".
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung
von codierenden Genen für zelluläre Bestandteile,
die eng in der Regelung der Angiogenese impliziert sind und zur
Familie der zweiten Generation von Angiogenesegenen gehören. Unter
zellulären
Bestandteilen werden Proteine, Gruppen von Proteinen oder Proteinassemblierungen
des Typs verstanden, der nachstehend für die von den Genen der Familie
der zweiten Generation codierten Produkte definiert ist. Die Faktoren,
die den Vorgang stimulieren oder inhibieren, steuern die Expression von
Genen, die in der Erhöhung
oder Hemmung der Angiogenese impliziert sind. Zwei Typen genetischer Expressionsprofile
müssen
somit untersucht werden: Das erste ist dasjenige der Zellen, die
unter Bedingungen gehalten werden, die die Angiogenese stimulieren,
das zweite entspricht demjenigen der Zellen, die unter Bedingungen
gehalten werden, die die Angiogenese inhibieren.
-
Obwohl
der physiologische Status der Zellen unter Bedingungen, die die
Angiogenese hemmen, und derjenige nicht-stimulierter endothelialer
Zellen vergleichbar sind, ist es wichtig, die Expression von Genen
in den zwei Fällen
zu unterscheiden. Tatsächlich
sind die endothelialen Zellen, die mit einem die Angiogenese fördernden
Faktor, wie beispielsweise FGF1, stimuliert und mit einem die Angiogenese hemmenden
Faktor inkubiert werden, nicht in der Lage, neue Gefäße zu bilden.
Außerdem
sind viele Faktoren, die die Angiogenese hemmen, Mitogene und beeinflussen
die Genexpression, wie IL-10, IL-12, gro-α und -β usw. Die endothelialen Zellen
können daher
unter Bedingungen, die die Angiogenese hemmen, eine Genexpression
aufweisen, die sich von der Genexpression einer nichtstimulierten
endothelialen Zelle unterscheidet. Also ist es wichtig, die Genexpressionsprofile
von Zellen, wenn diese unter verschiedenen Kulturbedingungen gehalten
werden, nämlich
Bedingungen, die die Angiogenese stimulieren und inhibieren, in
Bezug auf genau definierte Bezugskulturbedingungen zu vergleichen.
-
Die
Identifikation von für
zelluläre
Bestandteile codierenden Genen, die in der Regelung der Angiogenese
impliziert sind, wird dank des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglicht.
Dieses Verfahren ist im Anspruch 1 definiert.
-
Zur
Identifizierung der Mitglieder der Familie der zweiten Generation
von Genen, die in der Regelung der Angiogenese impliziert sind,
haben die Erfinder daher vier Typen von experimentellen Kulturbedingungen
für endotheliale
Zellen festgelegt:
- – Die unter der Bezugsbedingung
(CR) kultivierten Zellen werden nicht stimuliert.
- – Die
Zellen, die unter einer die Angiogenese fördernden Bedingung (CPA) kultiviert
werden, werden mit einem angiogenetischen Faktor stimuliert. Dieser
kann beispielsweise FGF1, FGF2, HGF, PDGF usw. sein.
- – Die
Zellen, die unter einer die Angiogenese inhibierenden Bedingung
(CIA) kultiviert werden, werden mit einem angiogenetischen Faktor
stimuliert und mit einem oder mehreren antiangiogenetischen Faktoren
inkubiert. Der stimulierende Faktor kann FGF2 sein, der inhibierende
Faktor kann beispielsweise aus IL-10, IL-12, der Chemokinen grc-α oder -β usw. ausgewählt sein.
- – Die
unter Kontrollbedingungen (CC) kultivierten Zellen werden mit einem
antiangiogenetischen Faktor inkubiert. Dieser kann beispielsweise IL-10, IL-12, die Chemokine
gro-α oder
-β usw. sein.
