JPS62500282A - リンパ節障害関連ウイルス（ｌａｖ）のゲノムｒｎａとハイブリダイズしうるクロ−ン化ｄｎａ配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 リンパ節障害関連ウィルス（［、ＡＶ）のｒツムＲＮＡとハイブリダイズしつる クローン化ＤＮＡ配列本発明はリンパ節障害関連ウィルス（ＬＡＶ）のデノムＲ ＮＡおよびＤＮＡとハイブリダイズしつるクローン化ＤＮＡ配列、その製造方法 ならびにその用途に係る。さらに特定的には、ＬＡＶウィルスまたは関連ウィル スまたはＤＮＡプロウィルスのいずれかを含有しているあらゆる媒質サンプル、 特に生物学的試料中のこれらウィルスの検出に用いることができるＤＮＡ配列を 含む安定なプローブに係る。

リンパ節障害関連ウィルス（ＬＡＹ）は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の 前徴または良性形態であることが多いリンパ節障害症候群に患った同性愛の患者 のリンパ節から初めて単（２〜５参照）。入手できるデータは全て、このウィル スがＡＩＤＳの病因であることと一致しているて１１参照）。

このウィルスは活性化１９７８球で増殖し、Ｔ細胞サブセラ）ＯＫＴ４に対して 向性をもっておシ（２〜６参照）、このサブセット中で細胞変性効果を誘発する 。しかしこのウィルスは、ある種のエプスタイン−バール（ｇｐｓｔｅｉｎ−Ｂ ａｒｒ）　ウィルスでトランス７オームしたＢ細胞株（ＣｏＩ２１ｉｎｅ）　（ ７参照）中や樹立したＴリンパ芽球細胞株、０ｇＭ中で増殖できるように順応さ せられている。

さらに最近になって、ＬＡＶ様ウィルスがＡＩＤＳ患者とプレーＡＩＤＳ患者か ら別個に単離された。Ｉ（ＴＬＶ−１（ヒトＴ細胞白血病／リンパ腫ウィルス夏 型。１２〜１５参照）およびＡＲｖ（ＡＩＤＳ関連レトロウィルス）とよばれる これらのウィルスはＬＡＹに類似した特性を多く有しており、ＬＡＶ原型（ｐｒ ｏｔｏｔｙｐｅ）の別々の単離体である。言葉の便宜上以後これらを全部「ＬＡ ｖ」と相称する。

現在のところ利用できる検出法はウィルスタンパク質の識別を基にしている。こ のような方法は、１９８３年９月１５日付の英国出願第８３　２４８００号の優 先権を主張して１９８４年９月１４日に出願された名称を「リンパ節障害と後天 性免疫不全症候群を診断するための抗原、手段および方法」とする欧州出願に開 示されている。実際抗−ｐ２５抗体がＡＩＤＳ患者とプレーＡＩＤＳ患者の血清 中に高率で発見され、これよりは低いがかなシの程度でＡＩＤＳの罹患の危険度 が高い群でも見つかっている（８〜１０参照）。

本発明は、ＬＡＶやその関連ウィルス（以後さらに概括的に「ＬＡＶウィルス（ 群）」と指体する）の検出に同様ｌこ有用であるばかりでなく、特にこれらウィ ルスのり４ツムＤＮＡの特定の一部であってその発現産物が免疫的手法では必ず しも検出できないようなりＮＡを検出する際にさらに多くの有用性を発揮する肋 規な手段を提供することを目的としている。

以下図面を参照するが、図面中で、・・−第１図はプラスミド組換え体に含有さ れる好ましいＬＡＹインサート（挿入物）の制限地図を示し、−第２図は完全な ＬＡＶ断片の制限地図を示し、−第３図は完全なＬＡＶ）ｆツム（クローンλＪ １９）の制限地図であり、 一部４〜１１図は、第４図に制限地図を示したＬＡＶ）ｆツムの全配列を示す。

本発明のＤＮＡはＬＡＶのデノム■ζＮＡとハイブリダイズしつるＤＮＡ断片を 含有するＤＮＡから成っている。特定的には、このＤＮＡは前記ｃＤＮＡまたは ｃ、　Ｄ　Ｎ　Ａ断片またはこのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａもしくはｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片を 含有する組換えＤＮＡから成る。

好ましいクローン化ｃＤＮＡ断片は各々次の制限部位をそれぞれ（３′末端から ５′末端へ）次の順序で含有する。

１）　ＨｉｎｄＪＩｌ、　５ａｃ４．　ＢｇｌＩｌ　（ＬＡＶ７５）２）　Ｈｉ ｎｄＩＩＩ、　５ａｃＩ、　Ｂｇｌｌｌ、ＢｇｌＩＩ、　ＫｐｎＩ　（Ｉ、ＡＶ ８２）３）　ＨｉｎｄＩｒＩ、　５ａｃＩ、　Ｂｇｌｒｌ、Ｂｇｌｌｌ、　Ｋｐ ｎｒ、ＸｈｏＴ。

ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｂｇｌｌｌ　（ＬＡＶＩ３）　。

ココで、Ｔ、ＡＶ７５　、’ＬＡＶ８２およびＬＡＶ１３という表示はそれぞれ を最初ｌこクローン化した組換えプラスミド（それぞれｐＬＡＶ７５　、　ｐＬ ＡＶ８２およびｐＬＡＶ１３と表示）の名称に対応している。言い換えると、Ｌ ＡＶ７５　、ＬＡＶ８２およびＬＡＶＩ３はそれぞれ上記の組換えプラスミド中 にインサートとして存在するということである。便宜上、ｃＤＮＡ断片が単離形 態にあってもプラスミド形態にあっても、本明細書を通じてこの断片を表示する のにこのＬＡＶ７５．　ＬＡｖ、８２およびＬＡＶＩ３という表示を使用する。

したがって、上で最後に述べた組換え体の他のＤＮＡ部分はそれぞれｐＬＡＶ７ ５、ｐＴ、ＡＶ８２およびｐＬＡＶ！３の対応する部分と同一かまたは異なる。

好ましいｃ　ＤＮＡも（Ｔ、ＡＶ７５　、　Ｉ、ＡＶ８２およびＬＡＶ１３と同 様に）、特にＴ、ＡＶのレトロウィルス構造が今日までに知られたレトロウィル スのデノム構造と概ね一致するものと仮定すれば、レトロウィルスのＤＮＡのコ ード領域の３′末端はもちろんＩ、ＴＲ（長い末端反復配列、’Ｌ、ｏｎｇ　Ｔ ｅｒｍｉｎａｌＲｅｐｅａｔ）　のＲ領域とＵ３領域に対応する領域を含有して いる。

大きさか約２．５ＫｂｐのＩ、ＡＶ１３は特に有利であることか判明した。この ものはＬＡＶ−？ＬＡＶＩ５１３連ウィルスに対して特異性が高く、またＬＡＶ ７５−？ＬＡＶ８２よ）も多くのＬＡＶＩ、’トロウィルスゲツムを認識する。

特に、ＬＡＶＩ３によってＬＴＲ内部のレトロウィルスゲツムのＲＵ５接合部の 同定が可能きなり、その後ＬＡＶｒツムのサイズの決定が可能になった。

ｔ、ＡＶデノムサイズは平均すると約９．１〜約９．２ｋｂである。

ＬＡＶＩ３は酵素　ＥｃｏＲＩ　、　ＮｒｕＩ　、　Ｐｖｕｌ　、　５ａｉｌ　 、　ＳｍａＩ。

５ｐｈＩ　、　５ｔｕＩおよびＸｂａ　Ｉ　に対する制限部位をもたない。

さらにＬＡＶＩ　３は、レトロウィルスゲツム内でエンベロープタンパク質をコ ーｖしている配列に相当するＤＮＡ配列部分だけは少なくとも含有しているよう である。

また本発明はＬＡＹレトロウィルスｒツム全体の一部分に相当すると思われるｃ 　ＤＮＡ中に含有される任意の断片にも係る。

このＬＡＶレトロウイルスデノム全体はその特徴としてθ′末端から３′末端に 向かって）後述の順序で一連の制限部位を含有している。

好ましい全ｔ、Ａｖｒツムの連続する部位の座標（制限地図）も後に、Ｒ領域に 位置するＨｉｎｄ　１部位〔これを座標１に選択した）に対する座標として示す 。この座標は＋２００　ｂｐ以内で評価されている。あるものは他のものよりも 充分に確立されている。

