KR19980703267A - 유전자발현 억제에 관련된 ｄｎａ분자 및 신규 단백질 - Google Patents

Abstract

p21X mRNA를 발현하고 있는 변이 프로바이러스에서 결실하고 있는 영역이고, 완전형 프로바이러스의 게놈에 존재하는 영역중에서, 인간 T세포백혈병 바이러스 I형(HTLV-I) 유래의 유전자발현 억제기능을 갖는 DNA분자 및 그 DNA분자를 함유하는 플라스미드를 제공한다. 더욱이 인간 T세포백혈병 바이러스 I형 유전자 LTR의 U5 영역에 존재하는 전사억제영역(U5RE)가 관여하는 전사억제활성 및 신경세포의 암화기구의 해명에 유용할 수 있고, U5RE에 특이적으로 결합하는 신규 단백질(TRP-1) 및 그 단백질의 구조유전자를 제공한다. 또한 그 유전자를 갖는 발현벡타, 그 발현벡타를 도입한 형질전환체 및 그 형질전환체를 이용하는 TRP-1 단백질의 제조방법을 제공한다.

Description

유전자발현 억제에 관련된 ＤＮＡ분자 및 신규 단백질

인간T세포 백혈병 바이러스 I형(human T-cell leukemia virus type I; HTLV-I)은 1980년에 인간에게서 처음으로 발견된 레트로바이러스이다. 이 바이러스의 감염이 성인T세포 백혈병(adult T-cell leukemia; ATL), HTLV-I 관련척수증(HAM), 열대성 경련성 마비증(TSP)등의 질환의 원인이 되고, 바이러스의 감염으로부터 평균 40~50년이라고 하는 장기간에 걸쳐서 체내에 잠복한 후에 발병하는 것이 밝혀져 왔다. 그러나 그 잠복감염 및 발병의 기구에 관해서는 거의 알려져 있지 않다.

HTLV-I의 유전자는 동물 레트로바이러스에 공통의 gag 영역, pol 영역 및 env 영역의 3개 영역 외에 tax/rex 영역을 갖고 있다. tax/rex 영역은 env 하류에 위치하고, 바이러스 유전자의 발현과 ATL의 발병에 중요한 역할을 하고 있다고 생각되고 있다. tax/rex의 mRNA는 HTLV-I의 유전자의 1차 전사산물에서 2단계의 스프라이싱을 받은 것이고, 오버랩하는 2개의 오픈리딩프레임을 가지고 있다. 1개의 오픈리딩프레임으로부터 40킬로달튼의 Tax라고 하는 단백질이 번역되고, 이 단백질은 바이러스 자신의 LTR과 세포의 여러 유전자의 프로모터에 작용하여 전사를 활성화한다. 다른 1개의 오픈리딩프레임으로부터는 27킬로달튼의 Rex라고 하는 단백질이 번역되고, 이 단백질은 전사 후에 핵내에서 일어나는 바이러스 RNA의 프로세싱을 조절하고, 스프라이싱을 받지 않은 mRNA의 세포질로의 이행에 긍정적으로 작용한다.

Rex 단백질과 같은 오픈리딩프레임 내의 다른 개시 코돈으로부터 21kD의 단백질 p21X이 번역된다. 발명자들은 이 p21X이 HTLV-I 유전자가 1단계의 스프라이싱을 받아서 제2엑손이 부족한 p21X mRNA로부터 번역되었다는 것을 밝혔다(Orita 등, FEBS Lett., 295, 127-134(1991)). 그러나 그 단백질의 기능에 관해서는 아직 불명확하다. 더욱이 발명자들은 이 p21X mRNA가 HTLV-I 감염세포주에 있어서, gag 로부터 pol, 더욱이 env 영역에 걸치는 광범위한 결실을 지닌 변이 프로바이러스에서 발현하고 있다는 것도 발견하였다(Orita 등, Nucleic Acids Res., 21, 3799-3807 (1993)). 또한 HTLV-I 감염자 말초혈 림프구에 있어서도, p21X mRNA가 상술한 바와 같은 변이 프로바이러스로 발현하고 있는 것을 발견하였다. 한편, 완전형 프로바이러스로부터의 tax/rex 영역의 mRNA의 발현은 HTLV-I 감염자 말초혈 중에 있어서는 거의 발견되지 않은 것이 알려져 있고, 생체내에서는 초고감도의 검출법인 RT-PCR 법으로만 검출된다. 그러나 그 발현은 감염자 말초혈 림프구를 실험관내의 배양계로 이전하면 용이하게 검출할 수 있을 정도로 높아진다는 것이 알려져 있다(Kiyokawa 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 8359-8363(1985)). 또한 p21X mRNA의 발현은 상기 감염자 말초혈 림프구의 배양 전후에 같은 정도인 것도 보이고 있다(Orita 등, J. Gen. Virol., 73, 2283-2289 (1992). 따라서 in vivo에는 tax/rex의 mRNA의 발현이 억제되어 있지만 p21X mRNA는 억제되는 것 없이 발현되는 것이라고 생각된다.

HTLV-I 및 RNA 바이러스의 일종인 인간 면역부전 바이러스(HIV)는 DNA 배열중의 스프라이싱 시그날을 적당하지 않은 것으로 함으로써 스프라이싱반응을 지연시키고, HTLV-I의 Rex 단백질 및 HIV의 Rev 단백질이 스프라이싱 반응을 억제하도록 시간적 유예를 갖게 한다고 생각되고 있다(Chang, D. D. 및 Sharp, P, A., Science, 249, 614-615(1990)). 그래서 Rex 단백질 및 Rev 단백질이 충분량 발현하고, 이들이 핵내에 축적하여 중합함으로써 초기에 그 기능이 발휘되어, RXE(Rex responsible element) 또는 RRE(Rev responsible element)를 갖는 바이러스 mRNA의 스프라이싱의 억제 및 세포질로의 이행을 촉진하고, 그 결과 바이러스의 복제(구조 단백질의 발현)을 일으킨다고 생각되고 있다(Inoue등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 84, 3653-3657(1987); Hidaka등, EMBO J., 7, 519-523(1988); Seiki등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 85, 7124-7128(1988); 및 Hanly등, Genes Dev., 3, 1534-1544(1989)).

상기와 같이 HTLV-I에 특유의 pX 영역으로부터 적어도 2개의 조절인자 Tax 및 Rex 단백질이 번역되고, 이들의 인자가 HTLV-I의 복제에 필요하다는 것이 나타나고 있다. Tax는 LTR(long terminal repeat)에 작용하는 전사활성화 인자이고, 더욱이 세포측의 여러 유전자를 활성화한다. 또한 Tax는 어느 종의 배양세포를 형질전환시키는 성질을 보인다. 이와 같이 HTLV-I에 의한 세포의 암화에 Tax가 관여하는 가능성이 시사되고 있다.

불현성 감염기의 HTLV-I 유전자의 발현은 대단히 낮고, ATL 발병 후에 있어서도 낮은 것이 알려져 있다. 거기에 HTLV-I의 잠복 감염의 메카니즘을 해명하기 위해서는 바이러스 유전자의 발현억제 기구를 조사하는 것이 중요하다고 생각된다. HTLV-I 유전자의 발현조절은 주로 HTLV-I의 LTR 상에서 행해지는 것이 알려져 있다. LTR 영역은 U3, R 및 U5로 불리우는 3개의 영역으로 세분된다. U3영역에는 Tax가 작용하는 배열, 또는 세포측의 전사활성화 인자인 CREB, ETS, AP1 등이 작용하는 배열이 존재한다. R 영역에는 YB-1이 결합해서 전사를 활성화하는 배열이 존재한다는 것이 알려져 있다(Kashanchi등, J. Virol., 68(1); 561-565(1994)). 또한 R 및 U5 영역에는 HTLV-I 유전자발현에 있어서 전사 레벨 및 전사후에 억제적으로 작용하는 영역이 있다.(Xu등, Mol. Cell. Bio1., 14(8); 5371-5383(1994); 및 Seiki등, Virology, 176; 81-86(1990)). 더욱이 발명자들은 최근 새롭게 U5 영역의 일부에서 전사억제 배열(U5 Repressive Element; U5RE)을 발견하였고, U5RE에 특이적으로 결합하는 110kDa, 80kDa 및 70kDa의 3개의 단백질의 존재를 보고하였다.(Okumura등, FEBS Let., 356; 94-100(1994)).

발명의 개시

본 발명자들은 인간T세포 백혈병 바이러스 I형의 유전자발현 억제기구를 해명하기 위하여 발현억제에 관련된 유전자 배열 및 단백질에 관해서 검토하였다.

본 발명자들은 우선 p21X mRNA를 발현하고 있는 인간T세포 백혈병 바이러스 I형(HILV-I)의 변이 프로바이러스에 결실하고 있는 영역이면서 동시에 완전형 프로바이러스의 게놈에 존재하는 영역중에서 바이러스 유전자의 발현을 억제하는 영역이 존재하는 것을 예상하고, 바이러스 게놈의 DNA 배열의 일부를 플라스미드에 결합해 넣고, CAT 유전자의 발현을 지표로 한 앗세이계를 이용해서 검토하였다. 그 결과 pol 영역중에 2개의 바이러스 유전자 발현억제영역을 발견하였다.

따라서 본 발명의 1개의 국면에는 p21X mRNA을 발현하고 있는 변이 프로바이러스에서 결실하고 있는 영역이며 완전형 프로바이러스의 게놈에 존재하는 영역중의 인간T세포 백혈병 바이러스 I형(HTLV-I) 유래의 유전자 발현 억제기능을 갖는 DNA분자 및 그 DNA분자를 포함하는 플라스미드가 제공된다.

본 발명의 유전자 발현 억제 기능을 갖는 DNA분자는 배열표의 배열번호 1의 2268위치의 C로부터 4080위치의 T까지 DNA 배열에 포함된, 연속한 적어도 400개의 핵산으로 이루어진 DNA 배열 또는 그 DNA 배열과 약 59% 이상의 상동성을 갖는 DNA 배열을 포함한다.

바람직한 실시형태에 의하면 상기 DNA 분자는 배열표의 배열번호 1의 2268위치의 C로부터 4080위치의 T까지 DNA 배열에 포함된 연속하는 적어도 400개의 핸삭으로 이루어진 DNA 배열 또는 그 DNA 배열과 약 59% 이상의 상동성을 갖는 DNA 배열이다.

바람직한 실시형태에 의하면 상기 DNA 분자는 배열표의 배열번호 1의 2268위치의 C로부터 3182위치의 G까지 DNA 배열 또는 그 DNA 배열과 약 59% 이상의 상동성을 갖는 DNA 배열을 포함한다.

바람직한 실시형태에 의하면 상기 DNA 분자는 배열표의 배열번호 1의 3368위치의 A로부터 3780위치의 A까지 DNA 배열 또는 그 DNA 배열과 약 59% 이상의 상동성을 갖는 DNA 배열을 포함한다.

바람직한 실시형태에 의하면 상기 DNA 분자는 배열표의 배열번호 1의 3165위치의 A로부터 4080위치의 T까지 DNA 배열 또는 그 DNA 배열과 약 59% 이상의 상동성을 갖는 DNA 배열을 포함한다.

본 발명의 플라스미드는 숙주세포내에서 활성을 갖는 프로모터 배열, 상기의 어딘가에 기재된 DNA 분자 및 RRE 또는 RXE 배열을 함유한다.

바람직한 실시형태에 의하면 상기 플라스미드는 치료 유전자배열을 더 포함한다.

바람직한 실시형태에 의하면 상기 플라스미드는 바이러스 감염세포에서 발현율을 높게 하는 프로모터 배열을 함유한다.

바람직한 실시형태에 의하면 상기 플라스미드는 상기 프로모터가 LTR이다.

바람직한 실시형태에 의하면 상기 플라스미드는 상기 치료유전자배열이 숙주세포에 대하여 독성일 수 있는 유전자 배열 또는 바이러스 복제를 저지할 수 있는 유전자배열이다.

본 발명의 DNA분자는 유전자 발현억제 또는 바이러스 감염병의 처치에 사용된다.

바람직한 실시형태에는 상기 바이러스 감염증은 인간T세포 백혈병 및 HIV감염증, 특히 AIDS이다.

또한 발명자들은 U5RE에 특이적으로 결합한 단백질에 관해서 여러 검사를 행한 결과 이 단백질 1개를 코드화하는 신규의 cDNA를 단리하였다. 대장균을 이용해서 이 유전자를 발현시켜 얻어진 산물이 DNA 결합 단백질의 Kruppel형 아연 핑거 도메인과 전사억제에 작용한다고 생각되는 Kruppel형의 전사억제인자에 공통적인 도메인을 갖는 단백질인 것을 발견하였다. 더욱이 이 단백질이 U5RE에 결합하여 전사억제에 작용하는 것을 발견하여 이를 TRP-1(Transcriptional Repressive Protein-1)이라고 명명하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 다른 국면으로는 인간T세포 백혈병 바이러스I형 유전자 LTR의 U5 영역에 존재하는 U5RE에 특이적으로 결합하고, 상기 종래기술과는 다른 단백질, 특히 Kruppel형의 전사억제인자에 공통적인 도메인 및 4개 반의 Kruppel형 아연 핑거 도메인을 함유하는 단백질이 제공된다. 더욱이 본 발명의 다른 국면으로는 상기 단백질의 구조 유전자; 그 유전자를 갖는 발현 벡타; 그 발현 벡타를 도입한 형질전환체; 및 그 형질전화체를 이용하는 인간T세포백혈병 바이러스 I형 유전자 LTR의 U5영역에 존재하는 전사억제영역에 결합하는 단백질의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 인간T세포 백혈병 바이러스 I형 유전자 LTR의 U5 영역에 존재하는 전사억제 영역에 결합하는 단백질(TRP-1)은 Kruppel형의 전사억제인자에 공통적인 도메인 및 4개 반의 Kruppel형 아연 핑거 도메인을 함유한다.

바람직한 실시형태에 의하면 상기 단백질은 상기 Kruppel형의 전사억제인자에 공통적인 도메인이 배열표의 배열번호 15의 196위치의 Val으로부터 261위치의 Trp 까지의 아미노산 배열 또는 그 유사의 배열이고, 그래서 상기 4개 반의 Kruppel형 아연 핑거 도메인이 배열표의 배열번호 15의 518위치의 Tyr로부터 648 위치의 His까지의 아미노산 배열 또는 그 유사의 배열이다.

바람직한 실시형태에 의하면 상기 단백질은 배열표의 배열번호 15의 154위치의 Leu로부터 185위치의 Leu까지 아미노산 배열, 배열표의 배열번호 15의 403위치의 Pro로부터 443위치의 Pro까지 아미노산 배열 및 배열표의 배열번호 15의 470위치의 Arg로부터 503위치의 Gly까지의 아미노산 배열 또는 이들의 아미노산 배열에 유사한 배열을 더 함유한다.

바람직한 실시형태에 의하면 상기 단백질은 배열표의 배열번호 15의 1위치의 Met로부터 688위치의 Ala까지의 아미노산 배열 또는 그 유사한 배열을 함유한다.

본 발명의 DNA분자는 상기의 어딘가에 기재된 단백질을 코드화한다.

바람직한 실시형태에 의하면 상기 DNA분자는 배열표의 배열번호 15의 724위치의 G로부터 921위치의 G까지인 염기 배열 및 배열표의 배열번호 15의 1690위치의 T로부터 2082위치의 C까지인 염기배열을 갖는다.

바람직한 실시형태에 의하면 상기 DNA분자는 배열표의 배열번호 15의 598위치의 C로부터 693위치의 G까지인 염기 배열, 배열표의 배열번호 15의 1345위치의 C로부터 1467위치의 G까지인 염기 배열 및 배열표의 배열번호 15의 1546위치의 C로부터 1647위치의 G까지인 염기 배열을 더 함유한다.

바람직한 실시형태에 의하면 상기 DNA분자는 배열표의 배열번호 15의 139위치의 A로부터 2202위치의 C까지인 염기 배열을 갖는다.

바람직한 실시형태에 의하면 상기 DNA분자는 배열표의 배열번호 15의 1위치의 C로부터 3776위치의 A까지인 염기 배열을 갖는다.

본 발명의 발현 벡타는 상기의 어딘가에 기재된 DNA분자를 갖는다.

본 발명의 형질전환체는 상기 발현 벡타를 숙주에 도입하여 얻어진다.

바람직한 실시형태에는 상기 숙주가 대장균이다.

본 발명의 인간T세포 백혈병 바이러스 I형 유전자 LTR의 U5 영역에 존재하는 전사억제 영역에 결합하는 단백질의 제조방법은 상기 형질전환체를 배양하는 공정 및 생산된 단백질을 배양배지로부터 회수하는 공정을 포함한다.

또한 본 발명은 상기 단백질을 유효성분으로 함유하는 항바이러스제를 제공한다. 본 발명의 항바이러스제는 HTLV-I에 대해 유효하고, 더욱이 인간면역부전 바이러스, 사이토메가로 바이러스등에 대해서도 유효하다.

더욱이 본 발명은 암의 검출방법을 제공한다. 이러한 본 발명의 방법은 상기 단백질의 발현을 지표로 하는 것이다.

본 발명은 유전자발현 억제에 관련된 DNA 분자 및 신규 단백질에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 인간T세포 백혈병 바이러스 I형 유래의 유전자 발현 억제 기능을 갖는 DNA 분자 및 그 DNA 분자를 함유하는 플라스미드에 관한 것이다. 또한 본 발명은 인간T세포 백혈병 바이러스 I형 유전자 LTR의 U5 영역에 존재하는 전사억제영역에 결합하는 단백질; 그 단백질의 구조유전자; 그 유전자를 갖는 발현 벡터; 그 발현 벡타를 도입한 형질전환체; 및 그 형질전환체를 이용하는 인간T세포 백혈병 바이러스 I형 유전자 LTR의 U5 영역에 존재하는 전사억제영역에 결합하는 단백질의 제조방법에 관한 것이다. 아울러 본 발명은 그 단백질을 함유하는 항바이러스제 및 그 단백질의 발현을 지표로 하는 암의 검출방법에 관한 것이다.