-
Diese
experimentellen Kulturbedingungen werden auf endotheliale Zellen
angewendet, die gemäß einem
der Verfahren kultiviert werden, die dem Fachmann bekannt sind.
Die extrazelluläre
Proteinmatrix kann insbesondere aus Fibrin, Kollagen, Laminin, Matrigel,
Fibronectin oder jedem anderen Protein bestehen, das zur Familie
der extrazellulären
Matrixproteine gehört.
-
Die
Faktoren, die die Angiogenese stimulieren oder inhibieren können, werden
aus Faktoren ausgewählt,
deren Wirkung auf den Angiogenesevorgang demonstriert wurde (Jensen,
Surg. Neural., 1998, 49, 189–195;
Tamatani et al., Carcinogenesis, 1999, 20, 957–962; Tanaka et al., Cancer
Res., 1998, 58, 3363–3369;
Ghe et al., Cancer Res., 1997, 57, 3733–3740; Kawahara et al., Hepatology,
1998, 28, 1512–1517;
Chandhuni et al., Cancer Res., 1997, 57, 1814–1819; Jendraschak und Sage,
Semin. Cancer Biol., 1996, 7, 139–146; Majewski et al., J. Invest. Dermatol.,
1996, 106, 1114–1119).
-
Die
im Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens
verwendeten Faktoren, die die Angiogenese stimulieren, werden aus
den Folgenden ausgewählt:
- – den
Fibroblastenwachstumsfaktoren 1 bis 15 (FGF 1 bis FGF 15)
- – dem
epidermalen Wachstumsfaktor (EGF)
- – dem
vaskulo-endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF)
- – dem
Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF)
- – dem
Plättchen-abhängigen Wachstumsfaktor (PDGF)
- – Interleukin
8 (IL-8)
- – Angiogenin
- – dem
transformierenden Wachstumsfaktor (TGF)
- – dem
Neurokin Midkin
- – Pleiotropin
jedem
anderen proteinartigen, die Angiogenese induzierenden Faktor.
-
Die
im Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens
verwendeten Faktoren, die die Angiogenese inhibieren, werden aus
Folgenden ausgewählt:
- – Thrombospondin
- – Angiostatin
- – Endostatin
- – Plättchen-Faktor
4
- – Interleukin
10 (IL-10)
- – Interleukin
12 (IL-12)
- – den
Chemokinen gro-α und
-β
- – dem
von menschlichen Chondrozyten abgeleiteten Inhibitor
- – dem
Leukämie
inhibierenden Faktor
- – Tumor-Nekrose-Faktor
(TNF)
oder jedem anderen proteinartigen Faktor, der die Angiogenese
inhibiert.
-
Die
verschiedenen, die Angiogenese regulierenden Faktoren werden zu
den Zellkulturen gemäß dem Fachmann
bekannten Verfahren hinzugefügt (Montesano
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83, 7297–7301).
Die für
jeden der verschiedenen Faktoren einzusetzenden wirksamen Konzentrationen
sind vorteilhafterweise die Folgenden: 1 ng/ml bis 200 ng/ml.
-
Bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren
ist es möglich,
dass ein oder mehrere der Faktoren, die die Angiogenese stimulieren
oder inhibieren können, zu
den kultivierten Zellen in Form eines Expressionsvektors zugegeben
werden, der derart konstruiert ist, dass er die Synthese des oder
der Faktor(s/en) in der Zellkultur gestattet. Ein Beispiel für einen
solchen Vektor ist in Tanaka et al. (Cancer Res., 1998, 58, 3362–3369) genannt.