Ｈｌｎｄ　ＩＩＩ　０ ８ａｃ　Ｉ　５０ ａｃｍ　Ｔ（Ｉ　４６０ Ｈｉｎｄ　丁ＩＩ　５２０ Ｈａｍ　ＨＩ　６００ Ｐｓｔ　Ｉ　８（１０ Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　１１０１ ００Ｂ　ＩＩ　１５００ Ｋｐｎ　Ｉ　３５００ Ｋｐｎ　Ｉ　３９００ Ｅｃｏ　［４１００ Ｅｃｏ　ＲＩ　５３００ Ｓａｌ　Ｉ　５５００ Ｋｐｎ　Ｉ　６１０１ ００Ｂ　ＩＩ　６５００ Ｂｇｌ　ＩＩ　７　６００ Ｈｉｎｃｌ　ＩＩＩ　７　８５０ Ｒａｍ　ＨＴ　８　１５０ Ｘｈｏ　Ｉ　８　６００ Ｋｐｎ　Ｉ　８　７００ Ｂｇｌ　ＩＩ　８　７５０ Ｂｇｌ　ＩＩ　９　１５０ Ｓａｃ　Ｉ　９　２００ ■（土ｎｄ　ＩＩＩ　９　２５０ 上記した本発明のＤＮＡはほぼ５５５０の座標の所に・Ｈｌｎｄｌを余分に含ん でいることもある。

さらに詳しくいう七本発明は概略の大きさが０，１ｋｂ（１０ｋｂ）で第３図に 示した一連の制限部位を含むＤＮＡＩこ係る。

より一般的にい７部本発明は、さらに詳、！）ｌにいった場合後者（上記のＤＮ Ａ）のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）に係シ、こり、ら変異体は同 じ一連の制限部位を後記の（５′　末端から３′末端へ向かう）順序で有してい てもよいが、制限部位のあるものが意図（自発）的かまたは意図的でなく誘発さ れた突然変異に起因して欠失していてもまたは付加されていてもよい。

さらに本発明は上述の制限地図でそれぞれ以下のように逍びるＤＮＡ断片にほぼ 対応する別の好ましいＤＮＡ断片にも係る。

−ＫｐｎＩ　（６１００）あたりからＢｇｌＩＩ（９１５０）あたシまで。この 断片は少なくとも１部がエンベロープのタンパク質をコードしている遺伝子に対 応していると考えられる。特に約１．１００００ダルトン（Ｄａｌｔｏｎｓ）の タンパク質ｐ１１０はこの領域にコードされている。

−ＫｐｎＩ　（３５００）あたりからＢｇｌｔｌ（６５００）あたυまで。この 断片は少なくとも１部がｐｏｌ遺伝子（ウィルスポリメラーゼをコーｒしている 。）に対応していると考えられる。

−Ｐｓｔ（８００）あたシからＫｐｎ　Ｉ　（３５００）あたりまで。

この断片は少なくとも１部がｇａｇ遺伝子　〔タンパク質ｐ２５．ｐ１８および ｐｌａを含めたコア抗原をコードしている）に対応していると考えられる。

また本発明は、後に示されるようにＴ、ＡＶのｒツムＲＮＡとハイブリダイズし つる他のＤＮＡ断片ならびにＬＡＶウィルス群の全ｒツムに相当する別のｃＤＮ Ａ変異体とハイブリダイズしつる他のＤＮＡ断片にも係シ、さらにこれらＤＮＡ −？ｃＤＮＡ断片を含有するＤＮＡ組換え体にも係る。

さらに特定的には本発明は、上記の断片に対応しており、はぼ同じ部位を互いに ほとんど同じ距離だけ離して有するあらゆる断片に係り、これら断片は全て共通 してＬＡＶレトロウィルスｒツムとハイブリダイズしつるという能力をもってい る。もちろん、同様にＬＡＶレトロウィルスｒツムとハイブリダイズするという 能力を実質的に変えない欠失や突然変異を有する断片は上でより特定的に述べた ＤＮＡ断片の自明な均等物を形成するものと理解されたい。

本発明の別の付加的な特徴は制限地図とヌクレオチド配列を含めて本発明の好ま しいＤＮＡの付加的な特徴に関する開示を通して明らかとなろう。以下本発明の 好ましいＤＮＡの製造条件とその特性を非限定的に例証する。

１、ｃＤＮＡライブラリーの構築 １．１　ウィルス精製 不死化した永久系ＬＡＶ産生Ｂ　−ＩＪンパ球株（ｌｉｎｅ　）Ｆ　ＲＢ（１９ ８４年５月９日付でパリ・パスツール研究所（ＩＮＳＴＩＴＩＪＴＰＡＳＴＥＵ Ｒ）のＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓｄ ８Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ″　に番号１−３０３で寄託。／７参照） からピリオンを精製した。精製手順（プロトコル）は既報の通り（１参照）。主 要なステップは、培養上清のポリエチレン−グリコール処理と、２０％シュクロ ース層（ｃｕｓｈｉｏｎ）を通すペレット化と、２０〜６０％シュクロース勾配 によるバンド分け（ｂａｎｄｉｎｇ）　（！：、ウィルス含有画分のペレット化 であった。

１．２　第１ストランドｃＤＮＡ合成 ウィルスに関連する洗浄で活性化された内因性反応は、ウィルスを精製しそのエ ンベロープを溶解した後このウィルスのリバーストランスクリプターゼ（逆転写 酵素）を作用せしめる技術である。

各反応毎にＦＲ８Ｒ８上清２御０〜３００ルスを用いた。最終反応（液）量は１ 蛯であり、インキュベーションは３７°Ｃで４５分間、タンパク質濃度は約２５ ０μｇ／ｍｌであった。バッファーはＮａＣＱ　２　５　ｍＭ，Ｔｒｉｓ　ＨＣ ＱＣｐＨ　７．　８　）５　０　ｍＭ　、ジチオスレイトール１　０　ｍＭ，　 ＭｉＣ９．２　６ｍＭ　。

ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ　各０．１　ｍＭ，　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−　１ 　０　００、０２％、オリゴｄＴｆライ−ｒ　−　５　０　μｇ／　’であった 。α−３２ｐ−ｄｃＴＰ　４　０　０：　Ｃ１／ｍｍｏｌｅ　を０．６μＭまで かつコールＩＳ（放射化していない、ｃｏｌｄ）　ｃｌｃＴＰ　を４μＭまで用 いて１５分間ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを標識した。その後、コールｐａｃＴｐ　を２５μ Ｍまで加えて第１ストランドの最適な伸長を確実にした。

ｄＣＴＰ追跡（付加、ｃｈａｓｅ）の３０分後ＥＤＴＡを２０ｍＭまで、ＳＤＳ を０．５％まで加えて反応を停止させ、ゾロテイナーゼＫ　１００μｇ／ｍｌで １時間消化し、フェノールークロロホルム抽出した。

次にＧ　−５０−５ｅｐｈａｄｅｘ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）上でｃＤＮＡを 精製し、エタノール沈殿した。

