JPH11271304A - Ｈｉｖ感染の診断方法 - Google Patents
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- JPH11271304A JPH11271304A JP9687098A JP9687098A JPH11271304A JP H11271304 A JPH11271304 A JP H11271304A JP 9687098 A JP9687098 A JP 9687098A JP 9687098 A JP9687098 A JP 9687098A JP H11271304 A JPH11271304 A JP H11271304A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ＨＩＶ感染の新規な診断法を提供する。
【構成】 Ｔ細胞リンパ球に特異的に発現するＴ細胞成
長因子受容体（ＩＬ−９Ｒ）を指標としてＨＩＶ感染を
診断する。 【効果】 ＣＤ８陽性細胞等の培養上清のＩＬ−９Ｒ発
現量を測定することによりＨＩＶ感染を診断することが
できる。
長因子受容体（ＩＬ−９Ｒ）を指標としてＨＩＶ感染を
診断する。 【効果】 ＣＤ８陽性細胞等の培養上清のＩＬ−９Ｒ発
現量を測定することによりＨＩＶ感染を診断することが
できる。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明はヒト免疫不全ウイル
ス（ＨＩＶ）感染の診断方法に関する。
ス（ＨＩＶ）感染の診断方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】レトロウイルス科に属するＨＩＶの基本
構造は、外部のエンベロープと内部のＲＮＡ及び逆転写
酵素を含むキャプシドから構成されている。ＨＩＶの遺
伝子には構造遺伝子のｇａｇ、逆転写酵素遺伝子のｐｏ
ｌ及びｅｎｖと呼ばれるエンベロープ糖蛋白質の遺伝子
があり、それらの両端に遺伝子発現を制御するためのＬ
ＴＲ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）の
塩基配列が存在する。
構造は、外部のエンベロープと内部のＲＮＡ及び逆転写
酵素を含むキャプシドから構成されている。ＨＩＶの遺
伝子には構造遺伝子のｇａｇ、逆転写酵素遺伝子のｐｏ
ｌ及びｅｎｖと呼ばれるエンベロープ糖蛋白質の遺伝子
があり、それらの両端に遺伝子発現を制御するためのＬ
ＴＲ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）の
塩基配列が存在する。
【０００３】ＨＩＶの感染及び増殖の機構は、第一にＨ
ＩＶがエンベロープ糖蛋白質と標的細胞の受容体との結
合を介して細胞表面に取り込まれる。次に、自らの逆転
写酵素を用いてＤＮＡに逆転写して染色体に挿入されて
感染が成立する。ＨＩＶの増殖では、染色体に組み込ま
れたＨＩＶのＤＮＡがＲＮＡに転写され、ウイルス蛋白
質に翻訳されて、成熟ＨＩＶが産生される。
ＩＶがエンベロープ糖蛋白質と標的細胞の受容体との結
合を介して細胞表面に取り込まれる。次に、自らの逆転
写酵素を用いてＤＮＡに逆転写して染色体に挿入されて
感染が成立する。ＨＩＶの増殖では、染色体に組み込ま
れたＨＩＶのＤＮＡがＲＮＡに転写され、ウイルス蛋白
質に翻訳されて、成熟ＨＩＶが産生される。
【０００４】ウイルス感染での宿主特異性は、標的細胞
のエンベロープ糖蛋白質と細胞膜受容体の特異性で決定
される。特に、ＨＩＶの感染ではリンパ球ＣＤ４の細胞
外ドメインがウイルス感染の特異性に関する糖蛋白質と
して必要であり、その受容体としてＣＣ−ケモカイン受
容体やＦｕｓｉｎなどが働いている。
のエンベロープ糖蛋白質と細胞膜受容体の特異性で決定
される。特に、ＨＩＶの感染ではリンパ球ＣＤ４の細胞
外ドメインがウイルス感染の特異性に関する糖蛋白質と
して必要であり、その受容体としてＣＣ−ケモカイン受
容体やＦｕｓｉｎなどが働いている。
【０００５】また、ＨＩＶウイルスはその発現増殖のた
めに数種の調節遺伝子を保持している。それらの調節遺
伝子であるｔａｔ及びｒｅｖ遺伝子はウイルスの増殖に
必須なＴａｔとＲｅｖ蛋白質をコードしている。ＨＩＶ
のプロモーターであるＬＴＲはＵ３、Ｒ、Ｕ５から構成
され、Ｕ３領域にＴＡＴＡ、ＧＣボックス、複製に必要
とされるＮＦκＢ配列が存在する。Ｒ領域にはＲＮＡに
転写された後にヘアピン構造になりＴａｔ分子と結合す
るＴＡＲ配列があり、ＴａｔとＴＡＲの結合は転写の開
始や継続に必須と考えられている。さらに、Ｒｅｖ蛋白
質はｍＲＮＡのＲＲＥ配列に結合してｍＲＮＡのスプラ
イシングの過程で機能している。
めに数種の調節遺伝子を保持している。それらの調節遺
伝子であるｔａｔ及びｒｅｖ遺伝子はウイルスの増殖に
必須なＴａｔとＲｅｖ蛋白質をコードしている。ＨＩＶ
のプロモーターであるＬＴＲはＵ３、Ｒ、Ｕ５から構成
され、Ｕ３領域にＴＡＴＡ、ＧＣボックス、複製に必要
とされるＮＦκＢ配列が存在する。Ｒ領域にはＲＮＡに
転写された後にヘアピン構造になりＴａｔ分子と結合す
るＴＡＲ配列があり、ＴａｔとＴＡＲの結合は転写の開
始や継続に必須と考えられている。さらに、Ｒｅｖ蛋白
質はｍＲＮＡのＲＲＥ配列に結合してｍＲＮＡのスプラ
イシングの過程で機能している。
【０００６】以上のことがレトロウイルス科のＨＩＶの
基本的な特徴として明らかにされている。しかし、レト
ロウイルスの関連する疾患は治癒の困難な難病が多く、
典型的な例としてはＨＩＶで引き起こされる致死性の高
い後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）がある。
基本的な特徴として明らかにされている。しかし、レト
ロウイルスの関連する疾患は治癒の困難な難病が多く、
典型的な例としてはＨＩＶで引き起こされる致死性の高
い後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）がある。
【０００７】ＨＩＶの感染で引き起こされる後天性免疫
不全症候群（ＡＩＤＳ）は、感染後に数年から十数年か
けて免疫系のゆっくりした破壊に特徴ずけられる。第一
次的な免疫応答が出現すると、次第にウイルス感染の症
状が消えて、ウイルス複製の低下が起こる。ＨＩＶ感染
の後期までに数年間、臨床的にも末梢血球（ＰＢＭＣ
ｓ）にウイルス及びその複製は殆ど検出されない。
不全症候群（ＡＩＤＳ）は、感染後に数年から十数年か
けて免疫系のゆっくりした破壊に特徴ずけられる。第一
次的な免疫応答が出現すると、次第にウイルス感染の症
状が消えて、ウイルス複製の低下が起こる。ＨＩＶ感染
の後期までに数年間、臨床的にも末梢血球（ＰＢＭＣ
ｓ）にウイルス及びその複製は殆ど検出されない。
【０００８】最近、ＨＩＶ感染者の中に少数であるが長
期無症候性患者の存在が注目され、それらの人々のリン
パ球がｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＩＶの複製を抑制できるＣ
Ｄ８陽性Ｔ細胞を維持していることが示された。
期無症候性患者の存在が注目され、それらの人々のリン
パ球がｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＩＶの複製を抑制できるＣ
Ｄ８陽性Ｔ細胞を維持していることが示された。
【０００９】多くのウイルス性疾患と同様に、ＣＤ８陽
性Ｔリンパ球はＨＩＶ感染の生体防御に重要な役割を果
たしていると推察され、感染症状の臨床的な潜在性や長
期無症候性患者においてもＣＤ８陽性Ｔリンパ球の重要
さが認められている〔Ｊ．Ｌ．Ｗｈｉｔｔｏｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，
ｐｐ．３６９−３８１，（１９９０），Ｗ．Ｅ．Ｐａｕ
ｌ，Ｃｅｌｌ，８２：１７７，（１９９５）〕。特に、
ＨＩＶ感染者患者の末梢血由来の活性化ＣＤ８陽性Ｔ細
胞が、数種の可溶性のＨＩＶの抑制因子を分泌し、ｉｎ
ｖｉｖｏでのＨＩＶ感染の防御に寄与していたことが
見いだされている〔Ｊ．Ｅ．Ｂｒｉｎｃｈｍａｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４４：２９６１，
（１９９０），Ｃ．Ｅ．Ｍａｃｋｅｗｉｃｚ ｅｔ ａ
ｌ．，ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ
ｅｓ，８：１０３９，（１９９２）〕。
性Ｔリンパ球はＨＩＶ感染の生体防御に重要な役割を果
たしていると推察され、感染症状の臨床的な潜在性や長
期無症候性患者においてもＣＤ８陽性Ｔリンパ球の重要
さが認められている〔Ｊ．Ｌ．Ｗｈｉｔｔｏｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，
ｐｐ．３６９−３８１，（１９９０），Ｗ．Ｅ．Ｐａｕ
ｌ，Ｃｅｌｌ，８２：１７７，（１９９５）〕。特に、
ＨＩＶ感染者患者の末梢血由来の活性化ＣＤ８陽性Ｔ細
胞が、数種の可溶性のＨＩＶの抑制因子を分泌し、ｉｎ
ｖｉｖｏでのＨＩＶ感染の防御に寄与していたことが
見いだされている〔Ｊ．Ｅ．Ｂｒｉｎｃｈｍａｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４４：２９６１，
（１９９０），Ｃ．Ｅ．Ｍａｃｋｅｗｉｃｚ ｅｔ ａ
ｌ．，ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ
ｅｓ，８：１０３９，（１９９２）〕。
【００１０】ＨＩＶの感染患者由来のＣＤ８陽性Ｔ細胞
の細胞培養液の上清は、高いレベルのＲＡＮＴＥＳ（６
−９５ｎｇ／ｍｌ）、ＭＩＰ−１α（２８−２５５ｎｇ
／ｍｌ）、ＭＩＰ−１β（３７−１９１ｎｇ／ｍｌ）を
含有し、これらのＨＩＶ抑制因子はＨＩＶの細胞感染の
阻害を示す〔Ｆｉｏｒｅｎｚａ Ｃｏｃｃｈｉ ｅｔａ
ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０：１８１１，（１９９
５）〕。
の細胞培養液の上清は、高いレベルのＲＡＮＴＥＳ（６
−９５ｎｇ／ｍｌ）、ＭＩＰ−１α（２８−２５５ｎｇ
／ｍｌ）、ＭＩＰ−１β（３７−１９１ｎｇ／ｍｌ）を
含有し、これらのＨＩＶ抑制因子はＨＩＶの細胞感染の
阻害を示す〔Ｆｉｏｒｅｎｚａ Ｃｏｃｃｈｉ ｅｔａ
ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０：１８１１，（１９９
５）〕。
【００１１】この様に、ＨＩＶ感染者の中に見られる長
期無症候性患者のＣＤ８陽性Ｔリンパ球は種々のサイト
カイン類を分泌し、Ｔリンパ球が活性化状態であること
を示唆している。細胞溶解性のＴリンパ球のＣＤ８抗原
は３２ｋＤａの分子量であり、免疫グロブリン科であ
り、主たる組織適合性複合体（ＭＨＣ−Ｉ）抗原の認識
に関与することが確認されている。また、Ｔヘルパーリ
ンパ球（Ｔｈ）は分子量５５ｋＤａのＣＤ４抗原を保持
している。これらのＣＤ８及びＣＤ４のリンパ球のサブ
セット抗原は、細胞の活性化制御に深く関与していると
推察されている。
期無症候性患者のＣＤ８陽性Ｔリンパ球は種々のサイト
カイン類を分泌し、Ｔリンパ球が活性化状態であること
を示唆している。細胞溶解性のＴリンパ球のＣＤ８抗原
は３２ｋＤａの分子量であり、免疫グロブリン科であ
り、主たる組織適合性複合体（ＭＨＣ−Ｉ）抗原の認識
に関与することが確認されている。また、Ｔヘルパーリ
ンパ球（Ｔｈ）は分子量５５ｋＤａのＣＤ４抗原を保持
している。これらのＣＤ８及びＣＤ４のリンパ球のサブ
セット抗原は、細胞の活性化制御に深く関与していると
推察されている。
【００１２】ヒトＣＤ４陽性Ｔリンパ球を抗ＣＤ３抗体
で活性化刺激するとインターロイキン９（ＩＬ−９）の
ｍＲＮＡを発現し、ＣＤ４陽性Ｔリンパ球がＩＬ−９を
分泌することが示された〔Ｒｅｎａｕｌｄ．Ｊ．Ｃ．ｅ
ｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：４２３５
（１９９０）〕。ＩＬ−９がＴヘルパーリンパ球の成長
因子として働いていることから、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の活
性化に関係する〔Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ．８５：８９３４，（１９８９）〕。ヒトリンパ球で
は、ＩＬ−９などのサイトカイン類のリガンドとそれら
のリガンド受容体のオートクリン的な成長及び活性化が
示唆されている。Ｉｎ ｖｉｔｒｏでＩＬ−９は活性化
された二型のＴリンパ球（Ｔｈ２）のＣＤ陽性Ｔ細胞及
びナイーブなＣＤ４陽性細胞で生成される〔Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ，１４７：３８４８，（１９９１）〕。
で活性化刺激するとインターロイキン９（ＩＬ−９）の
ｍＲＮＡを発現し、ＣＤ４陽性Ｔリンパ球がＩＬ−９を
分泌することが示された〔Ｒｅｎａｕｌｄ．Ｊ．Ｃ．ｅ
ｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：４２３５
（１９９０）〕。ＩＬ−９がＴヘルパーリンパ球の成長
因子として働いていることから、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の活
性化に関係する〔Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ．８５：８９３４，（１９８９）〕。ヒトリンパ球で
は、ＩＬ−９などのサイトカイン類のリガンドとそれら
のリガンド受容体のオートクリン的な成長及び活性化が
示唆されている。Ｉｎ ｖｉｔｒｏでＩＬ−９は活性化
された二型のＴリンパ球（Ｔｈ２）のＣＤ陽性Ｔ細胞及
びナイーブなＣＤ４陽性細胞で生成される〔Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ，１４７：３８４８，（１９９１）〕。
【００１３】ＩＬ−９の遺伝子は５個のエクソンと４個
のイントロンから構成され、基本的にヘルパーＴ細胞の
成長を支持する能力を持つとして固定されたが、標的細
胞は多様であり、肥満細胞（ｍａｓｔ ｃｅｌｌ）、巨
核芽球白血病（ｍｅｇａｋａｒｙｏｂｌａｓｔｉｃ ｌ
ｅｕｋｅｍｉａ）、胎児胸腺細胞（ｆｅｔａｌ ｔｈｙ
ｍｏｃｙｔｅｓ）、ｍｕｒｉｎｅ ｓｒｙｔｈｒｏｉｄ
ｐｒｏｇｃｎｉｔｏｒｓ、ｈｕｍａｎｅ ｒｙｔｈｒ
ｏｉｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）、ヒト骨髄前駆体
（ｈｕｍａｎ ｍｙｅｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ
ｓ）に関与する多機能のサイトカインである。ＩＬー９
の受容体（ＩＬ−９Ｒ）は９個のエクソンと８個のイン
トロンから成り〔Ｂｌｏｏｄ，８３：３１９９，（１９
４４）〕ヘモポエチン受容体スーパーファミリーであ
り、シグナルトランスダクションのためにインターロイ
キン受容体（ＩＬ−２Ｒ）のγ鎖と相互作用する〔Ｒｅ
ｎａｕｌｄ Ｊ−Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｅｕｋ
ｏ．Ｂｉｏｌ．，５７：３５３，（１９９５）〕。
のイントロンから構成され、基本的にヘルパーＴ細胞の
成長を支持する能力を持つとして固定されたが、標的細
胞は多様であり、肥満細胞（ｍａｓｔ ｃｅｌｌ）、巨
核芽球白血病（ｍｅｇａｋａｒｙｏｂｌａｓｔｉｃ ｌ
ｅｕｋｅｍｉａ）、胎児胸腺細胞（ｆｅｔａｌ ｔｈｙ
ｍｏｃｙｔｅｓ）、ｍｕｒｉｎｅ ｓｒｙｔｈｒｏｉｄ
ｐｒｏｇｃｎｉｔｏｒｓ、ｈｕｍａｎｅ ｒｙｔｈｒ
ｏｉｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）、ヒト骨髄前駆体
（ｈｕｍａｎ ｍｙｅｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ
ｓ）に関与する多機能のサイトカインである。ＩＬー９
の受容体（ＩＬ−９Ｒ）は９個のエクソンと８個のイン
トロンから成り〔Ｂｌｏｏｄ，８３：３１９９，（１９
４４）〕ヘモポエチン受容体スーパーファミリーであ
り、シグナルトランスダクションのためにインターロイ
キン受容体（ＩＬ−２Ｒ）のγ鎖と相互作用する〔Ｒｅ
ｎａｕｌｄ Ｊ−Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｅｕｋ
ｏ．Ｂｉｏｌ．，５７：３５３，（１９９５）〕。
【００１４】ＩＬ−９のＴリンパ球に対する応答は当惑
的であり、抗原刺激やその間合いで、顕著に変化するこ
とが知られている。胎児の胸腺細胞は、ＩＬ−２とＩＬ
−９の組み合わせの条件で細胞の伸長を示す。ＩＬ−９
の発現は活性化されたＴ細胞に限定されるが、その誘導
を速度論的に解析するとＩＬ−９ｍＲＮＡの発現は、Ｔ
細胞活性化の後期の段階（２８時間をピーク）で出現
し、ＩＬ−2 の媒介を必要としている。ＩＬ−９で多核
白血球を刺激し、ウエスタン ブロット分析で４つの未
固定のチロシン燐酸化バンドが認められるが、セリン−
スレオニン キナーゼ（Ｒａｆ−１、ＭＡＰ）の燐酸化
を促進しない。
的であり、抗原刺激やその間合いで、顕著に変化するこ
とが知られている。胎児の胸腺細胞は、ＩＬ−２とＩＬ
−９の組み合わせの条件で細胞の伸長を示す。ＩＬ−９
の発現は活性化されたＴ細胞に限定されるが、その誘導
を速度論的に解析するとＩＬ−９ｍＲＮＡの発現は、Ｔ
細胞活性化の後期の段階（２８時間をピーク）で出現
し、ＩＬ−2 の媒介を必要としている。ＩＬ−９で多核
白血球を刺激し、ウエスタン ブロット分析で４つの未
固定のチロシン燐酸化バンドが認められるが、セリン−
スレオニン キナーゼ（Ｒａｆ−１、ＭＡＰ）の燐酸化
を促進しない。
【００１５】インターロイキン９受容体（ＩＬ−９Ｒ）
はＴ細胞を含む種々の細胞膜上に存在し、ＩＬ−９に対
して特異的に高い親和性（Ｋｄ＝〜１００ｐＭ）で存在
する〔Ｉｄｚｅｒｄａ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅ
ｘｐ．Ｍｅｄ．，１７１：８６１，（１９９０）〕。ヒ
トに於いて、ＩＬ−９Ｒのメッセージはそれのオールタ
ーネイティブ スプライシング機構によりヘテロ性が見
られる。また、ヒトゲノムに少なくとも４個のＩＬ−９
Ｒの偽遺伝子が存在し、それらの遺伝子はＩＬ−９Ｒと
約９０％のホモロジーを示している。一般的に、サイト
カイン受容体は二つの鎖で構成され、第一鎖はリガンド
に特異的であり、付加的な鎖は数種のサイトカインで共
通であるが、ＩＬ−２Ｒのγ−鎖はＩＬ−９Ｒに関連
し、そのγ鎖の抗体はＩＬ−９の活性を完全に阻害す
る。
はＴ細胞を含む種々の細胞膜上に存在し、ＩＬ−９に対
して特異的に高い親和性（Ｋｄ＝〜１００ｐＭ）で存在
する〔Ｉｄｚｅｒｄａ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅ
ｘｐ．Ｍｅｄ．，１７１：８６１，（１９９０）〕。ヒ
トに於いて、ＩＬ−９Ｒのメッセージはそれのオールタ
ーネイティブ スプライシング機構によりヘテロ性が見
られる。また、ヒトゲノムに少なくとも４個のＩＬ−９
Ｒの偽遺伝子が存在し、それらの遺伝子はＩＬ−９Ｒと
約９０％のホモロジーを示している。一般的に、サイト
カイン受容体は二つの鎖で構成され、第一鎖はリガンド
に特異的であり、付加的な鎖は数種のサイトカインで共
通であるが、ＩＬ−２Ｒのγ−鎖はＩＬ−９Ｒに関連
し、そのγ鎖の抗体はＩＬ−９の活性を完全に阻害す
る。
【００１６】それ故、標的細胞に対してＩＬ−２とＩＬ
