DE69908688T2

DE69908688T2 - Verfahren zur Diagnose von HIV-Infektionen

Info

Publication number: DE69908688T2
Application number: DE69908688T
Authority: DE
Inventors: Akihiro Tarumi-ku Nishimoto; Jun-ichi Nishi-ku Koga; Hiroyuki Tarumi-ku Shirono; Takashi Amagasaki Kurimura
Original assignee: JCR Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: JCR Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 1998-03-24
Filing date: 1999-03-23
Publication date: 2004-04-29
Anticipated expiration: 2019-03-24
Also published as: EP0945727A1; EP0945727B1; DE69908688D1; JPH11271304A

Description

Die Erfindung betrifft ein neues diagnostisches Verfahren bezüglich einer Infektion mit dem humanen Immunschwächevirus (HIV).
Das HIV gehört zur Familie der Retroviren und weist die Grundstruktur auf, die sich aus einer äußeren Hülle und einem inneren Capsid zusammensetzt, welches RNS (RNA) und die reverse Transkriptase enthält. Das HIV weist eine Struktur auf, die aus den folgenden Genen besteht: dem gag-Gen, oder einem Strukturgen, dem pol-Gen oder einem Gen, das für die reverse Transkriptase kodiert, sowie dem env-Gen, oder einem Gen, das für das Hüll-Glykoprotein kodiert, zusammen mit LTR-Nukleotidsequen-zen (lange, terminale Wiederholung), welche an dessen Enden zur Steuerung der Genexpression vorhanden sind.
Im Hinblick auf die Mechanismen der HTV-Infektion und ihre Ausbreitung (Proliferation/Vermehrung) ist zu sagen, dass sie zunächst mittels Einbau des HIV in die Zelloberfläche über den Weg einer Bindung des Hüllglykoproteins an den Rezeptor der Targetzelle voranschreitet, wonach sie durch die reverse Transkription von dessen RNS in die DNS (DNA) der Targetzelle mit ihrer eigenen reversen Transkriptase begründet wird, während sich das HIV durch die Transkription zur RNS der Targetzelle aus der DNS vom HIV gemäß dem Einbau in das Targetchromosom ausbreitet; danach erfolgt die Translation in das virale Protein, wodurch ausgereifte humane Immunschwächeviren (HIV) erzeugt werden.
Die Wirtspezifität bei der viralen Infektion wird durch die Spezifität des Membranrezeptors bei der Targetzelle im Hinblick auf das Hüll-Glykoprotein festgelegt. Insbesondere erfordert die HIV-Infektion die extrazelluläre Domäne der Lymphozyten CD4 in Form eines Glykoproteins, das mit der Spezifität der Virusinfektion verknüpft ist, wobei der CC-Chemokin-Rezeptor (β-Chemokin), Fusin, etc., als dessen Rezeptor fungiert.
Darüber hinaus besitzt das HIV verschiedene Typen von Regulationsgenen für seine eigene Expression und Proliferation, wobei unter derartigen Regulationsgenen die tat- und rev-Gene individuell für die Tat- und Rev-Proteine kodieren, welche für die virale Proliferation von wesentlicher Bedeutung sind.
LTR, oder die Promoter-Region für das HIV ist aus den U3-, R- und U5-Regionen aufgebaut; die U3-Region enthält die TATA- und CC-Boxen wie auch die NF-κB-Sequenz, die für die Proliferation benötigt werden, während die R-Region die TAR-Sequenz beherbergt, welche nach der Transkription zu RNS die Haarnadelstruktur für die Bindung an das Tat-Molekül annimmt; dadurch wird die Bindung zwischen dem Tat-Molekül und der TAR-Sequenz als wesentlich für den Start und die Aufrechterhaltung der Transkription betrachtet. Es ist ferner noch hinzuzufügen, dass das Rev-Protein an die RRE- Sequenz der mRNS (Boten-RNS) bindet, wodurch so während des Spleißvorgangs der mRNS die Funktion abläuft.
Die oben angeführten Fakten haben sich als die grundlegenden charakteristischen Eigenschaften des HIV herausgestellt, welcher zur Familie der Retroviren gehört. Allerdings stellen zahlreiche Krankheiten, die mit Retroviren in Zusammenhang stehen, unzugängliche Erkrankungen dar, die schwer zu behandeln sind, wofür das höchst tödliche Syndrom der erworbenen Immunschwäche (AIDS), weiches durch das HIV verursacht wird, ein typisches Beispiel ist.
Das Syndrom der erworbenen Immunschwäche (AIDS), weiches durch die HIV-Infektion verursacht wird, ist durch eine schleichende Erschöpfung oder Zerstörung des Immunsystems gekennzeichnet, welche sich über die verhältnismäßig lange Zeitdauer, d. h. über eine Länge von mehreren Jahren bis zu 10 und mehr Jahren nach der Infektion erstreckt. Nach dem Ausbruch der ersten Immunantwort verschwinden die Symptome der viralen Infektion allmählich, was zu einem Rückgang der Virusvermehrung führt; das Virus und seine Replikation sind in den peripheren Monozyten des Blutes (PBMCen) während der Dauer von mehreren Jahren so lange schwer zu erkennen, bis die Spätphase der HIV-Infektion eintritt.
Erst vor kurzem wurde bemerkt, dass sich unter individuellen Personen mit einer HIV-I-Infektion solche Patienten befinden, die über lange Zeiträume asymptomatisch (symptomfrei) waren, – wenngleich nur wenige davon entdeckt wurden –; dabei wurde festgestellt, dass deren Lymphozyten CD-positive T-Zellen in sich tragen, die in vitro zur Unterdrückung der Replikation (Vermehrung) des HIV befähigt sind.
Wie es bei vielen Viruserkrankungen der Fall ist, wird angenommen, dass CD8-positive T-Lymphozyten eine vitale Rolle bei der Verteidigung des lebenden Körpers gegen die HIV-Infektion spielen, wobei die Bedeutung der CD8-positiven T-Lymphozyten in Anbetracht der klinischen latenten Eigenschaften von Infektionssymptomen und Patienten, die über lange Zeiträume symptomfrei bleiben, inzwischen erkannt wurde [J. L. Whitton et al., Reven Press New York, S. 369–381 (1990); W. E. Paul, Cell, Bd. 82; S. 177, (1995)]. Insbesondere wurde die Entdeckung gemacht, dass die aktivierten CD8-positiven T-Lymphozyten, die aus dem peripheren Blut von Patienten stammen, die mit HIV infiziert waren, mehrere lösliche, das HIV unterdrückende Faktoren absondern, so dass sie einen Beitrag zur Verhütung der Infektion in vitro leisten [J. E. Brinchman et al. in J. Immunol., Bd. 144, S. 2961, (1990), C. E. Heckewicz et al. in AIDS Res. Hu. Retroviruses, 8: 1039, (1992)].