１．３　ｍ２ストランＰ合成とクローニング不青製したｃＤＮＡ−ＲＮＡハイブ リッドをＧＵＢＬＥＲとＨＯＦＦＭＡＮ　（１７参照）に従ってＤＮＡポリメラ ーゼＩとＲＮａｓｅＨで処理した。ターミナルトランスフェラーゼを用いて２本 （１１ｃＤＮＡの末端にｄＯを付加（ａＱ　−ｔａｉｌ）　Ｌ　Ｔ）ＢＲ３２２ の銹導体であるｐＢｄ３２７（３４参照）をＰｓｔ消化し末端にｄＧを付加した ものとアニールした。

大腸ｒ４ｉ　（Ｅ　、　ｃｏｌｉ）Ｃ６００ｒｅｃＢｃ株をトランスフェクショ ンしてｃＤＮＡライブラリーを得た。

２、ＬＡＶ−特異的クローンの検出 ２．１　ライブラリーのスクリーニング５００個の組換えクローンをニトロセル ロースフィルター上で増殖させ、既報（１，２参照）のように内因性ウィルス関 連反応で作成し、Ｐで標識したｃ　ＤＮＡ　のもう１つのバッチを用いてその場 （ｉｎ　５ｉｔｕ）ど・・コロニーハイブリダイゼーション（３５参照）を実施 した。クローンの約１０％が検出できた。

これらのクローンを小規模に増幅しそれらのインサートのクロスバイア”ｌ＋ダ イゼーションを行なって主要な１群を得た。こレラノクローンのうち組換え体と ハイブリダイズする主要な１群を同定した。これらのｃＤＮＡクローンのうち３ 個、すなわち２．５　ｋｂ　、０．６　ｋｂおよび０．８ｋｂ　のインサートを もつものをそれぞれｐＬＡＶ１３．７５および８２と命名して更に特性決定した （第１図）。

３種のインサートは全て一端に共通の制限パターンをもっており、プライミング 部位が共通であることを示唆している。長さ５０　ｂｐで共通の　Ｈｉｎｄ　Ｉ 　−Ｐｓｔ　Ｉ断片の配列を決定した（第１図）。これら共通断片はクローニン グｄＱティル部の前にボＩＪ　Ａ鎖を含有することが示された。すなわちこれら のクローンはポリＡ−ＲＮＡの３′　末端のコピーである。

ＬＡＶＩ　３の特異性をいろいろなアッセイで示した。

ｐＬＡＶ１３の特異性を、ニック翻訳したｐＬＡＶ１３をプローブとして用いた 一連のフィルターハイブリダイゼーション実験で決定した。先ずこのプローブは ドツト（ｄＯｌ）およびノーデン（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）プロッティングによって 精製したＬＡＶ／７”ツムＲＮＡにハイブリダイズした（データは示さず）。ま たｐ　［、ＡＶ１３は培養上清から濃縮されフィルターに直接固定されたウィル スのｒツムＲＮＡにもハイブリダイズするＣドツトプロット法）。同様な方法で いろいろな起源、すなわち正常Ｔ細胞、ＦＲＢその他のＢ減肥のＬＡＶ産生株、 ＣＥＭ細胞、および、（これら根強くはないが）ＡＩＤＳに罹った血友病患者か ら得た骨髄培養物由来のＬＡＶ（３参照）から得たＩ、ＡＶ　ＲＮＡが検出され た。非感染培養物は負であることが立証された。この迅速なげットプロット法は 多少修正すれば血清その他の体液中のＬＡＶの検出に適用することができる。

第二にこのプローブはＬＡＶに感染したＴ　ｌ）ンパ球のすずン（５ｏｕｔｈｅ ｒｎ　’）　プロットとＩ、ＡＶを産生するＣＥＭ細胞株（ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ ）とにおいてＤＮＡを検出した。同じノーイブリダイセ゛−ジョン条件下では、 非感染リンパ球のＤＮＡでも正常肝から得たＤＮＡでもハイブリダイゼーション は検出されなかった（データは示さず）。

後述するようにＬＡＹウィルス群の全レトロウィルスｒツムを同定するのにＬＡ ＶＩ３を用いることができるという可能性から第３の特徴が導かれた。Ｈｉｎｄ 　ｌで開裂したｐ［、ＡＶ１３中の内部ウィルス断片と共に移動する特に特徴的 な１．４５ｋｂＨ１ｎｄ　Ｉ断片が検出された。２．３ｋｂと６．７ｋｂにもバ ンドが横接合断片は全く検出できなかったので、これら大き過ぎるパンげは、Ｉ 、ＡＶＰツムのＨｉｎｄ　ｌ各型性から生じた内部断片に当たるのであろう。

これらのデータを合わせると、ｐｔ、Ａｖｉ　３ＤＮＡ　はヒトデツムに対して 外因性であり、ＬＡＹに感染した細胞から得たＲＮＡ形も組み込まれたＤＮＡ形 も双方とも検出することが示される。すなわちｐ’ＬＡＶ１３はＩ、ＡＶに特異 的である。従来知られているレトロウィルスのｒツム構造を考えれば、ｐＬＡｖ １３はオリゴ−ｄＴでプライムしたのでコード領域の３′　末端と共にＬＴＲの Ｒ領域とＵ３領域も含有するはずである。

ＬＡＶＶ”ツムＤＮＡのクローニング Ｌ、ＴＲのＲ領域内にＨｌｎｄ　１　部位があることが判明したので、ＬＡＶに 感染した細胞から得たプロウィルスＤＮＡをＨ１ｎ４Ｉで部分消化することによ りＬＡＶデノムをクローン化することに決≠ｔた。　ｆａ１部分消化すると完全 なりローンを単離する機会が増大すること、および　ｆｂｌＴ（ｉｎｄｉ断片は ラムダ置換ベクター（ｌａｍｂｄａ　ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ｖｅｃｔｏｒｓ ）　中で容易にクローン化されることが判明した。健常「ナーから得インビトロ で（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）　Ｌ　Ａ　Ｖに感染させた後のＴ細胞から単離したＤＮ ＡをＨｌｎｄ　ｌで部分消化して分画した。９　＊　１．５　ｋｂＤＮＡを含有 する両分を沈殿させ、ラムダ−Ｌ　４７．１のＨｉｎｄ　ｉ　腕（ａｒｍｓ）内 へ連結した（１８参照）。

ＬＡＶＶ’ツムＤＮＡのクローニングはさらに詳細には次のようにして行なった 。

ｃＤＮＡ　を上述のようにＩ、ＡＶに感染したＴ細胞から調製した後、Ｈｌｎｄ 　Ｉで部分的に消化し、１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＣＱ（ＰＨ８）。

１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　Ｉ　Ｍ　ＮａＣ９９５〜４０％のシュクロース勾配 上で分画した（　ＳＷ４１０−ター、４０．００Ｏｒｐｍ　で１６時間）。単一 画分（９±０．５ｋｂ）　をキャリヤーとしてのＤｅｘｔｒａｎ　Ｔ　４０　２ ０　μｇ　７Ｍで沈殿させ、’ｒｇバッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｌｓ、ＣＱ、ｐ Ｈ８、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　）　中に取った。

λ−Ｌ４７．　Ｉ　Ｈｌｎｄ　Ｉ腕は、先ずｃｏｓ部位を連結した後Ｈｌｎｄ璽 で消化し５〜４０％のシュクロース勾配を通して分画して調製した。λ−Ｈ１ｎ ｄＩ　腕のみを含有する両分をプールし、沈殿させ、ＴＥ−バッファーに取った 。この腕とＤＮＡの連結は、３：１過剰モル濃度の腕と３００単位のＴ４ＯＮＡ Ｉ７ガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）とを用いてＤＮＡはぼ２００　μｇ／ｍｌで行な つへ溶解物（１ｙｓａ、ｔｅｓ）のｉｎ　ｖｉｔ、ｒｏパック組立（ｐａｃｋａ ｇｉｎｇ）は（３８）に従って行なった。ｉｎ　ｖｉｔｒｏパック組立後このフ ァージの溶菌物Ｄｙ５ａｔｅ）を、Ｃ６００ｒｅｃ　Ｂ　０株上のＮＭ５３８の 上にシレードアウドした。ニトロセルロースフィルターを用いた１ユ５ｉｔｕハ イブリダイゼーシヨン（３９参照）によって約２百万のプラークをスクリーニン グした。ハイブリダイゼーションは１　ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．５％Ｓ ＤＳ、２ｘＳＳＣ，２ｍＭＥＤＴＡの中６８°Ｃで行なった。プローブはｐＬＡ Ｖｌ　３の３２ｐでニック翻訳したＬＡＶインサートであった（　＞　１０８　 ｃｐｍ　／　ｌｔｇ’）。