−９は高いシナージー効果を示すことが認められてい
る。さらに、ある細胞系に対してＩＬ−９は細胞増殖よ
りもアポトーシスから細胞を保護する力があるが、ＩＬ
−２はより細胞の増殖に効果的である。アポトーシスは
活性化された細胞にユニークな特徴であり、従って、活
性状態にあるリンパ球で抗アポトーシス性を示すＩＬ−
９は重要な役割を果たしていると推察される。
−９は高いシナージー効果を示すことが認められてい
る。さらに、ある細胞系に対してＩＬ−９は細胞増殖よ
りもアポトーシスから細胞を保護する力があるが、ＩＬ
−２はより細胞の増殖に効果的である。アポトーシスは
活性化された細胞にユニークな特徴であり、従って、活
性状態にあるリンパ球で抗アポトーシス性を示すＩＬ−
９は重要な役割を果たしていると推察される。
【００１７】ヒトＴリンパ球細胞系とそのクローンは、
ＣＤ４陽性及びＣＤ８陽性型に関わらず、ＩＬ−９に応
答して高いＩＬ−９Ｒのメッセージを発現して細胞増殖
を示す。例えば、腫瘍特異的なＣＤ８陽性Ｔリンパ球は
ＩＬ−９Ｒのメッセージを発現し、ＩＬ−９は細胞の増
殖または生存の延長を促進する。ＩＬ−９の最適効果を
引き出すには、細胞の前活性化を必要とする〔Ｈｅｒｅ
ｄｅｒｉｃ Ａ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．，１５０：２６３４，（１９９３）〕。
ＣＤ４陽性及びＣＤ８陽性型に関わらず、ＩＬ−９に応
答して高いＩＬ−９Ｒのメッセージを発現して細胞増殖
を示す。例えば、腫瘍特異的なＣＤ８陽性Ｔリンパ球は
ＩＬ−９Ｒのメッセージを発現し、ＩＬ−９は細胞の増
殖または生存の延長を促進する。ＩＬ−９の最適効果を
引き出すには、細胞の前活性化を必要とする〔Ｈｅｒｅ
ｄｅｒｉｃ Ａ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．，１５０：２６３４，（１９９３）〕。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】本発明はＨＩＶ感染の
新しい診断法を提供しようとするものである。
新しい診断法を提供しようとするものである。
【００１９】
【課題を解決するための手段】発明者らは、ＨＩＶ感染
者の長期無症候性患者由来のリンパ球が、抗ＨＩＶ活性
を示すＣＤ８陽性Ｔリンパ球を保持することに着目し、
リンパ球のゲノム分析を行った。ＨＩＶ感染者及び非感
染者のＣＤ８陽性Ｔリンパ球由来のｃＤＮＡライブラリ
ーを作製し、非感染者のＣＤ８陽性Ｔ細胞のｍＲＮＡで
サブセットして、残ったＨＩＶ−１感染者のＣＤ８陽性
Ｔ細胞に特異的なプローブ使って、ＨＩＶ感染者に特有
なＣＤ８陽性Ｔ細胞のｃＤＮＡを有するコロニーを得た
（表１、２）。２回のハイブリダイゼーションを繰り返
し、得られた陽性コロニーについて塩基配列を決定し、
ホモロジー検索の結果として、ＩＬ−９Ｒが顕著に発現
していることが見い出された（表３）。
者の長期無症候性患者由来のリンパ球が、抗ＨＩＶ活性
を示すＣＤ８陽性Ｔリンパ球を保持することに着目し、
リンパ球のゲノム分析を行った。ＨＩＶ感染者及び非感
染者のＣＤ８陽性Ｔリンパ球由来のｃＤＮＡライブラリ
ーを作製し、非感染者のＣＤ８陽性Ｔ細胞のｍＲＮＡで
サブセットして、残ったＨＩＶ−１感染者のＣＤ８陽性
Ｔ細胞に特異的なプローブ使って、ＨＩＶ感染者に特有
なＣＤ８陽性Ｔ細胞のｃＤＮＡを有するコロニーを得た
（表１、２）。２回のハイブリダイゼーションを繰り返
し、得られた陽性コロニーについて塩基配列を決定し、
ホモロジー検索の結果として、ＩＬ−９Ｒが顕著に発現
していることが見い出された（表３）。
【００２０】その発現のレベルは、患者により個体差が
みられるが、強い抗ＨＩＶ活性を示す患者由来のＣＤ８
陽性Ｔリンパ球程、相対的のＩＬ−９Ｒが強く発現して
いる（図４、表５）。ＣＤ８陽性Ｔ細胞におけるＩＬ−
９Ｒの発現は長期無症候性感染者に特徴的であり、非感
染者のＣＤ８陽性Ｔリンパ球にＩＬ−９Ｒの発現は検出
されないか無視し得るレベルである（図４、表５）。従
って、本発明者らは長期無症候性ＨＩＶ患者の抗ＨＩＶ
活性をゲノム分析することでＩＬ−９Ｒの発現として特
徴づけたものであり、ＨＩＶを含むウイルス感染者の診
断を可能とした。
みられるが、強い抗ＨＩＶ活性を示す患者由来のＣＤ８
陽性Ｔリンパ球程、相対的のＩＬ−９Ｒが強く発現して
いる（図４、表５）。ＣＤ８陽性Ｔ細胞におけるＩＬ−
９Ｒの発現は長期無症候性感染者に特徴的であり、非感
染者のＣＤ８陽性Ｔリンパ球にＩＬ−９Ｒの発現は検出
されないか無視し得るレベルである（図４、表５）。従
って、本発明者らは長期無症候性ＨＩＶ患者の抗ＨＩＶ
活性をゲノム分析することでＩＬ−９Ｒの発現として特
徴づけたものであり、ＨＩＶを含むウイルス感染者の診
断を可能とした。
【００２１】本発明はこれらの知見に基づくもので、Ｔ
細胞リンパ球に特異的に発現するＴ細胞成長因子受容体
（ＩＬ−９Ｒ）を指標とすることを特徴とするＨＩＶ感
染の診断方法である。Ｔ細胞リンパ球としては、ＣＤ８
陽性又はＣＤ４陽性Ｔ細胞が好ましく、その培養上清を
検体として診断に用いることができる。
細胞リンパ球に特異的に発現するＴ細胞成長因子受容体
（ＩＬ−９Ｒ）を指標とすることを特徴とするＨＩＶ感
染の診断方法である。Ｔ細胞リンパ球としては、ＣＤ８
陽性又はＣＤ４陽性Ｔ細胞が好ましく、その培養上清を
検体として診断に用いることができる。
【００２２】本発明者らにより、ＨＩＶ感染者の長期無
症候性患者の末梢血由来のＴリンパ球が遺伝子レベルで
活性化状態にあることが明らかにされた。リンパ球活性
化の一つの指標としてＩＬ−９Ｒが発現されるために、
ＩＬ−９Ｒに対するリガンド蛋白質を加えることで、リ
ンパ球の抗ウイルス活性を増強させ、又調節することが
できる。リガンド蛋白質及びポリペプチドとしてサイト
カイン類及びケモカイン類があり、ＩＬ−９Ｒに高い親
和性を示すＩＬ−２及びＩＬ−９が効果的であると推察
され、特にＡＩＤＳ治療薬として有効と思われる。ま
た、リンパ球細胞にＩＬ−９Ｒの発現を誘導する物質も
抗ＨＩＶ薬となる。
症候性患者の末梢血由来のＴリンパ球が遺伝子レベルで
活性化状態にあることが明らかにされた。リンパ球活性
化の一つの指標としてＩＬ−９Ｒが発現されるために、
ＩＬ−９Ｒに対するリガンド蛋白質を加えることで、リ
ンパ球の抗ウイルス活性を増強させ、又調節することが
できる。リガンド蛋白質及びポリペプチドとしてサイト
カイン類及びケモカイン類があり、ＩＬ−９Ｒに高い親
和性を示すＩＬ−２及びＩＬ−９が効果的であると推察
され、特にＡＩＤＳ治療薬として有効と思われる。ま
た、リンパ球細胞にＩＬ−９Ｒの発現を誘導する物質も
抗ＨＩＶ薬となる。
【００２３】ＩＬ−２はｉｎ ｖｉｔｒｏでのリンパ球
培養に必須であることが知られているが、ＩＬ−２とＩ
Ｌ−９の同時投与及び個々の投与による活性化も可能で
ある。ＩＬ−９Ｒに対するリガンドとして非蛋白質を用
いてリンパ球を活性化することもできる。さらに、ＩＬ
−９Ｒに対するリガンドがＩＬ−２及びＩＬ−９の受容
体結合部位のアミノ酸配列を含有するポリペプチドであ
ってもよい。
培養に必須であることが知られているが、ＩＬ−２とＩ
Ｌ−９の同時投与及び個々の投与による活性化も可能で
ある。ＩＬ−９Ｒに対するリガンドとして非蛋白質を用
いてリンパ球を活性化することもできる。さらに、ＩＬ
−９Ｒに対するリガンドがＩＬ−２及びＩＬ−９の受容
体結合部位のアミノ酸配列を含有するポリペプチドであ
ってもよい。
【００２４】また、リンパ球活性化の調節・活性化アゴ
ニストとしてＩＬ−９Ｒに高い親和性を有するＩＬ−９
類似体を含む。その類似体の作製はアミノ酸の置換、削
除及び付加などの周知の遺伝子工学的な操作により容易
である。
ニストとしてＩＬ−９Ｒに高い親和性を有するＩＬ−９
類似体を含む。その類似体の作製はアミノ酸の置換、削
除及び付加などの周知の遺伝子工学的な操作により容易
である。
【００２５】リンパ球細胞膜上のＩＬ−９Ｒに対するア
ゴニスト及びアンタゴニストを探索する手段としてＨＩ
Ｖ感染者の長期無症候性患者の末梢血からＣＤ８陽性Ｔ
リンパ球を単離し、培養して用いた。アゴニスト及びア
ンタゴニスト作用の測定法として、サイトセンサーによ
るｐＨ変化の測定で細胞の代謝活性を測定する方法や、
抗ＨＩＶ分析としてＬＴＲ−ＣＡＴ分析やＲＴ分析を用
いることができる。アゴニスト及びアンタゴニストは蛋
白質・ポリペプチド類や非蛋白質物質を含む。
ゴニスト及びアンタゴニストを探索する手段としてＨＩ
Ｖ感染者の長期無症候性患者の末梢血からＣＤ８陽性Ｔ
リンパ球を単離し、培養して用いた。アゴニスト及びア
ンタゴニスト作用の測定法として、サイトセンサーによ
るｐＨ変化の測定で細胞の代謝活性を測定する方法や、
抗ＨＩＶ分析としてＬＴＲ−ＣＡＴ分析やＲＴ分析を用
いることができる。アゴニスト及びアンタゴニストは蛋
白質・ポリペプチド類や非蛋白質物質を含む。
【００２６】
【実施例】材料 Ｑｕｉｃｋ ｐｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｍｉｃｒｏ ｐｕｒ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、Ｇ
ｒｅａｔ Ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ ｋｉｔ（ＣＬＯＮＥＴＥＣ）、「α−３２Ｐ」ｄＣ
ＴＰ（３，０００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ）、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（ＴａＫ
ａＲａ）、ｐＵＣ１１８（ＴａＫａＲａ）＜ＥｃｏＲ
Ｉ ｓｉｔｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ、ＢＡＰ処理＞、Ｍ