도1(a)는 HTLV-I 게놈의 각 영역의 요약을 나타내고, 도1(b)는 pRC/CMV-CAT 벡타의 CAT 유전자를 코드화하는 영역과 소의 성장호르몬 폴리 A 시그날(BGH pA)과의 사이에 HTLV-I 게놈의 각 영역을 결합하여 구축한 플라스미드를 나타낸다.

도2는 HTLV-I 게놈의 R1~R5 영역의 DNA배열을 각각 결합한 pRC/CMV-CAT 플라스미드를 트랜스팩트한 HeLa 세포에 관해서 CAT 활성 앗세이의 박층 크로마토 그램이다.

도3은 HTLV-I 게놈의 R6~R9 및 R21 영역의 DNA배열을 각각 결합한 pRC/CMV-CAT 플라스미드를 트랜스팩트한 HeLa 세포에 관해서 CAT 활성 앗세이의 박층 크로마토 그램이다.

도4는 HTLV-I 게놈의 R7~R9 영역의 DNA배열을 각각 결합한 pRC/CMV-CAT 플라스미드를 트랜스팩트한 HeLa 세포의, CAT 유전자를 주형으로 한 노젠블로팅의 결과를 나타낸다.

도5는 HTLV-I 게놈의 R7, R8 및 R21 영역의 DNA배열을 각각 결합한 pRC/CMV-CAT 플라스미드의 3'측 하류에 RXE를 센스(+) 또는 안티센스(-)에 결합한 플라스미드를 트랜스팩트한 HeLa 세포에 관해서의 CAT 활성 앗세이의 박층 크로마토그램이다.

도6은 HTLV-I 게놈의 R7, R8 및 R21 영역의 DNA배열을 각각 결합한 pRC/CMV-CAT 플라스미드의 3'측 하류에 RXE를 센스(+) 또는 안티센스(-)에 결합한 플라스미드를 트랜스팩트한 HeLa 세포의, CAT 유전자를 주형으로 한 노젠블로팅의 결과를 나타낸다.

도7은 HTLV-I 게놈의 R8을 5' 또는 3'측으로부터 결실시켜 얻어진 결실 변이 영역의 DNA배열을 결합한 pRC/CMV-CAT 플라스미드를 트랜스팩트한 HeLa 세포의 CAT 활성을 나타낸 그래프이다.

도8은 C413 또는 N413을 센스 또는 안티센스 방향으로 결합한 pRC/CMV-CAT 플라스미드를 트랜스팩트한 HeLa 세포에 관해서의 CAT 활성의 박층 크로마토그램이다.

도9는 HIV 감염증(예를 들면 AIDS)의 유전자 치료용 플라스미드 중의 구성 유닛을 나타내는 모식도이다.

도10은 본 발명의 TRP-1 단백질의 도메인 구조의 모식도이다.

도11은 본 발명의 TRP-1 단백질의 아연 핑거 도메인의 아미노산 배열의 보존적 배열의 비교를 나타낸다.

도12는 본 발명의 TRP-1 단백질과 Kid-1과의 KRAB-A 및 KRAB-B 도메인의 아미노산 배열의 비교를 나타낸다.

도13은 대장균을 사용해서 발현시킨 본 발명의 TRP-1 단백질의 겔 시프트 앗세이에 의한 결합 특이성 해석의 전기영동 결과를 나타낸다.

도14는 여러 배양세포에서의 본 발명의 TRP-1의 mRNA의 발현의 노젠블로팅 분석의 전기영동 결과를 나타낸다.

도15는 여러 배양세포에서의 본 발명의 TRP-1의 mRNA의 발현의 노젠블로팅 분석의 전기영동 결과를 나타낸다.

도16은 (A) 및 (B) 함께 각 조직에서의 본 발명의 TRP-1의 mRNA의 발현의 노젠블로팅 분석의 전기영동 결과를 나타낸다.

도17은 CAT 앗세이에서의 본 발명의 TRP-1 단백질의 U5RE에 대한 기능해석의 결과를 나타낸다.

발명을 실시하기 위한 형태

(I) 정의

이하에 본 발명을 설명하기위해 사용된 용어를 설명한다.

Kruppel형 아연 핑거 도메인이라는 것은 아연원자의 주위에 폴리펩티드 사슬이 포개어짐으로써 형성되고, 단백질 중의 구조적 도메인이며, 일반적으로 이 도메인은 DNA 결합 단백질 중에서 발견되고, 단백질과 DNA와의 결합에 관련된다고 생각된다(Witzgall등, Mol. Cell. Biol., 13(3):1933-1942(1993); Constantinou-Deltas등, Genomics, 12(3):581-9(1992); 및 Numoto등, Nucl. Acids Res., 21(16):3767-75(1993)). 예를 들면 본 발명의 인간T세포 백혈병 바이러스 I형 유전자 LTR의 U5영역에 존재하는 전사억제 영역(U5RE;U5 Repressive Element)에 결합하는 단백질(TRP-1)은 Kruppel형 아연 핑거 도메인을 4개 반 갖는다.

Kruppel형의 전사억제인자에 공통하는 도메인은 Kruppel형의 전사억제 단백질에 공통적으로 인지되는 도메인이고, DNA의 전사억제에 관여하고 있다고 생각되는 도메인이다(Witzgall등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91(10):4514-8(1994); 및 Margolin등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91(10):4509-13(1994). 이하 본 명세서 중에는 이 도메인을 KRAB-A,B도메인(Kruppel Associated box-A,B domain)이라고 칭한다.

아미노산 배열 또는 DNA 배열에서 유사의 배열이라는 것은 특정한 배열에 반드시 한정되야 하는 것은 아니고, 이 배열에 첨가하여 당업자에게 공지의 치환, 삽입, 결실 등을 포함해서 코드화하는 단백질의 기능 또는 활성이 실질적으로 같은 정도인 개변을 포함하는 배열을 말한다. 혹은 단백질의 기능 또는 활성이 실질적으로 같은 정도라면 화학적 또는 생화학적인 개변, 혹은 비천연 또는 유도화된 아미노산 또는 염기를 포함하고 있어도 좋다. 예를 들면 상기 TRP-1 단백질의 경우, 바람직하게는 천연형과 약 50% 이상의 유사성 또는 약 35% 이상의 상동성을 갖는다. 더욱 바람직하게는 천연형과 약 70%이상의 유사성 또는 약 50%이상의 상동성, 더욱 더 바람직하게는 각각 약 80% 이상, 약 65% 이상을 갖는다. 여기에 유사성이라는 것은 아미노산을 이하의 A~E의 5개의 군으로 나누고, 각 군내의 아미노산을 동일하게 계산한 경우의 유사배열중에서 비교하고자 하는 배열에 대한 동일한 아미노산의 비율(%)이다. A군: Ala, Ser, Thr, Pro 및 Gly; B군:Asn, Asp, Glu 및 Gln; C군:His, Arg 및 Lys; D군:Met, Leu, Ile 및 Val; 및 E군:Phe, Tyr 및 Trp, 또한 아미노산 배열중의 상동이라는 것은 모두 같은 아미노산만을 동일한 것으로 하여 계산한 경우의, 유사 배열중에서 비교하려는 배열에 대한 동일한 아미노산의 비율(%)이다. 더욱이 DNA 배열의 상동성이라는 것은 특정의 배열에 반드시 한정되는 것은 아니고 이 배열에 첨가하여 당업자에게 공지의 치환, 삽입, 결실등을 포함하고 특히 이 DNA 배열이 갖는 기능, 예를들면 HTLV-I의 유전자발현 억제 기능이 실질적으로 동일한 정도인 개변을 포함하는 배열을 말한다.

(II) 본 발명에 사용할 수 있는 방법

본 발명의 각 공정에 있어서 이용할 수 있는 일반적인 생화학적 실험 또는 분자생물학적 실험방법(DNA의 전기영동, 전기영동 분리한 DNA를 겔 중으로부터 회수하는 방법, 라이게이션, 숙주의 형질전환, 조환숙주의 배양, 플라스미드 DNA의 조제, DNA의 제한효소에 의한 절단, DNA의 방사표지 등)은 예를들면 Molecular Cloning 제2판(Maniatis등, Cold Spring Harbor laboratory, New York(1989))에 기재되어 있는 바와 같이 당업자에게 공지의 방법이 채용되고 있다.

A. HTLV-I 유래의 유전자발현 억제기능을 갖는 DNA분자의 검토

(1) HTLV-I 게놈 상의 여러 영역을 포함하는 플라스미드의 구축

HTLV-I 감염세포주로서는 예를들면 MT-1, MT-2, MT-4, TL-Su, H583이 이용되고, 그 외에 ATL 환자 유래 말초백혈구가 이용될 수 있다. 이들의 세포를 배양하거나 또는 배양시키지 않고 세포로부터 전체 RNA의 추출이 산구아니디움티오시아네이트페놀클로로포름 추출법에 의해 행해진다. 추출한 RNA를 랜덤 헥사뉴클레오티드 프라이머와 아닐시킨 후, 역전사효소와 반응시킴으로써 cDNA가 조제된다.

우선 HTLV-I 게놈의, 예를 들면 도1(a)에 R1등에 나타낸 바와 같은 적당한 길이로 설정한 여러 영역을 포함하는 DNA배열은 HTLV-I의 게놈 DNA를 주형으로 하여 원하는 영역에 적절한 합성 프라이머 세트를 이용해서 공지의 PCR법에 의해 얻을 수 있다. 프라이머에는 다음의 서브클로닝에 사용될 수 있도록 5'측에 Not 1부위, Hind III부위, Apa I부위, Xba I부위등의 제한효소부위가 포함되어 있어도 좋다. 또한 HTLV-I 게놈 상의 각 영역은 화학적 또는 생화학적으로 개변될 수 있든가, 혹은 비천연 또는 유도화된 염기를 포함하고 있어도 좋다. 천연에 존재하는 DNA배열 이외의 배열을 함유하는 조환 DNA 배열도 또한 본 발명에 의해 제공된다. 천연형 DNA배열 대체형도 또한 제공되고, 여기에는 결실, 삽입, 1개 이상의 염기의 치환에 의한 것을 함유하는 것에 의해 한정되지는 않는다. 바람직하게는 천연형과 59%이상의 상동성을 갖는다.

PCR법에 의해 증폭한 각 영역을 포함하는 DNA 배열은, 예를 들면 겔에서 분리해서 회수하고, 제한효소를 이용해서 원하는 부위를 절출한 후, 프로모터, 발현을 조절하려고 하는 유전자 배열등이 결합된 또는 결합될 수 있는 적절한 발현 벡타 중에 결합될 수 있다. 바람직하게는 프로모터, HTLV-I의 발현 억제 영역, RXE 또는 RRE 등이 포함되도록 설계될 수 있다. 더욱 바람직한 것은 프로모터, 치료유전자배열, HTLV-I의 발현억제 영역, RXE 또는 RRE등이 포함되어 있도록 설계될 수 있다. 또는 목적에 따라서 프로모터의 5'상류에 결합하고, 또는 적절한 위치에 안티센스 방향으로 결합하는 것도 가능하다.

발현벡타로서는 진핵세포 발현 벡타를 이용해서, 이들의 발현 벡타를 트랜스팩트하는 세포로서는 포유류세포(예를 들면, HeLa세포, Jurkat세포, COS세포, CHO세포등)이 바람직하므로 이들의 선택된 세포주에서 발현가능한 벡타를 이용한다. SV40계 벡타, 소의 파필로마바이러스벡타, 헤르페스바이러스벡타, 아데노바이러스벡타, 폭스바이러스벡타, 레트로바이러스벡타 등의 포유류세포의 발현벡타를 이용할 수 있다. 바람직하게는 레트로바이러스벡타를 이용해서 Jurkat세포에 트랜스팩트할 수 있다.

프로모터로서는 공지의 것은 무엇이든 사용할 수 있고, 바이러스 감염세포에서 발현율을 높일 수 있는 프로모터가 바람직하다. 포유류 세포에 있어서 발현할 수 있는 프로모터는 예를 들면 사이토메가로바이러스 초기 프로모터(CMV), 바이러스성 LTR(long termanal repeat, 예를 들면 HTLV-I LTR, 라우스육종바이러스 LTR, HIV-LTR), SV40 초기프로모터 및 단순 헤르페스 티로신키나제 바이러스 프로모터가 포함된다. 바람직하게는 바이러스성 LTR, CMV이고 가장 바람직한 것은 바이러스성 LTR이다.

발현을 조절하려고 하는 유전자 배열로서는 목적에 따라서 여러 가지의 유전자 배열도 이용할 수 있다. 예를 들면 HTLV-I 게놈의 각 영역의 발현억제활성을 검토하는 목적으로는 그 유전자 배열에 의해 코드화하는 단백질이 발현되고, 쉽게 검출할 수 있는 유전자가 이용될수 있다. 예를 들면 클로람페니콜아세틸트랜스퍼라아제(CAT)유전자, 루시퍼라아제(Luc)유전자등이 이용될 수 있다. 또한 감염세포를 공격하는 목적 또는 바이러스 복제의 저지의 목적에는 감염세포(감염숙주세포)내에서 소정의 생물활성을 발휘할 수 있는 유전자 배열이 이용될 수 있다. 감염세포에 대해서 독성을 갖는 유전자 배열 또는 바이러스 복제를 저지할 수 있는 유전자 배열은 치료유전자로서 해당 분야에서 공지이다. 감염세포에 대해서 독성을 가질 수 있는 유전자로서는 독성유전자를 예로 들 수 있는 바, 디프테리아톡신 A 프래그먼트(DT-A)유전자, 단순 헤르페스티미딘키나아제(HSTK)유전자 등이 있다. 바이러스 복제를 저지할 수 있는 유전자로서는, 예를 들면 안티센스핵산, 리포자임, 데코이, 트랜스도미넌트뮤탄트 등이 포함된다.

RXE 또는 RRE는 후술한 바와 같이 본 발명의 HTLV-I의 유전자발현 억제영역의 기능을 해제하는 영역이다. 이들의 영역에 작용하는 Rex 또는 Rev 단백질이 각각 발현하고 있는 HTLV-I 또는 HIV-I 감염세포에는 유전자발현 억제기능에 대한 해제기구가 작용하고, 상기 치료유전자가 발현할 수 있다. 더욱이 RXE 또는 RRE는 각각 HTLV-I 또는 HIV-I 유래의 영역만큼은 아니고 예를들면 HTLV-II, HIV-II등의 RXE, RRE등이어도 좋다.

더욱이 mRNA의 3' 말단에 존재하는 폴리 A를 부가하기 위하여 폴리 A 시그날이 도입될 수 있고, 예를 들면 소의 성장 호르몬의 폴리 A 시그날(BGHpA), SV40의 폴리 A 시그널(SV40pA)이 이용될 수 있다.

상기의 프로모터등의 배열을 갖는 발현벡타도 또한 HTLV-I 게놈중의 억제영역을 검색하기 위한 목적에 알맞도록 시판중인 벡타에서 선택해도 좋다. HTLV-I 게놈 중의 억제영역을 검색하기 위해서는, 예를 들어 pRC/CMV-CAT 벡타(Invitrogen사제)을 이용될 수 있다. 이와 같은 발현벡타에, 예를 들면 도1(b)에 나타낸 바와 같은 Not I부위에 DNA 라이게이션 키트(Takara Shuzo사제)를 이용해서 HTLV-I 게놈의 각 영역을 결합하여 플라스미드를 구축할 수 있다. 얻어진 각 플라스미드에 대해서, 예를 들어 T7 시퀀싱 키트(Pharmacia 사제)을 이용해서 염기배열을 조절하고, 소정의 것임을 확인할 수 있다. 이들 플라스미드는, 예를들어 E.coli JM109주를 형질전환하여 배양하고, 염화 세슘 밀도구배 원심분리를 행함으로써 정제할 수 있다.

(2) DNA 트랜스팩션

상기 (1)항에서 얻어진 각 플라스미드에서 이하와 같이하여 적당한 세포를 트랜스팩트할 수 있다. 예를 들면 상기 플라스미드 및 루시퍼라아제(Luc) 유전자를 갖는 pRC/CMV-Luc 벡타(CMV-Luc)를 함유하는 혼합물을, HeLa 세포 또는 Jurkat 세포등에 공지의 방법(예를들면 리포펙틴(GIBCO BRL)법)을 따라서 트랜스팩트한다. 트랜스팩트한 세포를 배양한 후, 라이세트를 조제하고, 원심분리하여 상청을 얻는다. 이 상청에 대해서 CMV-Luc 유래의 루시퍼라아제 활성을 공지의 방법(예를들면 피카진 키트(동양잉크사제)을 이용하는 루마토 모델 LB9501(Berthold사제)에 의한 방법)에 의해 측정하여 이 결과를 트랜스팩션 효율을 보정하기 위해 이용할 수 있다.

(3) CAT 앗세이

상기 2항에서 얻어진 상청에 대해서, 예를 들어 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제(CAT)유전자를 함유하는 플라스미드에서 트랜스팩트하는 경우 그 분야의 공지의 방법(Fordis 등, Methods in Enzymology, 151, 382-397(1987)) 에 의해 CAT 활성을 측정할 수 있다. 예를들면, 상청에¹⁴C으로 방사표지를 한 클로람페니콜 및 아세틸 CoA를 가하고 배양한다. 다음으로 초산에틸을 이용해서 추출한 후 농축하고, 박층 크로마토그램(TLC) 플레이트에 스폿한다. 이것을 클로로포름:메탄올=95:5의 전개용매에서 포화시킨 전개조에서 전개하고, 예를들어 BioImage 분석기(Fujix사제) 부속의 이미징 플레이트에 1시간 접촉시켜, X선 필름에 인쇄한다. 이와 같이 하여 발현한 CAT에 의해 아세틸화된 클로람페니콜의 비율을 결정할 수 있다. 아세틸화클로람페니콜은 클로람페니콜보다도 지용성이 높으므로 순상TLC 플레이트상에서의 Rf값이 크다. 이 앗세이에 의한 CAT활성이 높을수록 결합된 영역의 발현억제활성이 낮고, 역으로 CAT활성이 낮을수록 발현억제활성이 높은 것을 나타낸다.