フィルターを６８°Ｃの０−ＩＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中３０分間で２回洗浄し 、ＫｏｄａｋＸＡＲ−５フイルムに２９〜４０時間露出した。陽性のクローンを ７個同定し、Ｃ６００ｒθｃ　８Ｃ株上でプラークを精製した。液体培養し、組 換えファージをＣｓＣ１，中にパンｒ分けした。ファージＤＮＡを抽出し、適当 な条件下で消化した。

このように、ニック翻訳したｐＬＡＶ１３インサートをプローブとして用いたｉ ｎ　５ｉｔｕスクリーニングによって約２百万のファージプラークから７個の別 々のクローンが得られた。λ−Ｊ１９の制限地図をＨｉｎｄ　ｌ　字型性のλ− Ｊ８１の制限地図と共に第２図に示す。他の組換えλ−Ｊ２７、λ−Ｊ３１およ びλ−Ｊ５７はλ−Ｊ１９と同じＴ（ｉｎｄ　ｌ　地図を示した。

λ−Ｊ８１の地図は同様であるが約５５５０の座標の所に余分なＨｌｎｄ　１　 部位がある。

第２図の制限地図はプロットをｐＬＡＶ１３ＤＮＡに対してハイプリダイスする ことで方向を決定した。

ＬＡＶＩ　３　ｃＤＮＡクローンの制限地図も第２図に示しである。λ−Ｊ１９ の制限部位はＢがＢａｍ　ＨＩ　＋　Ｂ　ｇがＢｇｌ　ｌ、ＨがＨｌｎｄ　ｌ　 、　ＫがＫｐｎ　１．　ＰがＰｓｔｒ、ＲがＥｃｏＲ４゜Ｓが５ａｃ１．Ｓａが ５ａｌｉ、ＸがＸｈｏ　Ｉである。目盛り（スケール）の下にはレトロウィルス の一般的な構造の概略図があり、これにはＬＴＲの要素Ｕ　３　、　ＲおよびＵ ５が示されている。Ｒ／ＵＳ境界のみかはつきシ決められており、他の境界は単 に比ゆ的に図示しただけである。

λ−Ｊ１９の５′の０．５２　ｋｈ　Ｈｌｎｄ　ｌ断片中には他のＢａｍＨＩ部 位があるかもしれない。これらの部位は小さ禍ぎて検出できない断片を生ずる。

第２図はまた、λ−Ｊ１９とλ−Ｊ８１のＨｌｎｄ　ｌ断片のうちｐＴ、ＡＶ１ ３で検出されるものを（＋）として検串されないものを（−）として示している 。

さらに詳細にみると、λ−Ｊ１９には４つのＨｌｎｄ　ｌ　バンド、すなわち６ ．７ｋｂ、１．４５ｋｂ、０．６　ｋｂおよび０．５２ｋｌ）のパンＶがあシ、 これらの最初の２つがＨｌｎｄ　Ｉで制限したＤＮＡのｒツムプロット中にある バンドに対応する。最小の０．６　ｋｂ（！：　０．５２　ｋｂのバンドはｒツ ムプロット内にはみられなかったが、これらが独立に得られた分析クローンの全 てに現われるという事実は、ＬＡＶのプロウィルスＤＮＡのラングるもので接合 断片（ｊｕｎｃｔｉｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）ではないということを示唆して いる。実際、０．５ｋｂバンドはｐＬＡＶｌ３の小さいＨｌｎｄ　Ｉ　−Ｐｓｔ 　Ｔ　断片を介してｐＴ、ＡＶ１３ＤＮＡと／＼イプリダイズする（第２図）。

すなわちλ−Ｊ１９の０．５ｋｂ）Ｔｉｎｄ　ｌ断片はＴ、ＴＲ内部のＲ−Ｕ５ 接合部（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）　を含有している。

λ−Ｊ８１はλ−Ｊ１９の制限部位各型現象であると思われる。λ−Ｊ８１には ４．３ｋｂ、２３ｋｂ、１．４５ｋｂ、０．６ｋｂおよび０．５２ｋｂの５種の Ｈｌｎｄ　ｌバンドがある。この２．３　ｋｂバンドはｐｌ、ＡＶ１３ニア’ロ ープによるｒツムプロットで容易に検出されるが、４．３ｋｂ断片は検出されな い。　λ−Ｊ８１がＨｌｎｄ　ｌ　多型現象の１つであシ組換えウィルスではな いということは、ニック翻訳したλ−Ｊ　１９　ＤＮＡが緊縮ハイブリダイゼー ションおよび洗浄条件下でλ−Ｊ８１の５つのＨｉｎｄ　Ｎパンｒ全てとハイブ リダイズするという事実によって示される。

マタ、λ−Ｊ８１内のその他の制限部位はλ−Ｊ１９と同一である。

ＬＡＹ由来ＣＤＮＡの配列決定 ファージ組換え体に対し特に重要な部位の配列決定を行なった。

クローンλＪ１９の組換えファージＤＮＡ全体をＤＥＩＮＩＮＧＥＲ（１９８３ ）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１２９，２１６ノプロトコル伊 順）に従って超音波処理した。このＤＮＡをフレノウ（Ｋｌ　ｅｎｏｗ　）反応 によって１６°Ｃで１２時間修復した。

ＤＮＡを０．８％アガロースｒル中に電気泳動させ、３００〜６００　ｂｐのサ イズ範囲のＤＮＡを切出し、電気溶出し、沈殿させた。ＤＮＡを（１０ｍＭ　Ｔ ｒｉｓ、Ｉ）Ｈ８，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ中に）再懸濁し、Ｔ４ＤＮＡ−および ＲＮＡ−リガーゼ（ＭａｎｉａｔｉｓＴら（１９８２）、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　 ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 　）を用いて、（制限酵素Ｓｍａｌで切断した後アルカリ性ホスファターゼ処理 をした）Ｍ１３ｍｐ８ＲＦＤＮＡ中に連結した。ＴＧＩと名付けたＢ、胚已ユ株 を用いて以下の研究を行なった。この株の遺伝子型はΔｌａｃ　ｐｒｏ。

５ｕｐＥ、ｔｈｉ、Ｆ’　ｔｒａＤ３６．ｐｒｏＡＢ、１ａｃＩｑ、ＺΔＭ１５ ．ｒ−で易に識別できる。ＬＡＶ　ＤＮＡの断片で組み換えなかったシラスミド によってトランスフェクトされた細胞の青色は変化しない。逆に、ＬＡ’Ｖ　Ｄ ＮＡ断片を含有する組換えシラスミドでトランスフェクトした細胞は白色のコロ ニーとなる。用いた方法はＧｅｎｅ（１９８３）、２６，１０１に開示されてい る。

Ｈａｎａｈａｎ法（Ｈａｎａｈａｎ　Ｄ　（１９８３）、Ｊ、Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ 、。