ａｘ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙＤＨ５α ｃｏｍｐｅｔｅ
ｎｔ ｃｅｌｌ（ＧＩＢＣＯ）、Ｓｕｂｔｒａｃｔｏｒ
Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｋｌｅｎｏｗ ｆ
ｒａｇｍｅｎｔ（ＴａＫａＲａ）、ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋
Ｎｙｌｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、
Ｗｈａｔｍａｎ ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ・３ＭＭ
（Ｃｈｒ）、ＲＰＭ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ １０１）、Ｒｅ
ａｄｙ・Ｔｏ・Ｇｏ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｓｙｎｔ
ｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
ｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、Ｇ
ｒｅａｔ Ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ ｋｉｔ（ＣＬＯＮＥＴＥＣ）、「α−３２Ｐ」ｄＣ
ＴＰ（３，０００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ）、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（ＴａＫ
ａＲａ）、ｐＵＣ１１８（ＴａＫａＲａ）＜ＥｃｏＲ
Ｉ ｓｉｔｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ、ＢＡＰ処理＞、Ｍ
ａｘ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙＤＨ５α ｃｏｍｐｅｔｅ
ｎｔ ｃｅｌｌ（ＧＩＢＣＯ）、Ｓｕｂｔｒａｃｔｏｒ
Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｋｌｅｎｏｗ ｆ
ｒａｇｍｅｎｔ（ＴａＫａＲａ）、ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋
Ｎｙｌｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、
Ｗｈａｔｍａｎ ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ・３ＭＭ
（Ｃｈｒ）、ＲＰＭ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ １０１）、Ｒｅ
ａｄｙ・Ｔｏ・Ｇｏ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｓｙｎｔ
ｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
【００２７】実施例１．ＨＩＶ感染者ＣＤ８陽性Ｔ細胞
ｃＤＮＡライブラリーの作製（図１、表１） 抗ＨＩＶ抗体陽性者のリンパ球よりＣＤ８陽性Ｔ細胞の
みを抗ＣＤ８抗体結合磁気ビーズ（第一化学薬品）を用
いて単離した。これらＣＤ８陽性Ｔ細胞を１０％のウシ
胎児血清（ギブコ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地（日
水製薬）で数日間培養しその培養上清をＨＩＶ感染細胞
に添加して培養液中のＨＩＶ蛋白質ｐ１７について酵素
免疫測定キット（ダイナボット）で定量した。その結
果、ある特定のＨＩＶ感染者由来のＣＤ８陽性Ｔ細胞の
培養液は他のＨＩＶ感染者や健常人由来のＣＤ８陽性Ｔ
細胞の培養液に比べＨＩＶ感染細胞のｐ１７産生を著し
く抑制した。そこで抗ＨＩＶ活性を示すＣＤ８陽性Ｔ細
胞を１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ培地で数日間培
養し細胞を回収しＱｕｉｃｋ ｐｒｅｐ ｍＲＮＡＭｉ
ｃｒｏ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ファルマ
シア）を用いてｍＲＮＡを単離した。そして、Ｏｌｉｇ
ｏ（ｄＴ）２５ｄ（Ａ／Ｃ／Ｇ）（クロンテック）をプ
ライマーとして逆転写酵素（クロンテック）で第１鎖ｃ
ＤＮＡを得た。一般的にＯｌｉｇｏ（ｄＴ）ｎＰｒｉｍ
ｅｒを用いるところをＯｌｉｇｏ（ｄＴ）２５ｄ（Ａ／
Ｃ／Ｇ）Ｐｒｉｍｅｒを用いることにより、ｍＲＮＡの
ｐｏｌｙ Ａ配列の５′側にアニーリングを行い、タン
パク質をコードしている部分の第１鎖ｃＤＮＡをより長
く合成することができた。続いてＲＮＡ分解酵素Ｈ（ク
ロンテック）と大腸菌由来ＤＮＡポリメラーゼＩ（クロ
ンテック）と大腸菌由来ＤＮＡリガーゼ（クロンテッ
ク）で第２鎖ｃＤＮＡ合成をした後、ＤＮＡポリメラー
ゼ（クロンテック）で末端を平滑化し、ＥｃｏＲＩ、Ｎ
ｏｔＩ、ＳａｌＩ認識部位を含むアダプター（クロンテ
ック）をＤＮＡリガーゼ（クロンテック）によりｃＤＮ
Ａの両端に結合させポリヌクレオチドキナーゼ（クロン
テック）でリン酸化した。尚、第１鎖、第２鎖ｃＤＮＡ
合成反応の基質に３２Ｐ−ｄＣＴＰ（アマシャム）を添
加し放射標識を行った。良質なｃＤＮＡライブラリーと
しての条件を満たす約５００ｂｐ以上のｃＤＮＡを選別
するため上記のｃＤＮＡをｃＤＮＡ分画カラム（クロン
テック）にアプライしＳＴＥ緩衝液（０．５ｍＭＥＤＴ
Ａと３０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス塩酸
緩衝液ｐＨ７．８）で展開した。５００ｂｐ以上に相当
する分画を集めて２倍量のエタノールと１０分の１量の
３Ｍ酢酸ナトリウム溶液ｐＨ５．２を加えて沈殿させ、
遠心分離によって回収した。１０ｕｌのＴＥ緩衝液（１
ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．
０）に溶解したｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ消化後アガロー
スゲル電気泳動で単離し脱リン酸化したｐＵＣ１１８
（宝酒造）ベクターと混合しさらにリガーゼ（宝酒造）
を加えてｃＤＮＡをｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩ切断部位
に組み込んだ（図３）。このプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ
ＤＨ５αコンピテントセル（ギブコ）に加えてＨａｎ
ａｈａｎの方法を用い形質転換し導入した。形質転換後
のＥ．ｃｏｌｉを１．５％寒天を含むＬ−Ｂｒｏｔｈ培
地に播種し３７度で培養してコロニーをＬ−Ｂｒｏｔｈ
培地で懸濁しさらに最終濃度７％になるようにジメチル
スルフォキシドを添加し−８０度で保存した。ライブラ
リーの複雑度を推定したところ３．６×１０５ｃｆｕ
（３．９×１０５ｃｆｕ／ｕｇ）であった。
ｃＤＮＡライブラリーの作製（図１、表１） 抗ＨＩＶ抗体陽性者のリンパ球よりＣＤ８陽性Ｔ細胞の
みを抗ＣＤ８抗体結合磁気ビーズ（第一化学薬品）を用
いて単離した。これらＣＤ８陽性Ｔ細胞を１０％のウシ
胎児血清（ギブコ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地（日
水製薬）で数日間培養しその培養上清をＨＩＶ感染細胞
に添加して培養液中のＨＩＶ蛋白質ｐ１７について酵素
免疫測定キット（ダイナボット）で定量した。その結
果、ある特定のＨＩＶ感染者由来のＣＤ８陽性Ｔ細胞の
培養液は他のＨＩＶ感染者や健常人由来のＣＤ８陽性Ｔ
細胞の培養液に比べＨＩＶ感染細胞のｐ１７産生を著し
く抑制した。そこで抗ＨＩＶ活性を示すＣＤ８陽性Ｔ細
胞を１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ培地で数日間培
養し細胞を回収しＱｕｉｃｋ ｐｒｅｐ ｍＲＮＡＭｉ
ｃｒｏ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ファルマ
シア）を用いてｍＲＮＡを単離した。そして、Ｏｌｉｇ
ｏ（ｄＴ）２５ｄ（Ａ／Ｃ／Ｇ）（クロンテック）をプ
ライマーとして逆転写酵素（クロンテック）で第１鎖ｃ
ＤＮＡを得た。一般的にＯｌｉｇｏ（ｄＴ）ｎＰｒｉｍ
ｅｒを用いるところをＯｌｉｇｏ（ｄＴ）２５ｄ（Ａ／
Ｃ／Ｇ）Ｐｒｉｍｅｒを用いることにより、ｍＲＮＡの
ｐｏｌｙ Ａ配列の５′側にアニーリングを行い、タン
パク質をコードしている部分の第１鎖ｃＤＮＡをより長
く合成することができた。続いてＲＮＡ分解酵素Ｈ（ク
ロンテック）と大腸菌由来ＤＮＡポリメラーゼＩ（クロ
ンテック）と大腸菌由来ＤＮＡリガーゼ（クロンテッ
ク）で第２鎖ｃＤＮＡ合成をした後、ＤＮＡポリメラー
ゼ（クロンテック）で末端を平滑化し、ＥｃｏＲＩ、Ｎ
ｏｔＩ、ＳａｌＩ認識部位を含むアダプター（クロンテ
ック）をＤＮＡリガーゼ（クロンテック）によりｃＤＮ
Ａの両端に結合させポリヌクレオチドキナーゼ（クロン
テック）でリン酸化した。尚、第１鎖、第２鎖ｃＤＮＡ
合成反応の基質に３２Ｐ−ｄＣＴＰ（アマシャム）を添
加し放射標識を行った。良質なｃＤＮＡライブラリーと
しての条件を満たす約５００ｂｐ以上のｃＤＮＡを選別
するため上記のｃＤＮＡをｃＤＮＡ分画カラム（クロン
テック）にアプライしＳＴＥ緩衝液（０．５ｍＭＥＤＴ
Ａと３０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス塩酸
