Bekannt ist, dass die sPLA2G2A eine Rolle bei der Entstehung verschiedener
entzündlicher Erkrankungen spielt. Die Expression der sPLA2G2A kann durch
Zytokine und bakterielle Toxine auf transkriptioneller Ebene induziert werden.
Allerdings scheint dieser Mechanismus nicht für alle Zelltypen zu gelten. In
vaskulären Glattmuskelzellen aus der Ratte konnte zum Beispiel gezeigt werden,
dass die Induktion der sPLA2G2A-Expression über Lipopolysaccharide unabhängig
von inflammatorischen Proteinen ist (4).
Überraschenderweise wurde nun in der Analyse von Aorten aus verschiedenen
hypertonen Rattenmodellen mittels Chiptechnologie eine erhöhte Expression der
sPLA2G2A in hypertonen Ratten im Vergleich zu normotonen Kontrollen
beobachtet. Dieser Befund konnte mittels quantitativer PCR-Analyse bestätigt
werden. Ebenso wurde über die Chip-Analyse von humanem Herzgewebe aus DCM-
Patienten (DCM = dilatative Kardiomyophatie) vor und nach mechanischer
Entlastung mittels left ventricular assist device (LVAD) eine Regulation der
sPLA2G2A gefunden. Nach Behandlung wurde eine deutlich niedrigere Expression
der sPLA2G2A beobachtet. Auch dieser Befund konnte mittels quantitativer PCR-
Analyse bestätigt werden.
In den untersuchten Aorten aus hypertonen Ratten ist eine eindeutige Korrelation
zwischen erhöhter sPLA2G2A-Expression und Hypertonie zu beobachten. Da diese
Beobachtung auch für Experimente an Dahl-Ratten zutrifft, in denen durch
Salzfütterung und nicht durch Alterung ein erhöhter Blutdruck erzeugt wird, spricht
dies für einen Zusammenhang von Bluthochdruck und sPLA2G2A-Expression.
Zudem zeigen auch schon die jungen, noch normotonen Tiere eine erhöhte
sPLA2G2a-Expression im Vergleich zu den Kontrollen gleichen Alters. Dies zeigt,
dass die sPLA2G2A eine Rolle in der Entstehung des Bluthochdruck spielt.
Bei der Analyse von DCM-Herzen unter LVDA-Behandlung konnte eine Korrelation
zwischen der Abnahme der sPLA2G2A-Expression und der Entlastung der DCM-
Herzen beobachtet werden. Ein ähnlicher Verlauf der Expression wird auch für ANP
und BNP gefunden, während keine Abnahme der Expression inflammatorischer
Marker beobachtet wird. Dieser Befund spricht für eine Regulation der sPLA2G2A
unabhängig von inflammatorischen Prozessen.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher die Verwendung von sPLA2G2A-
Inhibitoren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder der
Prophylaxe der folgenden Krankheiten: koronare Herzkrankheiten, insbesondere
stabiler und instabiler Angina pectoris, akuter Myokardinfarkt,
Myokardinfarktprophylaxe, plötzlicher Herztod, Herzinsuffizienz, sowie Bluthochdruck und die
Folgen der Atherosklerose, sowie Gefäßerkrankungen, Erkrankungen der Niere,
insbesondere Nierenversagen, entzündlichen Erkrankungen und Erektionsstörungen.
Antagonisten im Sinne der Erfindung sind alle Substanzen, die eine Inhibition der
biologischen Aktivität der sPLA2G2A bewirken. Besonders bevorzugte
Antagonisten sind Nukleinsäuren inklusive "locked nucleic acids", "peptide nucleic
acids" und "Spiegelmere", Proteine inklusive Antikörper und niedermolekulare
Substanzen, ganz besonders bevorzugte Antagonisten sind niedermolekulare
Substanzen.
Die Inhibition kann z. B. im unten beschriebenen sPLA2G2A-Inhibitionstest
gemessen werden.
Dabei werden solche sPLA2G2A-Antagonisten bevorzugt, die im unten angegebenen
sPLA2G2A-Inhibitionstest mit einem IC50 von 1 µM, bevorzugt mit einem IC50 von
weniger als 0,1 µM inhibieren.