Der Überstand des flüssigen Kulturmediums der CD8-positiven T-Lymphozyten, die von Patienten stammen, welche mit dem HIV infiziert sind, zeigt erhöhte Spiegel an RANTES (6 bis 95 ng pro ml), MIP-1a (20 bis 255 ng pro ml) und MIP-1b (37 bis 191 ng pro ml), wobei sich herausgestellt hat, dass solche den HIV unterdrückende Faktoren die zelluläre Infektion mit HIV inhibieren [Fiorenza Cocchi et al., Science, 270: 1811, (1995)].
Wie bereits oben dargelegt wurde, sondern die CD8-positiven T-Lymphozyten aus individuellen Patienten, die mit HIV infiziert sind, verschiedene Cytokine ab; dies legt die Vermutung nahe, dass die T-Lymphozyten im aktivierten Zustand gehalten werden.
Es wurde bestätigt, dass das CD8-Antigen der zytolytischen T-Lymphozyten, das ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 32 kDa darstellt und zur Superfamilie der Immunoglobuline gehört, bei der Erkennung der größeren Antigene (MHC-1) der Gewebeverträglichkeit eingebunden ist. Andererseits besitzen die Helfer-T-Lymphozyten (Th) ein CD4-Antigen mit einem Molekulargewicht von 55 kDa. Es besteht die Annahme, dass diese Teilmenge von Antigenen der CD8- und CD4-Lymphozyten intensiv bei der Regulierung der zellulären Aktivierung beteiligt ist.
Es wurde aufgezeigt, dass die humanen CD4-positiven T-Lymphozyten nach der Stimulierung mittels der Aktivierung durch das anti-CD3-Antigen die mRNS für das Interleukin 9 (IL-9) exprimieren, was zur Sekretion von IL-9 führt [J. C. Renauld, et al. in J. Immunol. 144: 4235, (1995)]. Das IL-9 fungiert als Wachstumsfaktor für T – Helfer-Lymphozyten, wobei es konsequenterweise an der Aktivierung von CD4-positiven T-Lymphozyten beteiligt ist [Proc. Acad. Sci., USA, 85: 8934, (1989)]. Im Falle von menschlichen Lymphozyten wurden im Hinblick auf die Liganden für Zytokine einschließlich IL-9 und die Ligandenrezeptoren ein autokrines Wachstum und Aktivierung vermutet. Das IL-9 wird in vitro durch CD-positive T-Zellen von T-Lymphozyten vom aktivierten Typ II (Th2) erzeugt, wie dies auch bei den naiven CD4-positiven Zellen der Fall ist [J. Immunol., 147: 3848, (1991)].
Das IL-9, dessen Gen sich aus 5 Exons und 4 Introns zusammensetzt, wurde dahin gehend identifiziert, dass es zum Unterstützen des Wachstums der Helfer-T-Zellen befähigt ist und auf Grund der Vielfalt seiner Targetzellen ein multifunktionelles Zytokin bildet, und zwar in Bezug auf Mastzellen, megakaryoblastische Leukämie, fötale Thymozyten, Erythroidvorläufer von Mäusen und menschlichen Erythroidvorläufer.
Der Rezeptor für IL-9 (IL-9R), dessen Gen aus 9 Exons und 9 Introns zusammengesetzt ist [Blood, 83: 3199, (1944)] gehört zur Superfamilie der Hämopoietinrezeptoren und übt eine Beeinflussung an der γ-Kette des Rezeptors für Interleukin-2 (IL-2R) aus, und zwar im Hinblick auf die Signalübertragung [J. C. Renauld et al. in J. Leuko. Biol., 57: 353, (1995)].
Es ist bekannt, dass die Antwort von IL-9 auf T-Lymphozyten je nach Typ und Zeitpunkt der Antigenstimuli veränderlich ist. Die fötalen Thymozyten zeigen unter speziellen Kombinationen von IL-2 mit IL-9 ein Wachstum. Die Expression von IL-9 ist auf aktivierte T-Zellen beschränkt, wobei eine dynamische Analyse von dessen Induktion erhellt, dass die Expression der IL-9-mRNS in der späteren Phase (deren Gipfel bei 28 Stunden erreicht wird) der Aktivierung der T-Zellen erscheint, wobei eine Mittlerrolle durch IL-9 erforderlich ist. Wie durch das analytische Verfahren des Western Blottings aufgezeigt wird, ergibt die Stimulierung von mehrkernigen Leukozyten 4 nichtfixierte Bande einer Tyrosinphosphorylierung, wobei jedoch keine Förderung der Phosphorylierung der Serin-Threonin-Kinase (Raf-1, MAP) erfolgt.
Der Interleukin-2-Rezeptor (IL-2R) ist auf den Zytoplasmamembranen verschiedener Zellen einschließlich der T-Zellen vorhanden, während er seine spezifisch hohe Affinität für das IL-9 (Kd ≅ 100 pM) zeigt [R. J. Idzerda et al. in J. Exp. Med., 171: 961, (1990)]. An Menschen zeigt die Boten-RNS von IL-9R dank ihres alternativen Spleißmechanismus eine Heterogenität. Im menschlichen Genom sind mindestens 4 falsche Gene für den IL-9R vorhanden, welche jeweils zu etwa 90% zu dem IL-9R homolog sind. Im allgemeinen bestehen die Zytokinrezeptoren aus 2 Ketten, worunter die erste Kette für den Ligandentyp spezifisch ist und wobei die zusätzliche Kette für verschiedene Arten von Zytokinen typisch ist; die γ-Kette von IL-2R ist mit dem IL-9R verbunden, wobei der Antikörper gegen die γ-Kette die Aktivität von IL-9R vollständig unterdrückt.
In der Folge hat es sich herausgestellt, dass das IL-2 und IL-9 eine intensivierte synergistische Wirkung gegenüber der Targetzelle auslösen, wobei das IL-9 ferner noch in einigen Zell-Linien einen Schutz von Zellen gegenüber der Apoptose eher auszuüben vermag, als eine Proliferation von Zellen, wogegen das IL-2 eine Effizienz bei der Proliferation von Zellen aufweist. Angesichts der Tatsache, dass die Apoptose eine Erscheinung darstellt, die in einzigartiger Weise für die aktivierten Zellen charakteristisch ist, und dass das IL-9 in Form von aktivierten Lymphozyten gegen eine Apoptose gerichtete Eigenschaften zeigt, wird davon ausgegangen, dass das IL-9 bei der Apoptose eine entscheidende Rolle spielt.