１６６．５５７）を用い、この菌株を連結混合物で形質転換した。軟アガロース 中にＩ　ＰＴＧとＸ−ｇａｌを有するトリプトン−アガロースプレート上にプレ ートアウトした。白色のプラークを摘出した後かまたは直接ｉ１　５ｉｔｕ　で ニトロセルロースフィルターを用いてスクリーニングした。これらプラークのＤ ＮＡはλＪ１９のｐｕｃ１８Ｈｉｎｄ■サブクローンのＤＮＡインサートをニッ ク翻訳したものとハイブリダイズした。これによって後記表に示すλのシラスミ ドまたはサブクローンの単離が可能になった。この表に関して、各プラスミドの 表示の後ろに学舎のプラスミドを含有するＥ、ｃｏｌｉ　ＴＧＩ　の培譬細胞を フランス、パリのＰａ５ｔｅｕｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅの′″Ｃｏ１１ｅｃｔｉ ｏｎＮａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅｓ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｄｅ　Ｍｉｃｒｏ−ｏｒ ｇａｎｉｓｍｅｓ”（Ｃ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、）に寄託した番号も示されていること（ ご注意されたい。形質転換してないＴＧＩ細胞株も番号ｌ−３６４でＣ１Ｎ、Ｃ ，Ｍ。

に寄託した。これらの寄託は全て１９８４年１１月１５日付で行なった。ＬＡＹ デノムから得られた対応するインサートのサイズも一緒に示す。

表 組換えプラスミドの基本的特徴 −ｐＪ１９−１　プラスミド　（Ｉ−３６５）　０．５ｋｂＨｉｎｄ　ｌｌｌ− ８ａｃ　Ｉ　−Ｈ４ｎｄ　ＩＩＩ−ｐＪ１９−１７プラスミド　（Ｉ−３６７） 　０．６ｋｂＨｉｎｄ　ＩＩＩ−Ｐｓｔ　１−Ｈｌｎｄ　ＩＩＩ−ｐＪ１９−６ 　７’ラスミド　（Ｉ−３６６）　１．５ｋｂＨｉｎｄ　ＩＩＩ（５’　） Ｂａｍ　ＨＩ ）（ｉｎｄ　ＩＩＩ −ｐＪ１９−１３シラスミド　（Ｉ−３６８）　６．７ｋｂＨｉｎｄ　ＩＩＩ（ ５’　） Ｂｇｌ　ｌｌ ＥＣ０ＲＩ Ｅｃｏ　ＲＩ 正にハイブリダイズするＭ１３ファージプレートを５時間増殖させ、一本領ＤＮ Ａを抽出した。

３ａｎｇｅｒらによって改良されたジデオキシ法および技法（Ｓａｎｇｅｒら（ １９７７）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ。

ｈａｎｄｂｏｏｋ、ＡＭＥＲ８ＨＡＭ（１９８３））に従ってλＪ　１９ＤＮＡ のＭ１３ｍｐ８サブクローンの配列決定をした。１７ｆ体のオリゴヌクレオチド プライマー　α−３５ＳｄＡＴＰ（４００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＡＭＥＲ８ＨＡＭ） 、および０．５Ｘ−５Ｘバッファー勾配ｒル（Ｂｉｇｇｅｎ　Ｍ、Ｄ、ら（１９ ８３）、Ｐｒｏ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、５０．３９６３）を用いた。ｒルを読み取り、Ｓｔ　ａｄｅｎ のプログラム（Ｓｔａｄｅｎ　Ｒ，（１９８２）、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　ｌ’ （ｅｓ、。

参考文献と方法は全てＡＭＥＲ３ＨＡＭ　Ｍ１３／Ｃ１ｏｎｉｎｇ　ａｎｄｓｅ ｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｈａｎｄｂｏｏｋ　中に書いである。

λＪ１９の完全な配列を第５〜１２図に示す。

ＨＴＬＶ−ＩとＨＴＩ、Ｖ−ＩＩはＴ’　Ｊ胞すブセットである０ＫＴ４に対す る指向性をもった１対のＣ−タイプ形質転換型レトロウィルスを講成している（ ２０参照）。単離したＨＴＬＶ−ｒは全配列が決定されており（２１参照）、Ｈ ＴＬＶ−ＩＩの部分配列も決定・報告されている（２２〜２４参照）。どちらの ｒツム（ＬＴＲ１個）も長さが約８，３　ｋ　ｂであり、ｐＸ領域を有しており 、広い範囲で配列に相同性がある。これらのｒツムはかなり緊縮な条件（４０％ ホルムアミド、５ＸＳＳＣ）下でお互い１こハイブリダイズし、しかもｐｘ領領 域６０％ホルムアミドでさえハイブリダイズする。（２６参照）。したがって、 保存されたｐｘ領領域この類のウィルスの極立った特徴である。

我々はクローン化したＴ、ＡＶ　ＤＮＡとクローン化したＨＴＬＶ−Ｉ　ＤＮＡ （ｐＭｏ１２７参照）とをソロットーハイ、ブリダイゼーションで比較し、ハイ ブリダイゼーションおよび洗浄の低緊縮条件下３まクロスーハイブリダイセ゛− ジョンが全く起こらないこ々を見出した。たとえば、Ｈ１ｎｄ夏で消化したλ− ５１９、λ−Ｊ２７およびλ−Ｊ８１を電気泳動させ、プロットし、　３２ｐ− 二ツク翻訳したｐＭｏ（ＨＴＬＶ−１１）ＤＮＡＣ比活性は０．５　ｘ　１０８ 　ｃｐｍ／４より大）と、２０％ホルムアミド、５　ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ，１＊　Ｄ ｅ’ｎｈａｒｄｔｓ　溶液、１０％Ｄｅｘｔｒａｎｓｕ、１ｐｈａｔｅ　（位・ ・酸デキストラン）中３７°Ｃで一晩ハイブリダイズさせた。ＨＴＬＶｉ　配列 （２１）から得た５３，１％ＧＣ含量を用いて３７℃（ｔｍ、５０）ｔｍ、５０ でフィルターを洗浄した。洗浄を５０℃と６５℃、ｌＸ５ＳＸ、０．１％ＳＤＳ 中で繰り返した。２０％ホルムアミド、８ＸＳＳＣ（ｔｍ、５０’１中でハイブ リダイズさせ、２ＸＳＳＣ（ｔｍ、５０）中３７°Ｃで洗浄した場合でさえ、増 感スクリーンを用いて一７０℃で２日露光した後でもハイブリダイゼ−ションは 全く検出されなかった。

このように、ＬＡｖと！（ＴＬＶ　ウィルスの間の関係を示す分子的な証拠はな い。また、ＨＴＴ、Ｖ　ウィルスが８．３ｋｂであるのに対ししＡＶゲノムはほ ぼ９ｋｂの長さである。ケゞツムサイズが近いにもかかわらず、ＬＡＶとビスナ （Ｖｉｓｎａ　、　２９参照）のクローン化したウィルスゲツムはクロスハイブ リダイズするこさはなく、非緊縮条件（ハイブリダイゼーション　２０％ホ／ｌ ／　ム７ミｙ、８ＳＳＣ，３７°Ｃ：洗浄　２ＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ、３７° Ｃ）でＴ、ＡＶと多くのヒト内因性ウィルスｒツム（３０参照）とのハイブリダ イゼーションが起こることもない。

本発明はまた、さらに特定的には本発明によるＤＮＡ断片のいずれかから出発し て作製することができるクローン化プローブにも係り、したがってこのような断 片を含有する組換えＤＮＡ特に原核または真核細胞中で増幅でき前記の断片を担 持しているあらゆるプラスミドにも係る。礪に述べたように好ましいＤＮＡ断片 はＬＡＶ１３である。