Vorzugsweise können die erfindungsgemäßen sPLA2G2A-Antagonisten die
Blut/Hirn Schranke nicht passieren und wirken systemisch und nicht zentral.
Beschreibung der Abbildungen
1. Vergleich der relative Expression der sPLA2G2A in Aorten von normotonen
und hypertonen Ratten
Dargestellt ist der Mittelwert ± SD der Expression der sPLA2G2A relativ zu β2-
Mikroglobulin (rE) in den Aorten verschiedener Rattenstämme. Der Mittelwert ± SD
wird aus der angegebenen Anzahl an Tieren pro Gruppe berechnet. Es wurden
folgende Ratten-Stämme untersucht: spontan hypertensive Ratten (SHR), spontan
hypertensive "stroke prone" Ratten (SHR-SP) mit Wistar-Kyoto-Ratten (WKY) als
Kontrolle, transgene Renin-Ratten (TGR) mit Sprague-Dawley-Ratten (SD) als
Kontrolle und salzsensitive Dahl-Ratten (DahlS) mit salzresistenten Dahl-Ratten
(DahlR) als Kontrolle. Für die SHR-, SHR-SP- und TGR-Ratten werden für die
Analysen zwei Zeitpunkte verwendet. Es werden Tiere im Alter von 5 Wochen
(young) und im Alter von 15-20 Wochen für die SHR- und SHR-SP-Ratten bzw. im
Alter von 10 Wochen für die TGR-Ratten (old) mit den entsprechenden Kontrollen
gleichen Alters analysiert. In den salzsensitiven Dahl-Ratten wird der Bluthochdruck
durch Salzbelastung induziert. 7 Wochen alte Tiere werden für 4 Wochen mit Futter,
welches 8% NaCl enthält, gefüttert (DahlS+NaCl). Als Kontrollen dienen DahlR-
Ratten mit Salzbelastung (DahlR+NaCl) und DahlS- und DahlR-Ratten des gleichen
Alters ohne Salzbelastung. Die Expressionsanalyse der sPLA2G2A in der Ratte
zeigt, dass in allen hypertonen Tieren (SHR old, SHR-SP old, TGR old,
DahlS+NaCl) die Expression der sPLA2G2A in der Aorta im Vergleich zu den
Kontrollen erhöht ist. Im Folgenden sind die Ergebnisse tabellarisch dargestellt
(Mittelwert der relativen Expression rE, Standardabweichung SD, Mittelwert der Ct-
Werte für sPLA2G2A und β2-Mikroglobulin).
2. Vergleich der relativen Expression der humanen sPLA2G2A in humanen
DCM-Herzen vor und nach LVAD-Behandlung
Dargestellt ist die Expression der sPLA2G2A relativ zu β-Aktin (rE) in Herzproben
aus vier Patienten (Patient1-4), die bei der Implantaion des LVAD (impl) und bei
Explantation des LVAD (expl) nach Erholung entnommen werden. In Patient 2, 3 und
4 ist eine Reduktion der mRNA für die sPLA2G2A zum Zeitpunkt der Explantation
im Vergleich zum Zeitpunkt der Implantation zu beobachten. Die Ergebnisse sind
tabellarisch dargestellt (Mittelwert der relativen Expression rE aus einer
Dreifachbestimmung, Standardabweichung SD, Mittelwert der Ct-Werte für
sPLA2G2A und beta-Aktin).
3. Relative Expression der humanen sPLA2G2A in humanen Geweben
Dargestellt ist die Expression der sPLA2G2A relativ zu β-Aktin in verschiedenen
humanen Geweben. Im humanen Gewebeprofil zeigt sich, dass die sPLA2G2A im
Herz weitaus schwächer exprimiert wird als in den Gefäßen, vor allem der
Koronaraterie. (1 = Herz, 2 = Koronaraterie, 3 = Ateria radialis, 4 = Vena saphena,
5 = fötale Aorta, 6 = Aorta, 7 = Gehirn, 8 = Rückenmark, 9 = Leber, 10 = Skelettmuskel,
11 = Fettgewebe, 12 = Magen, 13 = Dickdarm, 14 = Dünndarm, 15 = Niere, 16 = Lunge,
17 = Milz, 18 = Thymus, 19 = Knochenmark, 20 = Hoden, 21 = Nebenniere, 22 = Plazenta,
23 = Uterus, 24 = Prostata, 25 = Makrophagen, 26 = Thrombozyten).