Zell-Linien von menschlichen T-Lymphozyten sowie deren Klone exprimieren unabhängig davon, ob sie dem CD4-positiven oder CD8-positiven Typ angehören, eine verstärkte Boten-RNS von IL-9R als Antwort auf IL-9, wobei eine Proliferation von Zellen erfolgt. Beispielsweise exprimieren tumorspezifische, CD8-positive T-Lymphozyten die Boten-RNS von IL-9R, wodurch das IL-9 die Proliferation von Zellen mit verlängerter Überlebensdauer fördert. Zur Provokation des optimalen Effekts von IL-9 ist eine vorherige Aktivierung von Zellen erforderlich [A. N. Herederic et al. in J. Immunol., 150: 2634, (1993)]. Von M. M. Hossain et al. wird in Acta virologica, 42: S. 47–52, (1998) eine Suche nach Genen veröffentlicht, die mit einer anti-HIV-1-Aktivität von CD8+T-Zellen in Zusammenhang stehen, wobei molekulares Klonen zum Einsatz gekommen war. Es war die Beziehung zwischen der anti-HIV-1-Aktivität von CD8+T-Zellen und der Expression der mRNS von IL-9R-α aus den gewonnenen Klonen von cDNS überprüft worden. Die mRNS von IL-9R-α wurde anhand der RT-PCT (RT-PCR) analytisch bestimmt. Die mRNS wurde aus 5 Fällen, die ein hohes Niveau an anti-HIV-1-Aktivität zeigten, an Hand von 4 Fällen erkannt. Dagegen wurde die mRNS aus 10 Fällen, die ein niedriges Niveau an anti-HIV-1-Aktivität zeigten, in 1 Fall erkannt.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung eines diagnostischen Verfahrens zur Erkennung einer HIV-Infektion.
Von den Erfindern, die von der Tatsache Kenntnis nahmen, dass die Lymphozyten von den mit HIV infizierten, aber über lange Zeiträume symptomfrei bleibenden Patienten CD8-positive Lymphozyten behalten, welche eine anti-HIV-Aktivität aufweisen, wurde eine Analyse des Genoms derartiger Lymphozyten durchgeführt.
Aus CD8-positiven T-Lymphozyten, die jeweils von individuellen mit HIV infizierten und nicht infizierten Probanden stammten, wurden Banken mit cDNS (cDNS-Bibliotheken) aufgebaut und in untergeordnete Gruppen mit der mRNS von CD8-positiven T-Zellen des nicht infizierten Probanden ausgelesen, wobei eine Sonde benutzt wurde, die für die verbliebenen CD8-positiven T-Zellen des mit HIV infizierten Patienten spezifisch war; auf diese Weise wurde eine Kolonie mit der cDNS von CD8-positiven T-Zellen gewonnen, welche für den mit HIV infizierten Patienten charakteristisch war (Tabelle 1 und 2). Die Hybridisierung wurde zweimal wiederholt, wobei die daraus resultierende positive Kolonie auf die Nukleotidsequenz hin überprüft wurde, wonach sich das Screening für Homologie anschloss, was zu der Entdeckung führte, dass der IL-9R in deutlicher Weise exprimiert wurde.
Obschon das Ausmaß der Expression von Patient zu Patient individuelle Schwankungen zeigte, hat es sich herausgestellt, dass mit zunehmender Potenz der anti-HIV-Aktivität, wie sie durch die von den Patienten stammenden CD8-positiven T-Lymphozyten herausgestellt wurde, das relative Ausmaß der Expression von IL-9R größer wurde (4 und Tabelle 5). Die Expression von IL-9R in den CD8-positiven T-Lymphozyten ist für die mit HIV infizierten, über einen langen Zeitraum symptomfrei bleibenden Patienten charakteristisch, wogegen die Expression von IL-9R bei nicht infizierten individuellen Probanden nicht erkannt werden kann bzw. nur in einem vernachlässigbaren Ausmaß erkennbar ist (4 und Tabelle 5).
Konsequenterweise führten die Erfinder Analysen des Genoms durch, um die anti-HIV-Aktivität der über einen langen Zeitraum asymptomatischen Patienten durch die Expression von IL-9R zu charakterisieren, wobei auf diese Weise eine Möglichkeit besteht, die mit Viren einschließlich des HIV infizierten Patienten zu diagnostizieren.
Die vorliegende Erfindung wurde auf der Grundlage derartiger Befunde vervollständigt; sie betrifft ein diagnostisches Verfahren zur Erkennung einer HIV-Infektion, die dadurch gekennzeichnet ist, dass dieses Verfahren die Verwendung eines Rezeptors für den Wachstumsfaktor von T-Zellen (IL-9R) als einen spezifischen Indikator einer Infektion umfasst, wobei dieser Rezeptor speziell in T-Zell-Lymphozyten exprimiert.
Die T-Zell-Lymphozyten stellen vorzugsweise entweder CD4-positive oder CD8-positive Lymphozyten dar, wobei der jeweilige Überstand von deren Kulturen als Probe für die Diagnose eingesetzt werden kann.
Die Erfinder haben nunmehr Klarheit darüber geschaffen, dass die T-Lymphozyten aus dem peripheren Blut von mit HIV infizierten, über lange Zeiträume symptomfrei bleibenden Patienten im aktivierten Zustande auf dem genetischen Niveau gehalten werden. Aufgrund der Tatsache, dass der TL-9R als ein Indikator (Hinweis auf die) der Aktivierung von Lymphozyten exprimiert wird, schafft die Addition von Liganden gegenüber IL-9R die Möglichkeit einer Verstärkung oder Modifizierung der antiviralen Aktivität von Lymphozyten. Derartige Ligandenproteine und -polypeptide schließen zum Beispiel Zytokine und Chemokine mit ein, worin das IL-2 und IL-9 eine erhöhte Affinität für den IL-9R zeigen und von denen davon ausgegangen wird, dass sie wirksam sind und speziell als effizient im Hinblick auf einen therapeutischen Wirkstoff gegen AIDS in Betracht gezogen werden. Dies hat ferner auch die Bedeutung, dass beliebige Substanzen, wenn sie nur zur Induktion der Expression von IL-9R befähigt sind, als Arzneimittel gegen AIDS dienen würden.
Obwohl bekannt ist, dass das IL-2 für die Kultivierung von Lymphozyten in vitro von wesentlicher Bedeutung ist, könnte die Möglichkeit bestehen, Lymphozyten durch eine gleichzeitige oder individuell getrennte Verabreichung von IL-1 und IL-9 zu aktivieren. Ebenso lassen sich nicht-eiweißartige Substanzen als Liganden für den IL-9R zur Aktivierung von Lymphozyten einsetzen. Darüber hinaus können die Liganden für den IL-9R Polypeptide sein, welche die Aminosäuresequenz des Bindungszentrums für die IL-2- und IL-9-Rezeptoren enthalten.