クローン化したプロウィルスＤＮＡを放射性核種か蛍光試薬のいずれかで標識す ることによシ分子ハイブリダイゼーションプローブとして用いるとＩ、ＡＶピリ オンＲＮＡを、血液、体液および（たとえば第■因子濃縮物のような抗血友病因 子の）血液製剤ならびにワクチンすなわちＢ型肝炎ワクチン中で直接検出しうる 。ＬＡＶ産生細胞の培養上清中でウィルス全体が検出できることは既に示されて いる。その検出を達成する適切な方法は、前記の如き担体たと・えばニトロセル ロースフィルター等にウィルスを固定し、ピリオンを破砕し、標識（放射標識ま たは「冷い（ｃｏｌｄ）Ｊ蛍光もしくは酵素標識）したプローブとハイブリダイ ズすることである。このような方法は既に、末梢血中のＢ型肝炎ウィルスの場合 について（５ＣＯＴＴＯ，Ｊ、ら。

Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　（１９８３）　、　３　、３７９−３８４に従って）開 発されている。

本発明のプローブはまた、ＬＡＶ関連症状を示している患者の組織から得たデノ ムＤＮＡの迅速なスクリーニングに使用してプロウィルスＤＮＡまたはＲＮＡが 宿主組織およびその他の組織中に存在するかどうかを検べることもできる。

このようなスクリーニングに使用できる方法は次のステップからなる。すなわち 、組織からのＤＮＡの抽出、このＤＮＡの制限酵素開裂、断片の電気泳動および 組織からのｒツムＤＮＡのサデンブロツテイング、その後の標識クローン化ＬＡ ＶプロウィルスＤＮＡとのハイブリダイゼーションである。ｉｎ　５ｉｔｕハイ ブリダイゼーシヨンも使用できる。

また、ヒト、霊長目その他の補乳類の種のリンパ液やリンパ組織およびその他の 非リンパ組織を別の進化上関連したレトロウィルスか存在するかどうか検討する ためにスクリーニングすることもできる。上述の方法が使用できるがノ・イブリ ダイゼーションと洗浄は非緊縮条件下で行なわれるであろう。

本発明のＤＮＡは診断目的用のＬＡＶウィルス抗原の発現を達成するためにと、 もちろんＬＡＶに対するワクチンの製造にも使用できる。この点特に有利なのは コア（ｇａｇ領域）およびエンベロープタンパク質をコードしているＤＮＡ断片 、特にＫｐｎ　Ｉ　（６１００）からＢｇｌ　Ｉｔ　（９１５０）まで延びるＤ ＮＡ断片である。

このために使用できる方法は多様である。

ａ）ＤＮＡは様々な技法、たとえばリン酸カルシウム沈殿、ポリエチレングリコ ール、プロトシラスト−融合、等によって適当な選択マーカーをもっだ哺乳動物 細胞中にトランスフェクトすることができる。

ｂ）遺伝子に対応するＤＮＡ断片をＥ　、ｃｏｌｉ　、酵母または哺乳類の細胞 用の発現ベクター中でクローン化し、得られたタンパク質を精製することができ る。

Ｃ）ゾロウィルスＤＮＡを「ショットガンによって（断片化して）」原核生物発 現ベクター中に導入して融合ポリペプチドを生成させることができる。抗原性の ある融合タンパク質を産生ずる組換え体はこの組換え体をＬＡＹ抗原に対する抗 体で単にスクリーニングするだけで同定できる。

ｄ）本発明はまた、免疫原と抗原を産生すべ（ＬＡＶ抗原−遺伝子のＤＮＡ配列 から推定され、化学的に合成できるオリゴペプチＰにも係る。

上記（ａ、−ｄ）は全て診断において許容されない系を用いて産生されるウィル ス粒子をもたない、したがって生物学的危険がほとんどまたは全くない免疫原ま たは抗原の入手源として使用できる。

さらに本発明は上述の組換え体で形質伝播され、前記ＤＮＡ断片を発現すること ができる宿主（原核または真核細胞）に係る。

最後に本発明は、活性成分が発現された抗原、すなわち抗原全体、融合ポリペブ チＰまたはオリゴペプチＶから成るようなワクチン組成物にも係る。

本発明は最後に、ＬＡｖウィルス群から抽出するかまたはｃＤＮＡか再度合成す ることができる精製ｒツムｍＲＮＡ。

特に大きさがほぼ９．１〜９．２ｋｂで上記に定義したＤＮＡ断片のいずれかに ハイブリダイズできるｆ＃製ｍＲＮＡ　、あるいは前記精、ｌＩＪｍＲＮＡの一 部に関する。また本発明は前記ＲＮＡの一部分にも係る。この精製ＲＮＡまたは その一部分のヌクレオチド構造は実際関連ｃＤＮＡのヌクレオチド配列から推定 することができる。

】股後に、ラムダ−Ｊ１９とラムダ−Ｊ８１は１９８４年９月１１日付でそれぞ れ番号１−３３８と１−３３９をもってＰａ５ｔｅｕｒ　（フランス）のｌＮ５ ＴＩＴＵＴ　ＰＡＳＴＥＵＲのＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ＮａＪｉｏｎａｌｅ　ｄ ｅｓ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｄｅ　Ｍｉｃｒｏ　−ｏｒｇａｎｉａｍｅｓ　（Ｃ、 Ｎ　、　Ｃ、Ｍ　）　に寄託されていることに言及しておく。

終りに本発明は、そのＤＮＡ配列を決定してウィルスタンパク質（抗原）のアミ ノ酸配列の予知に使用することができるようなケ９ツムＤＮＡ、およびｃＤＮＡ から線溝することができるＲＮＡプローブに関する。

本明細書を通じてかっこで括った数で参照して来た参考文献の目録を次に挙げる 。

次の目録で参照されている刊行物は全て引用によってここに含まれるものとする 。

参照文献 １、　Ｂａｒｒ４−８ｉｎｏｕｓｓｉ、Ｆ−ｅｔ　ａｔ、５ｃｉｅｎｃｅ　２２ ０，８６８−８７１（１９８３）。

２、　Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒ、Ｌ、ｅｔ　ａｌ、ｉｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｔ−ｃｅｌ ｌ　ＬｅｕＫｅｒｎｉａ゛、′＋Ｖｉｒｕｓｅ、ｓ　（ａｄｓ＋Ｒ０Ｃ，Ｇａ１ ｌｏ、Ｍ、Ｅｓ５ｅｘ　ａｎｄ　Ｌ、Ｇｒｏｓｓ）ｐ、３６３−３７９（Ｃｏｌ ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ、１９８４）。

３　Ｖｉｌｍｅｒ、Ｂ、ｅｔ　ａｌ、Ｌａｎｃｅｔ、ｉｉ、７５３−７５７（１ ９８４）。

４　Ｅｌｌｒｏｄｔ、Ａ、ｅｔ　ａｌ、Ｌａｎｃｅｔ、ｉ、１３８３−１３８５ （１９８４）。

５　Ｆｅｏｒｉｎｏ、Ｍ、Ｐ、ｅｔ　ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ、２２５．６９−７ ２（１９８４）。

６　Ｋｌａｔｚｍａｎｎ、Ｄ、ｅｔ　ａｌ、３ｃｉｅｎｃｅ、２２５．５９−６ ３（１９８４）。

７　Ｎｏｎ　ｔａｇｎ　ｉ　ｅｒ　、Ｌ、ａｔ、ｉａｌ、ＳＣ１ｅｎｃｅ　、８ ８５．６３−６６（１９８４）。

８　Ｂｒｕｎ−ＶＪｚｉｎｅｔ、Ｆ、ｅｔ　ａｌ、Ｌａｎｃｅｔ、ｉ、１２５３ −１２５６（１９８４）。

９　Ｋａｌｙａｎａｒａｍａｎ、Ｖ、Ｓ＋ａｔ　ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ、２２５ ，３２１−３２３（１９８４）。

１０　Ｂｒｕｎ−Ｖ４ｚｉｎｅｔ、Ｆ、ｅｔ　ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ　ｉｎ　Ｐ ｒｅｓｓ。