(4) HTLV-I게놈으로부터 전사된 RNA양의 확인

HTLV-I 게놈의 각 영역을 포함하는 플라스미드로부터 전사된 RNA의 양은 이하와 같이 노젠블로팅하여 분석할 수 있다. 각 플라스미드에 적당한 세포를 트랜스팩트하고, 모든 RNA를 추출한다. 다음으로 RNA를 아가로스포름알데히드겔에서 전기영동하고, 멤브레인(예를들면 나이론막, 니트로셀룰로스막)에 블로팅한다. 예를 들어 CAT유전자를 함유하는 플라스미드의 경우 CAT유전자를 주형으로 해서³²P등으로 표지를 한 프로브와 하이브리다이즈함으로써 X선 필름을 사용하여 CAT RNA양을 검출할 수 있다. CAT RNA양이 많은 경우는 전사 레벨에서 억제되어 있지 않은 것을 알 수 있다.

(5) 결실 변이 영역을 갖는 플라스미드의 구축

높은 억제 활성을 나타내는 영역에 대해서, 그 억제활성의 중심부를 찾기위하여 그 영역을 5'측, 3'측의 쌍방향으로 결실시켜 얻어진 아영역을 갖는 플라스미드를 구축할 수 있다. 우선 영역을 5'측으로부터 결실시키기 위해 이를, 예를 들면 Not I으로 절단한 후 평골 말단으로 하여, 더욱이 그 영역내의 Eco NI 부위로 절단한 것을, 예를 들면 deletion 키트(Takara Shuzo사제)로 결실시킬 수 있다. 한편 3'측으로부터의 결실도, Apa I 및 Xba I으로 절단한 후, deletion 키트로 결실시킬 수 있다. 이와 같이 하여 얻어진 결실 변이영역을 벡타에 결합한다. 얻어진 플라스미드의 CAT활성을 측정하여 CAT활성의 억제에 최저로 필요로 하는 영역을 검색할 수 있다. 억제활성의 중심부에 있으면 그 일부가 결실함으로써 CAT활성이 억제되지 않는 것으로부터 활성중심부를 알 수 있다.

(6) 유전자 발현억제기구의 해명

이하의 실시예로부터 알 수 있는 것처럼 p21X mRNA를 발현하고 있는 변이 프로바이러스에서 결실하고 있는 영역이고, 완전형 프로바이러스의 게놈에 존재하는 영역 중에 HTLV-I 유래의 유전자발현 억제기능을 갖는 DNA 배열이 존재한다. 이 HTLV-I 유래의 유전자발현 억제영역은 생체내에서 바이러스 유전자의 발현을 억제함으로써 면역기구에 의한 배제로부터 바이러스 감염세포를 도피시킬 수 있고, HTLV-I의 잠복감염기구에 있어서 중요한 역할을 완수할 수 있다. 더욱이 이 유전자발현 억제작용은 충분량의 Rex 단백질의 발현에 의해 해제될 수 있고, 바이러스의 복제를 효율적으로 잘 일으키는 기서로서도 중요한 역할을 완수하고 있다고 생각된다.

B. HTLV-I 유전자의 전사억제영역에 결합하는 단백질의 검토

(1) TRP-1의 cDNA의 클로닝

본 발명의 단백질인 TRP-1을 코드화하는 DNA를 함유하는 DNA단편의 클로닝을 배열결정방법과 함께 이하에 예시한다. 이 DNA단편의 배열은, 예를들어 U5RE를 여러개 연결시킨 DNA를 프로브로서 급성 림파성 백혈병환자 말초혈 유래의 세포주인 Molt-4세포, Jurkat 세포, CEM세포등의 cDNA 라이브러리를 스크리닝하고, 스크리닝에 의해 얻어진 DNA를 DNA 시퀀싱에 의해 분석함으로써 결정할 수 있다.

(1.1) DNA 프로브의 작성

본 발명의 단백질인 TRP-1은 U5RE에 결합하는 것으로부터 TRP-1을 사우스웨스턴법으로 스크리닝하기위한 프로브로서는 U5RE에 적당한 DNA배열을 갖는 프로브를 사용할 수 있다. 이 프로브는 예를 들면 이하와 같이 작성할 수 있다. 우선 U5RE를 함유하는 것처럼 합성된 DNA단편을 정제하고, 열변성시킨 후 이본쇄 DNA로 한다. 다음으로 얻어진 이본쇄 DNA의 라이게이션을 행하고 U5RE가 여러개 연결된 배열을 함유하는 이본쇄 DNA로 한다. 이를 적당한 플라스미드(예를 들면 pSL1180, pUC118, pU19)에 결합한 후 PCR 증폭용의 주형으로서 사용한다. PCR을, 예를들어 방사표지용의³²P-dCTP 존재하에 행함으로써 사우스웨스턴법에 사용하기 위한 프로브를 작성할 수 있다.

(1.2) 라이브러리의 스크리닝

TRP-1을 코드화하는 DNA를 스크리닝하기 위한 라이브러리로서 급성 림파성 백혈병환자 말초혈 유래의 세포주인 Molt-4세포, Jurkat 세포, CEM 세포 등의 다양한 라이브러리를 이용할 수 있다. 예를들면 인간급성 림파성 백혈병 세포주 Molt-4의 pSport 1의 cDNA라이브러리는 이하와 같이 하여 작성할 수 있다. 우선, Molt-4 세포로부터 구아니딘티오시아네이트법(Chomczynski등, Anal. Biochem. 162, 156-159(1987))에 의해 RNA를 추출할 수 있다. 이 RNA로부터, 예를 들어 Oligotex(Takara Shuzo사제), Oligo dT Agarose 칼럼을 사용해서 mRNA을 얻고, 이 mRNA로서, 예를 들면 Superscript cDNA합성 시스템을 사용해서 cDNA 및 적절한 발현벡타에 결합한 cDNA 라이브러리를 작성할 수 있다.

다음으로, 얻어진 cDNA 라이브러리를 적당한 숙주, 예를 들면 대장균에 도입하여 페트리디쉬에 뿌리고, 이를 니트로셀룰로오스막등의 적당한 막에 접촉시킨 후 배양하여 단백질을 발현시킨다. 이와 같이 하여 조제한 니트로셀룰로오스막상에 고정시킨 cDNA로부터 생성된 단백질과 상기의 프로브와의 DNA결합활성을 지표로 하여 스크리닝을 할 수 있다.

더욱이 상기 스크리닝으로 얻어진 cDNA 클론으로 조제한 cDNA 단편을 프로브로 하여 cDNA 라이브러리를 코로니 하이브리디제이션, 플레이크 하이브리디제이션 등에 의해 스크리닝할 수 있다.

(1.3) 클론의 염기배열의 결정

라이브러리를 스크리닝하여 얻어진 클론의 삽입단편의 염기배열의 결정은, 예를 들어 디데옥시법(Sanger, Science, 214, 1205-1210(1981))에 따라 행할 수 있다. 이와 같은 클론을 해석하여 얻어진 TRP-1의 DNA배열 및 아미노산 배열을 배열표의 배열번호 15에 나타낸다.

(2) 재조합 TRP-1의 발현 및 U5RE과의 결합해석

본 발명의 TRP-1을 코드화하는 유전자는 적당한 벡타, 예를 들어 pRSET, pAM82, pCDM8 등에 결합되어, TRP-1을 발현시키기 위한 발현벡타로 된다.

이 발현벡타를, 예를 들어 세균, 효모, 곤충세포 또는 동물세포에 도입하여 형질전환체가 작성된다. 이 형질전환체를 배양함으로써 본 발명의 TRP-1이 생산될 수 있다.

예를 들면 pRSET의 KpnI-NotI 부위에 본 발명의 TRP-1 유전자를 도입하고, 그 유전자를 함유하는 발현벡타를 작성하고, 이를 대장균 BL12주에 도입함으로써 형질전환체를 작성할 수 있다. 이 형질전환체는 올리고히스티딘을 아미노 말단에 갖는 융합단백질로서 발현될 수 있다. 이와 같이 하여 얻어진 TRP-1 산생배양물은 아피니티 칼럼법으로 정제될 수 있다.

TRP-1과 U5RE와의 결합해석은 예를들면 아래와 같이 행할 수 있다.³²P로 표지를 한 U5RE DNA와 정제한 상기의 재조합 TRP-1을 결합반응용 완충액 중에서 poly d(I-C) 존재하에서 반응시켜, 그 반응액을 폴리아크릴아미드겔로 전기영동하고, 이를 여과지상에서 건조시킨 후 오토라디오그래피에 의해 해석할 수 있다.

(3) TRP-1의 조직분포의 확인

본 발명의 TRP-1의 조직분포는, 예를 들어 mRNA의 발현 또는 TRP-1의 발현을 분석함으로써 확인할 수 있다. mRNA의 발현에 대해서는 cDNA를 이용해서 노젠블로트 분석에 확인할 수 있다. TRP-1의 발현에 대해서는 TRP-1에 대한 항체를 작성한 후 웨스턴 블로트 분석에 의해 확인할 수 있다.

(4) TRP-1의 기능해석

TRP-1은 U5RE에 결합하여 전사억제에 관여한다고 생각되므로 그 기능해석은 아래와 같이 행할 수 있다. 예를 들면 TRP-1이 발현되도록 결합한 발현벡타와 U5RE 유전자 및 발현의 지표가 될 수 있는 유전자가 결합된 발현벡타를 적당한 세포에 동시에 도입한다. 이를 배양하여 지표가 되는 유전자의 발현을 측정함으로써 TRp-1이 U5RE를 중개해서 발현을 억제하는가의 여부를 확인할 수 있다.

발현의 지표가 될 수 있는 유전자로서는 그 유전자 배열에 의해 코드화하는 단백질의 발현이 쉽게 검출될 수 있는 유전자를 이용할 수 있다. 예를들면 클로람페니콜아세틸트랜스퍼라아제(CAT)유전자, 루시퍼라아제(Luc)유전자등이 이용될 수 있다.

실시예 1

(1) HTLV-I 게놈상의 각 영역의 유전자 발현 억제작용의 유무를 해석하기 위한 플라스미드의 구축

유전자발현 억제작용의 유무를 해석한 HTLV-I 게놈상의 각 영역은 도1 중에 나타낸바와 같이 R1(배열표의 배열번호 1의 1351~3182), R2(배열표의 배열번호 1의 3165~4984), R3(배열표의 배열번호 1의 4951~6635), R4(배열표의 배열번호 1의 2268~4078), R5(배열표의 배열번호 1의 4061~5782), R6(배열표의 배열번호 1의 1351~2268), R7(배열표의 배열번호 1의 2268~3182), R8(배열표의 배열번호 1의 3165~4080) 및 R9(배열표의 배열번호 1의 4061~4984)이다. 변이 프로바이러스에서 결실하고 있지 않기 위한 억제작용이 없다고 생각되는 영역 R21(배열표의 배열번호 1의 7302~8201)을 비교를 위해 네가티브컨트롤로서 사용하였다. 이제 뉴클레오티드의 염기번호 및 조성은 공표되어 있는 HTLV-I ATK 클론의 것을 이용하였다(Seiki 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 80, 3618~3622(1983)). 도1(a)는 HTLV-I 게놈의 각 영역의 개략을 나타내고, 장방형으로 표시된 부분은 HTLV-I의 LTR 및 각 구성유전자를 나타낸다. ▼은 스프라이스 도너 시그날을, ▲은 스프라이스 억셉터 시크날을 표시한다. 도1(b)는 HTLV-I 게놈의 일부를 결합하여 유전자발현 억제작용을 조사하기 위한 플라스미드 pRC/CMV-CAT의 개략도이고, P_CMV는 CMV 프로모터를, BGHpA는 소의 성장호르몬 폴리A 시그날을 표시한다. 도1(b)의 파선부는 이 위치에 HTLV-I 게놈상의 유전자 배열이 결합될 수 있다는 것을 표시한다.

HTLV-I 게놈의 각 영역은 HTLV-I 감염세포주 TL-Su의 게놈 DNA를 주형으로서, 아래의 표1에 나타낸 프라이머를 합성하고, 이들을 결합시켜 이용하고 PCR법으에 의해 얻었다. 각 프라이머와도 후의 서브클로닝에 사용할 수 있는 것 처럼 5'측에 Not I부위를 설치하였다.

증폭영역	사용한 플라이마
R1영역	1351FN(배열번호 2)	3182RN(배열번호 8)
R2영역	3165FN(배열번호 4)	4984RN(배열번호 10)
R3영역	4951FN(배열번호 6)	6635RN(배열번호 12)
R4영역	2268FN(배열번호 3)	4078RN(배열번호 9)
R5영역	4061FN(배열번호 5)	5782RN(배열번호 11)
R6영역	1351FN(배열번호 2)	2268RN(배열번호 7)
R7영역	2268FN(배열번호 3)	3182RN(배열번호 8)
R9영역	4061FN(배열번호 5)	4984RN(배열번호 10)
R21영역	7302FN(배열번호 13)	8201RN(배열번호 14)

HTLV-I 게놈의 각 영역을 증폭하기 위해 PCR 반응을 아래와 같이 행하였다. HTLV-I 감염 T세포주 TL-Su의 게놈 DNA 0.5㎍, 각 프라이머 100pmol/튜브, 10×PCR 반응완충액 10㎕, AmliTaq DNA 폴리머라아제 5유닛 및 최종 농도 200μM의 dNTP를 튜브에 넣고 최종적으로 멸균증류수로 100㎕로 하였다. 반응은 94℃에서 5분간 처리한 후, 94℃에서 1분, 50℃에서 1분, 72℃에서 2분의 반응 사이클을 30회 반복하고, 그후 72℃에서 7분간 행하였다. 증폭한 각 영역을 아가로스겔상에서 분리한 후, 절출하여 Takara Shuzo사제의 SUPREC-01을 사용하여 회수하였다. 정제한 각 영역의 DNA 프래그먼트는 Not I 제한효소(Takara Shuzo사제)에서 처리한 후 pRC/CMV-CAT벡타(Invitrogen사제, 이하 CMV-CAT)의 Not I부위에서 DNA 라이게이션키트(Takara Shuzo사제)를 이용해서 결합하고, 상기 표1에 나타낸 각 영역의 DNA 배열을 함유하는 플라스미드를 얻었다.(각각 CMV-CAT-R1, CMV-CAT-R2, CMV-CAT-R3, CMV-CAT-R4, CMV-CAT-R5, CMV-CAT-R6, CMV-CAT-R7, CMV-CAT-R9 및 CMV-CAT-R21이라 칭한다) R8영역의 DNA 배열을 함유하는 플라스미드인 CMV-CAT-R8은 R2의 대략 중앙에 존재하는 Xba I부위(배열표의 배열번호 1의 염기번호 4080)과 CMV-CAT의 Not I부위의 바로 3'측에 인접한 Xba I부위와를, Xba I(Takara Shuzo사제)을 이용해서 절단하고, R2의 3'측의 약 1/2의 영역을 취하여 제거한 후 자기접합하여 얻었다.

R7, R8 및 R21의 3'측 직하류에 RXE(Rex responsible element)를 결합한 플라스미드(CMV-CAT-R7-RXE, CMV-CAT-R8-RXE 및 CMV-CAT-R21-RXE)는 TL-Su 세포 게놈 DNA를 주형으로서 PCR법에 의해 얻어진 RXE(배열표의 배열번호 1의 염기번호 319~620)(Toyoshima 등, J.Virol., 64, 2825-2832(1990))를 CMV-CAT-R7, CMV-CAT-R8 및 CMV-CAT-R21의 Apa I 부위 또는 Xba I부위에 결합한 것에 의해 얻었다. pRC/CMV-루시퍼라아제(이하, CMV-Luc)는 pRC/CMV 벡타의 Hind III 부위에 pGV-C 벡타 플라스미드(동양잉크사제)를 주형으로 하는 PCR법으로 얻어진 루시퍼라아제 유전자를 결합한 것에 의해 얻었다. 더욱이 SRα-rex 플라스미드는 pCD-SRα 벡타에 rex cDNA를 결합함으로써 얻었다.(Orita등, J. Gen. Virol., 73, 2283-2289(1992))

각 플라스미드에 대해서 T7시퀀싱키트(Pharmacia사제)를 이용해서 염기배열을 조사하고, 소정의 것임을 확인하였다. 각 플라스미드에서 형질전환한 E.coli JM109주의 각각을 200ml의 2YT 배지에서 16시간, 37℃에서 배양하고 일반적인 방법으로 염화세슘 밀도구배 원심분리를 2회 행함으로써 정제하였다.

(2) CAT 앗세이에 의한 게놈상의 각 영역의 유전자발현 억제활성의 유무의 검토

친벡타인 CMV-CAT 2㎍ 및 같은 몰수의 상기 (1)항에서 얻어진 각 플라스미드를 각각 튜브에 넣고, 각 튜브에 1㎍의 CMV-Luc 및 pBluescript 벡타를 가해서 각 튜브의 플라스미드 양을 동일하게 하였다. 다음으로 TE 완충액을 가하여 동일한 양으로 하고, 최종중량이 100㎕가 되도록 Opti-MEM 배지(GIBCO BRL사제)를 가하였다. 리포펙틴 시약(GIBCO BRL사제) 15㎕와 Opti-MEM배지 85㎕을 혼합한 것을 상기 튜브에 가하고 실온에서 15분간 방치하였다. 이 혼합액을 6 웰디쉬 중의 HeLa 세포(3×10⁵/웰) 또는 Jurkat 세포(3×10⁵/웰)(이들은 3ml의 Opti-MEM 배지중)의 각각에 가하고 트랜스팩트하였다. HeLa 세포에는 6시간 후, Jurkat 세포에는 16시간 후에 배지를 통상의 함혈청배지(HeLa 세포에는 E-MEM+10% 열불활성화 소의 태아혈청, Jurkat 세포에는 RPMI+10% 열불활성화 소의 태아혈청)로 교환하고, 48시간 배양하였다. 그 후, 각세포를 모아서 300㎕의 Reporter lysis 완충액(Stratagene 사제)으로 라이세트를 제조하였다. 이들의 라이세트를 1200rpm으로 5분간 원심분리하고, 상청을 취해서 그 일정량을 피카진키트(동양잉크사제)를 이용해서 루마트(Belthord사제)에 의해 CMV-Luc 유래의 루시퍼라아제 활성을 측정하였다.