Weiterhin schließen die modifizierenden und aktivierenden Agonisten für die Aktivierung von Lymphozyten Homologe von IL-9 mit ein, welche eine hohe Affinität für den IL-9R zeigen, wobei die Gewinnung derartiger Homologe mittels bekannter gentechnischer Verfahrensweisen leicht durchführbar ist, beispielsweise mittels Ersatz, Weglassung und Addition von Aminosäuren.
Vermittels einer Vorrichtung für Screening von Agonisten oder Antagonisten für den IL-9R auf der Zellmembran von Lymphozyten wurden CD8-positive T-Lymphozyten isoliert und kultiviert, und zwar aus dem peripheren Blut von mit HIV infizierten, über lange Zeiträume symptomfrei bleibenden Patienten; dabei kann Gebrauch gemacht werden von der Messung von Veränderungen des pH, und zwar mit einem Cytosensor zur Bestimmung der metabolischen Aktivität der Zellen wie auch von LTR-Cat- und RT-Analysen in Form einer Analyse von anti-HIV. Unter den Bezeichnungen "Agonist" und "Antagonist" werden Proteine/Polypeptide und nicht-eiweißartige Substanzen verstanden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein diagnostisches Verfahren zur Erkennung einer HIV-Infektion, bestehend aus der Erkennung oder Messung der Expression durch CD8⁺ T-Zell-Lymphozyten des für T-Zellen spezifischen Interleukin-9-Rezeptors.
Das Verfahren kann aus der Erkennung oder Messung der Produktion von mRNS bestehen, welche für den IL-9R in einer Kultur aus CD8⁺ -T-Zellen kodieren.
Alternativ kann das Verfahren aus der Erkennung oder Messung der Wirkung von Expressionsprodukten von CD8+ -T-Zellen über ein Testsystem bestehen, welches eine Antwort gegenüber IL-9R liefert.
In bevorzugter Weise stellt das Testsystem die über den IL-9R vermittelte Unterdrückung der Replikation von HIV in T-Zellen dar.
Vorzugsweise werden die genannten Expressionsprodukte in jenes Testsystem in Form des Überstands aus einer Kultur von CD8⁺T-Zellen eingebracht.
Das genannte Verfahren stellt in bevorzugter Weise eine Diagnose einer Infektion bei einem mit HIV infizierten individuellen Probanden dar, der über lange Zeiträume symptomfrei ist.
Unten stehend werden Beispiele zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung in näheren Einzelheiten beschrieben, wobei auf die Zeichnungen wie folgt Bezug genommen wird:
1 zeigt eine schematische Erläuterung der verfahrensmäßigen Schritte zum Aufbau einer cDNS-Bank von CD8-positiven-T-Zellen, die von einem mit HIV infizierten Patienten stammten, wobei, nach der Isolierung von m-RNS aus CD8-positiven T-Zellen eines mit dem HIV infizierten Probanden, mit dem Primer Oligo (dt) 25d (A/C/G) eine reverse Transkription durchgeführt wurde, und zwar zum Erhalt des ersten Stranges an DNS; anschließend wurde der zweite Strang in Form der cDNS mit dem RNS-Depolymerisierungsenzym H (von Crontec geliefert), der DNS-Polymerase I aus E. coli (von Crontec geliefert) sowie der DNS-Ligase von E. coli (von Crontec geliefert) synthetisiert. Derartige Enden wurden an einen Adaptor gebunden, welcher die Erkennungszentren von EcoRI, NotI und SaII enthielt, wonach sich die Phosphorylierung anschloss, wobei Ketten von cDNS mit einer Länge von 500 bp und mehr mittels einer Fraktionierungssäule für cDNS gewonnen wurden und im Anschluss daran die Zerlegung mit EcoRI sowie der Einbau in pUC 188 an der Schnittstelle von EcoRI erfolgten; daran schloss sich die Transformation von E. coli mit dem rekombinanten Plasmid mittels des Verfahrens nach Hanahan an.
2 erläutert in schematischer Weise die verfahrensmäßigen Schritte für den Aufbau der cDNS in Einklang mit dem Subtraktionsverfahren, welche für die mit HIV infizierten, über einen langen Zeitraum symptomfrei bleibenden CD8-positiven T-Zellen spezifisch ist und worin die mRNS (der H.D.T.- Zell-mRNS) aus nicht infizierten CD8-positiven T-Zellen isoliert und biotinyliert wurde, wogegen die mRNS (Pt.T.-Zell-mRNS) aus mit HIV infizierten CD8-positiven T-Zellen isoliert wurde, woran sich die reverse Transkription mit einem Oligo (dt)n – Primer anschloss und wobei der so erhaltene erste Strang an DNS (dsDNS-RNS) einer Behandlung mit Alkali unterzogen wurde, um die einsträngige cDNS (ssDNS) zu gewinnen; die zuvor erwähnte biotinylierte mRNS aus gesunden CD8-positiven T-Zellen und der cDNS aus mit HIV infizierten CD8-positiven T-Zellen wurden zum Zwecke der Hybridisierung miteinander vermengt, wobei nach der Zugabe von Streptavidin (streptabydine ?) zur Anbindung an Biotin zu dem Hybrid eine Lösung aus Phenol und Chloroform im Mischungsverhältnis 1 : 1 hinzugefügt wurde, wonach das Rühren und Abzentrifugieren erfolgte, damit sich die wässrige und organische Schicht voneinander trennen konnte (phenolische Chloroformextraktion); auf diese Weise wurde lediglich die wässrige Schicht mit einem Gehalt an der cDNS abgetrennt (subtrahierte DNS), welche für die mit HIV infizierten CD8-positiven T-Zellen spezifisch ist.
3 zeigt die Ergebnisse der Säulenchromatographie auf Basis der Fraktionierung von cDNS zur Selektierung der gewünschten Kettenlänge von cDNS anhand von Beispielen, wobei im Gefolge des chromatographischen Verfahrens nach der Synthese des zweiten Stranges der cDNS, ausgehend vom ersten Strang der cDNS aus den mit dem HIV infizierten CD8-positiven T-Zellen, die cDNS mit einem daran gebundenen Adaptor über eine Fraktionierungssäule für cDNS gegossen wurde, wonach die Entwicklung mit STE-Puffer (0,5 mM EDTA, 30 mM Natriumchlorid und 10 mM Tris·Hydrochlorid bei einem pH von 7,8) erfolgte; auf der Grundlage der Ergebnisse in Verbindung mit chromatischen Vergleichsversuchsergebnissen wurden Fraktionen mit einem Gehalt an cDNS mit einer Länge von 500 bp und länger gewonnen.