緩衝液ｐＨ７．８）で展開した。５００ｂｐ以上に相当
する分画を集めて２倍量のエタノールと１０分の１量の
３Ｍ酢酸ナトリウム溶液ｐＨ５．２を加えて沈殿させ、
遠心分離によって回収した。１０ｕｌのＴＥ緩衝液（１
ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．
０）に溶解したｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ消化後アガロー
スゲル電気泳動で単離し脱リン酸化したｐＵＣ１１８
（宝酒造）ベクターと混合しさらにリガーゼ（宝酒造）
を加えてｃＤＮＡをｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩ切断部位
に組み込んだ（図３）。このプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ
ＤＨ５αコンピテントセル（ギブコ）に加えてＨａｎ
ａｈａｎの方法を用い形質転換し導入した。形質転換後
のＥ．ｃｏｌｉを１．５％寒天を含むＬ−Ｂｒｏｔｈ培
地に播種し３７度で培養してコロニーをＬ−Ｂｒｏｔｈ
培地で懸濁しさらに最終濃度７％になるようにジメチル
スルフォキシドを添加し−８０度で保存した。ライブラ
リーの複雑度を推定したところ３．６×１０５ｃｆｕ
（３．９×１０５ｃｆｕ／ｕｇ）であった。
【００２８】
【表１】
【００２９】表１はＨＩＶ感染者のＣＤ８陽性Ｔ細胞ｍ
ＲＮＡからのｃＤＮＡ回収状況を示すもので、ＨＩＶ感
染者のＣＤ８陽性Ｔ細胞ｍＲＮＡ ４．０ｕｇを単離
後、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５ｄ（Ａ／Ｃ／Ｇ）Ｐｒｉｍ
ｅｒを用いて逆転写を行い０．４ｕｇの第１鎖ｃＤＮＡ
を得た。コントロールとして用いたヒトリンパ球のＢｕ
ｒｋｉｔｔｓ′（Ｄａｕｄｉ）のｍＲＮＡ ５．０ｕｇ
からは２．６ｕｇの第１鎖ｃＤＮＡが得られた。初めの
ｍＲＮＡに対する第１鎖ｃＤＮＡ合成量比を％ｃｏｐｙ
で表１に示した。また、第１鎖ｃＤＮＡから第２鎖ｃＤ
ＮＡを合成し、アダプターを結合した後ｃＤＮＡ分画カ
ラムにより５００ｂｐ以上のｃＤＮＡを分画、回収し
た。これを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製し、ライ
ブラリー中の数十クローンのインサート鎖長を調べその
平均を同表に示した。表中、 Ｉｎｉｔｉａｌ；ｍＲＮＡ量 Ｙｉｅｌｄ；第１鎖ｃＤＮＡ量 ％ ｃｏｐｙ ＝第１鎖ｃＤＮＡ量／ｍＲＮＡ量 Ｆｉｎａｌ ｙｉｅｌｄ；ｃＤＮＡ分画カラムにより分
画した５００ｂｐ以上のｃＤＮＡ量 Ｌｅｎｇｔｈ（Ａｖ．）；ＨＩＶ感染者のＣＤ８陽性Ｔ
細胞のｃＤＮＡライブラリー中のｃＤＮＡの平均鎖長
ＲＮＡからのｃＤＮＡ回収状況を示すもので、ＨＩＶ感
染者のＣＤ８陽性Ｔ細胞ｍＲＮＡ ４．０ｕｇを単離
後、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５ｄ（Ａ／Ｃ／Ｇ）Ｐｒｉｍ
ｅｒを用いて逆転写を行い０．４ｕｇの第１鎖ｃＤＮＡ
を得た。コントロールとして用いたヒトリンパ球のＢｕ
ｒｋｉｔｔｓ′（Ｄａｕｄｉ）のｍＲＮＡ ５．０ｕｇ
からは２．６ｕｇの第１鎖ｃＤＮＡが得られた。初めの
ｍＲＮＡに対する第１鎖ｃＤＮＡ合成量比を％ｃｏｐｙ
で表１に示した。また、第１鎖ｃＤＮＡから第２鎖ｃＤ
ＮＡを合成し、アダプターを結合した後ｃＤＮＡ分画カ
ラムにより５００ｂｐ以上のｃＤＮＡを分画、回収し
た。これを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製し、ライ
ブラリー中の数十クローンのインサート鎖長を調べその
平均を同表に示した。表中、 Ｉｎｉｔｉａｌ；ｍＲＮＡ量 Ｙｉｅｌｄ；第１鎖ｃＤＮＡ量 ％ ｃｏｐｙ ＝第１鎖ｃＤＮＡ量／ｍＲＮＡ量 Ｆｉｎａｌ ｙｉｅｌｄ；ｃＤＮＡ分画カラムにより分
画した５００ｂｐ以上のｃＤＮＡ量 Ｌｅｎｇｔｈ（Ａｖ．）；ＨＩＶ感染者のＣＤ８陽性Ｔ
細胞のｃＤＮＡライブラリー中のｃＤＮＡの平均鎖長
【００３０】実施例２．コロニーハイブリダイゼーショ
ンによるスクリーニング １）サブトラクション法による長期無症候ＨＩＶ感染者
ＣＤ８陽性Ｔ細胞の特異的プローブの作製。抗ＨＩＶ活
性を有するＣＤ８陽性Ｔ細胞に特異的に発現するｃＤＮ
Ａを単離する目的でサブトラクション法で得られたｃＤ
ＮＡをプローブとしスクリーニングを行った（図２）。
ンによるスクリーニング １）サブトラクション法による長期無症候ＨＩＶ感染者
ＣＤ８陽性Ｔ細胞の特異的プローブの作製。抗ＨＩＶ活
性を有するＣＤ８陽性Ｔ細胞に特異的に発現するｃＤＮ
Ａを単離する目的でサブトラクション法で得られたｃＤ
ＮＡをプローブとしスクリーニングを行った（図２）。
【００３１】非感染者の血液よりリンパ球を遠心分離法
で分離した。さらに抗ＣＤ８抗体を結合させた磁気ビー
ズにＣＤ８陽性Ｔ細胞のみを吸着させてＣＤ８陽性Ｔ細
胞を単離した。１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６
４０培地にインターロイキン２（ＩＬ−２）とフィトヘ
マグルチニン（ＰＨＡ）を添加し培養後細胞を遠心分離
法で回収した。この非感染者由来ＣＤ８陽性Ｔ細胞を溶
解し、Ｑｕｉｃｋ ｐｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｍｉｃｒｏ
ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ファルマシア）を
用いてｍＲＮＡを単離した。さらにフォトピオチン酢酸
（インビトロジェン）を添加し３００Ｗのレフレクター
ランプの直下で２０分間放置しｍＲＮＡをビオチン標識
した。その後のブタノール抽出とエタノール沈澱によっ
て過剰なビオチンを除去したものについて、再度ビオチ
ン標識を行った。この時のブタノール抽出は、完全にビ
オチンを除去するためにブタノール層が透明になってか
らエタノール沈澱を行った。一方、ＨＩＶ感染者のＣＤ
８陽性Ｔ細胞を同様に分離し培養後ｍＲＮＡを抽出し、
ｏｌｉｇｏ ｄＴプライマー（インビトロジェン）と逆
転写酵素（インビトロジェン）を加えて第１鎖ｃＤＮＡ
を合成した。アルカリ処理によってＲＮＡを消化し、２
本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡを１本鎖ｃＤＮＡに調製した。先の
ビオチン標識した非感染者ＣＤ８陽性Ｔ細胞由来ｍＲＮ
ＡとＨＩＶ感染者ＣＤ８陽性Ｔ細胞由来ｃＤＮＡを混合
し熱変性後ハイブリダイズさせた。ストレプトアビジン
（インビトロジェン）を加えビオチンと結合させたの
ち、フェノール／クロロホルム溶液（１：１混合）（イ
ンビトロジェン）を加えて攪拌後遠心し水層と有機層に
分液して水層のみを取り出した。この操作を数回繰り返
しビオチン標識ｍＲＮＡと結合したｃＤＮＡを除去し
た。ストレプトアビジンがフェノール／クロロホルムで
変性し不溶化し有機層と水層の間にとどまるため水層に
残ったｃＤＮＡはＨＩＶ感染者ＣＤ８陽性Ｔ細胞にのみ
発現しているｃＤＮＡであると考えられた。ＨＩＶ感染
者特異的ｃＤＮＡにｄＡＴＰ（宝酒造）、ｄＧＴＰ（宝
酒造）、ｄＴＴＰ（宝酒造）、Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇ
ｍｅｎｔ（宝酒造）、３２Ｐ−ｄＣＴＰ（アマシャム）
を加え、第２鎖ｃＤＮＡ合成を行い放射標識プローブと
した。
で分離した。さらに抗ＣＤ８抗体を結合させた磁気ビー
ズにＣＤ８陽性Ｔ細胞のみを吸着させてＣＤ８陽性Ｔ細
胞を単離した。１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６
４０培地にインターロイキン２（ＩＬ−２）とフィトヘ
マグルチニン（ＰＨＡ）を添加し培養後細胞を遠心分離
法で回収した。この非感染者由来ＣＤ８陽性Ｔ細胞を溶
解し、Ｑｕｉｃｋ ｐｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｍｉｃｒｏ
ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ファルマシア）を
用いてｍＲＮＡを単離した。さらにフォトピオチン酢酸
（インビトロジェン）を添加し３００Ｗのレフレクター
ランプの直下で２０分間放置しｍＲＮＡをビオチン標識
した。その後のブタノール抽出とエタノール沈澱によっ
て過剰なビオチンを除去したものについて、再度ビオチ
ン標識を行った。この時のブタノール抽出は、完全にビ
オチンを除去するためにブタノール層が透明になってか
らエタノール沈澱を行った。一方、ＨＩＶ感染者のＣＤ
８陽性Ｔ細胞を同様に分離し培養後ｍＲＮＡを抽出し、
ｏｌｉｇｏ ｄＴプライマー（インビトロジェン）と逆
転写酵素（インビトロジェン）を加えて第１鎖ｃＤＮＡ
を合成した。アルカリ処理によってＲＮＡを消化し、２
本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡを１本鎖ｃＤＮＡに調製した。先の
ビオチン標識した非感染者ＣＤ８陽性Ｔ細胞由来ｍＲＮ
ＡとＨＩＶ感染者ＣＤ８陽性Ｔ細胞由来ｃＤＮＡを混合
し熱変性後ハイブリダイズさせた。ストレプトアビジン
（インビトロジェン）を加えビオチンと結合させたの
ち、フェノール／クロロホルム溶液（１：１混合）（イ
ンビトロジェン）を加えて攪拌後遠心し水層と有機層に
分液して水層のみを取り出した。この操作を数回繰り返
しビオチン標識ｍＲＮＡと結合したｃＤＮＡを除去し
た。ストレプトアビジンがフェノール／クロロホルムで
変性し不溶化し有機層と水層の間にとどまるため水層に
残ったｃＤＮＡはＨＩＶ感染者ＣＤ８陽性Ｔ細胞にのみ
発現しているｃＤＮＡであると考えられた。ＨＩＶ感染