Folgend sind die Ergebnisse tabellarisch aufgelistet.
Untersuchungen der sPLA2G2A-Expression an der Ratte und beim Menschen
Die relative Expression der sPLA2G2A in Geweben aus der Ratte und in humanen
Geweben wird durch die Quantifizierung der mRNA mittels der Echtzeit-
Polymerasekettenreaktion ermittelt (5). Gegenüber der klassischen PCR bietet die
Echtzeit-PCR den Vorteil einer genaueren Quantifizierung durch Einführung eines
zusätzlichen, fluoreszenzmarkierten Oligonucleotides. Diese sogenannte Sonde
enthält am 5'-Ende den Fluoreszenzfarbstoff FAM (6-Carboy-Fluorescein) und am
3'-Ende den Fluoreszenzquencher TAMRA (6-Carboxy-tetramethylrhodamin).
Während der Polymerasekettenreaktion wird in der TaqMan-PCR durch die 5'-
Exonukleaseaktivtät der Taq-Polymerase der Fluoreszenzfarbstoff FAM von der
Sonde abgespalten und dadurch das vorher gequenchte Fluoreszenzsignal erhalten.
Als sog. Schwellenwert [treshold cyle (Ct-Wert)] wird die Zyklenzahl aufgezeichnet,
bei der die Fluoreszenzintensität ca. 10 Standardabweichungen über der Hintergrund-
Fluoreszenz liegt.
Als Ausgangsmaterial für die PCR wird käuflich erworbene zelluläre Gesamt-RNA
verwendet (Fa. Clontech). Im Fall der humanen Herzen werden kleine Stücke (ca. 0,5 g)
explantierter Herzen von Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie (erhalten vom
Deutschen Herzzentrum Berlin) und die Gesamt-RNA hieraus mittels RNAeasy-
Säulen (Fa. Qiagen) gemäß der Anleitung isoliert. Im Fall der Gewebe aus der Ratte
wird aus den präparierten Aortenstücken ebenfalls die Gesamt-RNA isoliert. Je 1 µg
Gesamt-RNA je Gewebe wird zur Entfernung von Kontaminationen mit genomischer
DNA mit 1 Einheit DNase I (Fa. Invitrogen) für 15 min bei Raumtemperatur
umgesetzt. Die Inaktivierung der Dnase I erfolgt durch Zugabe von 1 µl EDTA (25 mM)
und nachfolgendes Erhitzen auf 65°C (10 min).
Anschließend wird im selben Reaktionsansatz die cDNA-Synthese gemäß der
Anleitung zum "SUPERSCRIPT-II RT cDNA synthesis kit" (Fa. Invitrogen)
durchgeführt und das Reaktionsvolumen mit destilliertem Wasser auf 200 µl
aufgefüllt. Für die PCR wird zu je 5 µl der verdünnten cDNA-Lösung 7,5 µl
Gemisch von Primer und Sonde sowie 12,5 µl TaqMan-Reaktionslösung (qPCR-
Mastermix, Fa. Eurogentec) gegeben. Die Endkonzentration der Primer ist jeweils
300 nM, die der Sonde 150 nM. Die Sequenz des "forward"- und "reverse"-Primers
für die sPLA2G2A der Ratte lautet: 5'-GACTCATGACTGTTGTTACAACCGT-3'
(SEQ ID NO: 6) bzw. 5'-CGGTAGGAGAACTTGTAGGTCAGAA-3' (SEQ ID
NO: 7), die Sequenz der fluoreszierenden Sonde 5'-6FAM-
TGGAGAAACGTGGATGTGGCACAAAG-TAMRA-3' (SEQ ID NO: 8). Die
Sequenz des "forward"- und "reverse"-Primers für die humane sPLA2G2A lautet: 5'-
CCCATGGGAATTTGGTGAAT-3' (SEQ ID NO: 3) bzw. 5'-
CATAACTGAGTGCGGCTTCCT-3' (SEQ ID NO: 4), die Sequenz der
fluoreszierenden Sonde 5'-6FAM-TCCACAGAATGATCAAGTTGACGACAGGA-
TAMRA-3' (SEQ ID NO: 5). Die PCR erfolgt auf einem ABI-Prism-SDS-7700-
Gerät (Fa. Applied Biosystems) gemäß der Anleitung des Herstellers. Dabei werden
40 Zyklen durchgeführt. Der Ct-Wert (s. o.) der für die sPLA2G2A für jedes Gewebe
erhalten wird, entspricht dem Zyklus, in dem die Fluoreszenzintensität der
freigesetzten Sonde ca. 10 Standardabweichungen über dem Hintergrundsignal liegt.