4 enthält Fotografien von elektrophoretischen Abtrennungen mittels Agarosegel von Produkten aus der RT-PCR (reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion), die mit einem Primerset für das IL-9 gemäß dem Beispiel 4 erhalten wurden; dabei wurde die RT-PCR-Technik durchgeführt (welche die Synthese des ersten Stranges von cDNS und Durchführung der PCR mit derselben als Art Matrize mit einschließt), und zwar unter Einsatz der mRNS-Ketten, welche aus mit HIV Infizierten CD8--positiven T-Zellen, nicht infizierten CD8-positiven T-Zellen und CD4-positiven T-Zellen stammten sowie unter Verwendung eines Primersets für den IL-9R; sodann wurden die Produkte der Gel-Elektrophorese mit 2,5% Agarose unterworfen (Elektrophoresepuffer; TAE-Puffer (40 mM Tris-Acetat-Puffer, 1 mM EDTA mit einem pH von 8,3) (A); zur Bestätigung einer normalen Arbeitsweise der RT-PCR-Technik wurde separat ein Primerset für das G3PDH-Gen oder ein "Haushalt"-Gen (housekeeping-Gen) zum Vergleich eingesetzt (B).
Im Zusammenhang mit der 4 werden zur Erläuterung die folgenden Anmerkungen gegeben:
Agarosegel, IL-9R; Interleukin-Rezeptor.
G3PDH; ein "Haushalt"-Gen (housekeeping-Gen, ein Gen, welches im Prinzip in allen Zellen exprimiert wird);
H.D. CD4-T-Zelle; gesunde bzw. nicht infizierte CD4-positive T-Zelle;
H.D. CD8-T-Zelle; gesunde bzw. nicht infizierte CD8-positive T-Zelle;
Pt. CD8-T-Zelle; mit HIV infizierte CD8-positive T-Zelle.
Spur M: ⏀X174/HincII-Maker
Spur 1: H.D. CD4-T-Zelle
Spur 2: H.D. CD4-T-Zelle
Spur 3: Pt. CD8-T-Zelle
Spur 4: Pt. CD8-T-Zelle a
Spur 5: Pt. CD8-T-Zelle b
Spur 6: Pt. CD8-T-Zelle c
Spur 7: Pt. CD8-T-Zelle d
Spur 8: Pt. CD8-T-Zelle e
Die in den Beispielen verwendeten Materialien:
Kit zur Mikroreinigung für mRNS zur raschen Gewinnung ("Quick prep mRNA Micro purification"/ geliefert von Pharmacia), Synthese-Kit für cDNS großer Kettenlänge (geliefert von CLONTEC), "α-32P" dCTP (3.000 Ci/mMol) (geliefert von Amersham), Ligierungskit Ver. 2 (geliefert von TaKaRa), pUC118 (geliefert von TaKaRa) < Zerlegung an EcoRI, Behandlung mit BAP >, max. effiziente Zelle im Hinblick auf die DH5α-Kompetenz (geliefert von GIBNCO), Subtraktionskit (geliefert von Invitrogen), Klenow-Fragment (geliefert von TaKaRa), Hybond N+Nylon-Membran (geliefert von Amersham), Whatman-Filterpapier 3 MM (Chr), RPM-Kit (Bio 101), Ready.To.Go Kit für die Synthese vom ersten Strang (geliefert von Pharmacia).
BEISPIEL 1:
Aufbau einer cDNS-Bank (Bibliothek) für CD8-positive T-Zellen eines mit HIV infizierten Patienten (1, Tabelle 1):
Aus Lymphozyten eines im Hinblick auf den anti-HIV-Antikörper positiven Probanden wurden CD8-positive T-Zellen allein isoliert unter Einsatz von magnetischen Perlchen mit daran gebundenen anti-CD-Antikörpern (geliefert von Dai -Ichi Kagaku Yakuhin Co.). Die CD8-positiven Zellen wurden über dem Kulturmedium RPMI 1640 (geliefert von Nissui Seiyaku Co.) mit einem Gehalt an 10% fötalem Rinderserum (geliefert von Gibco) mehrere Tage kultiviert, wonach der Überstand der Kultur zu den mit HIV infizierten Zellen zur quantitativen Bestimmung des HIV-Proteins p17 in dem Kulturmedium mittels eines enzymatischen immunologischen Analysenkits hinzugegeben wurde (geliefert von Dynabott). Die Ergebnisse zeigten, dass eine Kulturbrühe mit den CD8-positiven T-Zellen, die von einem besonders spezifizierten Probanden mit einer HIV-Infektion stammten, merklich die Produktion von p17 durch die mit HIV infizierten Zellen im Vergleich zu den Gegenstücken an CD8-positiven T-Zellen unterdrückte, die von anderen mit dem HIV infizierten Patienten und gesunden Probanden stammten. Im Anschluss daran wurden die CD8-positiven T-Zellen, welche eine anti-HIV-Wirksamkeit zeigten, über dem Kulturmedium RPMI mit einem Gehalt an 10% fötalem Rinderserum mehrere Tage kultiviert und die Zellen zur Isolierung der mRNS unter Verwendung des Kits zur Mikroreinigung für mRNS zur raschen Gewinnung (geliefert von Pharmacia) geerntet, woran sich eine Behandlung mit der reversen Transkriptase (geliefert von Crontec) unter Einsatz von Oligo 9 (dT) 25d (A/C/G) (geliefert von Crontec) als Primer anschloss, um den ersten Strang an DNS zu gewinnen. Durch die Verwendung des Primers Oligo (dT) 25d (A/C/G) an Stelle des Primers Oligo (dT)n, dessen Gebrauch im all gemeinen weit verbreitet ist, war es möglich, das "Verbacken" (Annealing) an der Stelle 5' der Sequenz Poly A der mRNS durchzuführen; auf diese Weise wurde der für das Protein kodierende erste Strang an cDNS in der verlängerten Form synthetisiert. Nach der Synthese des zweiten Stranges cDNS unter Verwendung von RNS-Depolymerase H (geliefert von Crontec) sowie von DNS-Polymerase I (geliefert von Crontec) und DNS-Ligase (geliefert von Crontec), wobei die beiden von E. coli stammen, wurden deren Enden mit DNS-Polymerase (geliefert von Crontec) "glatt" (blunt) gemacht und anschließend an Adaptor (geliefert von Crontec) gebunden, welche die Erkennungspunkte EcoRI, NotI und SaII enthielten, und zwar unter Einsatz einer DNS-Ligase (geliefert von Crontec); daran schloss sich die Phosphorylierung mit einer Polynukleotid-Kinase (geliefert von Crontec) an. Während der oben stehend erwähnten Synthesen des ersten und zweiten Stranges cDNS wurde ³²P-dCTP (geliefert von Amersham) zu den Substraten zur Durchführung der radioaktiven Markierung hinzugefügt. Zur Selektion der cDNS von etwa 500 bp