이 결과를 기초로 트랜스팩션 효율을 보정하고 CAT활성 측정에 이용하는 상청양을 결정하였다. 다음으로 결정량의 상청을 튜브에 취하고, ×1 Reporter lysis 완충액으로 122㎕로 하였다. 여기에¹⁴C-클로람페니콜(New England nuclear사제) 및 아세틸 CoA(4mM) 20㎕을 가하고, 혼화시킨후 37℃에서 1시간 방치하였다. 다음으로 500㎕의 초산에틸을 이용해서 추출한 후, 원심감압증류기로 농축하고, TLC 플레이트(DC-Alufolien Keiselgel 60 F254, MERCK사제)에 스폿하였다. 이를 클로로포름:메탄올=95:5의 전개용매로 포화시킨 전개조에서 전개했다. 그리고 BioImage 분석기(Fujix사제)부속의 이메징 플레이트에 1시간 접촉시켜 X선 필름(XAR5, 코닥사제)으로 인쇄하였다. 클로람페니콜 및 아세틸화 클로람페니콜에 상당하는 Rf값의 방사 활성으로부터 아세틸화의 비율을 결정하였다.

우선, p21X mRNA을 발현하는 HTLV-I 감염세포주 중의 결실형 바이러스에 있어서 결실하고 있는 것과 거의 같은 영역인 R1~R5의 5개의 영역에 대해서 그 유전자발현 억제활성의 유무를 HeLa세포를 이용해서 CAT 유전자의 발현을 지표로 한 앗세이계로 검토하였다. 그 결과를 도2에 나타낸다. 각 레인은 각각 CMV-CAT 2㎍의 몰수에 상당하는 양의 CMV-CAT-R1(레인1), CMV-CAT-R2(레인2), CMV-CAT-R3(레인3), CMV-CAT-R4(레인4), CMV-CAT-R5(레인5) 및 CMV-CAT(레인 C)를 트랜스팩트한 HeLa 세포의 CAT활성을 나타내고, 하부의 수자는 클로람페니콜의 아세틸화의 비율(%)을 나타내고 있다. CMV-CAT-R1, CMV-CAT-R2 및 CMV-CAT-R4를 트랜스팩트한 HeLa세포에는 CAT 활성이 현저하게 낮은 것에서 R1, R2 및 R4 영역이 강한 억제활성을 보여주는 것을 알았다. 또한 R3영역도 중간 정도의 억제활성을 나타내었다.

따라서 R1, R2 및 R4에 걸치는 영역을 4개의 영역으로 분할한 R6~R9영역(도1(a)참조)의 억제활성에 대해서 검토하였다. 결과를 도3에 나타낸다. 각 레인은 각각 CMV-CAT 2㎍의 몰수에 상당하는 양의 CMV-CAT-R6(레인 1), CMV-CAT-R7(레인 2), CMV-CAT-R8(레인 3), CMV-CAT-R9(레인 4), CMV-CAT-R21(레인 5) 및 CMV-CAT(레인 C)를 트랜스팩트한 HeLa 세포의 CAT활성을 나타내고, 하부의 수자는 아세틸화의 비율(%)을 나타내고 있다. CMV-CAT-R7 및 CMV-CAT-R8을 트랜스팩트한 HeLa세포에는 CAT활성이 낮고, R7 및 R8 영역이 강한 억제활성을 나타내는 것을 알았다. 그러나 네가티브컨트롤로 한 p21X mRNA에 전사된 R21영역, 또는 R6 및 R9 영역에는 억제활성이 보이지 않거나 대단히 약했다.

따라서 R1영역의 억제활성은 R7영역에 유래하고, R2영역의 억제활성은 R8 영역에, R4 영역의 억제활성은 R7 및 R8에 유래하는 것이 판명되었다. 또한 HTLV-I의 숙주인 세포유래의 Jurkat 세포를 이용해서 같은 실험을 행한 결과도 같고, R1, R2, R4, R7 및 R8 영역이 억제작용을 나타내는 것도 확인하였다. 이와 같이 pol 영역중에 2개의 바이러스 유전자발현 억제영역(R7 및 R8)을 보여주었다.

실시예 2 : R7 및 R8 영역의 유전자발현 억제활성의 기구의 검토

(1) 번역이후의 영향의 검토

R7 및 R8 영역의 유전자발현 억제활성의 기구의 검토를 CMV-CAT-R7 및 CMV-CAT-R8 로부터 전사된 CAT RNA의 양의 노젠블로팅에 의해 이하의 방법으로 행하였다.

페트리디쉬(직경 10cm) 중의 HeLa 세포(1.5×10⁶/디쉬)에 각각 CMV-CAT-R7 18.30 ㎍, CMV-CAT-R8 18.24㎍, CMV-CAT-R9 18.34㎍ 및 CMV-CAT 16㎍의 플라스미드를 트랜스팩트하고 40시간 후에 ISOGEN 시약(닛뽕진사제)을 이용해서 모든 RNA를 추출하였다. 다음으로 각 15㎍을 1% 또는 1.5%의 아가로스겔로 0.66M 포름알데히드 존재하에서 MOPS 완충액(20mM MOPS[3-(N-몰포린)-프로판술폰산] pH 7.0, 5mM 초산나트륨 및 0.5mM EDTA)에 의해 전기영동하고, 20×SSC를 이용한 캐필러리 트랜스퍼에 의해 나일론 막(Hybond-N+, Amersham사제)에 블로팅하였다. 통상적인 방법으로 알칼리 고정을 행하고 CAT 유전자를 주형으로 하여 멀티프라임 라벨링키트(Amersham사제)로 제작한³²P-표지 프로브로 68℃에서 2시간, 하이브리다이즈하였다. 하이브리다이제이션 액에는 Quick Hyb. 시약(Stratagene사제)을 이용하였다. 멤브레인의 세척은 2×SSC, 0.1% SDS 용액으로 실온에서 15분간, 2회 세척한 후, 0.1×SSC, 0.1% SDS 용액에서 60℃로 30분간 1회 행하였다. 시그날의 검출은 X선 필름에 코닥사제 XAR5을 이용하여 증감지 존재하에서 -80℃로 40시간 행하였다.

결과를 도4에 나타낸다. 각 레인은 CMV-CAT-R7(레인 1), CMV-CAT-R8(레인 2), CMV-CAT-R9(레인 3) 및 CMV-CAT(레인 C)를 트랙스팩트한 HeLa 세포에 대해서 노젠블로팅을 행한 후, 멤브레인을 CAT 유전자를 주형으로 하여 제작한 프로브로 하이브리다이즈한 결과를 나타낸다. 도 중의 GAPDH의 위치의 밴드는 GAPDH(글리세르알데히드 3-인산디히드로지나아제) 유전자를 주형으로 하여 제작한 프로브로 하이브리다이즈한 결과를 나타내고, 이것에 의해 멤브레인 상의 RNA의 양이 균일함을 검정하였다. 다음 레인 M에는 트랜스팩션을 행하지 않은 HeLa 세포의 RNA를 사용하였다. 대략 같은 몰수의 플라스미드를 트랜스팩션한 HeLa 세포에 있어서 CMV-CAT-R7 및 CMV-CAT-R9로부터 얻어지는 CAT RNA(예상사이즈 약 2.3kb)는 검출되지 않고, 현저히 낮은 양인 것을 알았다. 그러나 상기 실시예 1에서 억제작용이 약했던 R9영역을 갖는 CMV-CAT-R9으로부터 얻어지는 CAT RNA(예상사이즈 약 1.3kb)는 검출가능했다. 따라서 R7 및 R8영역에 의한 억제는 이미 RNA 레벨에서 일어나고 적어도 번역이후가 아닌 것을 알았다.

(2) 전사 레벨에서의 검토

발현한 RNA 양의 저하가 생긴 이유로서 이하의 2개의 기구가 고려된다. 1개는 R7 및 R8영역이 전사리프레서로서 시스로 작용하고, CMV 프로모터로부터의 전사량을 억제한다고 하는 기구이며, 다른 것은 CMV 프로모터로부터의 전사량에는 변화가 없지만 R7 및 R8 영역을 함유하는 RNA의 안정성이 나빠지는 것에 기인한다고 하는 기구이다. 일반적으로 전사리프레서는 프로모터에 대한 거리, 위치 및 센스-안티센스의 방향성을 문제삼지 않는다. 그래서 R1, R2 및 R4 영역을 CMV 프로모터의 5'측 직하류에 센스 또는 앤티센스 방향으로 결합한 플라스미드를 구축하여 조사했다. 그 결과 이들의 경우에 있어서 억제활성은 보이지 않았다. 따라서 전사레벨에서의 억제는 없다고 생각된다.

(3) 전사후의 영향의 검토

HTLV-I Rex는 바이러스 mRNA상의 RXE에 결합하여 전사후에 작용하고, 바이러스 mRNA의 스프라이싱의 억제 및 그로부터 세포질로의 이행을 촉진하고 있는 것을 알고 있다. 그래서 이 Rex에 의한 전사후의 작용이 R7 및 R8 영역의 억제작용에 미치는 영향에 대해서 검토했다. 그를 위해 CMV-CAT-R7, CMV-CAT-R8 및 CMV-CAT-R21의 각 게놈 영역의 3'측 직하류에, RXE를 센스(+) 또는 안티센스(-) 방향으로 결합하고, RNA에로 전사되도록 한 플라스미드(CMV-CAT-R7-RXE(+ 또는 -), CMV-CAT-R8-RXE(+ 또는 -) 및 CMV-CAT-R21-RXE(+ 또는 -))을 구축하였다.

이들을 RXE을 발현하는 SRα-rex 플라스미드와 같은 시각에 HeLa세포에 트랜스팩트하고, CAT활성을 측정하였다. 그 결과를 도5에 나타낸다. 도 중의 괄호로 표시한 각 블록(각각 2개의 레인으로 이루어진)은 각각 2㎍의 CMV-CAT-R7-RXE(+)(블록 A), CMV-CAT-R8-RXE(+)(블록 B), CMV-CAT-R21-RXE(+)(블록 C), CMV-CAT-R7-RXE(-)(블록 D), CMV-CAT-R8-RXE(-)(블록 E), CMV-CAT-R21-RXE(-)(블록 F)와 pCD-SRα-rex(Rex-)1.5㎍ 혹은 pCD-SRα(Rex-) 1.5㎍을 동시에 트랜스팩트한 HeLa세포의 CAT활성을 나타내고 하부의 수자는 클로람페니콜의 아세틸화의 비율(%)을 나타내고 있다. 도5로부터 알수 있는 것과 같이 R7 및 R8 영역의 억제작용은 블록 A 및 블록 B의 결과로부터 rex 존재하(Rex+), RXE가 센스방향일 때만 현저하게 저해되고 CAT활성의 회복이 발견되었다. 따라서 R7 및 R8 영역의 억제작용은 RXE로의 결합을 중개한 Rex에 의한 전사 후의 작용에 따라서 효과적으로 해제되는 것을 알았다.

다음으로 CMV-CAT-R7-RXE(+) 6㎍, CMV-CAT-R8-RXE(+) 6㎍ 또는 CMV-CAT-R21-RXE(+) 6㎍, pCD-SRα-rex(Rex+) 9㎍ 혹은 pCD-SRα(Rex-) 9㎍을 HeLa세포에 동시에 트랜스팩트하고 40시간 후에 전체 RNA를 얻었다. 이들을 1.5% 변성 알데히드겔에서 영동하고, 노젠블로팅을 행하여 멤브레인을 CAT유전자를 주형으로 하여 제작한 프로브로 하이브리다이제이션을 행하였다(도6). 이어서 GAPDH 유전자를 주형으로 제작한 프로브로 하이브리다이제이션을 행하고, 이에 의해 멤브레인 상의 RNA의 양의 균일성을 검정하였다(도6 중의 GAPDH의 위치의 밴드). 마찬가지로 도6 중의 SRα-rex로 나타낸 레벨은 SRα-rex 9㎍만을 트랜스팩션한 것이다. 이 결과는 상기의 CAT활성에서의 결과와 일치하였다.

더욱이 HTLV-I의 LTR을 트랜스로 활성화시켜 전사를 높인다고 알려져 있는 HTLV-I tax가 R7 및 R8 영역의 억제작용에 대하여 영향을 주지 않는 것도 확인하였다. 따라서 이상의 결과를 종합해보면 R7 및 R8 영역에 의한 억제 작용은 주로 전사후에 작용하는 것이라고 생각되었다.

실시예 3 : 유전자발현 억제활성 영역의 검토

(1) 결실변이 영역을 갖는 플라스미드의 구축

억제활성을 보인 R7 및 R8 영역의 내부보다 더 강한 활성을 보인 R8 영역에 대해서 그 억제활성의 중심부를 알아내기 위해서 CMV-CAT-R8 중의 R8을 5'측, 3'측의 쌍방향으로 결실시켜 얻어진 아영역을 갖는 플라스미드를 구축하였다. 우선 R8을 5'측으로부터 결실시키기 위하여 CMV-CAT-R8을 Not I(Takara Shuzo사제)으로 절단한 후, DNA Blunting 키트(Takara Shuzo사제)로 평골말단으로 하고, R8 영역내의 Eco NI부위(배열표의 배열번호 1의 염기번호 3362)로 절단한 것을 Kilo-sequence 용 deletion키트(Takara Shuzo사제)로 결실을 행하였다. 한편 R8을 3'측으로부터 결실시키기 위해 CMV-CAT-R8을 Apa I(Takara Shuzo사제) 및 Xba I(Takara Shuzo사제)으로 절단한 후, Kilo-sequence용 deletion 키트로 결실을 행하였다. 결실의 정도는 T7 시퀀싱 키트(Pharmacia사제)를 이용하여 결정하였다.

(2) 결실변이영역을 갖는 플라스미드의 CAT 활성의 측정

상기 (1)항에서 얻어진 결실변이 영역을 갖는 플라스미드의 CAT활성을 측정하였다. 그 결과를 도7에 표시한다. 이들의 플라스미드는 R8 영역을 5'(□) 또는 3'측(○)에서 결실시킨 것이다. 이 결과로부터 R8의 활성중심 영역이라고 생각되는 413 bp의 영역(C413)을 도7중에 나타낸다. 도7의 종축은 CAT 활성을 나타내고, 횡축은 R8 영역을 나타내고 있다. 결실의 정도가 진행함에 따라서 CAT활성은 R8 영역에 의한 저활성으로부터 서서히 회복하는 것을 알았다. 따라서 R8영역의 억제활성의 완전한 발현에는 넓은 영역을 필요로 하거나 또는 작은 활성 중심적인 것이 넓은 범위에 점재할 필요가 있다고 생각된다.

또한 R8 영역의 5'측 변연부(R7 영역의 3'측에서 R8 영역과 중복하는 영역)을 결실시켜도 강한 억제활성을 유지하고 있는 것으로부터 R7 과 R8 영역은 독립한 2개의 유전자발현 억제 영역이라는 것이 명백하다.

그래서 결실시킴으로써 CAT 활성의 회복이 뛰어난 중앙부의 413bp(배열표의 배열번호 1의 염기번호 3368~3780, 이하의 C413)에 대해서 억제활성의 정도를 검토하였다. 그 결과를 도8에 나타낸다. 각각 CMV-CAT 2㎍의 몰수에 상당하는 양의 CMV-CAT-C413센스(레인 1), CMV-CAT-C413안티센스(레인 2) 및 CMV-CAT-N413(레인 3)을 트랜스팩트한 HeLa 세포의 CAT활성을 비교하였다. 하부의 수자는 클로람페니콜의 아세틸화의 비율(%)을 나타내고 있다. C413을 갖는 CMV-CAT-C413은 R21 영역중의 413bp의 영역(배열표의 배열번호 1의 염기번호 7302~7714, 이하 N413)을 갖는 CMV-CAT-N413을 콘트롤로 하여 비교한 경우 CAT활성을 강하게 억제하였다. 그래도 이 C413에 대해서는 그 억제활성은 센스방향으로 결합한 때의 방법이 두드러지게 강하다는 것을 알았다. 따라서 이 점에서도 R8영역의 억제작용이 전사후에 작용하고 있는 것이 시사되었다. 이상과 같이 보다 강한 억제 작용을 갖는 영역은 그 억제작용의 충분한 발현에 비교적 긴 영역을 필요로 하고, 그 영역의 안티센스 배열에는 억제작용이 감약하는 것으로부터 그 억제작용은 그 영역이 전사되어 어느 특정의 고차구조를 취하는 것이 필요하고 전사후 조절기구라고 생각된다.

(3) 유전자발현 억제 활성 영역의 상동성의 검토

HTLV-I은 레토르바이러스의 온코바이러스에 속하고, 근연의 바이러스로서는 원숭이T세포 백혈병 바이러스 I형(STLV-I), HTLV-II 및 소의 백혈병바이러스(BLV)가 알려져 있다(Weiss 등, RNA TUMOR VIRUSES: Molecular Biology of Tumor Viruses, 제2판, 405-485, Cold Spring Harbor Laboratory(1985)). 한편 HIV는 레트로바이러스에는 있지만 렌티바이러스에 속하고 분류상 가깝지 않다. STLV-I, HTLV-II 및 BLV는 HTLV-I과 마찬가지로 감염숙주에 일생동안 지속적으로 감염하고, 생체내에서는 그들의 유전자발현이 강하게 억제되고 있다는 것이 알려져 있다. 발명자들은 STLV-I, HTLV-II 또는 BLV 감염세포에 있어서 HTLV-I의 p21X mRNA와 같은 성질의 mRNA를 발견하였다(Orita등, VIRUS GENES, 7, 197~204(1993)). 따라서 STLV-I, HTLV-II 및 BLV에도 유전자발현 억제활성을 갖는 DNA배열이 존재할 것으로 예상된다. 거기에 바이러스의 전체 DNA 배열이 알려져 있는 HTLV-II(Shimotohno 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82, 3101~3105(1985)), BLV(Sagata 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82, 677~681(1985)) 및 음성 대조로서 HIV(Adachi 등, J. Viro., 59, 284~291(1986))에 대해서 HTLV-I의 유전자발현 억제배열(2260~4080위치까지)과의 상동성을 해석하였다. 해석은 DNASIS(히타치 소프트웨어엔지니어링주식회사)의 DNA Maximum Homology 해석 프로그램을 데이터베이스로 하여 GenBank을 이용해서 행하였다.