者特異的ｃＤＮＡにｄＡＴＰ（宝酒造）、ｄＧＴＰ（宝
酒造）、ｄＴＴＰ（宝酒造）、Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇ
ｍｅｎｔ（宝酒造）、３２Ｐ−ｄＣＴＰ（アマシャム）
を加え、第２鎖ｃＤＮＡ合成を行い放射標識プローブと
した。
【００３２】２）コロニーハイブリダイゼーション ｃＤＮＡライブラリーをＬ−Ｂｒｏｔｈ培地で希釈し
１．５％寒天を含むＬ−Ｂｒｏｔｈ培地１プレート当た
り５００−１０００個のコロニーが生育する程度に接種
して３７度で培養した。培養後レプリカプレートを２枚
作製し３７℃で培養後４度に保存した。１枚のレプリカ
プレートにナイロンメンブラン（アマシャム）をのせて
コロニーを移行させ、変性溶解液（２×ＳＳＣ（０．３
Ｍ 塩化ナトリウム、０．０３Ｍ クエン酸ナトリウム
ｐＨ７．０），５％ ＳＤＳ）で湿らせたろ紙（ワッ
トマン）上にのせ、電子レンジで約１分加熱し菌体ＤＮ
Ａを露出させた。スキムミルクでメンブランをブロッキ
ングし放射標識プローブとハイブリダイズさせた。メン
ブランを各洗浄液（洗浄液 ２×ＳＳＣ，１％ ＳＤ
Ｓ，ｐＨ７．０，洗浄液 １×ＳＳＣ，１％ ＳＤ
Ｓ，ｐＨ７．０，洗浄液 ０．１×ＳＳＣ，１％ Ｓ
ＤＳ ｐＨ７．０）で洗浄後、Ｘ線フィルム上に置きフ
ィルムを感光させた。放射標識プローブとハイブリダイ
ズしたコロニーをもう一枚のレプリカプレートから拾い
１．５％寒天を含むＬ−Ｂｒｏｔｈ培地に接種、３７度
で培養し、同様に再度コロニーハイブリダイゼーション
を行った。かくして、ＨＩＶ感染者のＣＤ８陽性Ｔ細胞
に特異的なプローブを用いて、ＨＩＶ感染者のＣＤ８陽
性Ｔ細胞のｃＤＮＡライブラリーの約２０，０００コロ
ニーのスクリーニング（第１回目）を行った結果、シグ
ナルの強い約３０の陽性クローンとその周辺のコロニー
１０個程を再度スクリーニングし（第２回目）、シグナ
ルの強い陽性クローン２２個を得た。
１．５％寒天を含むＬ−Ｂｒｏｔｈ培地１プレート当た
り５００−１０００個のコロニーが生育する程度に接種
して３７度で培養した。培養後レプリカプレートを２枚
作製し３７℃で培養後４度に保存した。１枚のレプリカ
プレートにナイロンメンブラン（アマシャム）をのせて
コロニーを移行させ、変性溶解液（２×ＳＳＣ（０．３
Ｍ 塩化ナトリウム、０．０３Ｍ クエン酸ナトリウム
ｐＨ７．０），５％ ＳＤＳ）で湿らせたろ紙（ワッ
トマン）上にのせ、電子レンジで約１分加熱し菌体ＤＮ
Ａを露出させた。スキムミルクでメンブランをブロッキ
ングし放射標識プローブとハイブリダイズさせた。メン
ブランを各洗浄液（洗浄液 ２×ＳＳＣ，１％ ＳＤ
Ｓ，ｐＨ７．０，洗浄液 １×ＳＳＣ，１％ ＳＤ
Ｓ，ｐＨ７．０，洗浄液 ０．１×ＳＳＣ，１％ Ｓ
ＤＳ ｐＨ７．０）で洗浄後、Ｘ線フィルム上に置きフ
ィルムを感光させた。放射標識プローブとハイブリダイ
ズしたコロニーをもう一枚のレプリカプレートから拾い
１．５％寒天を含むＬ−Ｂｒｏｔｈ培地に接種、３７度
で培養し、同様に再度コロニーハイブリダイゼーション
を行った。かくして、ＨＩＶ感染者のＣＤ８陽性Ｔ細胞
に特異的なプローブを用いて、ＨＩＶ感染者のＣＤ８陽
性Ｔ細胞のｃＤＮＡライブラリーの約２０，０００コロ
ニーのスクリーニング（第１回目）を行った結果、シグ
ナルの強い約３０の陽性クローンとその周辺のコロニー
１０個程を再度スクリーニングし（第２回目）、シグナ
ルの強い陽性クローン２２個を得た。
【００３３】
【表２】
【００３４】実施例３．陽性クローンの塩基配列の決定
と相同性検索（表４） 放射標識プローブとハイブリダイズしたコロニーをレプ
リカプレートから拾いＬＢ培地で培養した。菌体を遠心
分離で回収し溶菌させてプラスミドを抽出した。Ｅｃｏ
ＲＩで消化しアガロース電気泳動で切り出されたｃＤＮ
Ａのサイズを調べた（図３）。５００ｂｐ以上のインサ
ートｃＤＮＡを含むプラスミドについてはｐＵＣ１１８
クローニング部位上流、下流に位置するシークエンス用
プライマーＭ４（宝酒造）、ＲＶ（宝酒造）とＤｙｅ
ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉ
ｎｇ ＦＳ ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ
（パーキンエルマー）で伸長反応後、ＤＮＡシークエン
サー（アプライドバイオ）で塩基配列を決定した。得ら
れた配列を核酸データベース（ジェンバンク）と照合し
た。表３はスクリーニングで得られた陽性クローンの相
同性検索とその特異性に関する。陽性クローン２２個の
プラスミドを単離、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化後、アガ
ロースゲル電気泳動を行い鎖長５００〜３，０００ｂｐ
のインサートを認めた。塩基配列決定をＤｙｅ Ｔｅｒ
ｍｉｎａｔｏｒ法でＤＮＡシーケンサーを用いて行い、
得られた配列を核酸データベース（ジェンバンク）と照
合していくつかの新規な配列と、ヒトＩＬ９受容体の配
列を見出した。
と相同性検索（表４） 放射標識プローブとハイブリダイズしたコロニーをレプ
リカプレートから拾いＬＢ培地で培養した。菌体を遠心
分離で回収し溶菌させてプラスミドを抽出した。Ｅｃｏ
ＲＩで消化しアガロース電気泳動で切り出されたｃＤＮ
Ａのサイズを調べた（図３）。５００ｂｐ以上のインサ
ートｃＤＮＡを含むプラスミドについてはｐＵＣ１１８
クローニング部位上流、下流に位置するシークエンス用
プライマーＭ４（宝酒造）、ＲＶ（宝酒造）とＤｙｅ
ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉ
ｎｇ ＦＳ ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ
（パーキンエルマー）で伸長反応後、ＤＮＡシークエン
サー（アプライドバイオ）で塩基配列を決定した。得ら
れた配列を核酸データベース（ジェンバンク）と照合し
た。表３はスクリーニングで得られた陽性クローンの相
同性検索とその特異性に関する。陽性クローン２２個の
プラスミドを単離、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化後、アガ
ロースゲル電気泳動を行い鎖長５００〜３，０００ｂｐ
のインサートを認めた。塩基配列決定をＤｙｅ Ｔｅｒ
ｍｉｎａｔｏｒ法でＤＮＡシーケンサーを用いて行い、
得られた配列を核酸データベース（ジェンバンク）と照
合していくつかの新規な配列と、ヒトＩＬ９受容体の配
列を見出した。
【００３５】
【表３】
【００３６】ＨＩＶ感染者ＣＤ８陽性Ｔ細胞、健常者Ｃ
Ｄ８陽性Ｔ細胞及びＣＤ４陽性Ｔ細胞由来ｍＲＮＡを用
いてＲＴ−ＰＣＲ法（第１鎖ｃＤＮＡ合成後、これをテ
ンプレートとしてＰＣＲを行う方法）を行ったところ、
ＩＬ−９Ｒと相同性を持つクローンに対するプライマー
を用いたときのみ、ＨＩＶ感染者ＣＤ８陽性Ｔ細胞に特
異的なバンドが見られた。プライマーは配列データを基
に設計したものを用いた。
Ｄ８陽性Ｔ細胞及びＣＤ４陽性Ｔ細胞由来ｍＲＮＡを用
いてＲＴ−ＰＣＲ法（第１鎖ｃＤＮＡ合成後、これをテ
ンプレートとしてＰＣＲを行う方法）を行ったところ、
ＩＬ−９Ｒと相同性を持つクローンに対するプライマー
を用いたときのみ、ＨＩＶ感染者ＣＤ８陽性Ｔ細胞に特
異的なバンドが見られた。プライマーは配列データを基
に設計したものを用いた。
【００３７】実施例４．ｍＲＮＡ特異的発現の確認（Ｒ
Ｔ−ＰＣＲ） ＨＩＶ感染者のＣＤ８陽性Ｔ細胞、健常者ＣＤ８陽性Ｔ
細胞及びＣＤ４陽性Ｔ細胞について、Ｑｕｉｃｋ ｐｒ
ｅｐ ｍＲＮＡ Ｍｉｃｒｏ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ Ｋｉｔ（ファルマシア）を用いてｍＲＮＡを単離
後、Ｒｅａｄｙ・Ｔｏ・Ｇｏ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ
ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ファルマシア）を用いて
ｍＲＮＡの逆転写を行い第１鎖ｃＤＮＡを合成した。こ
れを予め設計・作製した決定された塩基配列の上流と下
流のプライマー（表４）を用いてＰＣＲを行い、２．５
％アガロースゲル電気泳動によってｍＲＮＡの発現を確
認した（図４）。
Ｔ−ＰＣＲ） ＨＩＶ感染者のＣＤ８陽性Ｔ細胞、健常者ＣＤ８陽性Ｔ
細胞及びＣＤ４陽性Ｔ細胞について、Ｑｕｉｃｋ ｐｒ
ｅｐ ｍＲＮＡ Ｍｉｃｒｏ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ Ｋｉｔ（ファルマシア）を用いてｍＲＮＡを単離
後、Ｒｅａｄｙ・Ｔｏ・Ｇｏ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ
ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ファルマシア）を用いて
ｍＲＮＡの逆転写を行い第１鎖ｃＤＮＡを合成した。こ
れを予め設計・作製した決定された塩基配列の上流と下
流のプライマー（表４）を用いてＰＣＲを行い、２．５
％アガロースゲル電気泳動によってｍＲＮＡの発現を確
認した（図４）。
【００３８】
【表４】
【００３９】実施例５．感染能を有するＨＩＶのＤＮＡ
をトランスフェクトしたＣＤ４陽性Ｔ細胞を用いた抗Ｈ
ＩＶ分析系の確立と抗ＨＩＶ活性の測定 ＣＤ８陽性Ｔ細胞の抗ＨＩＶ活性の測定は、ＨＩＶ−１
の感染者由来のＣＤ４陽性Ｔ細胞を標的細胞としている
が、病状の進行しているＨＩＶ−１の感染者からＣＤ４
陽性Ｔ細胞を採取することは困難であり、ＨＩＶのＤＮ
ＡをトランスフェクトしたＣＤ４陽性Ｔ細胞の作製法を