oder länger, – um die Voraussetzungen einer cDNS-Bibliothek guter Qualität zu erfüllen –, wurden die oben stehend erwähnten cDNS-Stränge auf eine Fraktionierungssäule für cDNS (geliefert von Crontec) appliziert, wonach die Entwicklung mit STE-Puffer (10 mM Tris Hydrochlorid-Puffer mit einem pH von 7,8 und einem Gehalt an 0,5 mM EDTA sowie 30 mM Natriumchlorid) erfolgte. Die gegenüber cDNS äquivalenten Fraktionen mit nicht weniger als 500 bp wurden gesammelt und durch das Zumischen von 2 Volumina Ethanol und ein Zehntel Volumen an einer Lösung aus 3 M Natriumacetat mit einem pH von 5,2 absetzen gelassen; daran schloss sich die Gewinnung durch Zentrifugieren an. Die cDNS wurde in Form einer Lösung in 10 μg TE-Puffer (10 mM Tris Hydrochlorid-Puffer mit einem pH von 8,0 und einem Gehalt an 1 mM EDTA) wurde mit EcoRI zerlegt (verdaut) und sodann mittels der Elektrophorese über Agarosegel isoliert und mit dem desphosphoryliertem Vektor pUC188 (geliefert von Takara) vermengt, weiterhin mit Ligase (geliefert von Takara) vermischt, um den Einbau in die EcoRI – Schnittstelle von pUC118 (3) zu bewerkstelligen. Das so gewonnene Plasmid wurde DH5α-kompetenten Zellen von E. coli (geliefert von Gibco) zwecks Inkorporieren über die Transformation an Hand der Vorgehensweise nach Hanahan hinzugefügt. Das transformierte E. coli wurde auf dem flüssigen L-Kulturmedium mit einem Gehalt an 1,5% Agar ausgebracht und bei 37°C kultiviert; sodann wurden die gewonnenen Kolonien in dem flüssigen L-Kulturmedium suspendiert und ferner mit hinzugefügtem Dimethylsulfoxid bis auf die Endkonzentration von 7% hinzugegeben, wonach bei –80°C die Einlagerung erfolgte. Es wurde von der Annahme ausgegangen, dass die Bank ein Ausmaß an Komplexität von 3,6 × 10⁵ cpf (3,9 × 10⁵ cpf/μg) zeigte.

In der Tabelle 1 sind die Ergebnisse der Ausbeute an cDNS aus der mRNS aus CD8-positiven T-Zellen eines mit HIV infizierten Patienten aufgelistet; es wurden 4,0 ng mRNS aus CD8-positiven T-Zellen eines mit HIV infizierten Patienten isoliert und der reversen Transkription unter Einsatz des Primers Oligo (dT) 25d (A/C/G) unterzogen, wobei 0,4 μg erststrängige cDNS gewonnen wurden, wogegen 5,0 μg mRNS aus menschlichen Burketts-Lymphozyten (Daudi), welche als Vergleich herangezogen wurden, 2,6 μg erststrängige cDNS hervorbrachten; dabei ist das Gewichtsverhältnis des ersten Stranges von cDNS im Vergleich zu anfänglicher mRNS in % an Kopien in der Tabelle 1 dargestellt. Ebenso wurde der zweite Strang von cDNS aus dem ersten Strang cDNS synthetisiert, wobei nach der Anbindung des Adaptors die cDNS von 500 bp oder länger zur Gewinnung unter Verwendung einer Fraktionierungssäule für cDNS fraktioniert wurde. Eine derartige cDNS wurde dazu benutzt, eine cDNS-Bank aufzubauen, welche anschließend im Hinblick auf eine spezielle Kettenlänge zum Einfügen bei 10 Klonen mehrfach überprüft wurde, wobei die Durchschnittswerte in der Tabelle 1 wiedergegeben sind; die Ausdrücke und Formulierungen weisen individuell die folgenden Bedeutungen auf:

Anfänglich	Menge an mRNS;
Ausbeute	Menge an erststrängiger cDNS;
% an Kopien	Menge an erststrängiger DNS zur Menge an mRNS;
endgültige Ausbeute	Menge an cDNS (mit einer Länge) von 500 bp oder länger, welche aus der Fraktionierungssäule für cDNS fraktioniert wurde;
Länge (DS)	durchschnittliche Kettenlänge von cDNS in der cDNS-Bank von CD8-positiven T-Zellen eines mit HIV infizierten Patienten.

Tabelle 1: Ausbeute an cDNS aus der mRNS
BEISPIEL 2:
Durchtesten durch die Hybridisierung der Kolonien:
1) Herstellung einer spezifischen Sonde für CD8-positive Zellen eines mit HIV infizierten Patienten, der über lange Zeiträume frei von Symptomen ist, und zwar mittels des Subtraktionsverfahrens.
Zum Zwecke der Isolierung von cDNS, wodurch speziell in den CD8-positiven Zellen eine Expression erfolgt, wurde eine Austestung unter Einsatz einer cDNS-Sonde vorgenommen, welche an Hand des Subtraktionsverfahrens gewonnen wurde (2).
Es wurden aus dem Blut eines nicht infizierten Probanden Lymphozyten auf dem Weg der Zentrifugierung isoliert, wonach es magnetischen Kügelchen mit darauf gebundenen anti-CD8-Antikörpern ermöglicht wurde, alleine CD8-positive T-Zellen zu adsorbieren, um diese CD8-positiven T-Zellen zu isolieren. Dann wurden Interleukin 2 (IL-2) und Phytohämagglutinin (PHA) zu dem Medium RPMI 1640 mit einem Gehalt an 10% fötalem Rinderserum hinzugefügt, wonach die Kultivierung erfolgte und die Zellen mittels Zentrifugieren gewonnen wurden. Die CD8-positiven T-Zellen, welche von einem nicht infizierten Probanden stammten, wurden in eine Lösung verbracht, wobei die mRNS unter Einsatz des Mikro-Reinigungskits (geliefert von Pharmacia) zur raschen Gewinnung der mRNS isoliert wurde. Weiterhin wurde die Photobiotinessigsäure (geliefert von Invitrogen) hinzugegeben und die Mischung 20 Minuten lang direkt mit einer 300 Watt Reflektorlampe bestrahlt, so dass die mRNS mit Biotin markiert wurde. Zum Entfernen des Biotins wurde im Anschluss daran mit Butanol extrahiert und mit Ethanol ein Niederschlag gebildet; sodann wurde die so erhaltene von Biotin befreite mRNS noch einmal mit Biotin markiert; die genannte Extraktion mit Butanol wurde wiederholt, bis sich die Butanolschicht transparent zeigte; danach wurde erneut mit Ethanol ein Niederschlag gebildet, um die vollständige Entfernung des Biotins zu gewährleisten.