Je niedriger der Ct-Wert, umso früher beginnt also die Vervielfältigung, d. h. je mehr
mRNA ist in der ursprünglichen Probe enthalten. Zum Ausgleich eventueller
Schwankungen bei der cDNA-Synthese wird in allen untersuchten Geweben auch die
Expression eines sog. "Haushaltsgenes" analysiert. Dieses sollte in allen Geweben
ungefähr gleich stark exprimiert werden. Für die Normierung der sPLA2G2A-
Expression in humanen Geweben wird hierfür humanes β-Actin verwendet. Die
Sequenz des "forward"- bzw. "reverse" Primers für humanes β-Actin ist 5'-
TCCACCTTCCAGCAGATGTG-3' (SEQ ID NO: 9), und 5'-
CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3' (SEQ ID NO: 10), die Sequenz der Sonde 5'-
6FAM-ATCAGCAAGCAGGCAGTATGACGAGTCCG-TAMRA-3' (SEQ ID NO:
10). Für die Normierung der sPLA2G2A-Expression in Geweben aus der Ratte wird
hierfür β2-Mikroglobulin verwendet. Die Sequenz des "forward"- bzw. "reverse"
Primers für β2-Mikroglobulin aus der Ratte ist 5'-TGCCATTCAGAAAACTCCCC-
3' (SEQ ID NO: 12), und 5'-GGAAGTTGGGCTTCCCATTC-3' (SEQ ID NO: 13)
die Sequenz der Sonde 5'-6FAM-TCAAGTGTACTCTCGCCATCCACCGG-
TAMRA-3' (SEQ ID NO: 14). Die Auswertung der Daten wird folgendermaßen
durchgeführt: für die graphische Darstellung der Gewebeverteilung der sPLA2G2A
wird für jedes Gewebe der dCt-Wert berechnet. Der dCt-Wert ist die Differenz
zwischen dem Ct-Werte für die sPLAG2A und dem Ct-Wert des Haushaltsgens im
jeweiligen Gewebe. Aus diesem Wert wird nach folgender Formel eine relative
Expression rE berechnet:
rE = 2(x-dCt)
Der Wert X ist ein angenommener Durchschnittswert für das jeweilige Haushaltsgen
(x = 20 für β-Aktin, x = 17 für β2-Mikroglobulin).
Für Gewebe mit einem Ct-Wert > 35 wird die relative Expression gleich null gesetzt.
Für die Expressionsanalyse in der Ratte werden vier verschiedene
Bluthochdruckmodelle verwendet: spontan hypertensive Ratten (SHR), spontan hypertensive
"stroke prone" Ratten (SHR-SP) mit Wistar-Kyoto-Ratten (WKY) als Kontrolle,
transgene Renin-Ratten (TGR) mit Sprague-Dawley-Ratten (SD) als Kontrolle und
salzsensitive Dahl-Ratten (DahlS) mit salzresistenten Dahl-Ratten (DahlR) als
Kontrolle. In den SHR-, SHR-SP- und TGR-Ratten bildet sich der Bluthochdruck mit
zunehmendem Alter aus. Aus diesem Grund werden für die Analysen zwei
Zeitpunkte verwendet. Es werden Tiere im Alter von 5 Wochen (young) und im Alter
von 15-20 Wochen für die SHR- und SHR-SP-Ratten bzw. im Alter von 10 Wochen
für die TGR-Ratten (old) mit den entsprechenden Kontrollen gleichen Alters
analysiert. In den salzsensitiven Dahl-Ratten wird der Bluthochdruck durch
Salzbelastung induziert. 7 Wochen alte Tiere werden für 4 Wochen mit Futter,
welches 8% NaCl enthält, gefüttert. Als Kontrollen dienen DahlR-Ratten mit
Salzbelastung und DahlS- und DahlR-Ratten des gleichen Alters ohne Salzbelastung.