確立した。具体的にはＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ法を用
いて１×１０6 個の細胞に１ｕｇのｐＮＬ４３２（ｉｎ
ｆｅｃｔｉｏｕｓ ＨＩＶ−１ ＤＮＡ ｃｌｏｎｅ）
またはｐＧＨ１２３（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ＨＩＶ−
２ ＤＮＡ ｃｌｏｎｅ）をトランスフェクトし、ＲＰ
ＭＩ１６４０ １０％ＦＣＳの培地で３７℃、５％のＣ
Ｏ2 存在下で５時間培養する。５時間の後に、感染者の
ＣＤ８陽性Ｔ細胞の培養上清をトランスフェクトした細
胞液に加える培養上清の添加量は全量の１／４になるよ
うに加える。さらに、培地に馬ポリクローナル抗ＩＦＮ
−α抗体と組換え体ＩＬ−２をそれぞれ最終濃度５０ｕ
／ｍｌ、０．２５ｕ／ｍｌ加えて、６日目に培養上清を
回収してＨＩＶのｐ１７抗原を測定する。表５はＴａｌ
ｌ−１−ＣＤ４細胞におけるＨＩＶ−１複製に対するＨ
ＩＶ感染者由来のＣＤ８陽性Ｔ細胞の培養上清の抗ＨＩ
Ｖ活性とＩＬ−９Ｒの発現の関係を示すものである。
をトランスフェクトしたＣＤ４陽性Ｔ細胞を用いた抗Ｈ
ＩＶ分析系の確立と抗ＨＩＶ活性の測定 ＣＤ８陽性Ｔ細胞の抗ＨＩＶ活性の測定は、ＨＩＶ−１
の感染者由来のＣＤ４陽性Ｔ細胞を標的細胞としている
が、病状の進行しているＨＩＶ−１の感染者からＣＤ４
陽性Ｔ細胞を採取することは困難であり、ＨＩＶのＤＮ
ＡをトランスフェクトしたＣＤ４陽性Ｔ細胞の作製法を
確立した。具体的にはＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ法を用
いて１×１０6 個の細胞に１ｕｇのｐＮＬ４３２（ｉｎ
ｆｅｃｔｉｏｕｓ ＨＩＶ−１ ＤＮＡ ｃｌｏｎｅ）
またはｐＧＨ１２３（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ＨＩＶ−
２ ＤＮＡ ｃｌｏｎｅ）をトランスフェクトし、ＲＰ
ＭＩ１６４０ １０％ＦＣＳの培地で３７℃、５％のＣ
Ｏ2 存在下で５時間培養する。５時間の後に、感染者の
ＣＤ８陽性Ｔ細胞の培養上清をトランスフェクトした細
胞液に加える培養上清の添加量は全量の１／４になるよ
うに加える。さらに、培地に馬ポリクローナル抗ＩＦＮ
−α抗体と組換え体ＩＬ−２をそれぞれ最終濃度５０ｕ
／ｍｌ、０．２５ｕ／ｍｌ加えて、６日目に培養上清を
回収してＨＩＶのｐ１７抗原を測定する。表５はＴａｌ
ｌ−１−ＣＤ４細胞におけるＨＩＶ−１複製に対するＨ
ＩＶ感染者由来のＣＤ８陽性Ｔ細胞の培養上清の抗ＨＩ
Ｖ活性とＩＬ−９Ｒの発現の関係を示すものである。
【００４０】
【表５】 ａ：試料 ＣＤ８陽性Ｔ細胞 ＨＩＶ感染者（ｎ＝１
０）及び非感染者（ｎ＝３） ｂ：臨床段階 ｃ：培養６日目のＴａｌｌ−ＣＤ４細胞培養液のＨＩＶ
抗原（Ｐ１７抗原 ｐｇ／ｍｌ） ｄ：抑制のパーセンテージはネガティブコントロールと
ポジティブコントロールから計算した。 ｅ：ＩＬ−９Ｒ発現はＲＴ−ＰＣＲａｓｓａｙで検出し
た。発現の相対強度はハウスキーピング遺伝子であるＧ
３ＰＤＨの発現と比較した。
０）及び非感染者（ｎ＝３） ｂ：臨床段階 ｃ：培養６日目のＴａｌｌ−ＣＤ４細胞培養液のＨＩＶ
抗原（Ｐ１７抗原 ｐｇ／ｍｌ） ｄ：抑制のパーセンテージはネガティブコントロールと
ポジティブコントロールから計算した。 ｅ：ＩＬ−９Ｒ発現はＲＴ−ＰＣＲａｓｓａｙで検出し
た。発現の相対強度はハウスキーピング遺伝子であるＧ
３ＰＤＨの発現と比較した。
【００４１】
【発明の効果】本発明によれば、たとえばＣＤ８陽性Ｔ
細胞の培養上清中に発現するＩＬ−９Ｒの量を測定する
ことによりＨＩＶの感染を診断することができる。
細胞の培養上清中に発現するＩＬ−９Ｒの量を測定する
ことによりＨＩＶの感染を診断することができる。
【図１】実施例において、ＨＩＶ感染者のＣＤ８陽性Ｔ
細胞のｃＤＮＡライブラリーを作製した工程図である。
ＨＩＶ感染者のＣＤ８陽性Ｔ細胞由来ｍＲＮＡを単離
後、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５ｄ（Ａ／Ｃ／Ｇ）Ｐｒｉｍ
ｅｒを用いて逆転写を行い第１鎖ＤＮＡを得た。続いて
ＲＮＡ分解酵素Ｈ（クロンテック）と大腸菌由来ＤＮＡ
ポリメラーゼＩ（クロンテック）と大腸菌由来ＤＮＡリ
ガーゼ（クロンテック）で第２鎖ｃＤＮＡを合成をした
後、ＤＮＡポリメラーゼ（クロンテック）で末端を平滑
化した。両端にＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ、ＳａＩＩ認識部
位を含むアダプターを結合させリン酸化し、ｃＤＮＡ分
画カラムによって５００ｂｐ以上のｃＤＮＡを回収した
後ＥｃｏＲＩ消化し、ｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩ切断部
位に組み込んだ。これを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α
をＨａｎａｈａｎ法で形質転換した。
細胞のｃＤＮＡライブラリーを作製した工程図である。
ＨＩＶ感染者のＣＤ８陽性Ｔ細胞由来ｍＲＮＡを単離
後、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５ｄ（Ａ／Ｃ／Ｇ）Ｐｒｉｍ
ｅｒを用いて逆転写を行い第１鎖ＤＮＡを得た。続いて
ＲＮＡ分解酵素Ｈ（クロンテック）と大腸菌由来ＤＮＡ
ポリメラーゼＩ（クロンテック）と大腸菌由来ＤＮＡリ
ガーゼ（クロンテック）で第２鎖ｃＤＮＡを合成をした
後、ＤＮＡポリメラーゼ（クロンテック）で末端を平滑
化した。両端にＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ、ＳａＩＩ認識部
位を含むアダプターを結合させリン酸化し、ｃＤＮＡ分
画カラムによって５００ｂｐ以上のｃＤＮＡを回収した
後ＥｃｏＲＩ消化し、ｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩ切断部
位に組み込んだ。これを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α
をＨａｎａｈａｎ法で形質転換した。
【図２】実施例におけるサブトラクション法による長期
無症候ＨＩＶ感染者ＣＤ８陽性Ｔ細胞特異的ｃＤＮＡ作
製の工程図である。非感染者由来ＣＤ８陽性Ｔ細胞由来
ｍＲＮＡ（Ｈ．Ｄ．Ｔ ｃｅｌｌ ｍＲＮＡ）を単離し
ビオチン標識（Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ）した。一
方、ＨＩＶ感染者ＣＤ８陽性Ｔ細胞由来ｍＲＮＡ（Ｐ
ｔ．Ｔ ｃｅｌｌ ｍＲＮＡ）を単離してＯｌｉｇｏ
（ｄＴ）ｎ Ｐｒｉｍｅｒを用いて逆転写を行い得られ
た第１鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ−ＲＮＡ）をアルカリ処理
（Ａｌｋａｌｉ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）によって１本鎖
ｃＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）にした。先のビオチン標識した
健常人由来ＣＤ８陽性Ｔ細胞由来ｍＲＮＡとＨＩＶ感染
者ＣＤ８陽性Ｔ細胞由来ｃＤＮＡを混合しハイブリダイ
ズさせた（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）。ストレプト
アビジン（ｓｔｒｅｐｔａｂｙｄｉｎｅ）を加えビオチ
ンと結合させたのち、フェノール／クロロホルム溶液
（１：１混合）を加えて攪拌後遠心し水層と有機層に分
液して（ｐｈｅｎｏｌ−ｃｌｏｒｏｆｏｒｍ ｅｘｔｒ
ａｃｔｉｏｎ）ＨＩＶ感染者ＣＤ８陽性Ｔ細胞特異的ｃ
ＤＮＡ（ｓｕｂｔｒａｃｔｅ ｄＤＮＡ）を含む水層の
みを取り出した。
無症候ＨＩＶ感染者ＣＤ８陽性Ｔ細胞特異的ｃＤＮＡ作
製の工程図である。非感染者由来ＣＤ８陽性Ｔ細胞由来
ｍＲＮＡ（Ｈ．Ｄ．Ｔ ｃｅｌｌ ｍＲＮＡ）を単離し
ビオチン標識（Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ）した。一
方、ＨＩＶ感染者ＣＤ８陽性Ｔ細胞由来ｍＲＮＡ（Ｐ
ｔ．Ｔ ｃｅｌｌ ｍＲＮＡ）を単離してＯｌｉｇｏ
（ｄＴ）ｎ Ｐｒｉｍｅｒを用いて逆転写を行い得られ
た第１鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ−ＲＮＡ）をアルカリ処理
（Ａｌｋａｌｉ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）によって１本鎖
ｃＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）にした。先のビオチン標識した
健常人由来ＣＤ８陽性Ｔ細胞由来ｍＲＮＡとＨＩＶ感染
者ＣＤ８陽性Ｔ細胞由来ｃＤＮＡを混合しハイブリダイ
ズさせた（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）。ストレプト
アビジン（ｓｔｒｅｐｔａｂｙｄｉｎｅ）を加えビオチ
ンと結合させたのち、フェノール／クロロホルム溶液
（１：１混合）を加えて攪拌後遠心し水層と有機層に分
液して（ｐｈｅｎｏｌ−ｃｌｏｒｏｆｏｒｍ ｅｘｔｒ
ａｃｔｉｏｎ）ＨＩＶ感染者ＣＤ８陽性Ｔ細胞特異的ｃ
ＤＮＡ（ｓｕｂｔｒａｃｔｅ ｄＤＮＡ）を含む水層の
みを取り出した。
【図３】実施例におけるｃＤＮＡ鎖長の選別のためのｃ
ＤＮＡ分画カラムクロマトグラフィーを示す。ＨＩＶ感
染者ＣＤ８陽性Ｔ細胞由来の第１鎖ｃＤＮＡから第２鎖
ｃＤＮＡを合成後、アダプターを結合したｃＤＮＡをｃ
ＤＮＡ分画カラムに添加し、ＳＴＥ緩衝液（０．５ｍＭ
ＥＤＴＡ，３０ｍＭ 塩化ナトリウム，１０ｍＭトリス