Andererseits wurden die CD8-positiven T-Zellen eines mit HIV infizierten Patienten in ähnlicher Weise isoliert und kultiviert, wonach die mRNS extrahiert und mit dem Primer Oligo dT (geliefert von Invitrogen) sowie der reversen Transkriptase vermischt wurde, um so den ersten Strang der cDNS zu synthetisieren. Die RNS wurde durch alkalische Behandlung zerlegt, wobei die doppelsträngige DNS-RNS zur einsträngigen cDNS konvertiert wurde. Die zuvor mit Biotin markierte mRNS aus den nicht infizierten CD8-positiven Zellen wurde mit der cDNS aus den mit HIV infizierten CD8-positiven T-Zellen vermengt, woran sich die Denaturierung in der Wärme anschloss, um zu hybridisieren. Nach dem Zusatz von Streptavidin (geliefert von Invitrogen) zur Anbindung des Biotins wurde eine Lösung aus Phenol und Chloroform im Mischungsverhältnis 1 : 1 (geliefert von Invitrogen) hinzugegeben; danach wurde gerührt und zentrifugiert, so dass die Reaktionslösung in eine wässrige und eine organische Schicht aufgetrennt wurde, wobei die Abtrennung der wässrigen Schicht alleine erfolgte. Die Vorgehensweise wurde mehrere Male zum Entfernen der an die mit Biotin markierte RNS gebundenen cDNS wiederholt. Angesichts der Tatsache, dass das Streptavidin durch die Denaturierung mit Phenol/Chloroform unlöslich wird und sich in der Zwischenschicht zwischen der organischen und wässrigen Schicht befindet, wird von der Annahme ausgegangen, dass die in der wässrigen Schicht verbleibende cDNS eine solche darstellt, die im Zusammenhang mit der alleinigen Expression der mit HIV infizierten CD8-positiven T-Zellen steht. Die für einen mit HIV infizierten Patienten spezifische cDNS wurde zur Synthese des zweiten Stranges cDNS vermischt mit dATP (geliefert von Takara), dGGTP (geliefert von Takara), dTTP (geliefert von Takara), dem Klenow-Fragment (geliefert von Takara) sowie dem ³²P-dCPT (geliefert von Amersham), wobei die cDNS als radioaktiv markierte Sonde eingesetzt wurde.
2) Hybridisierung der Kolonien
Eine cDNS-Bank wurde mit flüssigem L-Kulturmedium verdünnt, wobei eine Aussaat in einem Wachstumsverhältnis von 500 bis 1000 Kolonien pro Platte mit dem flüssigem Kulturmedium mit einem Gehalt an 1,5% Agar vorgenommen wurde, wonach die Kultivierung bei 37°C erfolgte. Nach dem Abschluss der Kultivierung wurden 2 Abdruckplatten hergestellt, bei 37°C kultiviert und anschließend bei 4°C eingelagert. Eine Abdruckplatte wurde mit einer Nylonmembran (geliefert von Amersham) überzogen, um die Kolonien zu übertragen, wobei im Anschluss daran eine Platzierung auf Filterpapier (das von Wattman geliefert wurde) erfolgte; danach wurde mit einer Lösung zum Denaturieren und Auflösen benetzt (2 mal mit "SSC" (0,3 M Natriumchlorid, 0,03 M Natriumcitrat bei einem pH von 7,0)) und in einem Mikrowellenofen etwa 1 Minute lang zur Exposition der viralen DNS erwärmt. Die Membran wurde mit entrahmter Milch zwecks Hybridisierung mit einer radioaktiven Sonde abgeblockt. Die Membran wurde sodann jeweils mit einer der folgenden Waschlösungen gewaschen: Waschlösung (1): 2 mal SSC, 1% SDS bei einem pH von 7,0; Waschlösung (2): 1 mal SSC, 1% SDS bei einem pH von 7,0; Waschlösung (3): 0,1 mal SSC, 1% SDS bei einem pH von 7,0; danach wurde sie auf einem Röntgenfilm verbracht und belichtet. Die mit der radioaktiv markierten Sonde hybridisierten Kolonien wurden von einer anderen Abdruckplatte aufgenommen, wonach die Aussaat in einem flüssigen L-Kulturmedium mit einem Gehalt von 1,5% Agar vorgenommen wurde; danach wurde bei 37°C kultiviert und die Kolonien noch einmal in derselben Art und Weise hybridisiert.
Unter Verwendung einer Sonde, die für die CD8-positiven T-Zellen eines mit HIV infizierten Patienten gemäß der oben stehenden Beschreibung spezifisch war, wurde das (erste) Austesten (Screening) an Hand von 20.000 Kolonien der cDNS-Bank der mit dem HIV infizierten CD8-positiven T-Zellen zur Aufnahme von 300 positiven Klonen die ein intensives Signal zeigten, sowie von 10 Kolonien in deren Nachbarschaft ausgeführt, und das wiederholte (zweite) Austesten erbrachte im Ergebnis 22 positive Klone mit einem intensiven Signal. Tabelle 2: Screening mit einer Sonde aus subtrahierter DNS

Anzahl der positiven Klone

Zu Beginn 20.000

Erstes Austesten 300

Zweites Austesten 22
BEISPIEL 3:
Sequenzieren der Nukleotide und Austesten auf Homologie im Hinblick auf die positiven Klone (Tabelle 4):
Die mit einer radioaktiv markierten Sonde hybridisierten Kolonien wurden von der Abdruckplatte aufgenommen und sodann kultiviert. Die Zellen wurden mittels Zentrifugieren gewonnen und zur Extraktion des Plasmids einer Lysis unterzogen. Die cDNS, die durch das Zerlegen (Zerschneiden) mit EcoRI gespalten war, wurde im Hinblick auf deren Größe unter Einsatz der Elektrophorese auf Agarosebasis überprüft (3). Die Plasmide, welche eine eingefügte cDNS mit einer Länge von 500 bp oder länger aufwiesen, wurden unter Verwendung eines DNS-Sequenzers (eines Geräts zur automatischen Sequenzierung, geliefert von Applied Bio) nach der Reaktion zur Kettenverlängerung mit dem Sequenzierungsprimer M4 (geliefert von Takara) und RV (geliefert von Takara) sequenziert, und zwar in Bezug auf die Sequenzen, die oberhalb und unterhalb der Klonierungsstelle des pUC118 lokalisiert waren, wobei dafür auch das vorgefertigte Farbstoff-Terminator-Reaktionskit zum Farbstoffschicht-Sequenzieren (geliefert von Perkin-Elmer) eingesetzt wurde. Die daraus resultierende Sequenz wurde im Hinblick auf die Nukleinsäuredatenbank (Genbibliothek) überprüft.