상동성 해석의 결과, HTLV-II 및 BLV 둘다 HTLV-I 유래의 유전자발현 억제영역에 대응하는 pol 유전자 영역에서 각각 65% 및 59%의 상동성이 보였다. 한편 HIV에는 특정의 영역에서 높은 상동성이 보였다. 따라서 HTLV-I 유래의 유전자발현 억제배열과 같은 활성을 갖는 배열로서 바람직하게는 59%의 상동성을 갖는 것이 필요하다고 생각된다.

실시예 4 : HTLV-I 유래의 유전자발현 억제활성의 RRE 의존적 Rev에 의한 해제

HTLV-I의 Rex와 RXE의 관계와 마찬가지로 HIV에는 Rev와 RRE의 관계가 알려져 있다. 거기에 실시예 2의 (3)항의 기재와 마찬가지로 CMV-CAT-R7, CMV-CAT-R8 및 CMV-CAT-R21의 각 게놈 영역의 3'측 직하류에, RXE의 대신에 RRE를 센스(+) 또는 안티센스(-)방향으로 결합하고, RNA에로 전사되도록 플라스미드(CMV-CAT-R7-RRE(+ 또는 -), CMV-CAT-R8-RRE(+ 또는 -) 및 CMV-CAT-R21-RRE(+ 또는 -))을 구축하였다. 이들의 각 2㎍을, Rev 단백질을 발현하는 SRα-rev 플라스미드 1.5㎍ 또는 Rev 단백질을 발현하지 않는 pCD-SRα 플라스미드 1.5㎍과 동시에 HeLa 세포에 트랜스팩트하고, CAT 활성을 측정하였다. 결과를 표2에 나타낸다.

플라스미드	Rev	CAT활성(%)	유도배수(Rev+/Rev-)
CMV-CAT-R7-RRE(+)	+-	13.11.3	10.0
CMV-CAT-R7-RRE(-)	+-	1.51.2	1.3
CMV-CAT-R8-RRE(+)	+-	2.90.58	5.0
CMV-CAT-R8-RRE(-)	+-	0.480.42	1.1
CMV-CAT-R21-RRE(+)	+-	42.626.5	1.6
CMV-CAT-R21-RRE(-)	+-	33.945.7	0.74

표 2에서 알 수 있는 것처럼 R7 및 R8 영역은 RRE의 결합의 방향성에 관계없이 CAT 유전자의 발현을 강하게 억제하였다. 이들의 억제효과는 Rev+의 경우의 CAT 활성(%)을 Rev-의 경우의 CAT 활성(%)으로 나눈 수인 유도배수로 비교하면 RRE가 센스방향으로 결합한 경우에만 Rev 단백질의 효과가 발휘되는 것을 분명하게 알 수 있다. 이 결과는 상기 실시예 2의 (3)항의 결과와 같았다.

실시예 5 : TRP-1 cDNA의 클로닝

U5에 존재하는 전사억제배열 U5RE에 결합하는 인자를 단리하기 위해 U5RE를 8개 연결시킨 DNA를 프로브로 하여 이하와 같이 사우스웨스턴법으로 Molt-4 cDNA 라이브러리를 스크리닝하였다.

사우스웨스턴법에서의 스크리닝의 프로브를 조제하기 위하여 우선 U5RE에 상당하는 양쇄의 오리고뉴클레오티드(배열표의 배열번호 16 및 배열번호 17)을 합성하였다. 이 합성한 DNA를 19% 아크릴아미드, 1% 아크릴아미드비스 및 7M 요소에서 이루어진 겔을 이용해서 300V에서 2시간동안 전기영동한 후, 목적하는 합성DNA를 함유하는 겔을 잘라내었다. 다음으로 이 겔을 37℃에서 16시간 TE 완충액(10mM Tris-HCl, pH 7.4, 1mM EDTA)에 담그고, 겔로부터 DNA를 용출하였다. 이 용출액을 TE 완충액에서 포화시킨 DE52(Pharmacia사제)에 통해서 DNA를 흡착시킨 후, 0.5ml의 TNE 완충액(10mM Tris-HCl, ph7.4, 1mM EDTA, 1.5M NaCl)을 이용해서 용출하였다. 이 DNA 용액에 1ml의 에탄올을 첨가하고 DNA를 침전시켜 합성 DNA를 정제하였다. 정제한 합성DNA를 TE완충액에 용해하고, DNA의 최종 농도가 10㎍/㎕가 되도록 각각을 가한 용액을 65℃에서 10분간 열변성한 후, 서서히 온도를 낮춰 이본쇄 DNA를 작제하였다. 다음으로 이본쇄 DNA 1㎍에 대해서 100 유닛의 라이게스(닛뽕진사제)를 가하고, 12℃에서 16시간 반응시키고, U5RE를 8개 연결하여 얻어진 DNA(8×U5RE)를 플라스미드 pSL1180(Pharmacia사제)의 BamHI 및 BglII부위에 10 유닛의 라이게스 존재하에서 12℃에서 16시간 라이게이션을 행함으로써 결합하였다.

사우스웨스턴법으로 사용하기 위한 프로브를 상기 8×U5RE를 주형으로 해서 α³²P-dCTP 존재하에서 PCR을 행해 증폭하였다. PCR의 반응액은 1㎕의 8×U5RE-pLS1180(1ng/㎕)을 2㎕의 10×PCR용 완충액(100mM Tris-HCl, pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl₂, 0.1% 젤라틴), 1㎕의 dNTP(4mM dATP, 4mM dGTP, 4mM dTTP, 0.8mM dCTP), 0.5㎕의 Taq 폴리머라아제(Takara Shuzo사제, 5유닛/㎕), 1㎕의 합성 프라이머(pSL F; 배열표의 배열번호 18, pSL R; 배열표의 배열번호 19: 10pmol/㎕), 12.5㎕의 α³²P-dCTP에 넣고 멸균증류수로 20㎕를 만들었다. PCR은 Thermal sequencer TSR-300(Iwaki Glass사제)을 이용해서 94℃에서 60초간 반응시킨 후, 94℃에서 45초간, 55℃에서 45초간 및 72℃에서 45초간을 35회 행하고, 72℃에서 60초간 행하였다.

인간 급성 림파성 백혈병 세포주 Molt-4의 pSport 1의 cDNA 라이브러리를 이하와 같이 하여 작성하였다. 우선 Molt-4 세포 10⁹개를 1ml의 4M 구아니딘티오시아네이트를 가한 후, 1ml의 물로 포화시킨 페놀을 가하여 추출하였다. 이 추출액으로부터 1ml의 이소프로판올로 추출한 것을 전체 RNA로 하였다. 전체 RNA 100㎍에서 Oligotex을 이용하여 10㎍의 mRNA를 얻었다. 이 10㎍의 mRNA으로부터, Superscript cDNA 합성시스템(GIBCO-BRL사제)을 이용해서 cDNA 및 cDNA 라이브러리(pSPORT-1(BRL사제))을 작성하였다.

다음으로 Molt-4의 cDNA라이브러리를 E.coli DH5α에 도입하고, 1매의 페트리디쉬마다 클로니의 수가 5만개가 되도록 뿌려서 합계 200만개를 스크리닝에 이용하였다. 이와 같이 해서 뿌린 클로니에 대해서 니트로셀룰로오스막(Millipor사제)을 1분간 접촉시켰다. 그들의 니트로셀루로스막을 1mM IPTG(GIBCO-BRL사제)을 함유하는 배지상에서 3시간 37℃에서 배양하여 단백질을 발현시켰다. 이와 같이 해서 정제한 니트로셀룰로오스막에 고정된 cDNA로부터 생성된 단백질과 상기의 프로브를 반응시켜 단백질의 DNA결합활성을 지표로하여 스크리닝을 행하였다.

더욱이 얻어진 cDNA 클론으로 정제한 cDNA 단편을 프로브로 하여 10⁶개의 Molt-4 cDNA 라이브러리를 클로니하이브리다이제이션에 의해 스크리닝하였다. 필터의 조제는 한천배지에서 37℃로 하룻밤 배양한 클로니를 Colony/PlaqueScreen Plus(Dupont사제) 필타에 전사시킨 후, 0.5M NaOH, 1.5M NaCl에 1분간, 0.5M Tris-HCl, 1.5M NaCl에 5분간, 2×SSC에 5분간 담근 후 바람으로 건조시켰다. 프로브의 방사표지는 α³²P-dCTP에 의해 멀티프라임라벨링키트(Amersham사제)을 이용하였다. 하이브리다이제이션은 6×SSPE(0.9M NaCl, 0.06M 인산나트륨, 6mM EDTA, pH 7.4), 10% 아이리쉬 크림(RA BAILEYS사제), 1% SDS 및 50% 포름아미드에 의해 42℃에서 6시간 프로브 없이 프레하이브리다이제이션을 행한 후, 프로브를 가하여 42℃에서 16시간 하이브리다이제이션을 하였다. 필타의 세척은 1×SSC, 0.5% SDS를 이용하고, 실온에서 10분간 및 0.2×SSC, 0.5% SDS를 이용하여 65℃에서 30분간을 2회 행하였다. 시크날의 검출은 X선 필름(코닥사제; XAR5)을 이용하여 증감지 존재하에 -80℃에서 16시간 감광한 후 현상하였다.

그 결과 약 3.8kb의 cDNA 삽입단편을 함유하는 양성 클론을 얻을 수 있다. 얻어진 cDNA 클론의 염기배열의 결정은 디데옥시법(Sanger, 전술)에 따라서 Sequenase DNA 시퀀스 키트(U.S.B사제)를 이용하였다. 결정된 DNA 배열 및 아미노산 배열을 배열표의 배열번호 15에 나타낸다. 이 cDNA 단편을 해석하여 얻어진 염기배열을 함께 추정한 아미노산 배열을 해석하였다(DNASIS(히타치 소프트웨어엔지니어링주식회사)). 이 유전자는 컴퓨터에 의한 해석의 결과 신규의 유전자이며, 가장 긴 오픈리딩프레임을 아미노산으로 번역하면 688개의 아미노산 배열로 되는 것이 명확해졌다. 이 아미노산 배열에서 도10에 나타낸바와 같이 카르복실 말단측에 Kruppel형의 DNA결합영역인 아연 핑거 도메인 4개반 및 아미노 말단측에 전사조절영역인 KRAB-A,B도메인 1조에 유사성이 있는 것이 명확해졌다. 또한 아미노산 배열에 기초한 추정분자량은 76kDa이고, 기지의 U5RE에 특이적으로 결합한 단백질(110kDa, 80kDa 및 70kDa)과는 분자량 및 특징적인 도메인에 있어서 모두 다른 것이다.

더욱이 유사성 해석의 결과 가장 유사성이 높았던 아니모산 배열을 지닌 유전자는 Kid-1(Witzgall등, Mol. Cell. Biol., 13(3):1933-1942(1993), 전출)이었다. 아미노산배열과 비교하면 도11에 나타낸 바와 같이 그 아연 핑거 도메인(TRP-1의 아미노산 518~648위치에 상당하고, Kid-1에 관해서는 407~529위치에 상당한다)에는 61.0%의 유사성으로 53.7%의 상동성을 보이고, 도12에 나타낸 바와 같이 KRAB-A,B도메인(TRP-1의 아미노산 196~261위치에 상당하고, Kid-1에 관해서는 12~53위치에 상당한다)에는 48.5%의 유사성으로 34.9%의 상동성을 보였다.

상기 이외의 특징적인 배열로서는 아미노산 154~185위치에 루이신을 34.4% 함유하는 루이신리치 도메인, 403~443위치에 프로린/글루타민을 65.9% 함유하는 프로린/글루타민리치 도메인 및 470~503 위치에 글리신을 58.8% 함유하는 글리신리치 도메인이 있는 것을 알았다. 프로린/글루타민리치 도메인에 관해서는 단백질-단백질 상호작용에 관계하는 것이 지금까지 알려져 왔지만 그 외의 도메인의 작용은 아직 명확하지 않다.

실시예 6 : 재조합 TRP-1의 발현과 성상해석

TRP-1의 발현을 위해서 발현 클로닝에 의해 얻어진 cDNA클론의 DNA를 KpnI와 NotI로 절단해서 얻어진 3.8kb의 DNA단편을 발현 벡타 pRSET(Invitrogen사제)의 KpnI-Not부위에 삽입하였고, pRSET-TRP-1을 구축하였다. 이 pRSET-TRP-1을 도입한 대장균 BL12주는 올리고히스티딘을 아미노 말단에 지닌 융합단백질로서 TRP-1을 발현하여 얻었다. LB배지 2L중에서 균체를 30℃에서 하룻밤 배양한 후, 최종 농도 1mM가 되도록 IPTG를 가하고, 6시간 배양하였다. 이 융합단백질은 플레이트본드레진(Invitrogen사제)을 이용하여 아피니티 칼럼법으로 정제하였다. 더욱이 프레프셀(BIO-RAD사제)을 이용해서 전기영동에 의한 분리를 행하고 최종적인 제품으로 하였다.

TRP-1과 U5RE의 결합해석은 다음과 같이 행하였다. 우선³²P으로 표지한 U5RE DNA 1ng과 정제한 상기의 재조합 TRP-1을 결합반응용 완충액(20mM Tris-HCl, 1mM EDTA, 50mM NaCl, 1mM DTT, 5% 글리세롤) 중에서 1㎍ poly d(I-C) 존재하에 30분간 실온에서 반응시켰다. 다음으로 그 반응액을 5% 폴리아크릴아미드겔에서 전기영동한 것을 여과지상에서 건조시킨 후, 오토라디오그래피에 의해 해석하였다.

TRP-1과 U5RE의 결합해석의 결과를 도13에 나타낸다. 도13의 레인1은 대장균에 발현시킨 TRP-1과 U5RE 프로브와의 결합반응, 레인2는 레인1의 반응액에 U5RE 프로브에 대해서 100배 몰량의 비표지 U5RE를 가한 경우 및 레인3은 레인2의 U5RE의 대신에 비특이적인 DNA 단편을 100배 몰량 가한 경우의 각각의 결과를 나타낸다. 이 재조합 TRP-1이³²P로 표지를 한 U5RE DNA에 결합하는 것을 볼 수 있다. 또한 이 U5RE DNA 프로브에 대해서 표지하지 않은 U5RE DNA, 또는 같은 길이의 U5RE DNA의 염기배열에 무관한 dNA에 의한 경합반응을 한 결과, 비표지 U5RE DNA에 대해서만 경합한 것으로부터 이 TRP-1은 U5RE DNA에 특이적으로 결합한 것을 알았다.

실시예 7 : TRP-1 mRNA 발현의 조직분포

TRP-1의 조직별 발현분포를 알아내기 위하여 우리들은 인간 주화세포(28종류) 및 조직(16개소)의 RNA를 이용해서 노젠블로트 분석을 행하였다.

우선 각세포에서 단리한 poly(A)+RNA 3㎍을 0.66M 포름알데히드를 함유하는 1% 아가로스겔에서 MOPS 완충액(20mM MOPS, pH 7.0, 5mM 초산나트륨, 0.5mM EDTA)에 의해 전기영동에 걸고, 20×SSC를 이용한 캐필러리 트랜스퍼에 의해 나일론막(Gene Screen Plus, Dupont사제)으로 이송하고, 이 나일론막을 바람으로 건조하였다. 이 필터 및 인간 조직 유래 mRNA를 블로팅한 시판중인 필터(Clontech사제)의 각각에 대해서 TRP-1 cDNA(발현클로닝에 의해 얻어진 단편의 5'측에서 950번째까지의 염기)를 α32P-dCTP에 의해 멀티프라임라벨링 키트(Amersham사제)를 이용해서 표지를 한 것을 프로브로 이용하고, 하이브리다이제이션 완충액(6×SSPE, 1% SDS, 10% 아이리쉬 크림(RA BAILEYS사제), 50% 포름아미드) 중에서 하이브리다이제이션을 행하였다. 막의 세척은 1×SSC, 0.5% SDS를 이용하여 실온에서 10분간, 0.2×SSC, 0.5% SDS를 이용하여 65℃에서 30분간 2회 행하였다. 시그날의 검출에는 X선 필름(코닥사제; XAR5)을 이용하고, 증감지의 존재하에 -80℃, 16시간 감광한 후 현상하였다.

각 세포주에 대한 결과를 도 14 및 도15에 나타낸다. 도 14는 각각 HL60(급성 골수성 백혈병), HeLa 세포 S3(자궁경암), K-562(만성골수성백혈병), Molt-4(급성림파성 백혈병), Raji(버키트 림파종), SW480(대장선암), A549(폐암) 및 G361(흑색종)의 세포주에 대해서의 노젠블로트의 결과이다. 도15는 각각 CEM, HPB, jurkat, Molt-4, PND4.1(모두 급성 림파성 백혈병), CAKII(신장암), KATO III(위암), A549(폐암), A673 및 RD(모두 횡문근육종), IMR32, SKN SH, TGW 및 NB9(모두 신경아종)의 세포주에 대해서의 노젠블로트 분석의 결과이다. 세포주에는 HTLV-I 감염, 비감염 T세포에 관계없이 도중의 화살표로 나타낸 4.0kb의 전사물로서 발현되어 있고, 또한 실험한 전체의 세포주에 있어서 TRP-1 유전자의 발현이 발견되었다. 발현벡타는 신경아종세포의 4종 중에서 2종(TGW 및 NB9)이 그외의 신경아종 세포와 다른 세포보다도 발현이 5~10배 높았다. 더욱이 신경아종 세포주 GOTO, CHP134, NB19 및 NB16 혹은 그리아 세포종주 A2781, U251 및 T98G에 관해서 발현을 검토한 결과 GOTO 및 NB19으로 발현이 높은 결과가 되었다(데이타는 보이고 있지 않음). 따라서 검토한 신경아종 세포주 8주 중 4주에서 TRP-1의 mRNA의 발현이 높은 것을 알았다.