１１　Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒ、Ｌ、、Ｂａｒｒｅ−８＋ｎｏｕｓｓｉ、Ｆ、ａｎ ｄ　Ｃｈｅｒｍａｎｎ。

Ｊ、Ｃ，ｉｎ　Ｐｒｏｇ、　Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆ、Ｒｅｓ、Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｉ 、（ｅｄｓ。

Ｃ，Ｇｒｉｓｃｅｌ　目　ａｎｄ　Ｊ、’−′ｙｏｓｓｅｎ）ｐ　、３６７−３ ７２（ＥｘｃｅｒｐｔａＭｅｄｉｃａ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１９８４）。

１２　ＰｏｐＯｖｉｃ、Ｍ、、Ｓａｒｎｇａｄｈａｒａｎ、Ｍ、Ｇ、、Ｒｅａｄ 、Ｅ、ａｎｄＧａ目０．Ｒ，Ｃ，５ｃｉｅｎｃｅ、２２４，４９７−５００（１ ９８４）。

１３　Ｇａ１ｌｏ、ｅｔ　ａｌ、３ｃｉｅｎｃｅ、２２４，５００−５０３（１ ９８４）。

１４　５ｃｈｉｉｐｂａｃｈ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ、２２４，５０ ３−５０５（１９８４）。

ｉｓ　ｓａｒｎｇａａｈａｒａｎ、Ｍ、ａ、、ｐｏｐｏｖｉｃ＋Ｍ、＋Ｂｒｕ／ ｃｈ＋Ｌ、ｔＳｃｈｉｉｐｂａｃｈ、Ｊ、ａｎｄ　Ｃａ１１ｏ、Ｒ，Ｃ，５ｃｉ ｅｎｃｅ、２２４，５０６−ｓｏ８（１９ｓ４）。

１６　Ｌｅｖｙ、Ｊ、Ａ、ｅｔ　ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ、２２５，８４０−８４ ２（１９８４）。

１７　Ｇｕｂｌｅｒ、Ｕ、、ａｎｄ　）ｆｏｆｆｍａｎ、Ｂ、Ｊ、Ｇｅｒｌｅ、 ２５，２６３−２６９（１９８３）。

１ｇ　Ｌｏｅｎｅｎ、Ｗ、ＡｏＭ、ａｎｄ　Ｂｒａｍｍａｒ、Ｗ、Ｊ、Ｇｅｎｅ 、１０，２４９−２５９（１９８０）。

２０　Ｇａ１ｌｏ、Ｒ，（’、ｅｔ　ａｌ、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、ＵＳＡ、７９゜５６８．０−５６８３（１９８２）　。

２１　５ｅｉｋｊ、Ｍ、、Ｈａｔｔｏｒｉ、Ｓ、、Ｈｉｒａｙａｍａ、Ｙ、ａｎ ｄ　Ｙｏｓｈｉｄａ。

Ｍ、Ｐｒｏｃ、ＮａｔＩ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８０，３６１８−３６２ ２（１９８３）　。

２２　Ｈａｓｅｌｔｉｎｅ、Ｗ、Ａ、ｅｔ　ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ、２２５，４ １９−４２１（１９８４）。

２３　５ｏｄｒｏｓｋｉ、Ｊ、ｅｔ　ａｌＪｃｉｅｎｃｅ、２２５，４２１−４ ２４（１９８４）。

２４　Ｓｈｉｍｏｔｏｈｎｏ、に、ｅｔ　ａｌ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ＋Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ、ＵＳＡ。

ｉｎ　ｐｒｅｓｓ。

２５　Ｃｈｅｎ、１．Ｓ、Ｙ、ＭＣＬａｕｇｈｌｉｎ、Ｊ、、Ｇａ５５ｏｎ、Ｊ 、Ｃ，、Ｃ１ａｒｋ。

Ｓ、Ｃ，ａｎｄ　Ｇｏｌｄｅ、Ｄ、Ｗ、Ｎａｔｕｒｅ、３０５，５０２−５０５ （１９８３）。

２６　ｓｈａｗ、ａ、ｙｔ、ｅｔ　ａｌ、ｐｒＯｃ、Ｎａｔｌ、ＡＣａｄ、ＳＣ ｉ、ＵＳＡ、８１゜４．５４４−４５４８（１９８４）。

２７　Ｇｅｌｍａｎｎ、Ｅ、Ｐ、、Ｆｒａｎｃｈｉｎｉ、Ｇ、、Ｍａｎｚａｒｉ 、Ｖ、、ＷＱｎｇ−３ｔａａｌ、Ｆ、ａｎｄ　Ｇａ１ｌｏ、Ｒ，Ｃ，Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、８１，９９３−９９７（１９８４）。

２８　Ａｒｙａ、Ｓ、に、ｅｔ　ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ、２２５，９２７−９３ ０（１９８４）。

２９　Ｉ（ａｒｒｉｓ、Ｊ、Ｄ、ｅｔ　ａｔ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１１３，５７ ３−５８３（１９８１）。

３０　５ｔｅｅｌｅ、Ｐ、ＥｌＲａｂｓｏｎ、Ａ、Ｂ、、Ｂｒｙａｎ、Ｔ、ａｎ ｄ　Ｍａｒｔｉｎ。

Ｍ、Ａ、５ｃｉｅｎｃｅ、２２５，９４３−９４７（１９８４）。

３１　Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒ、Ｌ、ｅｔ　ａｌ、Ａｎｎ＋Ｖｉｒｏｌ、（Ｉｎｓ ｔｉｔｕｔＰａｓｔｅｕｒ）、１３５　Ｅ、１１９−１３４（１９８４）。

３２　Ｌｅｎｚ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ、３０８，４６７−４７０（１ ９８４）。

３３　Ｃｈｅｎ、Ｉ、Ｓ、Ｙ、、Ｍｃ　Ｌａｕｇｈｌｉｎ、Ｊ、ａｎｄ　Ｇｏｌ ｄｅ、Ｄ、Ｗ。

Ｎａｔｕｒｅ、３０９，２７６−２７９（１９８４）。

３４　５ｏｂｅｒｏｎ、Ｘ１Ｃｏｖａｒｒｕｂｉａｓ、Ｌ、ａｎｄ　Ｂｏｌｉｖ ａｒ、Ｆ、Ｇｅｎｅ。

９．２８７−３０５（１９８０）。

３５　Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ、Ｍ、ａｎｄ　Ｈｏｇｎｈｅｓｓ、Ｄ、Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７２．３９６１−３９６５（１９７５）。

３６　Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ、、Ｎ１ｃｋｌｅｎ、Ｓ、ａｎｄ　Ｃｏｕｌｓｅｎ、Ａ 、Ｒ，Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７９．５４６３−５４７６（１９７７） 。

３７　５ｏｕｔｈｅｒｎ、Ｅ、Ｍ、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、９８，５０３−５ １７（１９７５）。

３８　Ｉｓｈ−）１ｏｒｏｗｉｃｚ、Ｄ、ａｎｄ　Ｂｕｒｋｅ、Ｊ、Ｆ＋Ｎｕｃ １．Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、、９．２９８９−２９９８（１９８１）。