In der Tabelle 3 sind die Ergebnisse aus dem Austesten zur Homologie und die Spezifität der auf Basis des Austestens erhaltenen Klone aufgelistet; die Plasmide aus den 22 positiven Klone wurden isoliert und mit dem Schnittenzym (Restriktionsenzym) EcoRI zerlegt, wonach die Elektrophorese mit Agarosegel folgte; dies führte zu der Erkenntnis, dass es Einfügungen mit einer Kettenlänge von 500 bis 3000 vorhanden waren. Unter Befolgung der Verfahrensweise auf Basis des Farbstoff-Terminators wurde die Sequenzierung unter Einsatz des Sequenzers durchgeführt und die so erhaltenen Sequenzen im Hinblick auf die Nukleinsäuredatenbank (Genbank/-bibliothek) überprüft, wobei mehrere neuartige Sequenzen wie auch die Sequenz für den humanen IL-9-Rezeptor entdeckt wurden.
Tabelle 3: Sequenzanalyse der positiven Klone
Das Verfahren auf Basis von RT-PCR (welches die Synthese des ersten Stranges der cDNS und die Durchführung der PCR/Polymerase-Kettenreaktion mit derselben umfasst, die als Matrize verwendet wird) wurde mit den mRNS-Molekülen durchgeführt, die individuell aus CD8-positiven T-Zellen abgeleitet wurden, welche mit dem HIV infiziert waren, sowie von Zellen stammten, welche von gesunden CD8-positiven T-Zellen und CD4-positiven T-Zellen abgeleitet waren; dabei zeigt sich die Bande für mit dem HIV infizierte CD8-positive T-Zellen nur dann, wenn ein Primer eingesetzt wurde, der zum IL-9R homolog war.
BEISPIEL 4
Bestätigung der spezifischen Expression von mRNS:
Mittels der mit dem HIV infizierten CD8-positiven T-Zellen, gesunden CD8-positiven T-Zellen und CD4-positiven T-Zellen wurden individuelle mRNS-Moleküle unter Verwendung des Mikroreinigungskits zur raschen Präparation der mRNS (Quick prep mRNA Micro purif. kit, geliefert von der Pharmacia) isoliert, wobei die reverse Transkription der mRNS-Moleküle mit dem (gebrauchsfertigen) Synthesekit "Ready to go" für den ersten Strang (geliefert von Pharmacia) ausgeführt wurde, um auf diese Weise die erststrängigen cDNS-Moleküle zu synthetisieren. Unter Verwendung der Primer (Tabelle 4) wurde die PCR oberhalb und unterhalb der im voraus vorgezeichneten und aufgebauten Nukleotidsequenz durchgeführt, was zu dem Ergebnis führte, dass die Expression der mRNS durch die nachfolgende Elektrophorese mit 2,5%igen Agarosegel bestätigt wurde (siehe 4).
Tabelle 4: Sequenzen der PCR-Primern für die für Pt. CD8⁺8-T-Zelten spezifische cDNS
BEISPIEL 5:
Schaffung eines Analysensystems für anti-HIV und Untersuchung der Wirkung gegen das HIV unter Verwendung von CD4-positiven T-Zellen, die mit der DNS des infektiösen HIV transfiziert sind:
Die Untersuchung der Wirkung von CD8-positiven Zellen gegen das HIV ist auf die von einem mit HIV infizierten Patienten stammenden CD4-positiven T-Zellen gegründet, die als Targetzelle verwendet werden. Trotz der Probleme, CD4-positive T-Zellen von Patienten zu gewinnen, welche bei fortgeschrittenem Zustand mit HIV-1 infiziert sind, haben die Erfinder erfolgreich ein Verfahren zur Präparation von CD4-positiven T-Zellen geschaffen, welche mit der DNS vom HIV transfiziert sind.
Insbesondere wurden 1 × 10⁶ Zellen mit 1 mg pNL432 (infektiöser DNS-Klon von HIV-1) oder pGH123 (infektiöser DNS-Klon von HIV-2) transfiziert, wobei eine Methodik auf Basis von DEAE-Dextran eingesetzt wurde, wonach auf RPMI 1640/10% FCS in Anwesenheit von 5% CO₂ 5 Stunden lang bei 37°C inkubiert wurde.
Fünf Stunden später wurde ein Kulturüberstand von infizierten CD8-positiven T-Zellen zu einer Lösung mit transfizierten Zellen hinzugegeben, und zwar in einem solchen Mengenverhältnis, dass der hinzugefügte Überstand ein Viertel des Gesamtvolumens einzunehmen vermochte. Ferner wurde ein polyklonaler anti-IFN-α-Antikörper von Pferden und rekombinantes IL-2 zu dem Medium bis zu einer jeweils endgültigen Konzentration von 50 μ/ml und 0,25 μ/ml hinzugegeben und der Kulturüberstand am Tag 6 zur Untersuchung des Antigens p17 vom HIV gewonnen.
In der Tabelle 5 ist das Verhältnis zwischen der Wirkung gegen das HIV eines Kulturüberstandes von CD8-positiven T-Zellen von Patienten, die mit HIV infiziert waren, im Hinblick auf Ta11-1-CD4--Zellen und die Expression von IL-9R aufgelistet.
Tabelle 5: Effekte des Überstands einer Kultur von CD8⁺T-Zellen von individuellen Patienten, die mit dem HIV infiziert waren, auf die durch IL-9 vermittelte Unterdrückung der HIV-Replikation in Ta11-1-CD4-Zellen:

Claims

Diagnostisches Verfahren zur Erkennung einer HIV-Infektion, bestehend aus der Erkennung oder Messung der Expression durch CD8⁺ T-Lymphozyten (T-Zellen-Lymphozyten) des für T-Zellen spezifischen Interleukin-9-Rezeptors.
Verfahren nach Anspruch 1, bestehend aus der Erkennung oder Messung der Produktion von mRNA, die in einer Kultur von CD8⁺ T-Zellen für IL-9R kodiert.
Verfahren nach Anspruch 1, bestehend aus der Erkennung oder Messung des Effektes von CD8⁺ T-Zellen-Expressionsprodukten auf ein Testsystem, das auf IL-9R antwortet.
Verfahren nach Anspruch 3, bei dem das genannte Testsystem die über IL9R vermittelte Suppression der HIV-Replikation (Autoduplikation) in T-Zellen ist.
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, bei dem die genannten Expressionsprodukte in das genannte Testsystem in Form des Überstandes aus einer Kultur von CD8⁺ T-Zellen eingebracht werden.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem das genannte Verfahren die Diagnose einer Infektion bei einem langfristig asymptomatisch durch HIV infizierten, individuellen Probanden leistet.