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren
umfasst im Schritt c) die Analyse des Expressionsprofils der Gene
der Zellen unter einer die Angiogenese stimulierenden oder inhibierenden
Bedingung. Diese Analyse basiert auf der Untersuchung der Boten-RNAs der
Endothelzellen unter der die Angiogenese stimulierenden oder inhibierenden
Bedingung durch Vergleich mit den Boten-RNAs von Zellen unter der
Bezugs- und der Kontrollbedingung. Diese Boten-RNAs werden aus den
Zellen mittels herkömmlicher
Techniken extrahiert (Vancopoulos et al., 1990, in "Methods for cloning
and analysis of eucaryotic genes",
S. 8–23,
Hrsg. Jones and Bartlett, Boston), welche die Isolierung der RNA
von den anderen zellulären
Bestandteilen gestatten. Die Boten-RNAs werden von den anderen RNAs
beispielsweise unter Nutzung der an ihrem Ende vorliegenden Poly-A-Sequenz
isoliert.
-
Die
Analyse der verschiedenen Boten-RNA-Populationen kann mithilfe eines differenziellen
Darbietungs- (Display-) Verfahrens durchgeführt werden, das die folgenden
Schritte umfasst:
- – Die Boten-RNAs werden revers
transkribiert,
- – die
durch reverse Transkription erhaltenen DNA-Moleküle werden mittels Elektrophorese aufgetrennt,
- – die
DNA-Moleküle
von Interesse werden erkannt und anschließend vom Träger der Elektrophorese extrahiert,
- – die
DNA von Interesse wird gereinigt,
- – die
gereinigte DNA kann als Sonde zum Screening
einer cDNA-Bank
verwendet oder auch direkt subkloniert und sequenziert werden.
-
Die
gereinigte DNA kann insbesondere als Sonde für das Screening einer cDNA-Bank
oder auch zum Nachweis einer komplementären Nukleinsäure mittels
Northern-Blot verwendet werden.
-
Das
differenzielle Display gestattet den gleichzeitigen Nachweis von
zwei Gruppen von Genen, die differenziell exprimiert werden, beispielsweise
bestimmten Genen in Zusammenhang mit einem unter (a) ausgewählten angiogenetischen
Faktor und anderen in Zusammenhang mit einem unter (b) ausgewählten antiangiogenetischen
Faktor. Die differenzielle Displaytechnik gestattet außerdem der
Nachweis seltener mRNAs sowie die Minimierung von Redundanz und
falschpositiven Klonen.
-
Bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren
kann die Analyse der verschiedenen Boten-RNA-Populationen auch mittels
subtraktiver Hybridisierung erfolgen.
-
Subtraktive
Hybridisierung beinhaltet die Isolierung der mRNAs, die reverse
Transkription der mRNAs, die Konstruktion von cDNA-Bibliotheken, die Subtraktion
und das Screening mittels differenzieller Hybridisierung.
-
Die
beiden Techniken sind ergänzend
und werden zur Identifizierung der mRNAs verwendet, die mit Angiogenese
in Zusammenhang stehen.
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren
ist somit dahingehend bemerkenswert, dass es die qualitative und
quantitative Einschätzung
der Angiogenese unter der Wirkung zweier Typen von parakrinen, nämlich angiogenetischen
und antiangiogenetischen, Signalen gestattet.
-
Außerdem kann
mit diesem Verfahren die Wirkung verschiedener Proteine als extrazelluläre Matrix
(Fibrin, Kollagen, Laminin, Matrigel, Fibronectin usw.) in Kombination
mit den parakrinen Signalen getestet werden. Ferner kann das Verfahren
leicht modifiziert werden, so dass es einen anderen Zelltyp zusätzlich zu
den endothelialen Zellen enthält.
-
Weitere
Vorteile und Merkmale der Erfindung werden. beim Lesen der folgenden
Beispiele deutlich, die nicht einschränkend sind und sich auf 1 beziehen.
-
Beispiel 1: Differenzielles
Display
-
1 zeigt schematisch das Verfahren des differenziellen
Displays der in der Angiogenese implizierten Gene.
-
Die
mRNAs werden spezifisch extrahiert und unter Verwendung von jeder
von vier Gruppen degenerierter Oligo (dT) -Primer, T12MN, wobei
M für G, A
oder C und N für
G, A, T oder C stehen kann, revers transkribiert.