塩酸緩衝液ｐＨ７．８）で展開した。コントロールのク
ロマトグラフィーの結果をもとに、５００ｂｐ以上のｃ
ＤＮＡを含む分画を回収した。
ＤＮＡ分画カラムクロマトグラフィーを示す。ＨＩＶ感
染者ＣＤ８陽性Ｔ細胞由来の第１鎖ｃＤＮＡから第２鎖
ｃＤＮＡを合成後、アダプターを結合したｃＤＮＡをｃ
ＤＮＡ分画カラムに添加し、ＳＴＥ緩衝液（０．５ｍＭ
ＥＤＴＡ，３０ｍＭ 塩化ナトリウム，１０ｍＭトリス
塩酸緩衝液ｐＨ７．８）で展開した。コントロールのク
ロマトグラフィーの結果をもとに、５００ｂｐ以上のｃ
ＤＮＡを含む分画を回収した。
【図４】実施例におけるＩＬ−９Ｒに対するプライマー
セットを用いたＲＴ−ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気
泳動の写真であるＨＩＶ感染者ＣＤ８陽性Ｔ細胞、非感
染者ＣＤ８陽性Ｔ細胞及びＣＤ４陽性Ｔ細胞由来ｍＲＮ
ＡとＩＬ−９Ｒに対するプライマーセットを用いてＲＴ
−ＰＣＲ法（第１鎖ｃＤＮＡ合成後、これをテンプレー
トとしてＰＣＲを行う方法）を行い、その産物の２．５
％アガロースゲル電気泳動を行った（泳動緩衝液 ＴＡ
Ｅ緩衝液（４０ｍＭ トリス酢酸緩衝液，１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ，ｐＨ８．３）（Ａ）。ＲＴ−ＰＣＲが正常に行わ
れていることを確認するため、ポジティブコントロール
としてハウスキーピングジーンであるＧ３ＰＤＨ遺伝子
に対するプライマーセットを別に用いた（Ｂ）。 アガロースゲル，ＩＬ−９Ｒ；インターロイキン９受容
体 Ｇ３ＰＤＨ；ハウスキーピングジーン（全細胞に一定に
発現している遺伝子） Ｈ．Ｄ．ＣＤ４ Ｔ ｃｅｌｌ；非感染者ＣＤ４陽性Ｔ
細胞 Ｈ．Ｄ．ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ；非感染者ＣＤ８陽性Ｔ
細胞 Ｐｔ．ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ；ＨＩＶ感染者ＣＤ８陽性
Ｔ細胞 Ｌａｎｅ Ｍ；φＸ１７４／Ｈｉｎｃｌｌ Ｍａｋｅｒ Ｌａｎｅ １；Ｈ．Ｄ．ＣＤ４ Ｔ ｃｅｌｌ Ｌａｎｅ ２；Ｈ．Ｄ．ＣＤ４ Ｔ ｃｅｌｌ Ｌａｎｅ ３；Ｐｔ．ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ Ｌａｎｅ ４；Ｐｔ．ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ ａ Ｌａｎｅ ５；Ｐｔ．ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ ｂ Ｌａｎｅ ６；Ｐｔ．ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ ｃ Ｌａｎｅ ７；Ｐｔ．ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ ｄ Ｌａｎｅ ８；Ｐｔ．ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ ｅ
セットを用いたＲＴ−ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気
泳動の写真であるＨＩＶ感染者ＣＤ８陽性Ｔ細胞、非感
染者ＣＤ８陽性Ｔ細胞及びＣＤ４陽性Ｔ細胞由来ｍＲＮ
ＡとＩＬ−９Ｒに対するプライマーセットを用いてＲＴ
−ＰＣＲ法（第１鎖ｃＤＮＡ合成後、これをテンプレー
トとしてＰＣＲを行う方法）を行い、その産物の２．５
％アガロースゲル電気泳動を行った（泳動緩衝液 ＴＡ
Ｅ緩衝液（４０ｍＭ トリス酢酸緩衝液，１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ，ｐＨ８．３）（Ａ）。ＲＴ−ＰＣＲが正常に行わ
れていることを確認するため、ポジティブコントロール
としてハウスキーピングジーンであるＧ３ＰＤＨ遺伝子
に対するプライマーセットを別に用いた（Ｂ）。 アガロースゲル，ＩＬ−９Ｒ；インターロイキン９受容
体 Ｇ３ＰＤＨ；ハウスキーピングジーン（全細胞に一定に
発現している遺伝子） Ｈ．Ｄ．ＣＤ４ Ｔ ｃｅｌｌ；非感染者ＣＤ４陽性Ｔ
細胞 Ｈ．Ｄ．ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ；非感染者ＣＤ８陽性Ｔ
細胞 Ｐｔ．ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ；ＨＩＶ感染者ＣＤ８陽性
Ｔ細胞 Ｌａｎｅ Ｍ；φＸ１７４／Ｈｉｎｃｌｌ Ｍａｋｅｒ Ｌａｎｅ １；Ｈ．Ｄ．ＣＤ４ Ｔ ｃｅｌｌ Ｌａｎｅ ２；Ｈ．Ｄ．ＣＤ４ Ｔ ｃｅｌｌ Ｌａｎｅ ３；Ｐｔ．ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ Ｌａｎｅ ４；Ｐｔ．ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ ａ Ｌａｎｅ ５；Ｐｔ．ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ ｂ Ｌａｎｅ ６；Ｐｔ．ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ ｃ Ｌａｎｅ ７；Ｐｔ．ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ ｄ Ｌａｎｅ ８；Ｐｔ．ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ ｅ
Claims (2)
- 【請求項１】 Ｔ細胞リンパ球に特異的に発現するＴ細
胞成長因子受容体（ＩＬ−９Ｒ）を指標とすることを特
徴とするＨＩＶ感染の診断方法。 - 【請求項２】 Ｔ細胞リンパ球がＣＤ８陽性Ｔ細胞又は
ＣＤ４陽性Ｔ細胞である請求項１に記載の方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9687098A JPH11271304A (ja) | 1998-03-24 | 1998-03-24 | Ｈｉｖ感染の診断方法 |
| DE69908688T DE69908688T2 (de) | 1998-03-24 | 1999-03-23 | Verfahren zur Diagnose von HIV-Infektionen |
| EP99302242A EP0945727B1 (en) | 1998-03-24 | 1999-03-23 | Method for diagnosing HIV infection |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9687098A JPH11271304A (ja) | 1998-03-24 | 1998-03-24 | Ｈｉｖ感染の診断方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11271304A true JPH11271304A (ja) | 1999-10-08 |
Family
ID=14176479
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9687098A Pending JPH11271304A (ja) | 1998-03-24 | 1998-03-24 | Ｈｉｖ感染の診断方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0945727B1 (ja) |
| JP (1) | JPH11271304A (ja) |
| DE (1) | DE69908688T2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2198203B1 (es) * | 2002-02-25 | 2005-04-01 | Universidad De Cordoba | Nuevos metodos analiticos basados en la expresion de determinados receptores de celulas nk en celulas t cd8. |
| DE602004030369D1 (de) | 2003-10-24 | 2011-01-13 | Immunaid Pty Ltd | Therapieverfahren |
| CA2763373C (en) | 2009-05-27 | 2018-01-09 | Immunaid Pty Ltd | Methods and systems for determining preferred times for administering therapy to treat diseases |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR900702370A (ko) * | 1988-10-06 | 1990-12-06 | 제임스 디. 그랜트 | 가용성 t세포 표면분자를 사용하는 치료 및 진단방법 |
-
1998
- 1998-03-24 JP JP9687098A patent/JPH11271304A/ja active Pending
-
1999
- 1999-03-23 EP EP99302242A patent/EP0945727B1/en not_active Expired - Lifetime
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| DE69908688D1 (de) | 2003-07-17 |
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