다음으로 도16(A) 및 (B)에 각 조직의 경우의 결과를 나타낸다. 조직에 있어서는 정소로는 대단히 낮지만 다른 조직에 있어서는 대략 일정량의 발현이 있는 것이 명확해졌다. 이것으로부터 정상 뇌조직에는 다른 조직과 비교하여 특히 TRP-1의 mRNA의 발현이 높지 않다는 것에서 신경아종 세포주에서 발현이 높은 결과가 신경세포의 암화의 일부와 관계가 깊다고 생각된다.

실시예 8 : TRP-1의 기능해석

TRP-1의 기능해석은 다음과 같이 행하였다. EF-BOS 벡타에 인플루엔자 HA tag를 trp-1의 N말단에 갖는 HA-TRP-1 융합단백질이 발현되도록 결합한 발현벡타 pEF-HA-TRP-1과 CAT(클로람페니콜아세틸트랜스퍼라아제)유전자의 상류에 HSV TK(최조 프로메다 영역)을 연결한 레포타플라스미드 TK-CAT 혹은 TK와 CAT 유전자의 사이에 U5RE를 3개 삽입한 TK-3×U5RE-CAT을 동시에 리보팩틴(GIBCO-BRL사제)을 이용해서 HeLa 세포에 도입하였다. TK-3×U5RE-CAT는 TRP-1의 결합배열인 U5RE을 갖고, TK-CAT는 결합배열을 갖고 있지 않다. 세포를 48시간 배양한 후, 회수하고 호모게나이즈한 것을 원심분리하고, 그 상청의 단백질을 정량하였다. 그 100㎍에 대하여 [¹⁴C] 클로람페니콜(Amersham사제) 4㎕와 4mM의 아세틸CoA(Sigma사제) 10㎕을 가하여 37℃에서 1시간 인큐베이트하고, 초산에틸 0.5ml을 가하여 교반한 후, 10,000rpm, 10초간 원심분리하여 초산에틸층을 회수하였다. 이 초산에틸층을 건조하고, 다시 20㎕의 초산에틸에 용해하여 실리카겔박층 플레이트(DC-Alufolien Kiese gel 60 F254, MERCK사제)에 스포트하고, 클로로포름:에탄올(95:5)의 촉매로 막층 챔버 내에서 전개하였다. 이 전개한 실리카겔박층 플레이트를 바이오이메지 분석기(Fujix사제)을 이용하여 아세틸화의 비율을 조사함으로써 존재하고 있는 CAT의 활성을 조사하였다.

결과를 도17에 나타낸다. 도17의 레인1~3은 레포타 유전자로서 TK-3×U5RE-CAT를 2㎍ 이용하고, 레인4~6은 TK-CAT을 2㎍ 이용하며, 아울러 에펙타 유전자로서 레인 1 및 4는 pEF-BOS-TRP-1 10㎍을 레인 2 및 5는 pEF-BOS-TRP-15㎍+pEF-BOS 5㎍을, 레인3 및 6은 pEF-BOS 10㎍을 각각 HeLa세포에 도입하여, 48시간후에 회수한 세포의 추출액을 이용하여 해석한 결과이다. 즉 pEF-HA-TRP-1과 TK-3×U5RE-CAT 혹은 pEF-HA-TRP-1과 TK-CAT를 1조로 하여 HeLa세포에 도입하고, TRP-1이 U5RE을 중개하여 작용하는가의 여부를 해석하였다. 그 결과 TK-3×U5RE-CAT에 대해서는 pEF-HA-TRP-1 플라스미드의 농도의존적으로 CAT활성이 35% 억제되었지만 TK CAT에 대해서는 영향이 없었다. 이것으로 TRP-1은 U5RE을 중개하여 전사억제활성을 갖는 것을 알 수 있다.

본 발명에 의해 유전자발현 억제기능에 관련한 DNA분자 및 단백질이 제공된다.

본 발명의 HTLV-1 유래의 유전자발현 억제기능을 갖는 DNA분자는 생체내에서 바이러스 유전자의 발현을 억제함으로써 면역기구에 의한 배제에서 바이러스감염세포를 도피시킬 수 있고, HTLV-I의 잠복감염 기구에 있어서 중요한 역할을 하고 있다. 이 유전자발현 억제작용과 그 R9×단백질에 의한 해제를 잘 이용함으로써 인공적인 유전자발현 조절이 가능해지고, 유전자치료등에서의 세포특이적 유전자 발현에 대한 응용을 할 수 있다고 생각된다.

또한 도9에 나타낸바와 같은 구성 유닛을 함유하고, 본 발명의 유전자발현 억제기능을 갖는 DNA 배열을 함유하는 플라스미드를 이용함으로써 HIV 감염증(예를 들면 AIDS)의 유전자치료에 응용하는 것도 고려할 수 있다. 예를 들면 레트로바이러스 벡타에 도9와 같은 구성 유닛을 결합하고 감염 또는 비감염세포에 도입할 수 있다. 비감염세포에 도입된 경우에는 유전자발현 억제 DNA배열이 기능하고, 치료유전자의 발현은 억제된다. 더욱이 스프라이스 도너(SD) 시그날과 스프라이스 악셉터(SA) 시그날을 배치함으로써 치료유전자등이 스프라이스에 의해 제거되고, 치료유전자의 발현이 더욱 억제된다. 한편 감염세포에 있어서는 HIV 유전자로부터 Rev 단백질이 발현하므로 이것이 RRE를 중개해서 유전자발현 억제배열의 억제활성을 해제하고, 치료유전자의 발현이 촉진된다. 더욱이 프로모터로서 HIV LTR을 이용하면 HIV의 Tat 단백질에 의한 전사촉진기능에 의해 치료유전자의 발현이 더욱 높아진다.

또한 본 발명의 유전자발현 억제기능을 갖는 DNA 분자 및 그 DNA 분자를 함유하는 플라스미드는 성인 T세포백혈병(ATL), HTLV-I 관련 척수증(HAM), 열대성 경련성 마비증(TSP) 등의 질환의 발병기구의 해명 및 유효한 치료약의 개발에도 유효하다고 생각된다.

본 발명의 TRP-1은 U5RE에 특이적으로 결합한 DNA 결합단백질이고, 전사억제활성을 갖는 것에서 같은 배열을 갖는 바이러스 유전자, 예를들면 인간면역부전 바이러스, 사이토메가로바이러스 등의 유전자, 또는 세포유전자의 발현억제에 작용하는 것을 생각할 수 있다. 따라서 항바이러스활성을 갖는 가능성이 있고 항바이러스제의 개발에 응용할 수 있다.

또한 TRP-1과 비교적 유사성이 높은 Kid-1이 래트의 신장에서 단리되어서, 신장의 발생과정, 허혈, 또는 엽산처리후의 신장 조직 재생과정에서 mRNA의 발현이 상승하고, 전사를 억제하는 것이 알려져 있다. 따라서 TRP-1이 대부분의 조직 또는 세포주에서 발현하는 것에서 전사억제에 관련한 생리학적으로 중요한 활성을 갖는다고 생각된다. 즉 본 발명의 단백질은 항바이러스의 유효성분으로서 유용하게 이용될 수 있다.

더욱이 신경아종 세포주의 반수에 있어서 TRP-1의 이상한 고발현이 보이는 것에서 신경세포의 암화기구로의 관여가 시사되고, TRP-1의 연구에 의해 신경세포의 암화의 기전해명, 진단 및 치료에 대한 응용에 이용될 수 있다. 즉 본 발명의 단백질의 조직에 있어서 발현은 암발현의 검출지표가 될 수 있고, 더욱이 본 발명의 단백질 또는 그 단백질을 코드화하는 DNA 분자의 안티센스쇄는 암치료약이 될 수 있다.