３９　ＢｅｎｔＯｎ、Ｗ、Ｄ、ａｎｄ　Ｄａｖｉｓ、Ｒ，Ｗ、５ｃｉｅｎｃｅ、 １９６，１８０−１８２（１９７７）。

竹表昭６２−５００２８２　（１３） ＣＣＣ７０４丁　ＴＧＧ　ＣＡＧＡＡＣＴＡＣＡ　ＣＡＣＣＡＧＧＧＣＣＡＧＧ ＧＧＴＣ’ＡＧＡＧＴＧＣＴＡＣＡＡＧ　ＣτＡＧＴＡＣＣＡＧ　ＴＴＧＡＧＣ ＣＡＧＡ　τＡＡＧＧＴＡＧＡＡＣＡＣＣＡＧＣＴＴ、Ｇ　ＴＴＡＣＡＣＣＣＴ Ｇ　ＴＧＡＣＣＣＴＧＣＡ　ＴＧＧΔΔＴＧＧＡ丁８Ｂ３０　５ａｔｏ　５ｇ５ ｏ’　８８６０ＡＧＡＧＴＧＧＡＧＧ　ＴＴＴＧＡＣＡＧＣＣＧＣＣＴＡＧＣＡ ＴＴ　ＴＣＡＴＣＡＣＧＴＧＢＳ９０　８９００　８９１０　１！９２０ＧＴＡ ＣＴＴＣＡＡＧ　ＡＡｃＴＧｃＴＧＡｃ　ＡＴＣＧＡＧＣＴＴＧ　ＣＴＡＣＡ、 ＡＧＧＧＡＡＧＣＴＧＣＴＴＴＴ　ＴＧＣＣＴＧＴＡＣＴ　ＧＧＧＴＣＴＣＴＣ Ｔ　ＧＧＴＴＡＧＡＣＣＡ９０７０　９０８０　９０９０　タ１００ＣＴＧＧＣ ＴＡＡＣＴ　ＡＧＧＧＡＡＣＣＣＡ　ＣＴＧＣＴＴＡＡＧＣＣＴＣＡＡＴＡＡＡ Ｇ特衣昭６２−５００２８２　（１５） ２　〒ΔＴＣＣＡＣＴＧＡ　ＣＣＴＴＴＧＧＡＴＧ８７５０　ａ７６０ −　ＧＡＧＧＣＣＡＡＴＡ　ＡＡＧＧＡＧＡＧＡＡ’　ＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡ　 ＧＡＧＡＡＧＴＧＴＴｌ　１ｓ１ｉ１７０　％８８Ｇ １　ＧＣＣＣＧＡＧＡＧＣＴＧＣＡＴＣＣＧＧＡ８９３０　［４０ Ｌ　（ｒＴＴｃｃＧｃＴＧ　ＧＧＣＡＣｒＴＴＣＣ＋　９０５０　９０６０ −ＧＡＴＴＴＧＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＣＴＣＴ＋　０　０ ＋　Ｃ丁Ｔ 国　際　稠　岑　舖　牛 □、、、−、、、、、、　ＰＣＴ／ＥＰ　８５１００４８７

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．ＬＡＶウイルス群のゲノムＲＮＡとハイブリダイズしうるＤＮＡまたはこの ハイブリダイズしうるＤＮＡの断片を含有するクローン化ＤＮＡ。
2. ２．ＬＡＶウイルスのゲノムＲＮＡとハイブリダイズしうる前記ハイブリダイズ しうるＤＮＡまたはＤＮＡ断片の組換え体である請求の範囲１のＤＮＡ。
3. ３．前記ハイブリダイズしうるＤＮＡまたはＤＮＡ断片がｃＤＮＡである請求の 範囲１または２のＤＮＡ。
4. ４．次の制限部位を次の順序で（３′末端から５′末端に向かつて）含有する請 求の範囲１〜３のＤＮＡ：ＨｉｎｄＩＩＩ，ＳａｃＩ，ＢｇｌＩＩ（ＬＡＶ７５ ）。
5. ５．次の制限部位を次の順序で含有する請求の範囲４のＤＮＡ：ＨｉｎｄＩＩＩ ，ＳａｃＩ，ＢｇｌＩＩ，ＢｇｌＩＩ，ＫｐｎＩ（ＬＡＶ８２）。
6. ６．次の制限部位を次の順序で含有する請求の範囲４のＤＮＡ：ＨｉｎｄＩＩＩ ，ＳａｃＩ，ＢｇｌＩＩ，ＢｇｌＩＩ，ＫｐｎＩ，ＸＨｏＩ，ＢａｍＨＩ，Ｈｉ ｎｄＩＩＩ，ＢｇｌＩＩ（ＬＡＶ１３）。
7. ７．大きさが約２．５ｋｂである請求の範囲６のＤＮＡ。
8. ８．ＬＴＲのＲ領域およびＵ３領域とレトロウイルスＤＮＡのコード領域の３′ 末端とに対応する領域を含有する請求の範囲１〜７のいずれかのＤＮＡ。
9. ９．大きさが約９．１〜９．２ｋｂである請求の範囲１のＤＮＡ。
10. １０．次の一連の制限部位を含有する請求の範囲９のＤＮＡ：Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ 　０ Ｓａｃ　　Ｉ　　　５０ Ｂａｍ　　ＨＩ　　４６０ Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　５２０ Ｂａｍ　　ＨＩ　　６００ Ｐｓｔ　　Ｉ　　　８００ Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　１１００ Ｂｇｌ　　ＩＩ　　１５００ Ｋｐｎ　　Ｉ　　　３５００ Ｋｐｎ　　Ｉ　　　３９００ Ｅｃｏ　　ＲＩ　　４１００ Ｅｃｏ　　ＲＩ　　５３００ Ｓａｌ　　Ｉ　　　５５００ Ｋｐｎ　　Ｉ　　　６１００ Ｂｇｌ　　ＩＩ　　６５００ Ｂｇｌ　　ＩＩＩ　７６００ Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　７８５０ Ｂａｍ　　ＨＩ　　８１５０ Ｘｈｏ　　Ｉ　　　８６００ Ｋｐｎ　　Ｉ　　　８７００ Ｂｇｌ　　Ｉ　　　８７５０ Ｂｇｌ　　Ｉ　　　９１５０ Ｓａｃ　　Ｉ　　　９２００ Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　９２５０。
11. １１．さらにほぼ５５５０の座標付近にＨｉｎｄＩＩＩを１個含有する請求の範 囲１０のＤＮＡ。
12. １２．請求の範囲１１に規定した配列のＫｐｎＩ（６１００）辺りからＢａｍＨ Ｉ（８１５０）辺りまで延びる配列からなる請求の範囲１に従うＤＮＡ断片。
13. １３．請求の範囲１１に規定した配列のＫｐｎＩ（３５００）辺りからＢｇｌＩ Ｉ（６５００）辺りまで延びる配列からなる請求の範囲１に従うＤＮＡ断片。
14. １４．請求の範囲１１に規定した配列のＰｓｔ（８００）辺りからＫｐｎ　Ｉ（ ３５００）辺りまで延びる配列からなる請求の範囲１に従うＤＮＡ断片。
15. １５．エンベロープタンパク質をコードしている請求の範囲１のＤＮＡ断片。
16. １６．レトロウイルスポリメラーゼをコードしている請求の範囲１のＤＮＡ断片 。
17. １７．コアタンパク質をコードしているＤＮＡ断片。
18. １８．請求の範囲１〜１７のいずれかに従うＤＮＡから成るＬＡＶインビトロ検 出用プローブ。
19. １９．ＬＡＶ感染の診断をすベき人から得、ハイブリダイゼーシヨンに適した形 態のＤＮＡを含有する生物学的サンプルをハイブリダイズ条件下で請求の範囲１ ８のプローブと接触せしめ、ハイブリダイズしたプローブを検出することからな る、ＬＡＶウイルス群に起因するウイルス感染のインビトロ検出法。
20. ２０．請求の範囲１〜１７のいずれかに規定されているようにＬＡＶウイルス群 のレトロウイルスゲノムとハイブリダイズしうるＤＮＡ断片から成るインサート を含有する、原核または真核細胞の形質転換用発現ベクター、特にプラスミド。
21. ２１．請求の範囲１５のＤＮＡ断片を含有する請求の範囲２０のベクター。
22. ２２．請求の範囲１９または２０に従うベクターで形質転換されており、対応す るＤＮＡ断片がコードしているポリペプチドを発現する微生物の原核または真核 細胞。
23. ２３．前記微生物の発現産物。
24. ２４．大きさが９．１〜９．２ｋｂであるＬＡＶウイルス群の精製ＲＮＡ。