Die Expressionsanalyse der sPLA2G2A in der Ratte zeigt, dass in allen hypertonen
Tieren (SHR old, SHR-SP old, TGR old, DahlS+NaCl) die Expression der
sPLAG2A in der Aorta im Vergleich zu den Kontrollen erhöht ist (Abb. 1).
Dargestellt ist jeweils der Mittelwert ± SD der relativen Expression für die
angegebene Anzahl an Tieren pro Gruppe.
Die Expressionsdaten der sPLA2G2A im Menschen zeigen, dass in 3 von 4 Patienten
eine deutliche erniedrigte Expression der sPLA2G2A nach Entlastung der DCM-
Herzen zu beobachten ist (Impl = Probenentnahme bei Implantation des LVAD, Expl
= Probenentnahme nach Erholung bei Explantation des LVAD, Abb. 2).
Dargestellt ist jeweils der Mittelwert ±SD aus einer Dreifachbestimmung.
Im humanen Gewebeprofil zeigt sich, dass die sPLAG2A im Herz weitaus schwächer
exprimiert wird als in den Gefäßen, vor allem der Koronaraterie (Abb. 3).
Test der sPLA2G2A-Inhibition
Die Inhibition der sPLA2G2A wird in einem chromogenen Assay mit gemischten
Substratmizellen gemessen (Reynolds L. J. et al. Analysis of human synovial fluid
phospholipase A2 on short chain phosphatidylcholine-mixed micelles: Development
of a spectrophotometric assay suitable for a microtiterplate reader (6).
Dazu wird das sPLA2 Substrat 1,2-Bis(heptanoylthio)-1,2-dideoxy-sn-glycero-3-
phosphorylcholine (diheptanoyl thio-PC) (2 mM) mit Triton-X-100 (0.3 mM) in
Assaypuffer (10 mM CaCl2, 0.1 mM KCL, 1 mg/ml BSA, 25 mM Tris-HCl, pH 7.5)
versetzt. Die Suspension wird bei 40°C erwärmt und solange gemischt, bis eine klare
Lösung entstanden ist. Die Substratlösung wird zunächst auf die Polystyren-
Mikrotiterplatte pipettiert (0.2 ml pro Loch), anschließend wird jeweils 5 µl DTNB
(5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (33 mM in H2O, pH 7.5) hinzugegeben. Nach
einer Äquilibrierungsphase von 3 min wird jeweils 5 µl der zu testenden Substanzen
bzw einer Lösungsmittelkontrolle hinzupipettiert. Der Teststart erfolgt durch Zugabe
von 10 µl sPLA2G2A. Nach dem Mischen der Lösung wird die Absorption bei 405 nm
jede Minute 10-30 Minuten lang gemessen. Der IC50-Wert entspricht der
Substanzkonzentration, bei dem die sPLA2G2A-Aktivität zu 50% gehemmt ist.
Die in vivo-Testung der sPLA2G2A-Antagonisten wird in hypertonen
Rattenstämmen (SHR-SP, SHR, TGR) durchgeführt. Zudem existiert ein Mausstamm, in
dem die sPLA2G2A überexprimiert wird (7). Dieser Mausstamm dient zum einen als
weiteres in vivo-Testsystem und zum anderen zur weiteren Überprüfung der
Krankheitshypothese. Es ist zu erwarteten, dass bei diesem Mausstamm ein durch die
Überexpression der sPLA2G2A bedingter erhöhten Blutdruck zu beobachten ist.