배열표

배열번호1

배열의 길이 : 9045

배열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 일본쇄

토포로지 : 직쇄상

배열의 종류 : genomic DNA

기원

생물명 : 인간

배열의 특징

특징을 나타내는 기호 : LTR

존재위치 : 1..757

특징을 결정한 방법 : S

특징을 나타내는 기호 : polyA signal

존재위치 : 8584..8589

특징을 결정한 방법 : S

특징을 나타내는 기호 : LTR

존재위치 : 8278..9032

특징을 결정한 방법 : S

배열

TGACAATGAC CATGAGCCCC AAATATCCCC CGGGGGCTTA GAGCCTCCCA GTGAAAAACA 60

TTTCCGAGAA ACAGAAGTCT GAAAAGGTCA GGGCCCAGAC TAAGGCTCTG ACGTCTCCCC 120

CCGGAGGGCA GCTCAGCACC GGCTCGGGCT AGGCCCTGAC GTGTCCCCCT GAAGACAAAT 180

CATAAGCTCA GACCTCCGGG AAGCCACCAA GAACCACCCA TTTCCTCCCC ATGTTTGTCA 240

AGCCGTCCTC AGGCGTTGAC GACAACCCCT CACCTCAAAA AACTTTTCAT GGCACGCATA 300

TGGCTCAATA AACTAGCAGG AGTCTATAAA AGCGTGGAGA CAGTTCAGGA GGGGGCTCGC 360

ATCTCTCCTT CACGCGCCCG CCGCCCTACC TGAGGCCGCC ATCCACGCCG GTTGAGTCGC 420

GTTCTGCCGC CTCCCGCCTG TGGTGCCTCC TGAACTGCGT CCGCCGTCTA GGTAAGTTTA 480

AAGCTCAGGT CGAGACCGGG CCTTTGTCCG GCGCTCCCTT GGAGCCTACC TAGACTCAGC 540

CGGCTCTCCA CGCTTTGCCT GACCCTGCTT GCTCAACTCT ACGTCTTTGT TTCGTTTTCT 600

GTTCTGCGCC GTTACAGATC GAAAGTTCCA CCCCTTTCCC TTTCATTCAC GACTGACTGC 660

CGGCTTGGCC CACGGCCAAG TACCGGCGAC TCCGTTGGCT CGGAGCCAGC GACAGCCCAT 720

CCTATAGCAC TCTCAGGAGA GAAATTTAGT ACACAGTTGG GGGCTCGTCC GGGATACGAG 780

CGCCCCTTTA TTCCCTAGGC AATGGGCCAA ATCTTTTCCC GTAGCGCTAG CCCTATTCCG 840

CGACCGCCCC GGGGGCTGGC CGCTCATCAC TGGCTTAACT TCCTCCAGGC GGCATATCGC 900

CTAGAACCCG GTCCCTCCAG TTACGATTTC CACCAGTTAA AAAAATTTCT TAAAATAGCT 960

TTAGAAACAC CGGCTCGGAT CTGTCCCATT AACTACTCCC TCCTAGCCAG CCTACTCCCA 1020

AAAGGATACC CCGGCCGGGT GAATGAAATT TTACACATAC TCATCCAAAC CCAAGCCCAG 1080

ATCCCGTCCC GTCCCGCGCC ACCGCCGCCG TCATCCCCCA CCCACGACCC CCCGGATTCT 1140

GATCCACAAA TCCCCCCTCC CTATGTTGAG CCTACGGCCC CCCAAGTCCT TCCAGTCATG 1200

CATCCACATG GTGCTCCTCC TAACCATCGC CCATGGCAAA TGAAAGACCT ACAGGCCATT 1260

AAGCAAGAAG TCTCCCAAGC AGCCCCTGGG AGCCCCCAGT TTATGCAGAC CATCCGGCTT 1320

GCGGTGCAGC AGTTTGACCC CACTGCCAAA GACCTCCAAG ACCTCCTGCA GTACCTTTGC 1380

TCCTCCCTCG TGGCTTCCCT CCATCACCAG CAGCTAGATA GCCTTATATC AGAGGCCGAA 1440

ACCCGAGGTA TTACAGGTTA TAACCCATTA GCCGGTCCCC TCCGTGTCCA AGCCAACAAT 1500

CCACAACAAC AAGGATTAAG GCGAGAATAC CAGCAACTCT GGCTCGCCGC CTTCGCCGCC 1560

CTGCCGGGGA GTGCCAAAGA CCCTTCCTGG GCCTCTATCC TCCAAGGCCT GGAGGAGCCT 1620

TACCACGCCT TCGTAGAACG CCTCAACATA GCTCTTGACA ATGGGCTGCC AGAAGGCACG 1680

CCCAAAGACC CCATCTTACG TTCCTTAGCC TACTCCAATG CAAACAAAGA ATGCCAAAAA 1740

TTACTACAGG CCCGAGGACA CACTAATAGC CCTCTAGGAG ATATGTTGCG GGCTTGTCAG 1800

ACCTGGACCC CCAAAGACAA AACCAAAGTG TTAGTTGTCC AGCCTAAAAA ACCCCCCCCA 1860

AATCAGCCGT GCTTCCGGTG CGGGAAAGCA GGCCACTGGA GTCGGGACTG CACTCAGCCT 1920

CGTCCCCCCC CCGGGCCATG CCCCCTATGT CAAGACCCAA CTCACTGGAA GCGAGACTGC 1980

CCCCGCCTAA AGCCCACTAT CCCAGAACCA GAGCCAGAGG AAGATGCCCT CCTATTAGAC 2040

CTCCCCGCTG ACATCCCACA CCCAAAAAAC TTCATAGGGG GGGAGGTTTA ACCTCCCCCC 2100

CCACATTACA GCAAGTCCTT CCTAACCAAG ACCCAGCATC TATTCTGCCA GTTATACCGT 2160

TAGATCCCGC CCGTCGGCCC GTAATTAAAG CCCAGGTTGA CACCCAGACC AGCCACCCAA 2220

AGACTATCGA AGCTTTACTA GATACAGGAG CAGACATGAC AGTCCTTCCG ATAGCCTTGT 2280

TCTCAAGTAA TACTCCCTCA AAAATACATC CGTATTAGGG GCAGGGGGCC AAACCCAAGA 2340

TCACTTTAAG CTCACCTCCC TTCCTGTGCT AATACGCCTC CCTTTCCGGA CAACGCCTAT 2400

TGTTTTAACA TCTTGCCTAG TTGATACCAA AAACAACTAG GCCATCATAG GTCGTGATGC 2460

CTTACAACAA TGCCAAGGCG TCCTGTACCT CCCTGAGGCA AAAAGGCCGC CTGTAATCTT 2520

GCCAATACAG GCGCCAGCCG TCCTTGGGCT AGAACACCTC CCAAGGCCCC CCGAAATCAG 2580

CCAGTTCCCT TTAAACCAGA ACGCCTCCAG GCCTTGCAAC ACTTGGTCCG GAAGGCCCTG 2640

GAGGCAGGCC ATATCGAACC CTACACCGGG CCAGGGAATA ACCCAGTATT CCCAGTTAAA 2700

AAGGCCAATG GAACCTGGCG ATTCATCCAC GACCTGCGGG CCACTAACTC TCTAACCATA 2760

GATCTCTCAT CATCTTCCCC CGGGCCCCCT GACTTGTCCA GCCTGCCAAC CACACTAGCC 2820

CACTTGCAAA CTATAGACCT TAGAGACGCC TTTTTCCAAA TCCCCTTACC TAAACAGTTC 2880

CAGCCCTACT TTGCTTTCAC TGTCCCACAG CAGTGTAACT ACGGCCCCGG CACTAGATAC 2940

GCCTGGAAAG TACTACCCCA AGGGTTTAAA AATAGTCCCA CCCTGTTCGA AATGCAGCTG 3000

GCCCATATCC TGCAGCCCAT TCGGCAAGCT TTCCCCCAAT GCACTATTCT TCAGTACATG 3060

GATGACATTC TCCTAGCAAG CCCCTCCCAT GAGGACCTAC TACTACTCTC AGAGGCCACA 3120

ATGGCTTCCC TAATCTCCCA TGGGTTGCCT GTGTCCGAAA ACAAAACCCA GCAAACCCCT 3180

GGAACAATTA AGTTCCTAGG GCAGATAATT TCACCCAATC ACCTCACTTA TGATGCAGTC 3240

CCCACGGTAC CTATACGGTC CCGCTGGGCG CTACCTGAAC TTCAAGCCCT ACTTGGCGAG 3300

ATTCAGTGGG TCTCCAAAGG AACTCCTACC TTACGCCAGC CCCTTCACAG TCTCTACTGT 3360

GCCTTACAAA GGCATACTGA TCCCCGAGAC CAAATATATT TAAATCCTTC TCAAGTTCAA 3420

TCATTAGTGC AGCTGCGGCA GGCCCTGTCA CAGAACTGCC GCAGTAGACT AGTCCAAACC 3480

CTGCCCCTCC TAGGGGCTAT TATGCTGACC CTCACTGGCA CCACTACTGT AGTGTTCCAG 3540

TCCAAGGAGC AGTGGCCACT TGTCTGGCTA CATGCCCCCC TACCCCACAC TAGCCAGTGC 3600

CCCTGGGGGC AGCTACTTGC CTCAGCTGTG TTATTACTCG ACAAATACAC CTTGCAATCC 3660

TATGGGCTGC TCTGCCAAAC CATACATCAT AACATCTCCA CCCAAACCTT CAACCAATTC 3720

ATTCAAACAT CTGACCACCC CAGTGTTCCT ATCTTACTCC ACCACAGTCA CCGATTCAAA 3780

AATTTAGGTG CCCAAACTGG AGAACTTTGG AACACTTTTC TTAAAACAGC TGCCCCATTG 3840

GCTCCTGTGA AAGCCCTCAT GCCAGTGTTT ACTCTTTCCC CGGTGATTAT AAACACCGCC 3900

CCCTGCCTGT TTTCAGACGG ATCTACCTCC CGGGCAGCCT ATATTCTCTG GGACAAGCAA 3960

ATATTGTCAC AAAGATCATT CCCCCTTCCG CCACCGCACA AGTCGGCCCA ACGGGCCGAA 4020

CTTCTCGGAC TTTTGCATGG CCTCTCCAGC GCCCGTTCGT GGCGCTGTCT CAACATATTT 4080

CTAGACTCCA AGTATCTTTA TCATTACCTT CGGACCCTTG CCCTGGGCAC CTTCCAAGGC 4140

AGGTCCTCTC AGGCCCCCTT TCAGGCCCTT CTGCCCCGCT TACTATCGCG TAAGGTCGTC 4200

TATTTGCACC ACGTTCGCAG CCATACCAAT CTACCTGATC CCATCTCCAG GCTCAACGCT 4260

CTCACAGATG CCCTACTAAT CACCCCTGTC CTGCAGCTCT CTCCTGCAGA ACTACACAGT 4320

TTCACCCATT GCGGACAGAC GGCCCTCACA TTGCAAGGGG CAACCACAAC TGAGGCTTCC 4380

AATATCCTGC GCTCTTGCCA CGCCTGCCGC GGAGGCAACC CACAACATCA GATGCCTCGG 4440

GGACACATCC GCCGTGGCCT ACTTCCTAAC CACATCTGGC AAGGCGACAT TACCCATTTC 4500

AAATATAAAA ATACGCTGTA TCGCCTTCAT GTATGGGTAG ACACCTTTTC AGGAGCCATC 4560

TCAGCTACCC AAAAGAGAAA AGAAACAAGC TCAGAAGCTA TTTCCTCTTT GCTTCAGGCC 4620

ATTGCCCATC TAGGCAAGCC TAGCTACATA AACACAGACA ACGGCCCTGC CTATATTTCC 4680

CAAGACTTCC TCAATATGTG TACCTCCCTT GCTATTCGCC ATACCACCCA TGTCCCCTAC 4740

AATCCAACCA GCTCAGGACT TGTAGAACGC TCTAATGGCA TTCTTAAAAC CCTATTATAT 4800

AAGTACTTTA CTGACAAACC CGACCTACCC ATGGATAATG CTCTATCCAT AGCCCTATGG 4860

ACAATCAACC ACCTGAATGT GTTAACCAAC TGCCACAAAA CCCGATGGCA GCTTCACCAC 4920

TCCCCCCGAC TCCAGCCGAT CCCAGAGACA CGTTCCCTCA GCAATAAACA AACCCATTGG 4980

TATTATTTCA AGCTTCCTGG TCTTAATAGC CGCCAGTGGA AAGGACCACA GGAGGCTCTC 5040

CAAGAAGCTG CCGGCGCTGC TCTCATCCCG GTAAGCGCTA GTTCTGCCCA GTGGATCCCG 5100

TGGAGACTCC TCAAGCGAGC TGCATGCCCA AGACCCGTCG GAGGCCCCGC CGATCCCAAA 5160

GAAAAAGACC TCCAACACCA TGGGTAAGTT TCTCGCCACT TTGATTTTAT TCTTCCAGTT 5220

CTGCCCCCTC ATCTTCGGTG ATTACAGCCC CAGCTGCTGT ACTCTCACAA TTGGAGTCTC 5280

CTCATACCAC TCTAAACCCT GCAATCCTGC CCAGCCAGTT TGTTCGTGGA CCCTCGACCT 5340

GCTGGCCCTT TCAGCAGATC AGGCCCTACA GCCCCCCTGC CCTAACCTAG TAAGTTACTC 5400

CAGCTACCAT GCCACCTATT CCCTATATCT ATTCCCTCAT TGGACTAAGA AGCCAAACCG 5460

AAATGGCGGA GGCTATTATT CAGCCTCTTA TTCAGACCCT TGTTCCTTAA AGTGCCCATA 5520

CCTGGGGTGC CAATCATGGA CCTGCCCCTA TACAGGAGCC GTCTCCAGCC CCTACTGGAA 5580

GTTTCAACAC GATGTCAATT TTACTCAAGA AGTTTCACGC CTCAATATTA ATCTCCATTT 5640

TTCAAAATGC GGTTTTCCCT TCTCCCTTCT AGTCGACGCT CCAGGATATG ACCCCATCTG 5700

GTTCCTTAAT ACCGAACCCA GCCAACTGCC TCCCACCGCC CCTCCTCTAC TCCCCCACTC 5760

TAACCTAGAC CACATCCTCG AGCCCTCTAT ACCATGGAAA TCAAAACTCC TGACCCTTGT 5820

CCAGTTAACC CTACAAAGCA CTAATTATAC TTGCATTGTC TGTATCGATC GTGCCAGCCT 5880

CTCCACTTGG CACGTCCTAT ACTCTCCCAA CGTCTCTGTT CCATCCTCTT CTTCTACCCC 5940

CCTCCTTTAC CCATCGTTAG CGCTTCCAGC CCCCCACCTG ACGTTACCAT TTAACTGGAC 6000

CCACTGCTTT GACCCCCAGA TTCAAGCTAT AGTCTCCTCC CCCTGTCATA ACTCCCTCAT 6060

CCTGCCCCCC TTTTCCTTGT CACCTGTTCC CACCCTAGGA TCCCGCTCCC GCCGAGCGGT 6120

ACCGGTGGCG GTCTGGCTTG TCTCCGCCCT GGCCATGGGA GCCGGAGTGG CTGGCGGGAT 6180

TACCGGCTCC ATGTCCCTCG CCTCAGGAAA GAGCCTCCTA CATGAGGTGG ACAAAGATAT 6240

TTCCCAGTTA ACTCAAGCAA TAGTCAAAAA CCACAAAAAT CTACTCAAAA TTGCGCAGTA 6300

TGCTGCCCAG AACAGACGAG GCCTTGATCT CCTGTTCTGG GAGCAAGGAG GATTATGCAA 6360

AGCATTACAA GAACAGTGCC GTTTTCCGAA TATTACCAAT TCCCATGTCC CAATACTACA 6420

AGAAAGACCC CCCCTTGAGA ATCGAGTCCT GACTGGCTGG GGCCTTAACT GGGACCTTGG 6480

CCTCTCACAG TGGGCTCGAG AGGCCTTACA AACTGGAATC ACCCTTGTTG CGCTACTCCT 6540

TCTTGTTATC CTTGCAGGAC CATGCATCCT CCGTCAGCTA CGACACCTCC CCTCGCGCGT 6600

CAGATACCCC CATTACTCTC TTATAAAACC TGAGTCATCC CTGTAAACCA AGCACGCAAT 6660

TATTGCAACC ACATCGCCTC CAGCCTCCCC TGCCAATAAT TAACCTCTCC CATCAAATCC 6720

TCCTTCTCCT GCAGCAACTT CCTCCGTTCA GCCTCCAAGG ACTCCACCTC GCCTTCCAAC 6780

TGTCTAGTAT AGCCATCAAT CCCCAACTCC TGCATTTTTT CTTTCCTAGC ACTATGCTGT 6840

TTCGCCTTCT CAGCCCCTTG TCTCCACTTG CGCTCACGGC GCTCCTGCTC TTCCTGCTTC 6900

CTCCTAGCGA CGTCAGCGGC CTTCTTCTCC GCCCGCCTCC TGCGCCGTGC CTTCTCCTCT 6960

TCCTTCCTTT TCAAATACTC AGCGGTCTGC TTTTCCTCCT CTTTCTCCCG CTCTTTTTTT 7020

CGCTTCCTCT TCTCCTCAGC CCGTCGCTGC CGATCACGAT GCGTTTCCCC GCGAGGTGGC 7080

GCTTTCTCCC CTGGAGGGCC CCGTCGCAGC CGGCCGCGGC TTTCCTCTTC TAAGGATAGC 7140

AAACCGTCAA GCACAGCTTC CTCCTCCTCC TTGTCCTTTA ACTCTTCCTC CAAGGATAAT 7200

AGCCCGTCCA CCAATTCCTC CACCAGCAGG TCCTCCGGGC ATGACACAGG CAAGCATCGA 7260

AACAGCCCTG CAGATACAAA GTTAACCATG CTTATTATCA GCCCACTTCC CAGGGTTTGG 7320

ACAGAGTCTT CTTTTCGGAT ACCCAGTCTA CGTGTTTGGA GACTGTGTAC AAGGCGACTG 7380

GTGCCCCATC TCTGGGGGAC TATGTTCGGC CCGCCTACAT CGTCACGCCC TACTGGCCAC 7440

CTGTCCAGAG CATCAGATCA CCTGGGACCC CATCGATGGA CGCGTTATCG GCTCAGCTCT 7500

ACAGTTCCTT ATCCCTCGAC TCCCCTCCTT CCCCACCCAG AGAACCTCTA AGACCCTCAA 7560

GGTCCTTACC CCGCCAATCA CTCATACAAC CCCCAACATT CCACCCTCCT TCCTCCAGGC 7620

CATGCGCAAA TACTCCCCCT TCCGAAATGG ATACATGGAA CCCACCCTTG GGCAGCACCT 7680

CCCAACCCTG TCTTTTCCAG ACCCCGGACT CCGGCCCCAA AACCTGTACA CCCTCTGGGG 7740

AGGCTCCGTT GTCTGCATGT ACCTCTACCA GCTTTCCCCC CCCATCACCT GGCCCCTCCT 7800

GCCCCACGTG ATTTTTTGCC ACCCCGGCCA GCTCGGGGCC TTCCTCACCA ATGTTCCCTA 7860

CAAGCGAATA GAAGAACTCC TCTATAAAAT TTCCCTCACC ACAGGGGCCC TAATAATTCT 7920

ACCCGAAGAC TGTTTGCCCA CCACCCTTTT CCAGCCTGCT AGGGCACCCG TCACGCTAAC 7980

AGCCTGGCAA AACGGCCTCC TTCCGTTCCA CTCAACCCTC ACCACTCCAG GCCTTATTTG 8040

GACATTTACC GATGGCACGC CTATGATTTC CGGGCCCTGC CCTAAAGATG GCCAGCCATC 8100

TTTAGTACTA CAGTCCTCCT CCTTTATATT TCACAAATTT CAAACCAAGG CCTACCACCC 8160

CTCATTTCTA CTCTCACACG GCCTCATACA GTACTCTTCC TTTCATAGTT TACATCTCCT 8220

GTTTGAAGAA TACACCAACA TCCCCATTTC TCTACTTTTT AACGAAAAAG AGGCAGATGA 8280

CAATGACCAT GAGCCCCAAA TATCCCCCGG GGGCTTAGAG CCTCCCAGTG AAAAACATTT 8340

CCGAGAAACA GAAGTCTGAA AAGGTCAGGG CCCAGACTAA GGCTCTGACG TCTCCCCCCG 8400

GAGGGCAGCT CAGCACCGGC TCGGGCTAGG CCCTGACGTG TCCCCCTGAA GACAAATCAT 8460

AAGCTCAGAC CTCCGGGAAG CCACCAAGAA CCACCCATTT CCTCCCCATG TTTGTCAAGC 8520

CGTCCTCAGG CGTTGACGAC AACCCCTCAC CTCAAAAAAC TTTTCATGGC ACGCATATGG 8580

CTCAATAAAC TAGCAGGAGT CTATAAAAGC GTGGAGACAG TTCAGGAGGG GGCTCGCATC 8640

TCTCCTTCAC GCGCCCGCCG CCCTACCTGA GGCCGCCATC CACGCCGGTT GAGTCGCGTT 8700

CTGCCGCCTC CCGCCTGTGG TGCCTCCTGA ACTGCGTCCG CCGTCTAGGT AAGTTTAAAG 8760

CTCAGGTCGA GACCGGGCCT TTGTCCGGCG CTCCCTTGGA GCCTACCTAG ACTCAGCCGG 8820

CTCTCCACGC TTTGCCTGAC CCTGCTTGCT CAACTCTACG TCTTTGTTTC GTTTTCTGTT 8880

CTGCGCCGTT ACAGATCGAA AGTTCCACCC CTTTCCCTTT CATTCACGAC TGACTGCCGG 8940

CTTGGCCCAC GGCCAAGTAC CGGCGACTCC GTTGGCTCGG AGCCAGCGAC AGCCCATCCT 9000

ATAGCACTCT CAGGAGAGAA ATTTAGTACA CATAGTTGGA GGTAG 9045

배열번호2

배열의 길이 : 29

배열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 일본쇄

토포로지 : 직쇄상

배열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA

배열

CCAGCGGCCG CGACCTCCAA GACCTCCTG 29

배열번호3

배열의 길이 : 29

배열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 일본쇄

토포로지 : 직쇄상

배열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA

배열

AAAGCGGCCG CCCGATAGCC TTGTTCTCA 29

배열번호4

배열의 길이 : 29

배열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 일본쇄

토포로지 : 직쇄상

배열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA

배열

TTTGCGGCCG CAACCCAGCA AACCCCTGG 29

배열번호 5

배열의 길이 : 29

배열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 일본쇄

토포로지 : 직쇄상

배열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA

배열

TTAGCGGCCG CGGCGCTGTC TCAACATAT 29

배열번호 6

배열의 길이 : 29

배열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 일본쇄

토포로지 : 직쇄상

배열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA

배열

AAAGCGGCCG CCGTTCCCTC AGCAATAAA 29

배열번호 7

배열의 길이 : 29

배열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 일본쇄

토포로지 : 직쇄상

배열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA

배열

AAAGCGGCCG CGAAGGACTG TCATGTCTG 29

배열번호 8

배열의 길이 : 29

배열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 일본쇄

토포로지 : 직쇄상

배열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA

배열

ACTGCGGCCG CCCAGGGGTT TGCTGGGTT 29

배열번호 9

배열의 길이 : 29

배열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 일본쇄

토포로지 : 직쇄상

배열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA

배열

TTAGCGGCCG CATATGTTGA GACAGCGCC 29

배열번호 10

배열의 길이 : 29

배열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 일본쇄

토포로지 : 직쇄상

배열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA

배열

AAAGCGGCCG CAATACCAAT GGGTTTGTT 29

배열번호 11

배열의 길이 : 29

배열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 일본쇄

토포로지 : 직쇄상

배열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA

배열

AATGCGGCCG CCTCGAGGAT GTGGTCTAG 29

배열번호 12

배열의 길이 : 29

배열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 일본쇄

토포로지 : 직쇄상

배열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA

배열

AAAGCGGCCG CACTCAGGTT TTATAAGAG 29

배열번호 13

배열의 길이 : 29

배열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 일본쇄

토포로지 : 직쇄상

배열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA

배열

ATAGCGGCCG CCCCACTTCC CAGGGTTTG 29

배열번호 14

배열의 길이 : 29

배열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 일본쇄

토포로지 : 직쇄상

배열의 종류 : 다른 핵산 합성 DNA

배열

TATGCGGCCG CAGGAAGAGT ACTGTATGA 29

배열번호 15

배열의 길이 : 3776

배열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 이본쇄

토포로지 : 직쇄상

배열의 종류 : cDNA to mRNA

기원

생물명 : 인간

배열의 특징

특징을 나타내는 기호 : CDS

존재위치 : 139..2205

특징을 결정한 방법 : P

배열

CACGCGTCCG GCCGCCGAAG GGGACTGTTT GCTCCTACGG GCTGTAGATG GAGCTGTCCG 60

GCCCCGGAGA GGGGGAAGGC GCCTGGAAAA CGTTCTTCTT CTCCCTGGCC GACCCGAGCG 120

GGGAACAGCA CTCCCAGG ATG CAG TTT GTG TCA ACA CGG CCG CAG CCT CAG 171

Met Gln Phe Val Ser Thr Arg Pro Gln Pro Gln

1 5 10

CAG CTG GGC ATC CAG GGC CTG GGG CTG GAC AGC GGG AGC TGG AGC TGG 219

Gln Leu Gly Ile Gln Gly Leu Gly Leu Asp Ser Gly Ser Trp Ser Trp

15 20 25

GCC CAG GCT CTG CCC CCG GAG CAG GTC TGC CAC CAG GAG CCG GCG CTG 267

Ala Gln Ala Leu Pro Pro Glu Gln Val Cys His Gln Glu Pro Ala Leu

30 35 40

CGC GGG GAA ATG GCC GAG GGA ATG CCG CCC ATG CAG GCT CAA GAA TGG 315

Arg Gly Glu Met Ala Glu Gly Met Pro Pro Met Gln Ala Gln Glu Trp

45 50 55

GAC ATG GAC GCC CGG CGG CCA ATG CCT TTT CAG TTC CCA CCC TTT CCA 363

Asp Met Asp Ala Arg Arg Pro Met Pro Phe Gln Phe Pro Pro Phe Pro

60 65 70 75

GAT AGG GCA CCT GTC TTC CCC GAC CGC ATG ATG CGA GAG CCC CAG TTG 411

Asp Arg Ala Pro Val Phe Pro Asp Arg Met Met Arg Glu Pro Gln Leu

80 85 90

CCC ACA GCA GAG ATC TCA CTC TGG ACT GTG GTG GCT GCC ATT CAG GCT 459

Pro Thr Ala Glu Ile Ser Leu Trp Thr Val Val Ala Ala Ile Gln Ala

95 100 105

GTG GAG AGG AAG GTG GAT GCC CAG GCC AGC CAG CTG CTG AAC CTG GAG 507

Val Glu Arg Lys Val Asp Ala Gln Ala Ser Gln Leu Leu Asn Leu Glu

110 115 120

GGG CGC ACG GGG ACA GCC GAG AAG AAG CTG GCC GAC TGT GAA AAG ACG 555

Gly Arg Thr Gly Thr Ala Glu Lys Lys Leu Ala Asp Cys Glu Lys Thr

125 130 135

GCC GTG GAA TTT GGG AAC CAC ATG GAG AGC AAG TGG GCC GTG CTG GGG 603

Ala Val Glu Phe Gly Asn His Met Glu Ser Lys Trp Ala Val Leu Gly

140 145 150 155

ACC CTG CTG CAG GAG TAC GGG CTG CTG CAG AGG CGG CTG GAG AAC TTG 651

Thr Leu Leu Gln Glu Tyr Gly Leu Leu Gln Arg Arg Leu Glu Asn Leu

160 165 170

GAG AAC TTG CTG CGC AAC AGG AAC TTC TGG GTC CTG CGG CTG CCC CCG 699

Glu Asn Leu Leu Arg Asn Arg Asn Phe Trp Val Leu Arg Leu Pro Pro

175 180 185

GGC AGC AAG GGG GAG GCC CCC AAG GTT CCA GTG ACT TTT GTC GAC ATT 747

Gly Ser Lys Gly Glu Ala Pro Lys Val Pro Val Thr Phe Val Asp Ile

190 195 200

GCT GTG TAC TTC TCC GAA GAC GAG TGG AAG AAC TTG GAC GAA TGG CAG 795

Ala Val Tyr Phe Ser Glu Asp Glu Trp Lys Asn Leu Asp Glu Trp Gln

205 210 215

AAG GAG CTT TAT AAC AAC CTT GTT AAG GAG AAC TAC AAA ACC CTC ATG 843

Lys Glu Leu Tyr Asn Asn Leu Val Lys Glu Asn Tyr Lys Thr Leu Met

220 225 230 235

TCC CTG GAC GCG GAG GGC TCA GTC CCC AAG CCA GAT GCT CCA GTC CAG 891

Ser Leu Asp Ala Glu Gly Ser Val Pro Lys Pro Asp Ala Pro Val Gln

240 245 250

GCT GAG CCC AGG GAA GAA CCT TGT GTG TGG GAG CAG CGC CAC CCC GAA 939

Ala Glu Pro Arg Glu Glu Pro Cys Val Trp Glu Gln Arg His Pro Glu

255 260 265

GAG AGA GAA ATC CCA ATG GAT CCC GAA GCA GGA GCA GAG CCC CTG GTG 987

Glu Arg Glu Ile Pro Met Asp Pro Glu Ala Gly Ala Glu Pro Leu Val

270 275 280

CCT GCG CAG GAT GCG TCC TCC CAG GTG AAG CGT GAG GAC ACC CTG TGT 1035

Pro Ala Gln Asp Ala Ser Ser Gln Val Lys Arg Glu Asp Thr Leu Cys

285 290 295

GTC CGG GGT CAG CGG GGC CTG GAG GAA AGA GCC ATC CCT ACG GAA TCC 1083

Val Arg Gly Gln Arg Gly Leu Glu Glu Arg Ala Ile Pro Thr Glu Ser

300 305 310 315

ATT ACC GAC TCC CCA ATT TCT GCC CAG GAC CTC TTG TCC CGG ATT AAA 1131

Ile Thr Asp Ser Pro Ile Ser Ala Gln Asp Leu Leu Ser Arg Ile Lys

320 325 330

CAG GAG GAG CAT CAG TGC GTG TGG GAT CAG CAG GAT TTG GCA GAC AGA 1179

Gln Glu Glu His Gln Cys Val Trp Asp Gln Gln Asp Leu Ala Asp Arg

335 340 345

GAT ATT CCC ACG GAT CCC AAT TCA GAG TCT CTC ATC TCA GCA CAT GAC 1227

Asp Ile Pro Thr Asp Pro Asn Ser Glu Ser Leu Ile Ser Ala His Asp

350 355 360

ATT TTG TCA TGG ATC AAG CAG GAG GAG CAG CCA TAC CCA TGG GGA CCA 1275

Ile Leu Ser Trp Ile Lys Gln Glu Glu Gln Pro Tyr Pro Trp Gly Pro

365 370 375

CGC GAC TCA ATG GAC GGA GAG CTT GGA TTA GAC TCT GGC CCT AGT GAC 1323

Arg Asp Ser Met Asp Gly Glu Leu Gly Leu Asp Ser Gly Pro Ser Asp

380 385 390 395

AGC CTG CTG ATG GTG AAG AAC CCA CCC CCG GCC CCG CCA CAG CCC CAG 1371

Ser Leu Leu Met Val Lys Asn Pro Pro Pro Ala Pro Pro Gln Pro Gln

400 405 410

CCC CAG CGC CAG CCA CCG CAG CCG CAG CTG CAG TCG CAG CCC CAG CCC 1419

Pro Gln Arg Gln Pro Pro Gln Pro Gln Leu Gln Ser Gln Pro Gln Pro

415 420 425

CAG AGC CTG CCC CCC ATC GCG GTG GCC GAG AAC CCG GGC GGC CCC CCG 1467

Gln Ser Leu Pro Pro Ile Ala Val Ala Glu Asn Pro Gly Gly Pro Pro

430 435 440

AGC CGA GGG CTG CTG GAC GAC GGT TTC CAG GTG CTG CCC GGG GAG CGT 1515

Ser Arg Gly Leu Leu Asp Asp Gly Phe Gln Val Leu Pro Gly Glu Arg

445 450 455

GGC TCC GGC GAG GCG CCG CCG GGT GGG GAC CGC AGC ACC GGG GGC GGC 1563

Gly Ser Gly Glu Ala Pro Pro Gly Gly Asp Arg Ser Thr Gly Gly Gly

460 465 470 475

GGG GGC GAT GGG GGC GGT GGG GGC GGC GGC GCG GAG GCG GGG ACG GGG 1611

Gly Gly Asp Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Glu Ala Gly Thr Gly

480 485 490

GCA GGC GGC GGC TGT GGC AGC TGC TGC CCT GGC GGG CTG CGG CGG AGC 1659

Ala Gly Gly Gly Cys Gly Ser Cys Cys Pro Gly Gly Leu Arg Arg Ser

495 500 505

CTC CTC CTG CAC GGC GCC CGC AGC AAG CCC TAC TCG TGC CCC GAG TGC 1707

Leu Leu Leu His Gly Ala Arg Ser Lys Pro Tyr Ser Cys Pro Glu Cys

510 515 520

GGC AAG AGC TTC GGC GTG CGC AAG AGC CTC ATC ATC CAC CAC CGC AGC 1755

Gly Lys Ser Phe Gly Val Arg Lys Ser Leu Ile Ile His His Arg Ser

525 530 535

CAC ACC AAG GAG CGG CCC TAC GAG TGC GCT GAG TGC GAG AAG AGC TTC 1803

His Thr Lys Glu Arg Pro Tyr Glu Cys Ala Glu Cys Glu Lys Ser Phe

540 545 550 555

AAC TGC CAC TCG GGC CTC ATC CGC CAC CAG ATG ACG CAC CGC GGC GAG 1851

Asn Cys His Ser Gly Leu Ile Arg His Gln Met Thr His Arg Gly Glu

560 565 570

CGG CCC TAC AAG TGC TCG GAG TGC GAG AAG ACC TAC AGC CGT AAG GAG 1899

Arg Pro Tyr Lys Cys Ser Glu Cys Glu Lys Thr Tyr Ser Arg Lys Glu

575 580 585

CAC CTG CAG AAC CAC CAG CGG CTG CAC ACG GGC GAG CGG CCT TTC CAA 1947

His Leu Gln Asn His Gln Arg Leu His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Gln

590 595 600

TGT GCA CTG TGC GGC AAG AGC TTC ATC CGC AAG CAG AAC CTG CTC AAG 1995

Cys Ala Leu Cys Gly Lys Ser Phe Ile Arg Lys Gln Asn Leu Leu Lys

605 610 615

CAC CAG CGC ATC CAC ACG GGC GAG CGC CCC TAC ACG TGC GGC GAG TGC 2043

His Gln Arg Ile His Thr Gly Glu Arg Pro Tyr Thr Cys Gly Glu Cys

620 625 630 635

GGC AAG AGC TTC CGC TAC AAG GAG TCG CTC AAG GAC CAC CTG CAG TGC 2091

Gly Lys Ser Phe Arg Tyr Lys Glu Ser Leu Lys Asp His Leu Gln Cys

640 645 650

ACA GCG GCG GCC CGG GCC CCG GCG CCC CAC GGC AGC TCC CGC CGC CTC 2139

Ala Arg Ala Pro Ala Pro His Gly Ser Ser Arg Arg Leu Leu Ser Glu

655 660 665

CTG AGC GAG ACT AGG GCT GGG CTG GGG GAG GGC AGG GCC GGA CGG AGT 2187

Thr Arg Ala Gly Thr Ala Ala Leu Gly Glu Gly Arg Ala Gly Arg Ser

670 675 680

GGA TCG GGG GCG GCC TGAGCACCAA CCACCTTGCC GGGTGTCCTC AGCCACCGTC 2242

Gly Ser Gly Ala Ala

685

TGGAAATCGG CAACAGGCAT TGCACTCCGG TTGGGGGTCC CCCAGGGTGG GGCAGGGATC 2302

CCCCAGATCT GTCTGGTCTG AATGGACGCC CAGCTCATCT AGGGTGGACC CAGCTGCTGG 2362

GGAAGAGCCA GGGGGACCGC GAGGAGCCGA GCGTCCTCGG GCACCGCCCT CACACCTCCT 2422

CGAGTGCCCT GGGACCACTG GGCCACAGAT GGTCATCAGG GGAAGCCACC AGGGAGTCCC 2482

GAAGCCCTTC TGAGATCAGG AAATCAGGTC CCAAGGTTAG GAGACGCCCT GAAAAAAAGT 2542

GAAGGCCGAG GGATGTGCTA AGGGTAACAC CTTCATGATG ACAACACTGC CTCGCGTTTC 2602

AATAGCGCTT TATACTTTTT TAAGTGTTTT CTATCCGTTA TCCATTTCAC CCTTGGCCTA 2662

TCCCTCTCAG ATAGGTGGGG TAGGATTTTC CTGGTGACCG AGTAAAGTGA GAGGCAGGTG 2722

AGACGGTTCA CCCAATCACA CGGGAAGGGG CGCGCGCTGC CCAACCGCGC TCTCCGCCTA 2782

CCTCGCTGCT CGGGAAGCTG CTGGCCTGGC CCTCCTGGTC TCTCTTCCTT TCTGGTCTCT 2842

CTTCCTTTCC TTGCTCTCAC CCACGGATAA AACCAGAAGC GACAGGAGGC CAGCTCCTGG 2902

GGTTCCTGGG ACCGGGAACA GATTGGCTAC GGAACGCCCC AGGTTGTACA TTCAGAGGGC 2962

TCTTTCTCCA TGGGAGCTCC TGGTGCCGCC TTCGGCCCCA GCCTGTCCCC AGCCCCTCAA 3022

TCTGGTGCAG CAGCATCTTG TCACTGCACA ACAGTGGCCT GGTCCCCCAC AGGCAGTTAG 3082

GGCCCCAGGT CAGACCTCAC CATGATGATT TGTTCCAGTT CTCCCAGGGC AGAGGGGCGA 3142

GGGAGAGGCT TTTGCTGTGA GAGTAGCCGT CACGTGTCTC TTCCCAGCAG CGCCGGGCAA 3202

GTGGGTGCTA GAGTCTGAGC CTCAGGCTCT CCTGCCCTGG GCCTCCCAAT TGGTGCTATC 3262

TGTTACTGCC CGTGCTCACG GACATGGATA CAGACCCTGC TGTGCTCCAC ACCCTGCAGG 3322

CGCCTCGGGA AGCGCCCAAA GGATTCCCCT TCACGTTGGT GCACCTGCTC CATAGCTCCG 3382

GGCGCTGCGT CCCGAGGGGC CACAGTCTCC ATTTCAGCGT CTTGCATGGC CTGGCACCGG 3442

GTGGGGTGGT ATGCCCCCTT GTTTGTGTCA AAAATGACTT TCCCTGCCCT TGCCGTGGGT 3502

CCGGCGTTCC TCCCAGCCGG GATCACAGTG GGCAGCCGGC ACCCGGCACC ACTTTGGCGA 3562

GCGTCCTGCT TCCGCCCTCG CCCTCATCTA CGCTGCTCCG CTTTCCTCAG ACCCCTTTTT 3622

GCCGTGCAAA GGAATTCTTG ACATTAAATA AAAGGTATCC AGATTGCAGA CTGCATGTTC 3682

ACAGAGCTGG GGGTTCTCCA GCTTGCCTAC AGTAAAGCCT CAATGAACTG GAAAAAAAAA 3742

AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAA 3776

배열번호 16

배열의 길이 : 32

배열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 일본쇄

토포로지 : 직쇄상

배열의 종류 : 합성 DNA

배열

GATCTAAGTT CCACCCCTTT CCCTTTCATT CG 32

배열번호 17

배열의 길이 : 32

배열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 일본쇄

토포로지 : 직쇄상

배열의 종류 : 합성 DNA

배열

GATCCGAATG AAAGGGAAAG GGGTGGAACT TA 32

배열번호 18

배열의 길이 : 20

배열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 일본쇄

토포로지 : 직쇄상

배열의 종류 : 합성 DNA

배열

CCTGAGGTAA TTATAACCCG 20

배열번호 19

배열의 길이 : 20

배열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 일본쇄

토포로지 : 직쇄상

배열의 종류 : 합성 DNA

배열

CGCTGATATC GATCGCGCGC 20

Claims (29)

1. 유전자발현 억제기능을 갖는 DNA분자이고, 배열표의 배열번호 1의 2268위치의 C에서 4080위치의 T까지의 DNA 배열에 함유된 연속한 적어도 400개의 핵산으로 이루어진 DNA 배열 또는 그 DNA 배열과 약 59% 이상의 상동성을 갖는 DNA 배열을 함유하는 DNA 분자.
2. 유전자발현 억제기능을 갖는 DNA분자이고, 배열표의 배열번호 1의 2268위치의 C에서 4080위치의 T까지의 DNA 배열에 함유된 연속한 적어도 400개의 핵산으로 이루어진 DNA 배열 또는 그 DNA 배열과 약 59% 이상의 상동성을 갖는 DNA 배열인 DNA 분자.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 배열표의 배열번호 1의 2268위치의 C에서 3182위치의 G까지의 DNA 배열 또는 그 DNA 배열과 약 59% 이상의 상동성을 갖는 DNA 배열을 함유하는 DNA 분자.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 배열표의 배열번호 1의 3368위치의 A에서 3780위치의 A까지의 DNA 배열 또는 그 DNA 배열과 약 59% 이상의 상동성을 갖는 DNA 배열을 함유하는 DNA 분자.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 배열표의 배열번호 1의 3165위치의 A에서 4080위치의 T까지의 DNA 배열 또는 그 DNA 배열과 약 59% 이상의 상동성을 갖는 DNA 배열을 함유하는 DNA 분자.
6. 숙주세포내에서 활성을 갖는 프로모터 배열, 제1항 내지 제5항의 어딘가에 기재된 DNA 배열 및 RRE 또는 RXE 배열을 함유하는 플라스미드.
7. 제6항에 있어서, 치료유전자 배열을 더 함유하는 플라스미드.
8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 프로모터가 바이러스 감염세포에서 발현율을 높게 하는 프로모터인 플라스미드.
9. 제8항에 있어서, 상기 프로모터가 LTR인 플라스미드.
10. 제7항에 있어서, 상기 치료유전자 배열이 숙주세포에 대해서 독성이 있을 수 있는 유전자배열 또는 바이러스복제를 저지할 수 있는 유전자배열인 플라스미드.
11. 제1항 및 제5항의 어딘가에 기재된 DNA 분자의 유전자발현 억제를 위한 용도.
12. 제1항 및 제5항의 어딘가에 기재된 DNA 분자의 바이러스감염증의 처치를 위한 용도.
13. 제12항에 있어서, 상기 바이러스감염증이 인간 T세포 백혈병 및 HIV 감염증인 용도.
14. 인간 T세포 백혈병 바이러스 I형 유전자 LTR의 U5 영역에 존재하는 전사억제 영역에 결합하는 단백질이고, Kruppel 형의 전사억제인자에 공통적인 도메인 및 4개반의 Kruppel 형 아연 핑거 도메인을 함유하는 단백질.
15. 제14항에 있어서, 분자량이 약 76kDa인 단백질.
16. 제14항에 있어서, 상기 Kruppel형의 전사억제 인자에 공통적인 도메인이 배열표의 배열번호15의 196위치의 Val에서 261위치의 Trp까지의 아미노산 배열 또는 그 유사의 배열이고, 그래서 상기 4개반의 Kruppel형 아연 핑거 도메인이 배열표의 배열번호 15의 518위치의 Try에서 648위치의 His까지의 아미노산 배열 또는 그 유사한 배열인 단백질.
17. 제16항에 있어서, 배열표의 배열번호 15의 154위치의 Lue에서 185위치의 Leu까지의 아미노산 배열, 배열표의 배열번호 15의 403위치의 Pro에서 443위치의 Pro까지의 아미노산 배열 및 배열표의 배열번호 15의 470위치의 Arg에서 503위치의 Gly까지의 아미노산 배열 또는 이들의 아미노산 배열에 유사한 배열을 더 함유하는 단백질.
18. 제14항에 있어서, 배열표의 배열번호 15의 1위치의 Met에서 688위치의 Ala까지의 아미노산 배열 또는 이들의 아미노산 배열에 유사한 배열을 함유하는 단백질.
19. 제14항 내지 제18항의 어딘가에 기재된 상기 단백질을 코드화하는 DNA분자.
20. 제19항에 있어서, 배열표의 배열번호 15의 724위치의 G에서 921위치의 G까지로 이루어진 염기배열 및 배열표의 배열번호 15의 1690위치의 T에서 2082위치의 C까지로 이루어진 염기배열을 갖는 DNA분자.
21. 제20항에 있어서, 배열표의 배열번호 15의 598위치의 C에서 693위치의 G까지로 이루어진 염기배열, 배열표의 배열번호 15의 1345위치의 C에서 1467위치의 G까지로 이루어진 염기배열 및 배열표의 배열번호 15의 1546위치의 C에서 1647위치의 G까지로 이루어진 염기배열을 더 갖는 DNA분자.
22. 제19항에 있어서, 배열표의 배열번호 15의 139위치의 A에서 2202위치의 C까지로 이루어진 염기배열을 갖는 DNA분자.
23. 제22항에 있어서, 배열표의 배열번호 15의 1위치의 C에서 3776위치의 A까지로 이루어진 염기배열을 갖는 DNA분자.
24. 제19항 내지 제23항의 어딘가에 기재된 상기 DNA분자를 갖는 발현벡타.
25. 제24항의 발현벡타를 숙주에 도입하여 얻어지는 형질전환체.
26. 제25항에 있어서, 상기 숙주가 대장균인 형질전환체.
27. 제25항에 기재된 형질전환체를 배양하는 공정 및 생산된 단백질을 배양배지에서 회수하는 공정을 포함하는 제14항 내지 제18항에 어딘가에 기재된 단백질의 제조방법.
28. 제14항 내지 제18항의 어딘가에 기재된 단백질을 유효성분으로 하여 함유하는 항바이러스제.
29. 제14항 내지 제18항의 어딘가에 기재된 단백질의 발현을 지표로 하는 암의 검출방법.