-
Jede
Gruppe vor Primern ist durch die 3'-terminale Base (N) definiert, mit einer
Degeneration in Höhe
der Position (M). Beispielsweise besteht der Primer-Satz, in dem
N = G ist, aus Folgenden:
5'-TTTTTTTTTTTTGG-3'
5'-TTTTTTTTTTTTAG-3'
5'-TTTTTTTTTTTTCG-3'
-
Das
Diagramm des Gels stellt schematisch die Ergebnisse der Verwendung
einer einzelnen Gruppe von Primern an Endothelzellen unter den drei folgenden
experimentellen Bedingungen dar: CR = Bezugsbedingung (endotheliale
Zellen in Kultur ohne jegliche Stimulation), CPA = die Angiogenese
fördernde
Bedingung (endotheliale Zellen, die mit einem aus (a) ausgewählten angiogenetischen
Faktor, wie FGF2, stimuliert wurden), CIA = die Angiogenese inhibierende
Bedingung (endotheliale Zellen werden gleichzeitig mit einem aus
(a) ausgewählten
angiogenetischen Faktor und einem aus (b) ausgewählten antiangiogenetischen
Faktor stimuliert); CC = Kontrollbedingung (durch einen aus (b)
ausgewählten antiangiogenetischen
Faktor stimulierte Endothelzellen).
-
Die
gestrichelten Linien in 1 zeigen die RNA,
die durchgezogenen Linien die DNA. T12MN ist der degenerierte Oligo(dT)-Primer;
M kann A, G oder G (degenerierte Position) sein; N kann A, C, G oder
T sein.
-
Beispiel 2: Subtraktive
Hybridisierung
-
2 zeigt schematisch das Verfahren der subtraktiven
Hybridisierung von cDNA.
-
Die
mRNAs werden aus den Zellen, die verschiedenen Arbeitsbedingungen
unterworfen werden, extrahiert und revers transkribiert, um die
einzelsträngigen
cDNAs zu erhalten, die die in den Zellen exprimierten RNA-Sequenzen wiedergeben.
-
Die
einsträngige
cDNA, die aus einer Zelle hervorgeht, die einer Arbeitsbedingung
unterworfen wurde, beispielsweise einer die Angiogenese stimulierenden
Bedingung, wird mit einem Überschuss
an RNA hybridisiert, die aus Zellen stammt, die einer anderen Arbeitsbedingung
unterworfen wurden, beispielsweise den Bezugsbedingungen. Bei einer
derartigen Hybridisierungsreaktion bilden die cDNAs, die Sequenzen
entsprechen, die unter den beiden Arbeitsbedingungen exprimiert
werden, Hybride mit der RNA. Dagegen verbleibt cDNA, die nicht in
der RNA repräsentiert
ist, in Form der einzelsträngigen
cDNA.
-
Indem
die Menge der in der Hybridisierungsreaktion verwendeten mRNA beschränkt wird,
kann dieses Verfahren vorteilhafterweise auch zur Isolierung einer
cDNA-Sequenz verwendet
werden, die eine oder mehrere mRNA(s) darstellt, die in den Zellen überexprimiert
wird/werden, die einer Arbeitsbedingung, beispielsweise einer die
Angiogenese stimulierenden Bedingung, unterworfen wurden.
-
Die
doppelsträngige
cDNA und die einzelsträngige
cDNA können
insbesondere mittels Chromatographie an einer Hydroxyapatit-Säule getrennt werden.
Die so isolierte einzelsträngige
cDNA entspricht einer mRNA, die in den Zellen, die einer besonderen
Kulturbedingung unterworfen werden, spezifisch vorhanden ist oder überexprimiert
wird. Diese cDNA kann für
das Screening einer cDNA-Bank verwendet werden, um das entsprechende
Gen zu identifizieren, zu isolieren und zu klonieren.