sPLA2G2A-Antagonisten Formulierungen
Die sPLA2G2A-Antagonisten können in bekannter Weise in die üblichen
Formulierungen überführt werden, wie Tabletten, Dragees, Pillen, Granulate, Aerosole,
Sirupe, Emulsionen, Suspensionen und Lösungen, unter Verwendung inerter, nicht
toxischer, pharmazeutisch geeigneter Trägerstoffe oder Lösungsmittel. Hierbei soll
die therapeutisch wirksame Verbindung jeweils in einer Konzentration von 0,5 bis 90 Gew.-%
der Gesamtmischung vorhanden sein, d. h. in Mengen, die ausreichend sind,
um den angegebenen Dosierungsspielraum zu erreichen.
Die Formulierungen werden beispielsweise hergestellt durch Strecken der Wirkstoffe
mit Lösungsmitteln und/oder Trägerstoffen, gegebenenfalls unter Verwendung von
Emulgiermitteln und/oder Dispergiermitteln, wobei z. B. im Fall der Benutzung von
Wasser als Verdünnungsmittel gegebenenfalls organische Lösungsmittel als
Hilfslösungsmittel verwendet werden können.
Die Applikation erfolgt in üblicher Weise, vorzugsweise oral, transdermal,
intravenös oder parenteral, insbesondere oral oder intravenös. Sie kann aber auch durch
Inhalation über Mund oder Nase, beispielsweise mit Hilfe eines Sprays erfolgen, oder
topisch über die Haut.
Im Allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, Mengen von etwas 0,001 bis
10 mg/kg, bei oraler Anwendung vorzugsweise etwa 0,005 bis 3 mg/kg
Körpergewicht zur Erzielen wirksamer Ergebnisse zu verabreichen.
Trotzdem kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen
abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit vom Körpergewicht bzw. der Art des
Applikationsweges, vom individuellen Verhalten gegenüber dem Medikament, der Art von
dessen Formulierung und dem Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchen die
Verabreichung erfolgt. So kann es in einigen Fällen ausreichend sein, mit weniger als der
vorgenannten Mindestmenge auszukommen, während in anderen Fällen die genannte
obere Grenze überschritten werden muss. Im Falle der Applikation größerer Mengen
kann es empfehlenswert sein, diese in mehreren Einzelgaben über den Tag zu
verteilen.
Literatur
1. Forth, Henschler, Rummel; Allgemeine und spezielle Pharmakologie und
Toxikologie; Urban & Fischer Verlag (2001), München.
2. Valentin E, Ghomashchi F, Gelb MH, Lazdunski M, Lambeau G., On the
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functional expression of two novel mouse group II enzymes. The Journal of
Biological Chemistry, 274 (1999) 31195-31202.
3. Cupillard L, Koumanov K, Mattei MG, Lazdunski M, Lambeau G., Cloning,
chromosomal mapping, and expression of a novel human secretory
phospholipase A2. The Journal of Biological Chemistry, 272 (1997)
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their pathophysiological significance in inflammatory diseases. Curr Mol
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5. Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM., Real time quantitative PCR.
Genome Res 6 (1996), 986-994.
6. Reynolds LJ, Hughes LL, Dennis EA., Analysis of human synovial fluid
phospholipase A2 on short chain phosphatidylcholine-mixed micelles:
development of a spectrophotometric assay suitable for a microtiterplate
reader. Anal Biochem. 204 (1992) 190-197.
7. Grass DS, Felkner RH, Chiang MY, Wallace RE, Nevalainen TJ, Bennett CF,
Swanson ME., Expression of human group II PLA2 in transgenic mice results
in epidermal hyperplasia in the absence of inflammatory infiltrate. J Clin
Invest 97 (1996) 2233-2241.
Abkürzungen
ANP: atriales natriuretisches Peptid (atrial natriuretic peptide)
BNP: natriuretisches Peptid, Gehirn-spezifisch (natriuretic peptide, brain
type)
Ct: Schwellenwert (threshold cycle)
DCM: dilatative Kardiomyopathie
expl: Explantation
impl: Implantation
LVAD: mechanische Links-Herzunterstützung (left ventricular assist device)
rE: relative Expression
SD: Standardabweichung SEQUENCE LISTING